Вплив оксиду азоту на властивості скорочувального апарату гладеньких м'язів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив оксиду азоту на властивості скорочувального апарату гладеньких м'язів

03.00.02. -- Біофізика

Андрухов Олег Якович

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: чл.-кор. НАН України, доктор медичних наук, професор САГАЧ Вадим Федорович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Завідувач відділом фізіології кровообігу

Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук Жолос Олександр Вікторович Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Провідний науковий співробітник відділу нервово-м'язової фізіології

Доктор медичних наук, професор Соловйов Анатолій Іванович Центр доклінічного вивчення лікарських засобів Фармакологічного комітету МОЗ України, Директор Центру

Додатковий опонент: Доктор біологічних наук, професор Мірошниченко Микола Степанович Київський Національний університет імені Тараса Шевченка Завідувач кафедрою біофізики Біологічного факультету

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця МОЗ України, кафедра нормальної фізіології, м. Київ

Захист відбудеться 19.03.2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024 , м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024 , м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 18.02.2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

АНОТАЦІЯ

оксид азот скорочувальний м'яз

Андрухов Олег Якович. Вплив оксиду азоту на властивості скорочувального апарату гладеньких м'язів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02. - Біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. - Київ, 2000 р.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу оксиду азоту на скорочувальний апарат гладеньких м'язів (ГМ). Використовуючи експериментальну модель скінованих препаратів встановлено, що оксид азоту призводить до зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+, що може бути одним з механізмів його дилататорного ефекту в ГМ. Цей механізм не пов'язаний з активацією розчинної гуанілатциклази, а обумовлений прямим впливом оксиду азоту на скорочувальні білки. Такий ефект є більш специфічним для ГМ, порівняно з серцевим м'язом, і обумовлений, головним чином, порушенням взаємодії між актином та міозином. Показано, що сульфогідрильні групи скорочувальних білків є суттєвими у регуляції скорочувальної активності ГМ. Зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+ обумовлено взаємодією оксиду азоту з сульфогідрильними групами скорочувальних білків. Крім того, показано, що оксид азоту викликає зміни ферментативної активності очищених скорочувальних білків ГМ: міозину та актоміозину. Такі зміни подібні до тих, що відбуваються при модифікації критичних сульфогідрильних груп міозину, що свідчить про можливість релізації ефекту оксиду азоту внаслідок його взаємодії з сульфогідрильними групами міозину.

Ключові слова: гладенькі м'язи, оксид азоту, скорочувальна активність, сульфогідрильні групи, скіновані препарати, міозин.

АННОТАЦИЯ

Андрухов Олег Яковлевич. Влияние оксида азота на свойства сократительного аппарата гладких мышц - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02. - Биофизика. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины.-Киев, 2001 г.

Диссертация посвящена исследованию влияния оксида азота на сократительный аппарат гладких мышц (ГМ). В работе было исследовано влияние оксида азота на сократительную активность изолированных интактных и скинированных мышечных препаратов, а также его влияние на ферментативную активность очищенных сократительных белков гладких мышц. Полученные данные позволяют расширить сущесвующие представления о механизме влияния оксида азота на сократительную активность гладких мышц. В опытах на интактных препаратах ГМ показано, что в реализации дилататорного эффекта оксида азота как эндогенного, так и экзогенного происхождения, задействованы как цГМФ-зависимые, так и цГМФ-независимые механизмы. Для исследования влияния оксида азота на сократительный аппарат ГМ использовалась экспериментальная модель скинированных препаратов. В таких препаратах отсутствуют мембранные механизмы регуляции Са2+, и его концентрация определяется только его содержанием в окружающем растворе. Сократительная активность таких препаратов определяется главным образом свойствами сократительного аппарата, и, в частности, его чувствительностью к Са2+. Используя данную экспериментальную модель установлено, что оксид азота приводит к уменьшению амплитуды сокращения таких препаратов. Такое действие оксида азота можна объяснить уменьшением чувствительности сократительного аппарата ГМ к Са2+, что может быть одним из механизмов его дилататорного эффекта в ГМ. Величина дилататорного эффекта оксида азота в скинированных препаратов гладких мышц не изменяется в присутствии блокатора растворимой гуанилатциклазы метиленового синего. Полученные данные говорят о том, что данный эффект оксида азота не опосредован классическим цГМФзависимым механизмом, а обусловлен прямым влиянием на сократительный аппарат. Данные о том, что величина описанного эффекта оксида азота является практически одинаковой как при максимальной, так и при немаксимальной активации сократительного аппарата, а также то, что он не вызывает изменения сродства сократительного аппарата гладких мышц к Са2+ говорят о том, что данный эффект оксида азота скорее всего обусловлено нарушением взаимодействия между актином и миозином. Сравнительное исследование влияния оксида азота на сократительную активность скинированных препаратов мышц с разными типами регуляции показало, что уменьшение чувствительности сократительного аппарата к Са2+ под влиянием оксида азота является более существенным в мышечных препаратах с миозинзависимой регуляцией сократительной активности, чем в препаратах с актинзависимой регуляцией. Показано, что сульфгидрильные группы сократительных белков ГМ являются существенными в регуляции сократительной активности ГМ. Модификация этих групп при помощи специфического реагента N-этилмалеинимида, или их восстановление дитиотриэтолом приводят к уменьшению чуствительности сократительного аппарата к Са2+. Исследование суммарного влияния дитиотриэтола и донора оксида азота нитропруссида натрия на сократительную активность скинированных препаратов показало, что их дилататорные эффекты не суммируются между собой. После действия одного из этих веществ, величина эффекта другого незначительна. Полученные данные позволяют сделать вывод, что оксид азота вызывает уменьшение чувствительности сократительного аппарата ГМ к Са2+ вследствие взаимодействия с сульфгидрильными групами сократительных белков. Показано, что оксид азота вызывает изменения ферментативной активности актомиозина гладких мышц. Такие изменения по характеру аналогичны тем, что возникают при действии модификатора сульфгидрильных групп N-этилмалеинимида. Оксид азота также приводил к изменениям АТФазной активности миозина гладких мышц, и в частности, увеличению Са2+-АТФазной активности и уменьшению К+-ЭДТА-АТФазной активности. Такие изменения идентичны тем, которые характерны для модификации критических сульфгидрильных групп миозина. Полученные данные свидетельствует о том, что изменение ферментативной активности сократительных белков гладких мышц под влиянием оксида азота реализуется путем его взаимодействия с сульфгидрильными группами миозина.

