Молекулярно-біологічні аспекти білково-мембранних взаємодій: термодинамічний і кінетичний контроль вбудовування

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат

на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

03.00.03 молекулярна біологія

Молекулярно-біологічні аспекти білково-мембранних взаємодій: термодинамічний і кінетичний контроль вбудовування

Ладохін Олексій Сергійович

Київ 2001

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ; в Університетах штату Вірджинія, м. Шарлотсвиль, Джонс Хопкінса, м. Балтімор, штату Каліфорнія, м. Ірвайн.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Говорун Дмитро Миколайович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, завідувач відділу молекулярної біофізики;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Малишева Маргарита Костянтинівна, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, м. Київ, завідувач відділу нейрохімії;

доктор фізико-математичних наук Левчук Юрій Миколайович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ, провідний науковий співробітник лабораторії оптичних методів дослідження

Провідна установа:

Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії, м. Київ

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О.В. Підпала

Анотація

молекулярний білок ліпідний флуоресцентний

Ладохін О.С. Молекулярно-біологічні аспекти білково-мембранних взаємодій: термодинамічний і кінетичний контроль вбудовування. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено встановленню загальних принципів та молекулярних механізмів спонтанного вбудовування білків у мембрани і набуття ними активної конформації. Запропоновано і обґрунтовано структурно-термодинамічну концепцію білкового вбудовування, згідно з якою воно неодмінно проходить через фолдинговий метастабільний інтермедіат. Вивчено взаємовідношення кінетичного і термодинамічного контролю, які здійснюються на різних стадіях вбудовування і фолдингу мембранних білків. Доведено, що білки взаємодіють з поверхневою зоною мембрани за відсутності адитивності електростатичних та гідрофобних взаємодій. Кількісно охарактеризовано енергетичну спряженість процесу взаємодії білокповерхнева зона мембрани з формуванням вторинної структури білка. Встановлено, що різні типи вторинної структури (-спіраль і -складка) мають близькі вільні енергії фолдингу. Розроблено, вдосконалено та впроваджено в науково-дослідну практику низку флуоресцентних методів вивчення термодинамічних, кінетичних і структурно-функціональних характеристик білково-мембранних взаємодій.

Ключові слова: вбудовування білків у мембрани, термодинамічний і кінетичний контроль, фолдинг, електростатичні та гідрофобні взаємодії, спряження зв'зування і згортання, флуоресценція.

Ладохин А.С. Молекулярно-биологические аспекты белок-мембранных взаимодействий: термодинамический и кинетический контроль встраивания. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена установлению общих принципов и молекулярных механизмов спонтанного встраивания белков в мембраны и приобретения ими активной конформации. Предложена и обоснована структурно-термодинамическая концепция белкового встраивания, согласно которой оно обязательно проходит через фолдинговый метастабильный интермедиат. Изучены взаимоотношения кинетического и термодинамического контроля, осуществляемых на разных стадиях встраивания и фолдинга мембранных белков. Доказано, что белки взаимодействуют с поверхностной зоной мембраны в отсутствие аддитивности электростатических и гидрофобных взаимодействий. Количественно охарактеризована энергетическая сопряженность процесса взаимодействия белок-поверхностная зона мембраны с формированием вторичной структуры белка (-спираль и -складка). Установлено, что разные типы вторичной структуры имеют близкие значения свободных энергий фолдинга. Разработан, усовершенствован и внедрен в научно-исследовательскую практику ряд флюоресцентных методов изучения термодинамических, кинетических и структурно-функциональных характеристик белково-мембранных взаимодействий.

Ключевые слова: встраивание белков в мембраны, термодинамический и кинетический контроль, фолдинг, электростатические и гидрофобные взаимодействия, сопряжение связывания и сворачивания, флюоресценция.

Annotation

Ladokhin A.S. Molecular biology aspects of protein-membrane interactions: thermodynamic and kinetic control of insertion - Manuscript.

