Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль у біосинтезі антибіотиків

Ген канаміцин-резистентності з штаму S. kanamyceticus 1 та його GenR -мутанта genR10 був клонований у висококопійному векторі pIJ702 у S. lividans 66. У результаті отримали два штами S. lividans з рекомбінантними плазмідами: а) pIJK12, що несе фрагмент ДНК штаму 1; б) pIJG31 - ДНК genR10. Рестрикційне картування показало, що обидві плазміди містять гомологічні гени, позначені як kmrB, у ділянках ДНК розмірами 4,2 та 6,1 т.п.н., відповідно (рис.9). Ген kmrB зумовлює стійкість до канаміцину, гентаміцину, тобраміцину та сизоміцину (табл.2) За рівнем АГ-резистентності трансформанти перевищують штам-донор S. kanamyceticus 1. Секвенування гена kmrB показало, що він складається з 831 п.н. (стартовий кодон - ATG, термінуючий кодон - TGA). Стартовому кодону передує потенційна RBS - послідовність (GAGGA), комплементарна 3'-кінцю 16S рРНК S.lividans. Частка G+C пар у першій, другій та третій позиціях кодонів у гені становить, відповідно, 70, 52 та 92%. Ймовірним продуктом гена kmrB є метилаза 16S рРНК, оскільки він має високий рівень гомології з відомими генами метилаз з інших актиноміцетів - продуцентів АГ. Порівняння ймовірної амінокислотної (ак) послідовності продукту гена kmrB із вже відомими білками показало, що найвищий ступінь гомології є з метилазою 16S рРНК продуцента небраміцинового комплексу S. tenebrarius (ступінь ідентичності ак-послідовностей становить 53,9%, а подібності - 77,9%). Спостерігається подібність визначеної ймовірної ак-послідовності з метилазами 16S рРНК інших актиноміцетів - продуцентів АГ. Експерименти з ДНК-ДНК гібридизації за Саузерном клонованого гена kmrB та сумарної ДНК різних штамів S. kanamyceticus виявили ампліфікації ділянки ДНК, що містить ген kmrB, у геномі мутантів genR10, genR8, genR8.1. Рівні ампліфікації та рівні стійкості корелюють. Ампліфікація гена kmrВ виявлена також й в одного з нестабільних Kan--мутантів - kаn12 (рис.10). Отже, однією з причин підвищеної резистентності мутантів S. kanamyceticus до АГ є ампліфікація гена kmrB. Ділянки ДНК, що оточують цей ген, мають гомологію з фрагментами сумарної ДНК продуцента неоміцину S. fradiae та продуцента сизоміцину Micromonospora zionensis.

Проведено аналіз макрофрагментів хромосомної ДНК 5 штамів S. kanamyceticus за допомогою пульс-електрофорезу. Показана доцільність використання протопластів S. kanamyceticus у приготуванні препаратів ДНК для пульс-електрофорезу. Ідентифіковані 16 AseI- та 12 DraI-фрагментів хромосомної ДНК штаму 1, розміри яких коливаються від 40 до 1800 т.п.н. Розміри хромосомної ДНК вивчених штамів S. kanamyceticus становлять від 7715 до 8217 т.п.н.. Виявлені перебудови нуклеотидних послідовностей у хромосомах мутантів kan12, genR8 та genR10. Порівняно з ДНК вихідного штаму 1 у kan12 відсутні два AseI-фрагменти - D (98 т.п.н.) та J (220 т.п.н.), натомість є фрагменти J'(297) та K'(450 т.п.н.). У мутантів genR10 та genR8 відсутній фрагмент К (420 т.п.н.), але з'являється фрагмент К'. У мутантів kan12, genR10 та genR8 більші розміри хромосомної ДНК (8217 та по 7818 т.п.н., відповідно), порівняно з штамом 1 (7788 т.п.н.), що узгоджується з даними про ампліфікацію в них гена kmrB. Ці результати є вихідними для подальшого фізичного картування хромосоми S. kanamyceticus, а також вивчення механізмів нестабільності генома цієї культури.