Ключевые слова: гладкие мышцы, оксид азота, сократительная активность, сульфгидрильные группы, скинированные препараты, миозин.

ANNOTATION

Andruchov Oleg Yakovlevich. The effect of nitric oxide on the properties of smooth muscle contractile apparatus - Manuscript.

Thesis for the candidate's degree by speciality - 03.00.02 - Biophysics. - Bogomolets Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The dissertation deals with an exploration of the effect of nitric oxide (NO) on smooth muscle (SM) contractile activity. Using an experimental model of skinned preparation, it has been established that nitric oxide decreased the force sensitivity of SM contractile apparatus to Ca2+. This effect does not result from activation of soluble guanylyl cyclase, but it is due to the direct effect of nitric oxide on the contractile proteins. It is more pronounced in smooth muscle as compared to other types of muscle, and is realized mainly through the impairment of actin-myosin interaction. It has also been shown that sulfhydryl groups of contractile proteins in smooth muscle are essential for their contractile activity. Decreasing the force sensitivity of SM contractile apparatus to Ca2+ is due to NO interaction with critical sulfhydryl groups of the smooth muscle contractile proteins. Nitric oxide has been shown to cause changes of enzymatic activity of the isolated smooth muscle contractile proteins, myosin and actomyosin. Such changes are similar to those occurring at modificating myosin sulfhydryl groups, suggesting that the direct effect of nitric oxide be realized through myosin sulfhydryl groups.

Key words: smooth muscle, nitric oxide, contractile activity, sulfhydryl groups, skinned preparation, myosin.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми дисертаційного дослідження. Одним із найбільш значних досягнень фізіологічної науки другої половини ХХ-го сторіччя є відкриття ключової ролі ендотелію в регуляції судинного тонусу та серцевої діяльності. В 1980 році був відкритий так званий ендотеліальний фактор розслаблення - одна із багатьох речовин, що синтезуються ендотелієм [Furchgotte & Zawadski, 1980]. В 1987 році цей фактор був ідентифікований як оксид азоту (NO), який синтезується з L-аргініну Са2+-залежним ферментом ендотеліальною NO-синтазою [Ignarro et al., 1987]. Подальші дослідження показали, що роль NO не обмежується лише впливом на серцево-судинну систему. Було показано, що оксид азоту відіграє роль унікального міжклітинного посередника в різноманітних фізіологічних та патологічних процесах [Moncada, 1991]. Він бере участь в регуляції діяльності серцево-судинної та імунної систем [Sagach & Tkachenko, 1991, Сагач & Ткаченко, 1994, Мойбенко та ін., 1997], виконує роль нейротрансміттера в центральній та периферичній нервових системах [Gartwaite et al., 1988]. Було також показано, що NO може синтезуватись не лише ендотеліальними клітинами. Ізоформи NO синтази знайдено в багатьох типах клітин, зокрема, в скелетних м`язах, судинних гладеньких м'язах (ГМ), міокарді, клітинах печінки [Griffith & Stuehr 1995]. Крім того, було також показано існування механізмів нітрит- та нітратредукції [Реутов, 1997]. Такий широкий спектр ефектів оксиду азоту пов'язаний з його унікальними фізико-хімічними властивостями. Як одна з найменших за розміром біологічно активних речовин, NO може легко дифундувати крізь клітинні мембрани. В біологічних системах No може вступати в хімічні реакції з киснем, супероксид-аніоном, гемовим залізом, сульфогідрильними групами [Stamler, 1994]. Таким чином, білки, що містять гем або мають критичні сульфогідрильні групи, є потенційними мішенями для NO. Відомо, що NO викликає розслаблення судинних ГМ, проте механізми такого впливу вивчені недостатньо. Основним механізмом розслаблюючого впливу NO в ГМ вважають його взаємодію з цитозольним ферментом гуанілатциклазою, що призводить до її активації, зростання внутрішньоклітинного рівня циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ) та активації специфічного ферменту цГМФ-залежної протеїнкінази (G-кінази) [Lincoln, 1996]. Активована G-кіназа може фосфорилювати цілий ряд білків, що в кінцевому результаті призводить до зниження [Са2+]і та до зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+. Проте цГМФ-залежний механізм дії NO не є єдиним. Так, NO може викликати розслаблення ГМ навіть за умови блокади активності розчинної гуанілатциклази та відсутності зростання рівня цГМФ. Такий ефект можна пояснить безпосередньою взаємодією NO з Са2+-залежними калієвими каналами [Bolotina, 1994]. Донори оксиду азоту також можуть викликати розслаблення в м'язових препаратах тварин з відсутнім геном G-кінази та за умов блокади Са2+-залежних калієвих каналів [Pfeifer et al., 1998]. Оксид азоту може викликати розслаблення ГМ не змінюючи концентрації Са2+ в клітині та ступеня фосфорилювання міозину [McDaniel, 1992], що свідчить про порушення взаємодії між актином та міозином. Такий факт говорить про наявність інших механізмів впливу оксиду азоту на ГМ. Нещодавно було показано існування прямого впливу оксиду азоту на скорочувальні білки в скелетних м?язах, де донори NO викликали дозозалежне зменшення амплітуди скорочення скінованих препаратів скелетних м?язів, яке супроводжувалось одночасним зменшенням гідролізу АТФ цими препаратами [Galler, 1997]. Такий ефект оксиду азоту автори пояснюють його взаємодією з критичними сульфогідрильними групами міозину. Схожий ефект був знайдений і в інтактних препаратах скелетних м?язів, де донори оксиду азоту спричиняли зменшення амплітуди тетанічного скорочення, не змінюючи при цьому внутрішньоклітинний рівень Са2+ [Andrade, 1998]. Та обставина, що міозин ГМ також має критичні сульфогідрильні групи, модифікація яких призводить до зміни його ферментативної та моторної властивостей [Koijma, 1999], робить його однією з потенційних мішеней для дії оксиду азоту. З таким механізмом можуть бути пов`язані зміни чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+, що спостерігаються при дії різних нітровазодилататорів [Chen & Rembold, 1996]. Проте такий механізм впливу NO на скорочувальну активність ГМ до теперішнього часу вивчений недостатньо.

Зв'язок теми дослідження з планом основних наукових робіт Інституту: Дисертаційна робота виконана згідно плану навчання в аспірантурі. Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої Ради Інституту (протокол №2 від 20.02.1997).