Thesis for the Doctor of sciences' degree by specialty 03.00.03 - molecular biology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

Membrane proteins are abundant and important for a variety of cellular functions, yet very little is understood of the molecular events accompanying their assembly [Engelman (1996) Science 274:1850; Bibi (1998) Trends Biochem. Sci. 23:51]. The main goal of this study was to gain insight into thermodynamic and kinetic control of membrane protein folding and stability by studying spontaneously inserting proteins and peptides.In the initial stage of the study we developed new theoretical and experimental approaches, which allowed us to use fluorescence spectroscopy to answer fundamental structural and thermodynamic questions of protein-membrane interactions. We have developed and implemented procedures and experimental schemes to minimize and correct for artifacts arising from the high light scattering caused by lipid vesicles. We have developed a distribution analysis technique to analyze depth-dependent fluorescence quenching in membranes and demonstrated the dynamic nature of this process. We have also developed tools to analyze the mechanism of membrane permeabilization by host-defense peptides. Next we characterize and quantitate the energetics of various steps of membrane binding and insertion of proteins. The latter partition into lipid bilayers mainly through hydrophobic and electrostatic interactions. We have explored systematically free energy group additivity for hydrophobic partitioning and additivity of hydrophobic and electrostatic free energy components. We employed several series of mutants of the proline-rich antimicrobial peptide indolicidin that cannot adopt an ordered secondary structure. The free energy of partitioning into zwitterionic phosphocholine vesicles (GH) measured by equilibrium dialysis coincides within the experimental error with the prediction of the pentapeptide-based interfacial hydrophobicity scale [Wimley & White (1996) Nature Str. Biol. 3:842]. This confirms the complete group additivity for GH derived from the pentapeptide scale in the context of a different peptide family. In contrast, we find no additivity in the contributions from hydrophobic and electrostatic interactions: G of transfer of indolicidin mutants into mixed POPC/POPG bilayers depends linearly on bilayer surface potential, but the effective charge of the peptide, Zeff, correlates reciprocally with the peptide's hydrophobicity, GH. An empirical rule based on the indolicidin results suggests a reduction of approximately 20% of the value of Zeff for every 3 kcal/mole in GH. We have determined the energetics of melittin helix formation through measurements of the partitioning free energies and the helicities of native melittin and of a diastereomeric analog with four D-amino acids (D4,L-melittin). Because D4,L-melittin has little secondary structure in either the free or bound forms, it serves as a model for the experimentally inaccessible unfolded bound form of native melittin. The partitioning of native melittin into large unilamellar phosphocholine vesicles is 5.0 0.7 kcal/mol more favorable than that of D4,L-melittin. Differences in the circular dichroism spectra of the two forms of melittin indicate that bound native melittin is more helical than bound D4,L-melittin by about 12 residues. These findings disclose that the free energy reduction per residue accompanying the folding of melittin in membrane interfaces is about 0.4 kcal/mole, consistent with the hypothesis that hydrogen bonding reduces the high cost of partitioning peptide bonds. A similar value of 0.5 kcal/mol per residue has been observed for -sheet formation by a hexapeptide model system. These two values allow estimation of the energetic consequences of membrane-induced secondary structure formation. We have characterized kinetic control of membrane penetration of cytochrome b5 and melittin. In both cases we find that final insertion is preceded by formation of a metastable intermediate and that heating the system helps to overcome the kinetic barrier towards the final state. We have characterized the conformational change associated with this transition by means of distribution analysis of fluorescence spectroscopy and oriented circular dichroism. For cytochrome b5 , heating was shown to decrease dramatically the tightness of packing of the nonpolar domain, which allows a translocation of the C-terminus across the bilayer. This change is connected to temperature-induced conversion of the exchangeable (“loosely” bound) form of cytochrome b5 to the non-exchangeable (“tightly” bound) form, forms which have dramatically different rates of exchange between membranes We have demonstrated that for melittin an intermediate state has an interfacial topology, while a final pore-forming state consists of transmembrane helices. Kinetic differences for melittin binding/insertion into membranes formed with anionic and zwitterionic lipids result in variation in the mechanism of membrane permeabilization, and thus are important for the peptide's functioning. We summarize our results in a general model for post-translational membrane insertion of proteins that requires a passage through an obligatory unfolded intermediate state. We suggest that transition from the water-soluble state to this interfacial intermediate is under thermodynamic control, while the final stages of insertion are sometimes irreversible and influenced by kinetic control.

Key words: membrane insertion of proteins, thermodynamic and kinetic control, folding, electrostatic and hydrophobic interactions, fluorescence.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Мембранні білки (МБ), що складають третину усіх білків клітини (Wallin, von Heijne, 1998), відіграють значну роль у різноманітних молекулярно-біологічних процесах у клітині, таких, зокрема, як упізнавання, передача сигналів, апоптоз, проліферація, виробництво енергії і транспорт поживних речовин. Проте наше розуміння молекулярних механізмів їхнього функціонування, а відтак і можливість спрогнозованої корекції асоційованих патогенних фенотипів обмежені, насамперед, відсутністю знань про загальні принципи, що визначають як правильний, так і неправильний фолдинг МБ.