Таблиця 2. Стійкість штамів-донорів S. kanamyceticus та штамів-реципієнтів S. lividans до аміноглікозидних антибіотиків

Примітка: Km -канаміцин, Gm-гентаміцин, Tm-тобраміцин, Sn-сизоміцин, Nm-неоміцин, Ap-апраміцин, Sm-стрептоміцин, Pm-паромоміцин

Спроби трансформувати протопласти штаму S. kanamyceticus 1 та його мутантів за допомогою ДНК плазмід pIJ702, pWHM4, pTO1 та pSET152 виявилися невдалими. Тому ми розробили систему пренесення ДНК реплікативних (pSOK101, pSOK201 та pCHZ101) та інтегративних (pSET152 та pVWB) плазмід у S. kanamyceticus за допомогою кон'югаційних схрещувань з E. coli ET12567(pUB037). Частота появи транскон'югантів, що містили перелічені вище плазміди становила від 2,2?10-5 до 2,5?10-4. Інтегративні плазміди pSET152 (з геном інтегрази та attP-сайтом фага ?С31) та pVWB (з геном інтегрази та attP-сайтом фага VWB) успадковувались у неселективних умовах з ефективністю 100%. За таких умов менше 20% клонів успадковували реплікативні плазміди. Спостерігається пригнічення синтезу канаміцину у pSET152+- транскон'югантів. Якщо ж використовувати вектор pVWB з відмінною системою інтеграції у хромосому, то синтез антибіотика в екскон'югантів є на рівні вихідного штаму. Досліди з гібридизації фрагментів сумарної ДНК pSET152+-екскон'югантів з міченим PstI-фрагментом pSET152 (800 п.н.) показали, що в хромосомі S. kanamyceticus є два сайти інтеграції цієї плазміди (attB1 та attB2). Клоновано та секвеновано ділянки хромосоми S. kanamyceticus, що прилягають до цих сайтів. У них виявлено 4 ORF, з яких одна - ORF1, ймовірним продуктом якої є білок, що бере участь у конденсації хромосоми штаму, зруйнована інтеграцією pSET152. Розроблена система перенесення реплікативних та інтегративних векторів у S. kanamyceticus та дані про сайти інтеграції pSET152 у хромосому дозволяють застосовувати методи генної інженерії для вивчення та конструювання S. kanamyceticus.

Виконаний комплекс досліджень S. kanamyceticus - одного з найважливіших промислових стрептоміцетів, дозволяє застосувати до нього сучасні генетичні та генно-інженерні підходи і розробити на цій основі раціональні підходи до його конструювання й селекції, а також використовувати його як модель для вивчення інших актиноміцетів, що утворюють 2-дезоксистрептамінові аміноглікозидні антибіотики.

ВИСНОВКИ

У результаті виконаної роботи встановлено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вивчено вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. Обґрунтовано перспективність використання мутацій, що змінюють стійкість актиноміцетів до антибіотиків у селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. Показано, що ознаки природної стійкості до антибіотиків можуть розглядатися як модельні для вивчення генетичної нестабільності актиноміцетів а їх виявлення та аналіз є необхідною складовою частиною конструювання та селекції цих бактерій. На основі отриманих результатів опрацьовано підходи до селекції високоактивних продуцентів антибіотиків та створено Колекцію культур мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків ЛНУ ім.І.Франка, що включена до Державного реєстру об'єктів, що становлять національне надбання.

Головні наукові та практичні результати викладені у таких висновках:

1. Дослідженим штамам актиноміцетів - продуцентам полікетидних антибіотиків та канаміцину властива природна стійкість як до власного, так і інших антибіотиків. Для кожного виду актиноміцетів характерний відмінний спектр множинної антибіотикорезистентності. У різних похідних одного виду, що отримані у результаті селекції на підвищену продукцію антибіотиків, або ж мутантів, що їх не синтезують, а також у морфологічних варіантів одного виду спостерігаються відміни у вияві ознак стійкості як до власного, так і до інших антибіотиків.