Мета роботи: Метою даної роботи було дослідити вплив оксиду азоту на скорочувальний апарат гладеньких м'язів та пов'язані з цим зміни їх скорочувальної активності.

Задачі дослідження:

1. Дослідити та охарактеризувати вплив донорів оксиду азоту на чутливість скорочувального апарату гладеньких м`язів до Са2+.

2. Порівняти ефект оксиду азоту на скорочувальний апарат гладеньких м'язів та серцевого м'язу.

3. Вивчити вплив оксиду азоту на ферментативну активність очищених скорочувальних білків гладеньких м`язів.

4. Дослідити роль сульфогідрильних груп скорочувальних білків у реалізації впливу оксиду азоту на чутливість скорочувального апарату гладеньких м`язів до Са2+.

Наукова новизна роботи. Вперше досліджено прямий ефект оксиду азоту на основні скорочувальні білки гладеньких м?язів. Показано, що оксид азоту викликає зменшення чутливості скорочувального апарату судинних гладеньких м?язів до Са2+, що може бути одним з механізмів його розслаблюючої дії в ГМ. Такий ефект оксиду азоту пов`язаний з його впливом на скорочувальні білки, і є більш характерним для ГМ, ніж для серцевого м'язу. Встановлено, що цей ефект NO не пов?язаний з класичним цГМФ-залежним механізмом, а обумовлений взаємодією оксиду азоту з критичними сульфогідрильними групами скорочувальних білків. Встановлено, що як модифікація, так і відновлення сульфогідрильних груп скорочувального апарату пригнічують скорочувальну активність ГМ. Досліджено вплив оксиду азоту на ферментативну активність міозину та актоміозинового комплексу ГМ. Показано, що зміни цієї активності під впливом NO подібні за характером до тих, що спостерігаються при модифікації критичних сульфогідрильних груп міозину.

Теоретична та практична цінність роботи. Отримані результати розширюють існуючі уявлення про механізми впливу оксиду азоту на скорочувальну активність гладеньких м?язів. Показано, що, крім класичного цГМФ-залежного механізму існує і інший механізм розслаблюючого впливу NO на ГМ, пов'язаний з безпосередньою взаємодією оксиду азоту із скорочувальним апаратом ГМ. Показано, що сульфогідрильні групи скорочувального апарату є критичними у регуляції скорочувальної активності ГМ, і розслаблююча дія оксиду азоту в гладеньких м'язах може реалізовуватись шляхом його взаємодії з цими групами. Результати роботи є додатковим теоретичним обгрунтуванням доцільності використання донорів NO в клінічній практиці.

Особистий внесок пошукувача. Автор самостійно вивчав вплив NO на скорочувальну активність скінованих сапоніном ізольованих препаратів судинних ГМ, самостійно проводив експериментальну лабораторну обробку матеріалу, статистичну обробку, аналіз та узагальнення результатів дослідження. Біохімічні дослідження ферментативної активності очищених скорочувальних білків гладеньких м'язів проводились у співробітництві з відділом біофізики науково-дослідного Інституту фізіології імені академіка Петра Богача Київського національного Університету імені Тараса Шевченка (зав. відділом к.б.н. В.М. Данилова).

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи були представлені та обговорені на семінарах відділу фізіології кровообігу Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України ; на міжнародній школі-семінарі “Мембрани та сигнали” (Київ, 2000); міжнародній конференції, присвяченій 75-річчю з дня народження А.М.Угольова “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, 2001); міжгалузевій конференції молодих вчених з проблем загальної біохімії та біотехнології (Київ, 2001); засіданні сектору фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України; науковій конференції фізіологів України, присвяченій 160-річчю Національного медичного університету (Київ, 2001); Всеукраїнській науковій конференції “Актуальні проблеми гастроентерології” (Київ, 2001).

Публікації. За результатами проведеного дослідження опубліковано 7 наукових праць, в тому числі 3 статті у фахових виданнях та тези 4 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел з 269 найменувань. Роботу викладено на 160 сторінках та ілюстровано 37 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Матеріали та методи досліджень

Реєстрація скорочувальної активності інтактних м'язових препаратів Експерименти по вивченню скорочувальної активності проводили на судинних препаратах ворітної вени та аорти, а також препаратах папілярного м'язу щурів лінії Вістар-Кіото, 6-8 місяців та вагою 250-300 г. Після декапітації та розтину черевної порожнини на два кінці ворітної вени накладали лігатуру та виділяли її. Після цього, вену препарували, очищаючи її від з?єднувальної тканини, та розрізали на 2-3 повздовжні сегменти довжиною 4-5 мм та шириною 0,5-1,0 мм. В необхідних випадках перед початком експерименту препарат деендотелізували легким прокатуванням на фільтрувальному папері. М'язовий препарат поміщали в камеру об?ємом 1,5 мл., що була виготовлена з хімічно неактивного плексигласу. В камері препарат кріпився в горизонтальному положенні до двох гачків, один з яких був сполучений з механоелектричним перетворювачем 6МХ-1С, а другий кріпився через блок до вантажу, за допомогою якого розтягується смужка, та фіксувався. Препарати ворітної вени розтягували з силою 4-8 мН та залишали для стабілізації режиму роботи на 30-40 хв. Камеру перфузували з швидкістю 2-3 мл за хвилину стандартним розчином Кребса наступного складу: 133 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 16,3 мМ NaHCO3, 1,38 мМ NaH2PO4, 1,05 мМ MgCl2, 12 мМ глюкоза, 2,5 мМ CaCl2, pH - 7,4. Після розтину грудної порожнини виділяли грудний сегмент аорти довжиною 4-5 см. Аорту препарували та розрізали на кільцеві препарати товщиною від 0,5 до 1,5 мм. Препарати аорти різали під кутом 45? до повздовжньої осі судини. Як і в випадку ворітної вени, препарати поміщали в камеру, розтягували з силою 15-25 мН та перфузували розчином Кребса. Період стабілізації для аорти був більший, ніж для ворітної вени і становив 1-1,5 год. Папілярний м`яз вирізали із лівого шлуночка серця. Препарати довжиною 4-6 мм поміщали в камеру, яку перфузували розчином Кребса та розтягували з силою 1-1,2 мН.