Конститутивні МБ вбудовуються співтрансляційно за допомогою транслоконового комплексу (Andrews and Johnson, 1996; Bibi, 1998), тоді як неконститутивні (токсини, антимікробні пептиди) роблять це спонтанно. Жоден з цих процесів не вивчений достатньо на молекулярному рівні, хоча не виключено, що обидва вони ґрунтуються на тих же фізичних засадах. Спонтанний перехід МБ від водорозчинної до мембранозв'язаної форми необхідний для багатьох біологічних процесів - пост-трансляційного вбудовування білків у мембрани органел, дії комплементу, фузогенної активності вірусів, мембранної пермеабілізації токсинами та білковими антибіотиками тощо. Проте дуже мало відомо про конформаційні зміни, що супроводжують цей перехід, енергетичні бар'єри, які відокремлюють фолдингові інтермедіати, та про природу рушійних сил. Немає також загального розуміння стосовно співвідношення між термодинамічним і кінетичним контролем над процесом вбудовування білків у мембрани. Панівною в літературі є гіпотеза про виключне домінування термодинамічного контролю над фолдингом водорозчинних білків, проте залишається відкритим питання, наскільки ця концепція може бути застосована до МБ.

Розв'язання проблеми вбудовування МБ є важливим для розуміння процесу білкового фолдингу. Взаємодії білкових поліпептидних ланцюгів між собою та з оточенням визначають структуру і стабільність білка. Вивчення розчинних білків як спрощується, так і ускладнюється наявністю спільної водної фази (White and Wimley, 1999). Для мембранних білків, хоча їхнє оточення більш складне, бішар створює термодинамічні та геометричні обмеження, які лімітують число можливих структурних мотивів. Перевагою вивчення білкового фолдингу на МБ є те, що події, взаємопов'язані в складні шляхи у розчинних білках, можуть бути значною мірою відокремлені.

Як структурні, так і термодинамічні дослідження МБ суттєво відстають від вивчення їхніх розчинних аналогів. Основна причина криється в тому, що ліпідні бішарові мембрани є завеликими для ЯМР-досліджень у розчині і занадто “двовимірними” для дифракційних методів, зокрема рентгенівських. Ці обмеження, що знижують можливість застосування структурних методів з високою роздільною здатністю, принципово не поширюються на флуоресценцію та інші спектроскопічні методи. Отже, на додаток до традиційного застосування флуоресценції як методу, що дозволяє отримувати інформацію про динамічні флюктуації білкової структури та її кінетичні зміни, вона може відігравати нову роль структурного інструменту у вивченні МБ. Однак це вимагає розробки нових методичних підходів, спеціально призначених для флуоресцентних досліджень у мембранних системах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації ІМБіГ НАН України. Частково її виконано в рамках бюджетної теми “Молекулярні основи компартменталізації білкового синтезу” (шифр теми 2.2.4.9, № держ. реєстрації 0198U000672, 1998-2001 рр.). Робота виконувалася також у рамках вітчизняних грантів МОС України, шифр 5.04/0061, 5.04/0073, та грантів США NIH: GM 23858, GM 46823, AI 22931.

Мета і завдання дослідження. Метою дослідження було встановлення загальних принципів та молекулярних механізмів вбудовування білків у ліпідні мембрани і набуття ними активної конформації.

До завдань роботи входило:

? розробка флуоресцентних методів структурного, термодинамічного та функціонального аналізу, придатних для дослідження МБ;

? кількісне визначення енергетики мембранного зв'язування за наявності гідрофобних і електростатичних взаємодій та структурна характеризація нативного індоліцидину і його аналогів;

? кількісне визначення енергетики формування ?-спіральної структури на мембрані та структурна характеризація нативного і енантіомерного мелітину;

? кількісне визначення енергетики формування ?-структури та структурна характеризація модельного гексапептиду WLLLLL;

? з'ясування співвідношення термодинамічного і кінетичного контролю над процесом пост-трансляційного вбудовування в мембрани та набуття активної конформації мелітином, нативним цитохромом b₅ i його мутантами;

? узагальнення отриманих результатів та створення структурно-термодинамічної концепції вбудовування білків у мембрани.

Об'єкт дослідження: процеси спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у ліпідні мембрани та їхні молекулярні механізми.