2. Охарактеризовано спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності досліджених штамів актиноміцетів до антибіотиків. У геномі нестабільних мутантів S. coelicolor A3(2) та S. ambofaciens виявлено й охарактеризовано послідовності ДНК, здатні до ампліфікації.

3. Отримано та вивчено колекції мутантів продуцента еритроміцину Sacch. erythraea, стійких до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутантів продуцента даунорубіцину та доксорубіцину S. peucetius subsp.сaesius, стійких до власних антибіотиків, а також мутантів S. kanamyceticus, стійких до аміноглікозидних антибіотиків. Кожна з груп мутантів є гетерогенною за рівнем стійкості до вказаних антибіотиків, а у значної їх частини змінені інші ознаки, зокрема, синтез антибіотиків.

4. Створено бібліотеку генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та частково секвеновано кластер генів біосинтезу ландоміцину Е. У кластері виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Гени lndE, lndF, lndA, lndB, lndC, lndD, lndL, lndM, lndN, lndO, lndP, lndV, lndZ4, lndZ6, lndZ5 контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1, lndZ3 - синтез дезоксицукрів, lndGT2, lndGT1, lndGT4 - їхнє приєднання до аглікону, ген lndJ є імовірним детермінантом стійкості до ландоміцину Е, а lndI - регулятором структурних lnd-генів.

5. Отримано і досліджено колекцію мутантів S. kanamyceticus, в яких порушені різні етапи біосинтезу канаміцину та ідентифіковано п'ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину (kanA, kanB, kanC, kanD та kanG). Вперше продемонстровано генетичну рекомбінацію після злиття протопластів S. kanamyceticus. Показано зчепленість мутацій kanB та kanD з мутаціями стійкості до еритроміцину, гентаміцину та рифампіцину.

6. Із штаму S. kanamyceticus 1 та його мутанта genR10 клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує ймовірну метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Ділянки ДНК, що оточують ген kmrB, виявляють високий рівень гомології з фрагментами сумарної ДНК продуцента неоміцину S. fradiae та продуцента сизоміцину M. zionensis.

7. За допомогою аналізу макрофрагментів із використанням пульс-електрофорезу визначено розміри хромосомної ДНК п'яти штамів S. kanamyceticus - 7715-8217 т.п.н. Перебудови нуклеотидних послідовностей, а також ампліфікації гена kmrB виявлено у геномах нестабільного Kan- - мутанта kan12 та мутантів genR8 та genR10, стійких до гентаміцину.

8. Створено систему клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон'югаційного перенесення плазмід з E. coli. Показано ефективність розробленої системи для спрямованої інактивації lnd-генів S. globisporus.

9. Доведено, що отримання RifR-, CmlR-, TsrR- та StrR-мутантів Sacch. erythraea, CmlR-мутантів S. ambofaciens, DnrR та DxrR -мутантів S. peucetius subsp.caesius, GenR-мутантів S. kanamyceticus може бути одним з етапів селекції відповідних штамів. Злиття протопластів та відбір рекомбінантів, що поєднують rif-, str- та tsr-мутації є ефективним методом селекції штамів Sacch. erythraea.

10. Показано, що у селекції S. kanamyceticus та S. peucetius subsp.caesius можуть використовуватися мутанти з порушеною глюкозною репресією.

11. Клонування генів dnrI та cpx у S. peucetius subsp.caesius дозволяє виділити штами з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин.

12. Спрямована інактивація гена lndGT4 продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912 зумовлює продукцію нових ландоміцинів F та H, а комплементація генетичних порушень у ньому - синтез ландоміцину G. Нові ландоміцини мають змінені антибактерійні та протипухлинні властивості.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Федоренко В.А., Стародубцева Л.И., Заворотная С.А., Ломовская Н.В., Даниленко В.Н. Характеристика множественного изменения признаков устойчивости к антибиотикам у Streptomyces coelicolor A3(2) // Генетика.-1989.-Т.25. №4.-С.626-634.

2. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Кириченко Н.В., Даниленко В.Н. Получение и характеристика рифампицин-устойчивых мутантов у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. - 1990. - Т.35,№12.-С.11-13.

3. Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Генетическая нестабильность признака стрептомицин-устойчивости у Streptomyces erythraeus // Антибиот. и химиотер. - 1990. - Т.35,№12.-С.18-21.

4. Заворотная С.А., Федоренко В.А.,Стародубцева Л.И., Даниленко В.Н. Амплифицирующаеся последовательности в геноме Streptomyces coelicolor A3(2) // Антибиот. и химиотер. - 1990. - Т.35,№12.-С.21-23.

5. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Кириченко Н.В., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces erythraeus с измененнной устойчивостью к антибиотикам // Труды ВНИИА.-1992.-Вып.21.-С.39-45.

6. Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика генетических рекомбинантов при слиянии протопластов Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. - 1993. - Т.38,№1.-С.24-28.

7. Кириченко Н.В., Настасяк И.Н., Басилия Л.И., Захарова Г.М., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Использование слияния протопластов в селекции продуцента эритромицина Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. - 1993. - Т.38,№6.-С.3-8.

8. Голец Л.М., Басилия Л.И., Мазепа А.И., Федоренко В.А. Получение и изучение свойств мутантов Streptomyces kanamyceticus с нарушениями биосинтеза канамицина // Антибиот. и химиотер. - 1995. - Т.40,№1.-С.3-7.

9. Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Федоренко В.А. Биосинтез канамицина и резистентность к аминогликозидам у мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе // Антибиот. и химиотер. - 1996. - Т.41,№6.-С.10-14.

10. Демидчук Ю.А., Голец Л.М., Федоренко В.А. Характеристика мутантов Streptomyces kanamyceticus, устойчивых к аминогликозидным антибиотикам // Антибиот. и химиотер. - 1996. - Т.41,№6.-С.15-20.

11. Голец Л.М., Есипов С.Е., Федоренко В.А. Метаболиты, образуемые мутантами Streptomyces kanamyceticus с нарушенным биосинтезом канамицина // Антибиот. и химиотер. - 1997. - Т.42,№4.-С.8-12.

12. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea, устойчивых к тиострептону // Антибиот. и химиотер. - 1997. - Т.42,№1.-С.7-11.

13. Настасяк И.Н., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Локализация детерминантов устойчивости к рифампицину на генетической карте Saccharopolyspora erythraea // Антибиот. и химиотер. - 1997. - Т.42,№8.-С.14-20.

14. Федоренко В.А., Голец Л.М., Демидчук Ю.А., Крюгель Г. Анализ перестроек генома у мутантов Streptomyces kanamyceticus // Антибиот. и химиотер. - 1998. - Т.43,№4.-С.14-19.

15. Demydchuk J., Oliynyk Z., Fedorenko V. Analysis of a kanamycin resistance gene (kmr) from Streptomyces kanamyceticus and a mutants with increased aminoglycoside resistance // J.Basic Microbiol. - 1998. - Vol.38, N4.- P.231-239.

16. Настасяк И.Н., Заворотная С.А., Федоренко В.А., Даниленко В.Н. Получение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraea, устойчивых в хлорамфениколу // Антибиот. и химиотер. - 1999. - Т.44,№3.-С.5-10.

17. Федоренко В.О. Конструювання штамів-продуцентів антибіотика канаміцину Streptomyces kanamyceticus за допомогою методів клітинної та генної інженерії // Биол. вестник - 1999.-Т.3.№1-2.-С.111-117.

18. Дубицька Л., Заворотна С., Осташ Б., Громико О., Басілія Л., Федоренко В. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC29050 та Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.49-60.

19. Федоренко В.О. Генетична нестабільність стійкості Streptomyces ambofaciens до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.25.-С.67-73.

20. Громико О., Басілія Л., Кириченко Н., Федоренко В. Отримання і характеристика стрептоміцин-резистентних мутантів продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е Streptomyces globisporus // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.46-53.