Електричний сигнал з виходу механоелектричного перетворювача реєстрували за допомогою записуючого пристрою КСП-4. Реєстрацію скорочувальної активності здійснювали у режимі, наближеному до ізометричного. Амплітуду скорочення оцінювали як відношення абсолютної сили скорочення до маси препарату.

Реєстрація скорочувальної активності скінованих м'язових препаратів. Для скінування м'язових препаратів використовувався сапонін - речовина, що належить до класу глікозидів. Після поміщення препарату в робочу камеру та стабілізації режиму його роботи камеру перфузували релаксуючим розчином наступного складу: 130 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 3,3 мМ АТФ, 4 мМ ЕГТА, 20 мМ трис, рН-6,8. Після стабілізації режиму роботи препарату, мірою якого був стабільний базальний рівень, до перфузату додавали сапонін. Після дії сапоніну його вимивали з камери, перфузуючи її релаксуючим розчином. Скорочення скінованих препаратів відтворювали, підвищуючи концентрацію Са2+ в перфузаті до рівня від 10-7 до 10-4 М. Концентрацію вільного Са2+ вираховували за допомогою комп?ютерної програми, написаної за алгоритмом, запропонованим Fabiato [Fabiato & Fabiato, 1979]. Критерій, за яким відбиралися препарати для подальшої роботи був наступним: амплітуда максимального скорочення скінованих препаратів має бути не меншою ніж 30 % від амплітуди скорочення інтактного препарату у відповідь на гіперкалієвий розчин (100 мМ KCl). Наближеними до оптимальних умов скінування були наступні умови: концентрація сапоніну - 0,08-0,1 мг/мл для ворітної вени і папілярного м`язу, та 0,12-0,15 мг/мл для аорти, а тривалість обробки сапоніном препаратів - 20 хв. для ворітної вени, 25 хв. для папілярного м`язу та 25-30 хв. для аорти при температурі 22-24 ?С. Амплітуду скорочення скінованих м'язових препаратів оцінювали аналогічно, як і в випадку інтактних препаратів.

Визначення АТФазної активності актоміозину та міозину ГМ: Скорочувальні білки актоміозин та міозин виділяли з препарату міофібрил ГМ шлунку свині за методикою, розробленою Собешеком [Sobieszek, 1994]. Електрофорез в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію проводили за методикою, описаною Лемлі [Laemmli, 1970].

АТФазну активність актоміозину та Mg2+-АТФазну активність міозину визначали у буфері наступного складу: 90 мМ KCl, 2,5 мМ MgCl2, 100 мкМ СаCl2, 20 мМ імідазол, рН 7,0. Визначення Са2+-АТФазної активності міозину проводили у буфері наступного складу: 600 мМ KCl, 5 мМ СаCl2, 20 мМ імідазол, рН 7,0. К+-ЕДТА-АТФазну активність міозину визначали у буфері наступного складу: 600 мМ KCl, 1 мМ ЕДТА, 20 мМ імідазол, рН 7,0. Концентрація актоміозину у пробі становила 0,28 мг/мл, міозину - 0,14 мг/мл. Реакцію запускали додаючи до суміші АТФ, концентрація якого у пробі становила 1 мМ, а зупиняли, додаючи до проби трихлороцтову кислоту, в такій кількості, що її кінцевий вміст в пробі становив 4 %. АТФазну активність оцінювали за кількістю неорганічного фосфату, що гідролізується 1 мг білку за одиницю часу. Кількість неорганічного фосфату визначали за методом, описаним Фіске-Суббароу [Fiske & Subbarow, 1925].

Результати досліджень.

Вплив оксиду азоту на скорочувальну активність інтактних препаратів ворітної вени та аорти щура. Додавання до перфузату донору оксиду азоту нітропрусиду натрію (НН) призводило до зміни скорочувальної активності деендотелізованих препаратів ворітної вени, причому змінювались як частота, так і амплітуда фазних скорочень. Зменшення амплітуди становило 17,3±3,8 % (n=5, Р<0,05) при 10-5 М НН та 31,6±5,2 % (n=5, Р<0,01) при 10-4 М НН. Частота скорочень зменшувалась на 19,4±3,2 % (n=5, Р<0,05) при 10-5 М НН та 30,9±6,1 % (n=5, Р<0,01) при 10-4 М НН. Вивчення впливу НН на скорочувальну активність препаратів ворітної вени за умов блокади розчинної гуанілатциклази метиленовим синім (50 мкМ) показало, що ефекти НН за цих умов повністю не виключались: частота скорочень практично не змінювалась, але амплітуда зменшувалась на 23,4±4,9% (n=5, Р<0,05) при 10-5 М НН та 42,9±5,7% (n=5, Р<0,01) при 10-4 М НН. Отримані дані показують, що оксид азоту змінює скорочувальну активність інтактних препаратів ворітної вени. Інгібування розчинної гуанілатциклази не усуває в повній мірі ефект НН, що свідчить про участь як цГМФ-залежних, так і цГМФ-незалежних механізмів у реалізації розслаблювального впливу оксиду азоту.

В наступній серії експериментів ми досліджували механізми дії оксиду азоту, що виділяється ендотелієм, на скорочувальну активність ізольованих препаратів аорти щура. Скорочення викликали, перфузуючи камеру гіперкалієвим розчином (100 мМ KCl), а після досягнення фази плато до перфузату додавали ацетилхолін (10-6 М), що призводило до розслаблення препаратів аорти внаслідок синтезу NO ендотеліальними клітинами. Величина цього розслаблення становила 51,4±5,9% (n=6, Р<0,01) від початкової амплітуди скорочення. За аналогічною схемою було проведено дослідження впливу NO, що синтезується ендотелієм, на скорочувальну активність препаратів аорти за умов блокади розчинної гуанілатциклази метиленовим синім (50 мкМ). В цьому випадку додавання до перфузату ацетилхоліну призводило до розслаблення, величина якого становила 24,2±6,3 % (n=6, Р<0,05) від початкової амплітуди скорочення. Як видно, блокада розчинної гуанілатциклази призводить до зменшення величини реакції на ацетилхолін, проте розслаблення повністю не усувається.