Предмет дослідження: нативний мелітин із бджолиної отрути і його синтетичний енантіомерний аналог; нативний бичачий антимікробний пептид індоліцидин і його дев'ять синтетичних аналогів із модифікованою гідрофобністю; нативний кролячий цитохром b₅ і три його мутанти з одиночними і подвійними замінами в мембранозв'язаному фрагменті; синтетичний мембранно-активний пептид WLLLLL і низькомолекулярні модельні сполуки; модельні ліпідні мембрани.

Мелітин - переходить із невпорядкованого клубка у розчині в -спіральну конформацію на мембрані і є зручною моделлю для вивчення енергетики формування вторинної структури на мембрані.

Індоліцидин ? має унікальний амінокислотний склад (40 % Trp, 25 % Pro, 25 % катіонних груп), що дозволяє вивчати гідрофобні та електростатичні складові вільної енергії мембранного зв'язування.

Модельний пептид WLLLLL ? переходить на мембрані з мономерного стану в розчині до -структурного агрегату, що дає змогу вивчати енергетику формування в-структури.

Цитохром b₅ ? важливою рисою є його здатність обмінюватися між мембранами, що дозволяє вивчати кінетичні аспекти білково-мембранних взаємодій.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено загальну структурно-термодинамічну концепцію спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у мембрани, згідно з якою спонтанне вбудовування неодмінно проходить через фолдинговий інтермедіат.

Вперше експериментально доведено наявність кінетичного контролю над пост-трансляційним вбудовуванням і фолдингом мембранних білків.

Вперше продемонстровано і кількісно охарактеризовано неадитивність гідрофобних і електростатичних складових білково-мембранних взаємодій. Запропоновано просте емпіричне правило обчислення сумарної вільної енергії зв'язування пептидів з мембранами.

Вперше кількісно визначено вільну енергію формування вторинної структури білків (-спіралі та -структури) у поверхневій зоні мембрани і теоретично обгрунтовано феномен спряження процесів мембранного зв'язування і фолдингу білків.

Розроблено серію експериментальних і обчислювальних засобів, що дозволяють отримувати коректні параметри флуоресценції в присутності сильного світлорозсіювання на мембранах. Запропоновано новий структурний метод розподільного аналізу гасіння флуоресценції в мембранах, залежного від глибини, що дозволяє визначати глибину занурення хромофорів, ступінь їхньої експонованості в ліпідну фазу і конформаційну гетерогенність.

Теоретичне та практичне значення роботи. Основним результатом виконаної роботи є розробка структурно-термодинамічної концепції вбудовування білків у мембрани, без якої неможливе розуміння фундаментальних засад життєдіяльності клітини на молекулярному рівні. Результати досліджень широко цитуються міжнародною науковою спільнотою і є базисними для подальшого вивчення як спонтанного, так і співтрансляційного фолдингу та функціонування МБ.

Дослідження енергетики білково-мембранних взаємодій та мембранної пермеабілізації взагалі, а надто ті, що зроблені за допомогою антимікробного пептиду індоліцидину, мають потенційно важливе значення для розробки пептидних антибіотиків. Через велику варіабельність патогенних бактерій проблема розробки нових підходів антимікробного контролю постає в усьому світі. Особливе значення цієї проблеми в умовах України пов'язане з наслідками аварії на ЧАЕС, що спричинили зниження загального рівня природного імунітету населення.

В останні роки встановлено, що помилковий білковий фолдинг і наступна акумуляція білків при хворобах Альцгеймера, Паркінсона та інших пріонових захворюваннях тісно пов'язані з білково-мембранними взаємодіями. Вивчення механізмів та енергетики білкової агрегації, що супроводжує формування в-структури в поверхневій зоні ліпідного бішару, відкриває нові шляхи пошуку новітніх методів діагностики і лікування цих хвороб.

Запропоновані методологічні розробки в галузі флуоресцентної спектроскопії значно розширюють сфери її успішного використання для вивчення термодинамічних, кінетичних, структурних і функціональних аспектів білково-мембранних взаємодій.