21. Мар'їна О., Заворотна С., Федоренко В. Вплив кофеїну на вияв генетичної нестабільності у Streptomyces coelicolor A3(2) // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2000.-Вип.26.-С.63-67.

22. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Панькевич К.О., Дубицька Л.П., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Крюгель Г. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків-полікетидів // Бюл. ін-ту сільськогосп. мікробіол.-2000.-№8.-С.27-31.

23. Лужецкий А.Н., Осташ Б.Е., Федоренко В.А. Межродовая конъюгация Escherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 c использованием интегративной плазмиды pSET152 // Генетика.-2001.-Т.37,№10.-С.1340-1347.

24. Ostash B., Basiliya L., Gromyko O., Rebets Yu., Fedorenko V. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin biosynthesis // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.-Вип.27.-C.106-112.

25. Pankevych K., Kruegel H., Fedorenko V. Cloning and sequencing of a putative positive transcription regulator gene of landomycin biosynthetic cluster of Streptomyces globisporus 1912 // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2001.- Вип.27.-С.97-105.

26. Ostash B., Luzhetskyy A., Gromyko O., Fedorenko V. Transfer of plasmid from Escherichia coli to mutant strain Streptomyces globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. вісн. Ужгород. ун-ту. Сер.біол.-2001.-№10.-С.147-149.

27. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952, cтійких до антрациклінових антибіотиків Мікробіол.журн.- 2001.-Т.63,№4.-С.53-61.

28. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Мар'їна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.-К.:Логос,2001.-Т.1.-С.469-476.

29. Федоренко В.О., Заворотна С.А., Голець Л.М., Настасяк І.М., Мар'їна О.В., Басілія Л.І., Кириченко Н.В., Демидчук Ю.О. Механізми генетичної нестабільності ознак актиноміцетів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. У 4 т. / Редкол.: В.В.Моргун (головн. ред.) та ін.- К.:Логос, 2001.-Т.1.-С.462-468.

30. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2, cтійких до хлорамфеніколу // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.28.-С.105-113.

31. Дубицька Л.П., Федоренко В.О. Конструювання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеною здатністю перетворювати даунорубіцин в доксорубіцин // Біополімери і клітина-2002.-Т.18,№2.-С.91-95.

32. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechthold A., Fedorenko V. Gene cloning system for Streptomyces cyanogenus S136 // Вісн. Львів.ун-ту.Сер.біол.-2002.-Вип.29.-С.62-68.

33. Дубицкая Л.П., Федоренко В.А. Влияние глюкозы на антиботическую активность и резистентность к антибиотикам у Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 и его мутантов // Антибиот. и химиотер. - 2002. - Т.47,№6.-С.7-11.

34. Cидоров Ю.І., Федоренко В.О., Громико О.М., Новіков В.П., Влязло Р.Й., Верес.Р.М. Розрахункова модель виробництва протипухлинного антибіотика “Ландоміцин Е” // Вісн. Націонал. ун-ту “Львівська політехніка”. Хімія, технологія речовин та їх застосування. - 2002.-№461.-С.204-208.

35. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Hoffmeister D., Brana A., Salas J.A., Bechtold A., V.Fedorenko. Production of landomycins in Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Let.-2003.-Vol. 222, Is.1. -P.149 - 153.

36. Ostash B., Rebets Y., Yuskevich V., Luzhetskyy A., Tkachenko V., V.Fedorenko. Targeted disruption of Streptomyces globisporus lndF and lndL cyclase genes involved in landomycin E biosynthesis // Folia Microbiol.-2003.-Vol.48.-P.484-488.

37. Ostash B., Rebets Yu., Samborskyy M., Salas J.A., Fedorenko V. Sequencing and analysis of putative 3D-4H ring cyclase gene lndF of Streptomyces globisporus 1912 landomycin E biosynthetic gene cluster // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.32.-C.84-91.