Дослідження впливу ендогенного оксиду азоту на скорочення, викликане норадреналіном показало, що в цьому випадку величина ендотелійзалежного розслаблення становила 67,5±6,3% (n=6, Р<0,01) від початкової амплітуди скорочення. За умов блокади розчинної фракції гуанілатциклази метиленовим синім амплітуда скорочення під впливом ендотеліального оксиду азоту зменшувалась на 39,1±5,4% (n=6, Р<0,01) від початкового рівня. Отримані дані дозволяють зробити висновок, що дилататорний ефект оксиду азоту як ендогенного, так і екзогенного походження реалізується як внаслідок активації розчинної фракції гуанілатциклази, так і через механізми, не пов'язані з її активацією.

Вплив донорів оксиду азоту на скорочувальну активність скінованих препаратів м`язів різних типів. Для дослідження впливу NO на скорочувальний апарат ГМ використовувалась експериментальна модель скінованих препаратів. Скорочувальна активність таких препаратів визначається головним чином властивостями скорочувального апарату, і, зокрема, його чутливістю до Са2+. В першій серії експериментів ми досліджували вплив НН на скорочувальну активність скінованих препаратів ворітної вени щура. Скорочення відтворювали, підвищуючи концентрацію Са2+ в перфузаті до 10-4 М, що викликало тонічне скорочення препаратів, з амплітудою 1,3-1,7 мН/мг. Додавання до перфузату НН в концентрації від 10-6 М до 10-4 М після досягнення фази плато скорочення призводило до дозозалежного зменшення амплітуди скорочення (рис. 1а). При концентрації НН 10-6 М зменшення амплітуди становило 13,5?6.2% (n=6, P<0.05), в концентрації 10-5 М - 31,6?7.1% (n=8, P<0.01), в концентрації 10-4 М - 54,2?7.9% (n=8, P<0.001), порівняно з амплітудою початкового скорочення. Зменшення амплітуди скорочення скінованих препаратів при сталій концентрації Са2+ вказує на те, що оксид азоту зменшує чутливість скорочувального апарату ГМ до Са2+. Величина ефекту нітропрусиду натрію не змінювалась в присутності інгібітору розчинної гуанілатциклази метиленового синього (50 мкМ), що вказує на те, що даний ефект NO не пов'язаний з активацією розчинної гуанілатциклази і не опосередковується класичним цГМФ-залежним механізмом.

Також було досліджено вплив іншого за хімічною природою донору оксиду азоту - нітрогліцерину - на скорочувальну активність скінованих препаратів ворітної вени. Як і НН, нітрогліцерин викликав дозозалежне зменшення амплітуди скорочення скінованих препаратів ворітної вени. При концентрації нітрогліцерину 10-6 М розслаблення становило 8,5?6.9% (n=5), при 10-5 М - 24,3?9.2 (n=8, P<0.01), а при 10-4 М - 41,5?7,2% (n=8, P<0.001). Як з'ясувалось, розслаблюючий ефект нітрогліцерину за амплітудою дещо менший за ефект нітропрусиду натрію, що, можливо, пояснюється вивільненням різних кількостей оксиду азоту цими донорами. Метиленовий синій (50 мкМ) також не змінював величини розслаблення при дії нітрогліцерину, і це дозволяє зробити висновок, що його ефект також не пов'язаний з активацією розчинної гуанілатциклази.

З метою встановлення, чи не є даний ефект NO специфічним лише для ворітної вени, нами був досліджений вплив НН на скорочувальну активність скінованих препаратів грудного відділу аорти щура. В скінованих препаратах аорти скорочення також викликали шляхом підвищення концентрації Са2+ в перфузаті до 10-4 М, що супроводжувалось тонічним скороченням. Амплітуда скорочення в препаратах аорти становила 1,3-1,5 мН/мг. Як і в випадку ворітної вени, додавання до перфузату НН в концентраціях від 10-6 М до 10-4 М викликало дозозалежне розслаблення, величина якого становила 16,3?4,2% (n=5) при 10-6 М НН, 37,7?5,1% (n=6) - при 10-5 М НН, в концентрації 51,5?5,9% (n=8) - 10-4 М НН (рис. 2а). Величина даного ефекту також не змінювалась в присутності метиленового синього (50 мкМ). Отримані дані показують, що ефект НН в скінованих препаратах ГМ не є специфічним лише для ворітної вени, а спостерігається і в судинах інших типів.

Особливістю ГМ є те, що в них існує міозинзалежна регуляція скорочення, тоді як в інших типах м'язів існує актинзалежна система регуляції. Наступною задачею нашої роботи стало порівняння впливу NO на скіновані препарати м'язів з різними типами регуляції, для чого нами було досліджено вплив НН на скорочувальну активність папілярного м'язу щура. В скінованих препаратах папілярного м`язу щура скорочення також викликали шляхом підвищення концентрації Са2+ в перфузаті до 10-4 М. Таке підвищення призводило до ізотонічного скорочення, амплітуда якого становила 1,1-1,4 мН/мг. Додавання НН до перфузату, як і в випадку ГМ, також викликало дозозалежне розслаблення (рис 2б). За своїми характеристиками дилататорний ефект НН в папілярному м'язі дещо відрізнявся від такого ефекту в ГМ. По-перше, мінімальна концентрація, при якій спостерігалось розслаблення, становила 10-5 М (в ГМ - 10-6 М). По-друге, величина розслаблення була значно меншою, ніж у випадку ГМ. При концентрації НН 10-5 М зменшення амплітуди становило 6,01,9% (n=5, P<0.05), в концентрації 10-4 М - 14,73,0% (n=5, P<0.05), в концентрації 10-3 М - 30,55.9% (n=5, P<0.01) відносно амплітуди скорочення при рСа 4,0. Ефект НН також не блокувався метиленовим синім (50 мкМ). Порівняльний ефект НН на скорочувальну активність скінованих препаратів м'язів різних типів зображено.

Розслаблення скінованих препаратів ГМ можна пояснити зменшенням чутливості скорочувального апарату до Са2+. Це може відбуватись як за рахунок зміни активності регуляторних ферментів - кінази та фосфатази легкого ланцюгу міозину, так і за рахунок порушення взаємодії між актином та міозином. Внесок кожного з цих механізмів в реалізацію впливу конкретного розслаблюючого агента на скорочувальну активність ГМ залежить від ступеня активації скорочення, і тому нами було досліджено вплив донора оксиду азоту нітропрусиду натрію на амплітуду скорочення скінованих препаратів ГМ ворітної вени при різних концентраціях Са2+, і було показано, що розслаблюючий ефект НН є практично однаковим як при максимальній активації (рСа 4,0), так і при субмаксимальній активації (рСа 5,8) скорочувального апарату.

Крім того, було досліджено вплив НН на співвідношення між [Са2+] та амплітудою скорочення як при його активації, так і при деактивації. В серії експериментів без нітропрусиду натрію було показано, що напівмаксимальна амплітуда скорочення при поступовому підвищенні концентрації Са2+ досягається при рСа 5,41±0,12 (n=5), а при поступовому зниженні концентрації Са2+ після максимального скорочення - при рСа 5,81±0,14 (n=5). В присутності нітропрусиду натрію ці показники становили 5,39±0,11 (n=5) та 5,83±0,14 (n=5) при поступовій активації скорочення та поступовому розслабленні, відповідно. Підсумовуючи отримані дані можна сказати, що величина розслаблення скінованих сапоніном препаратів під впливом оксиду азоту не залежить від ступеня активації. Оксид азоту практично не впливає на спорідненість скорочувального апарату ГМ до Са2+ ні при активації, яка визначається головним чином властивостями системи Са2+ - кальмодулін - кіназа легкого ланцюгу міозину, ні при деактивації скорочення, що визначається активністю фосфатази легкого ланцюгу міозину. Такий результат говорить про те, що зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+ під впливом оксиду азоту не пов'язане зі зміною його спорідненості до Са2+ внаслідок змін активності регуляторних ферментів, а скоріше за все обумовлений порушенням взаємодії між актиновими та міозиновими протофібрилами.

Вплив оксиду азоту на ферментативну активність скорочувальних білків ГМ. В попередньому розділі нами було продемонстровано, що оксид азоту зменшує чутливість скорочувального апарату ГМ до Са2+. Оскільки існує кореляція між механічними та біохімічними характеристиками ГМ, важливим уявлялось дослідження впливу оксиду азоту на ферментативну активність очищених скорочувальних білків ГМ. Міозин ГМ має сульфогідрильні групи, модифікація яких призводить до змін його АТФазної активності [Koijma, 1999].

В першій серії експериментів нами було досліджено вплив модифікації сульфогідрильних груп актоміозинового комплексу на його ферментативну активність. Для модифікації сульфогідрильних груп ми використовували N-етилмалеінімід - реагент, який неспецифічно алкілує SH-групи. В результаті нами було отримано, що вплив N-етилмалеініміду на ферментативну активність актоміозину ГМ має двофазний характер. Низькі концентрації цього реагенту (50 мкМ) викликали збільшення АТФазної активності актоміозину (на 32,8±3,4 %, n=7, P<0.05), а високі (500 мкМ) - суттєве зменшення АТФазної активності актоміозину (на 70,1±7,6 %, n=7, P<0.01). В другій серії експериментів нами досліджувався вплив донору оксиду азоту нітропрусиду натрію на АТФазну активність актоміозину, і було показано, що за своїм характером ефекти НН та N-етилмалеініміду подібні. В низьких концентраціях НН (0,5 мМ) підвищував АТФазну активність актоміозину на 37,1±4,5% (n=8, P<0.05), а більш високі його концентрації (5-10 мМ) призводили до суттєвого зменшення цієї активності (на 50,6±4,8 % при 10 мМ НН, n=8, P<0.01).

Відомо, що міозин характеризується різною АТФазною активністю, яка залежить від виду катіонів. Це так звані Mg2+-АТФазна активність, К+-ЕДТА-АТФазна активність та Са2+-АТФазна активність. Дві останні АТФази вважають індикатором стану SH-груп міозину, а Mg2+-АТФазна активність активується актином. Як відомо з літературних джерел, модифікація сульфогідрильних груп міозину ГМ супроводжується характерними змінами його ферментативної активності, і, зокрема, збільшенням Са2+-АТФазної активності та зменшенням К+-ЕДТА-АТФазної активності [Onishi, 1975]. Нами було досліджено вплив НН на всі три види АТФазної активності міозину, і в результаті були отримані дані, що НН збільшує Са2+-АТФазну активність (рис. 6а), на 23,9±2,3 % (n=6, P<0.05) при 5 мМ нітропрусиду натрію, та зменшує К+-ЕДТА-АТФазної активності (рис. 6б), на 19,8±2,1% (n=6, P<0.05) при 5 мМ нітропрусиду натрію. Наші дослідження показали, що характер змін цих двох АТФазних активностей міозину при дії нітропрусиду натрію подібний до тих, що виникають при модифікації сульффогідрильних груп міозину. Характер та величина ефекту НН на Mg2+-АТФазну активність міозину, яка активується актином, відрізнялися від його ж ефекту на АТФазну активність актоміозину. Нітропрусид натрію спричиняв лише зменшення Mg2+-АТФазної активності міозину, причому цей ефект був меншим, ніж для актоміозину (рис. 6в). Так, при 10 мМ нітропрусиду натрію Mg2+-АТФазна активність міозину зменшувалась на 31,2±5,7% (n=8, P<0.05).

Дослідження участі сульфогідрильних груп у реалізації прямого ефекту оксиду азоту на скорочувальний апарат ГМ. Скорочувальні білки ГМ мають критичні сульфогідрильні групи, модифікація яких призводить до зміни їх властивостей. В попередньому розділі нами було показано, що оксид азоту викликає зміни ферментативної активності очищених скорочувальних білків ГМ. Такий ефект оксиду азоту обумовлений його взаємодією з сульфогідрильними групами скорочувальних білків, зокрема міозину. Тому наступною задачею нашої роботи було дослідити, чи є сульфогідрильні групи скорочувальних білків ГМ критичними у регуляції скорочувальної активності ГМ, а також дослідити роль цих груп у зниженні чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+ під впливом No. В першу чергу нами було досліджено вплив N-етилмалеініміду на скорочувальну активність скінованих препаратів ГМ і було показано, що додавання цієї речовини в концентрації 5·10-4 М до перфузуючого розчину викликало суттєве зменшення амплітуди скорочення (рис. 7а). Отримані результати свідчать про те, що модифікація сульфогідрильних груп білків в скінованих препаратах ГМ призводить до майже повного пригнічення скорочувальної активності такими препаратами. Оскільки однією з властивостей оксиду азоту є його здатність взаємодіяти з сульфогідрильними групами білків, було висловлено припущення, що зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+ під впливом NO відбувається внаслідок його взаємодії з SH-групами скорочувальних білків. З метою дослідження участі цих груп у реалізації ефекту оксиду азоту на скорочувальний апарат ми вивчали вплив НН на скорочувальну активність скінованих препаратів ГМ ворітної вени у присутності відновлювача SH-груп дитіотрейтолу (ДТТ). Контрольні дослідження показали, що сам ДТТ викликає зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+. Додавання до перфузуючого розчину ДТТ в концентраціях від 2 мМ до 10 мМ викликало дозозалежне зменшення амплітуди скорочення, яке становило 13,96,1% (n=7, P<0.05) при 2 мМ ДТТ, 23,67,0% (n=9, P<0.01) - при 5 мМ, 44,14,8% (n=10, P<0.001) - при 10 мМ