38. Rebets Yu., Ostash B., Gromyko O., Mik U., Basiliya L., Fedorenko V. Resistance of recombinant Streptomyces albus CEST 114 and Streptomyces globisporus strains to landomycin E // Вісн. Львів. ун-ту. Сер.біол.-2003.-Вип.33.-C.47-54.

39. Громико О.,Басілія Л.,Федоренко В. Вплив мутагенів на антибіотичну активність Streptomyces globisporus 1912 - продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е // Наук.вісн. Львів. держ. акад. вет. мед.-2003.- Т.5, (№2).-Ч.3. - С.45-52.

40. Ostash B., Rix U., Remsing Rix L.L., Tao Liu, Lombo F., Luzhetskyy A., Gromyko O., Wang C., Brana A.F., Mendez C., Salas J.A., Fedorenko V., Rohr J. Generation of novel landomycins by combinatorial biosynthetic manipulation of the lndGT4 gene of the landopmycin E cluster in S.globisporus // Chemistry and Biology-2004.-Vol.11.-N.4.-P.547-555.

41. Gromyko O., Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Fukuchara M., Bechthold A., Nakamura T., Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it's initial characterization // J.Antibiot.-2004.-Vol.57.-N.6-P.383-389.

42. Cпосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subsp.caesius ATCC27952-2 з підвищеним біосинтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин. Патент UA50047A, МПК7C12N13/03 / Федоренко В.О., Дубицька Л.П. - Заявл.16.03.200; Опубл.15.10.2002.-Бюл.№10. - 10 с.

43. Спосіб отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Федоренко В.О., Ребець Ю.В., Осташ Б.О., Лужецький А.М. - Заявл. 24.01.2003; Опубл.15.12.2003.- Бюл.№12. - 10 с.

44. Штам актиноміцетів Streptomyces globisporus Smy622 - продуцент протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Патент UA62200A, МПК7C12N15/00 / Громико О.М., Федоренко В.О., Басілія Л.І. - Заявл. 3.06. 2003; Опубл. 15.04.2004.-Бюл.№4.-4 с.

45. Zavorotna S., Fedorenko V. The pSE201 plasmid of Saccharopolyspora erythraea. // Abstr. 7th Int. Symp. Genet. Ind. Microorg., Montreal, June 26-July 1, 1994 - P.252.

46. Golec L., Basiliya L., Mazepa A., Kirichenko N., Esypov S., Fedorenko V. Identification of genes controlling the kanamycin biosynthesis in Streptomyces kanamyceticus // Abstr. VAAM Workshop “Biologie der Actinomyceten”, Mьnster, Sept.24-26, 1995.-P.30.

47. Golec L., Sambir M., Mazepa A., Fedorenko V. Genetic recombination during protoplast fusion Streptomyces kanamyceticus // Abstr. 10th Int. Symp. Biol. Actinom., Bejing, May 27-30, 1997.-10P1.

48. Luzhetskyy A., Fedoryshyn M., Hoffmeister D., Bechtold A., Fedorenko V. Conjugal transfer of plasmid DNA from Esherichia coli to Streptomyces kanamyceticus: effects of chromosomal insertions on kanamycin production // Abstr. VAAM Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten”, Freiburg, Sept.29-Oct.1, 2003.-V3.

49. Ostash B., Luzhetskyy A.,Yuskevich V., Hrek M., Salas J.A., Bechtold A., Rohr J., Fedorenko V. Generation of novel landomycin through genetic engineering // Abstr. Int. Weigl Conf. “Microorganisms in pathogenesis and their drug resistance”, Lviv, Sept.11-14, 2003.-P.126.

АНОТАЦІЇ

Федоренко В.О. Генетичний контроль стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його роль у біосинтезі антибіотиків. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.15.- генетика. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2004.