Для з'ясування ролі SH-груп у реалізації ефекту оксиду азоту було вирішено дослідити сумарний вплив дитіотрейтолу та нітропрусиду натрію на скорочувальну активність скінованих препаратів ворітної вени в залежності від послідовності їх введення. В результаті було отримано, що на фоні розслаблення, викликаного дитіотрейтолом, ефект нітропрусиду натрію є незначним (рис 8а). І навпаки, ефект ДТТ є незначним на фоні розслаблення, викликаного нітропрусидом натрію.

В останній серії експериментів нами було досліджено вплив нітропрусиду натрію на скорочувальну активність скінованих препаратів ГМ ворітної вени щура на фоні дії ДТТ в різних концентраціях. Результати даного дослідження зображено на рис. 9. Як видно з рисунку, загальний розслаблюючий ефект НН та ДТТ в усіх чотирьох випадках практично однаковий, хоча і є тенденція до його незначного збільшення при підвищенням концентрації ДТТ. По мірі зростання концентрації останньго його внесок в загальний розслаблюючий ефект зростає, а внесок НН, відповідно, зменшується. Проведені дослідження показують, що дилататорні ефекти НН та ДТТ не додаються один до одного. Отримані результати свідчать про те, що, скоріше за все, в реалізації розслаблюючого ефекту кожної з цих цих двох речовин можуть бути задіяні спільні механізми. Оскільки ДТТ є відновлювачем SH-груп, а однією з властивостей оксиду азоту є його здатність взаємодіяти з сульфогідрильними групами білків, можна зробити висновок, що NO призводить до зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+ внаслідок взаємодії з сульфогідрильними групами скорочувальних білків.

ЗАКЛЮЧЕННЯ

В скінованих препаратах гладеньких м'язів відсутні мембранні механізми транспорту Са2+, тому його концентрація в міоплазмі визначається його вмістом в перфузаті [Соловьев, 1990]. Проте при обробці гладеньких м'язів сапоніном можуть залишатись інтактними внутрішньоклітинні кальцієві депо, зокрема саркоплазматичний ретикулум. В наших дослідах концентрація Са2+ підтримувалась на сталому рівні за допомогою буферної системи Са2+-ЕГТА і була досить високою (10-4 М). Беручи до уваги той факт, що повна активація скорочувального апарату ГМ відбувається при концентраціях Са2+ 5-8 мкМ [Шуба, Кочемасова, 1988], можна стверджувати, що виділення або поглинання Са2+ саркоплазматичним ретикулумом не впливає на амплітуду скорочення. Це означає, що релаксуючий вплив донорів оксиду азоту не пов?язаний зі змінами концентрації Са2+. Скоріше за все, цей ефект пов?язаний з безпосереднім впливом оксиду азоту на скорочувальний апарат ГМ. Можливими механізмами такого впливу можуть бути або зміна активності регуляторних ферментів кінази та фосфатази легкого ланцюгу міозину, або пригнічення взаємодії між актином та міозином. Незважаючи на високий рівень Са2+, ми не можемо стверджувати, що в наших експериментах рівень фосфорилювання регуляторного легкого ланцюгу міозину та активації скорочення був макисмально можливим, тому що скіновані сапоніном препарати ГМ втрачають велику кількість (до 30%) ендогенного кальмодуліну. Скоріше за все, фаза плато досягалася за умов динамічної рівноваги процесів фосфорилювання-дефосфорилювання. В такому випадку зміна активності будь-якого з регулюючих ферментів, кінази чи фосфатази, призведе до зміни рівня фосфорилювання міозину та, як наслідок, зміни тонічної напруги. Іншим механізмом може бути порушення взаємодії між актином та міозином, що супроводжується зменшенням АТФазної активності при сталому рівні фосфорилювання міозину. Подібний механізм описаний в скелетних м?язах, де донори NO одночасно зменшують як АТФазну активність актоміозину, так і амплітуду скорочення скінованих препаратів [Galler, 1997]. Існування такого механізму в ГМ показано на інтактних препаратах сонної артерії кроля, в яких донори NO викликали зміни співвідношення між ступенем фосфорилювання та генерацією активної напруги [McDaniel, 1992]. Наше дослідження показує, що подібний ефект можна пояснити безпосереднім впливом NO на скорочувальний апарат ГМ. Отримані нами дані про є практично однаковий ефект NO як при максимальній, так і при немаксимальній активації скорочувального апарату, відсутність змін спорідненості скорочувального апарату ГМ до Са2+, вказують на те, що зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+, скоріше за все, пов'язано з порушенням взаємодії між актином та міозином без зміни ступеня фосфорилювання.

Той факт, що донори оксиду азоту викликають розслаблення скінованих препаратів гладеньких м'язів в присутності метиленового синього, свідчить про те, що дилататорний вплив оксиду азоту на ГМ, принаймні частково, може здійснюватись через модуляцію чутливості скорочувального апарату до Са2+, причому цей вплив не пов?язаний з активацією розчинної гуанілатциклази. Підтвердженням існування цГМФ незалежного механізму є той факт, що в інтактних препаратах грудної аорти кроля селективний інгібітор гуанілатциклази 1Н - [1,2,4] оксодіазоло [4,3-?] квіноксалін-1 лише частково інгібував розслаблення, викликане ацетилхоліном, або донорами оксиду азоту [Moro, 1996].

Не зважаючи на те, що ділянка міозинової молекули, яка містить сульфогідрильні групи, не входить безпосередньо до активного центру, гідроліз АТФ супроводжується значними конформаційними змінами в ній [Rayment, 1993]. Наші досліди показують, що N-етилмалеінімід, який неспецифічно алкілує сульфогідрильні групи, викликає зміни ферментативної активності актоміозину ГМ, подібні до тих, що виникають при дії НН. Крім того, НН призводить до змін АТФазної активності міозину, які за характером подібні до тих, що спостерігаються при модифікації SH1 міозину ГМ [Koijma, 1999]. Оскільки оксид азоту може вступати в реакцію з сульфогідрильними групами, можна припустити, що такий вплив НН обумовлений нітрозилюванням критичних сульфогідрильних груп міозину. Викликає інтерес двофазний характер впливу НН та N-етилмалеініміду на АТФазну активність актоміозину. Вплив модифікації SH1 на актин-активовану АТФазну активність міозину ГМ залежить від стану фосфорилювання регуляторного легкого ланцюгу молекули. Модифікація SH1 викликає збільшення актин-активованої АТФазної активності у дефосфорильованому міозині та зменшення у фосфорильованому [Sellers, 1982]. Можна припустити, що дійсно деяка частина міозинових молекул є дефосфорильованою, і модифікація SH1 груп цих молекул, або їх взаємодія з NO призводять до зростання актин-активованої АТФазної активності. Важливим фактом також є те, що характер впливу НН на Mg2+-АТФазну активність міозину, яка активується актином, відрізняється від його впливу на АТФазну активність актоміозину. По-перше, у міозині не спостерігається зростання АТФазної активності при низьких концентраціях НН. По-друге, при високих концентраціях НН вона гальмується в менший мірі, у порівнянні з актоміозином. З цього факту можна зробити висновок, що оксид азоту, скоріше за все, не змінює швидкості гідролізу АТФ безпосередньо міозиновою молекулою, а призводить до порушення взаємодії між актином та міозином.

Отримані нами результати свідчать про те, що сульфогідрильні групи скорочувальних білків мають важливе значення в регуляції скорочувальної активності ГМ. Так, додавання до перфузату N-етилмалеініміду, який специфічно алкілує ці групи, призводить до суттєвого зменшення амплітуди скорочення скінованих препаратів ГМ. ДТТ, який відновлює SH-групи, також викликає дозозалежне розслаблення скінованих препаратів ГМ. Такий ефект ДТТ може бути обумовлений відновленням критичних сульфогідрильних груп скорочувального апарату. Подібний механізм був описаний в скелетних м'язах, де ДТТ призводив до зменшення чутливості скорочувального апарату до Са2+ [Andrade, 1998]. Очевидно, ми маємо справу з подібним механізмом в ГМ. Беручи до уваги факт, що скорочувальний цикл супроводжується значним рухом всередині ділянки міозину, яка містить сульфогідрильні групи, можна допустити, що відновлення цих груп може бути критичним у процесі актин-міозинової взаємодії. В ГМ, крім того, ділянка, що містить сульфогідрильні групи, має важливе значення у реалізації зв'язку фосфорилювання регуляторного легкого ланцюгу міозину - скорочення [Trybus, 1997], і тому зміни стану SH-груп можуть призводити до порушення цього зв'язку.

Як NO, так і ДТТ, викликають розслаблення ГМ внаслідок зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+. Дослідження сумарного впливу НН та ДТТ на скорочувальну активність ГМ показує, що ці ефекти не додаються один до одного. Загальний розслаблюючий вплив цих речовин практично не залежить від послідовності їх дії (рис. 8). Проте ефект НН на фоні дії ДТТ є значно меншим, ніж слід було б того очікувати, при додаванні ефектів (рис. 8а, 9). Цей факт може свідчити про те, що в реалізації розслаблюючих ефектів оксиду азоту та ДТТ в скінованих ГМ можуть бути задіяні одні й ті ж самі механізми. Оскільки дія ДТТ пов`язана з відновленням сульфогідрильних груп, а оксид азоту може нітрозилювати ці групи, можна припустити, що в реалізації ефектів як NO, так і ДТТ, задіяні одні й ті ж самі SH-групи. Підтвердженням цієї гіпотези є результати дослідження впливу НН на скорочувальну активність скінованих препаратів ГМ на фоні дії різних концентрацій ДТТ (рис. 9). Як видно з цього рисунку, сумарний вплив ДТТ та НН практично однаковий при різних концентраціях ДТТ. Невелике зростання загального розслаблення, що спостерігається з підвищенням концентрації ДТТ, можна пояснить збільшенням кількості речовин, що можуть реагувати з SH-групами. З підвищенням концентрації ДТТ внесок НН в загальне розслаблення стає меншим, а ДТТ навпаки, більшим. Очевидно, що ДТТ відновлює критичні SH-групи, що і є причиною розслаблення. Проте, при низьких концентраціях ДТТ відновлюються не всі SH-групи. Тому додавання НН викликає нітрозилювання решти сульфогідрильних груп і подальше розслаблення. З підвищенням концентрації ДТТ кількість відновлених SH-груп зростає і залишається менше мішеней для дії оксиду азоту. Тому ми і спостерігаємо зменшення внеску НН у загальне розслаблення. Найбільш ймовірною мішенню для дії No можна вважати SH-групи міозину. Таке припущення можна зробити, враховуючи отримані нами дані (рис. 4), що прямий ефект No на скорочувальний апарат є більш специфічним для ГМ, в яких регуляція скорочувальної активності є міозинзалежною. Підсумовуючи отримані дані, можна сказати, що сульфогідрильні групи скорочувальних білків є критичними у регуляції скорочувальної активності ГМ, і вони можуть бути залучені у реалізацію дилататорного ефекту NO в ГМ. Зміна стану цих груп: алкілування за допомогою NEM, відновлення за допомогою ДТТ призводить до розслаблення скінованих препаратів ГМ. Зменшення чутливості скорочувального апарату ГМ до Са2+, що спостерігається при дії NO, очевидно відбувається внаслідок його взаємодії з сульфогідрильними групами скорочувальних білків ГМ.

Дані, отримані в нашій роботі, а також дані інших дослідників, дозволяють розширити існуючі уявлення про механізми дії оксиду азоту в ГМ, і запропонувати наступну схему впливу оксиду азоту на скорочувальну активність ГМ.

Розслаблення ГМ під впливом оксиду азоту може відбуватись як внаслідок зменшення концентрації Са2+ в цитоплазмі, так і внаслідок зменшення чутливості скорочувального апарату до Са2+, причому такі зміни можуть відбуватись як через цГМФ-залежний сигнальний шлях, так і через цГМФ-незалежні механізми. Активація розчинної гуанілатциклази призводить до зростання концентрації цгмф та активації G-кінази типу І.