У дисертації вивчено закономірності генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та вплив генетичних детермінантів антибіотикорезистентності на біосинтез полікетидних антибіотиків еритроміцину в Sacch. erythraea, спіраміцину в S. ambofaciens, даунорубіцину та доксорубіцину в S. peucetius subsp.caesius, а також аміноглікозидного антибіотика канаміцину в S. kanamyceticus. У досліджених штамів відбуваються спонтанні та індуковані мутагенами множинні зміни ознак резистентності до антибіотиків. Показано, що мутанти Sacch. erythraea, стійкі до рифампіцину, хлорамфеніколу, тіострептону та стрептоміцину, мутанти S. peucetius subsp.сaesius, стійкі до даунорубіцину та доксорубіцину, а також мутанти S. kanamyceticus, стійкі до аміноглікозидів, перспективні для селекції штамів з підвищеним синтезом антибіотиків. З бібліотеки генома продуцента ландоміцину Е S. globisporus 1912, клоновано та секвеновано кластер генів біосинтезу цього антибіотика. У ньому виявлено 30 генів та визначено ймовірні функції 28 з них. Ідентифіковано п'ять класів мутацій генів, що контролюють утворення канаміцину в S. kanamyceticus. Клоновано та секвеновано ген kmrB, що кодує метилазу 16S рРНК та зумовлює стійкість S. kanamyceticus до канаміцину, гентаміцину, сизоміцину та тобраміцину. Опрацьовано системи клонування генів у штамах S. kanamyceticus та S. globisporus за допомогою кон'югаційного перенесення плазмід з E. coli та розоблено генетичні та генно-інженерні підходи до створення штамів, які здатні до підвищеного синтезу еритроміцину, ефективної трансформації даунорубіцину в доксорубіцин та продукції нових ландоміцинів H, F та G.

Ключові слова: Streptomyces, Saccharopolyspora, антибіотики, еритроміцин, канаміцин, спіраміцин, даунорубіцин, доксорубіцин, ландоміцин, стійкість до антибіотиків.

Федоренко В.А. Генетический контроль устойчивсти актиномицетов к антибиотикам и его роль в биосинтезе антибиотиков. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.15.- генетика. Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2004.

В диссертации изучены закономерности генетического контроля устойчивости актиномицетов к антибиотикам и влияние генетических детерминантов антибиотикорезистентности на биосинтез поликетидных антибиотиков эритромицина у Sacch. erythraea, спирамицина у S. ambofaciens, даунорубицина и доксорубицина у S. peucetius subsp.caesius, а также аминогликозидного антибиотика канамицина у S. kanamyceticus. У исследованных штаммов происходят спонтанные и индуцированные мутагенами множественные изменения признаков резистентности к антибиотикам. Показано, что мутанты Sacch. erythraea, устойчивые к рифампицину, хлорамфениколу, тиострептону и стрептомицину, мутанты S. peucetius subsp.сaesius, устойчивые к даунорубицину и доксорубицину, а также мутанты S. kanamyceticus, резистентные к аминогликозидам, перспективны для селекции штаммов с повышенным синтезом антибиотиков. Из библиотеки генома продуцента ландомицина Е S. globisporus 1912 клонирован и секвенирован кластер генов биосинтеза этого антибиотика. В нем обнаружены 30 генов и определены вероятные функции 28 из них. Идентифицированы пять классов мутаций генов, контролирующих продукцию канамицина у S. kanamyceticus. Клонирован та секвенирован ген kmrB, кодирующий метилазу 16S рРНК и определяющий устойчивость S. kanamyceticus к канамицину, гентамицину, сизомицину и тобрамицину. Разработаны системы клонирования генов в штаммах S. kanamyceticus и S. globisporus с помощью конъюгационного переноса плазмид из E. coli, а также генетические и генно-инженерные походы к созданию штаммов, способных к повышенному синтезу эритромицина, эффективной трансформации даунорубицина в доксорубицин, а также продукции новых ландомицинов H, F и G.

Ключевые слова: Streptomyces, Saccharopolyspora, антибиотики, эритромицин, канамицин, спирамицин, даунорубицин, доксорубицин, ландомицин, устойчивость к антибиотикам.

Fedorenko V. O. Genetic control of actinomycete resistance to antibiotics and its role in the biosynthesis of antibiotics. - Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree on speciality 03.00.15 - Genetics. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2004.

The mechanisms underlying the genetic control of actinomycete resistance to antibiotics have been investigated together with the roles of the genetic determinants of antibiotic resistance in the biosynthesis of the polyketide antibiotics erythromycin by Sacch. erythraea, spiramycin by S. ambofaciens, daunorubicin and doxorubicin by S. peucetius subsp. caesius as well as of the aminoglycoside antibiotic kanamycin by S. kanamyceticus. The spontaneous and mutagen-induced multiple changes of the antibiotic resistance traits were shown to occur in the studied strains. The amplification-capable DNA sequences have been found and characterized in the genome of S. coelicolor A3(2) and S. ambofaciens unstable mutants.

The genomic library of landomycin E producer S. globisporus 1912 has been constructed and the landomycin E biosynthesis gene cluster has been cloned and sequenced. 30 genes have been identified, with the putative functions assigned to 28 of them. The lndE, lndF, lndA, lndB, lndC, lndD, lndL, lndM, lndN, lndO, lndP, lndV, lndZ4, lndZ6, lndZ5 genes govern the biosynthesis of landomycine E polyketide moiety, lndG, lndH, lndQ, lndR, lndS, lndT, lndZ1, lndZ3 are responsible for the deoxysugars syntesis, lndGT2, lndGT1, lndGT4 - for sugar chain attachment to the aglycone structure; the lndJ gene is recognized as landomycin E resistance determinant, and lndI -- as regulatory gene for lnd-cluster.

The collection of S. kanamyceticus mutant strains with deficiencies for the different kanamycin biosynthesis stages has been created and studied. The five classes of mutations within genes controlling the kanamycin biosynthesis (kanA, kanB, kanC, kanD та kanG) have been identified in these mutants. The genetic recombination events following the S. kanamyceticus protoplasts fusion have been shown. The linkage of the kanB and kanD mutations with the erythromycin, gentamycin and rifampicin resistance mutations has been revealed.

The kmrB gene which codes for 16S rRNA methylase and conferrs the kanamycin, gentamycin, sisomycin and tobramycin resistance to S. kanamyceticus, has been cloned and sequenced. By means of the PFGE-analysis of the restriction macrofragments, the chromosome sizes of five S. kanamyceticus strains have been determined and fall in the range of 7715-8217 kb. The nucleotide sequence rearrangements as well as kmrB gene amplifications have been found in the genomes of the unstable Kan--mutant kan12 and gentamycin-resistant mutants genR8 and genR10.

The gene cloning system for S. kanamyceticus and S. globisporus strains based on the conjugative plasmid transfer from E. coli has been developed. This system has been shown to work effectively for the targeted lnd-genes disruption in S. globisporus.

The rifampicin, chloramphenicol, thiostrepton and streptomycin resistant Sacch. erythraea mutant strains, as well as daunorubicin and doxorubicin resistant S. peucetius subsp. сaesius mutant strains appeared to be promising for the selection of the strains with an elevated antibiotic biosynthesis levels. The protoplast fusion and the selection of the recombinants simultaneously containing rif-, str- and tsr-mutations is an effective technique for Sacch. erythraea strains selection. It has been demonstrated that mutants with impaired glucose repression can be used in the selection of S. kanamyceticus and S. peucetius subsp. caesius. The cloning of dnrI and cpx genes in S. peucetius subsp. caesius makes possible the isolation of the strains owing an increased ability of daunorubicin to doxorubicin transformation. The lndGT4 gene knockout in landomycin E producer S. globisporus 1912 causes the appearance of novel landomycins F and G, and after the complementation of this deficiency -- the synthesis of landomycin G. The novel landomycins posess an altered antibacterial and antitumor properties.

Keywords: Streptomyces, Saccharopolyspora, antibiotics, erythromycin, kanamycin, spiramycin, daunorubicin, doxorubicin, landomycin, antibiotic resistance.

Размещено на Allbest.ur