Особистий внесок здобувача. Нові теоретичні та експериментальні ідеї, що розроблялися в дисертації, належать автору. Всі експерименти здійснено особисто автором за винятком частини експериментів, що наведені в розділі 5.3, у виконанні яких брав участь Dr. W. C. Wimley (Університет Каліфорнії, Ірвайн, США). Приготування та виділення мутантів цитохрому b₅ було зроблено у співробітництві з Dr. L. Wang тa Dr. A. W. Steggles (Північно-Східний Університет Огайо, США). Отримані в співробітництві результати опубліковано як спільні наукові статті.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідалися на III Конгресі Європейського Товариства Фотобіологіі (Будапешт, Угорщина, 1989), на 5-му Симпозіумі Білкового Товариства (США, 1991), на щорічних з'їздах Американського Біофізичного Товариства (США, 1991-2001), на 17-му Міжнародному конгресі з біохімії та молекулярної біології (США, 1997), на двох конференціях FASEB “Біофізика клітинних мембран” (США, 1998, 2000). Вони також повідомлялися на наукових семінарах в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Інституті молекулярної біології і генетики НАН України, в Аграрному Університеті (Вагенинген, Нідерланди, 1993); в Інституті лазерних досліджень (Ірвайн, США, 1995) та Університеті Рутгерс (Нью Брунсвік, США, 1998).

Публікації. За темою дисертації надруковано 31 статтю (з них - 7 одноосібних) у вітчизняних та зарубіжних фахових журналах, що реферуються, та тези 16 доповідей на наукових конференціях. Вони в повному обсязі висвітлюють зміст, результати, висновки і рекомендації дисертації.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, результатів дослідження та їхнього обговорення, висновків та переліку використаних джерел, який охоплює 517 посилань. Роботу викладено на 328 сторінках машинописного тексту. Вона містить 67 рисунків та 17 таблиць на 47 стор.

2. Основний зміст

Особливості флуоресцентних досліджень на мембранах

Стислий огляд методів дослідження. Основним методологічним підходом до вирішення поставлених завдань була флуоресцентна спектроскопія, що поєднує в собі чутливість і універсальність, так необхідні для мембранних досліджень. Оскільки в дисертації вирішувалася ціла низка оригінальних завдань, багато уваги було приділено розробці специфічних флуоресцентних методів, націлених на розв'язання конкретних питань. Особлива важливість розвитку методології флуоресцентного мембранного експерименту знайшла відбиток у висновках і наукових досягненнях роботи, про що йтиметься нижче. Серед інших методів значне місце посідає круговий дихроїзм (КД), який дозволяє визначати вторинну структуру білків - необхідну складову структурно-термодинамічної характеризації. Енергетику білково-мембранних взаємодій досліджували методом рівноважного діалізу.

Параметри обраховували за методом мінімізації найменших квадратів із розподіленою вагою експериментальних точок, зворотно пропорційною стандартній помилці у даній точці. Звичайна похибка не перевищувала 5 %. Як модельні мембрани було використано везикули різного ліпідного складу та розміру: малі бішарові везикули (МБВ) та великі бішарові везикули (ВБВ).

Розробка методології флуоресцентних досліджень у мембранних системах. На першому етапі досліджень нам було необхідно розв'язати низку методологічних завдань, пов'язаних із застосуванням флуоресцентної спектроскопії до мембранних систем. Труднощі, що притаманні таким системам, полягають у викривленні спектрів флуоресценції внаслідок значного розсіювання світла бішаровими везикулами (модельними мембранами), яке залежить від довжини хвилі. На рис. 1 наведено характерний приклад, що ілюструє необхідність корекційних процедур для визначення термодинаміки зв'язування мелітину з різними типами модельних мембран. Зауважимо, що інтенсивності відхиляються при високих концентраціях везикул через втрати, викликані розсіюванням як збуджуючого світла, так і флуоресценції. Ці результати чітко показують, що використання нескоректованих даних може призвести до отримання неправильних значень моль-фракційних коефіцієнтів і вільнoї енергії зв'язування тa навіть до помилкових висновків стосовно самого процесу “зв'язування”, наприклад, про некооперативне зв'язування або агрегування мелітину на поверхні.

Ми здійснили систематичне дослідження артефактів подібного типу і методичних підходів для їхнього усунення, які можна легко застосовувати в експерименті. Всі подальші флуоресцентні дослідження проводили з використанням оптимізованих експериментальних схем детекції, а отримані дані піддавали необхідній математичній корекції та аналізу.

Дослідження природи неекспоненційного затухання триптофанової флуоресценції. Природа неекспоненційного затухання флуоресценції тісно пов'язана з динамічною організацією білкової структури. В представленому розділі було використано дві прості моделі з альтернативними механізмами відхилення затухання від моноекспоненційної поведінки: 1) мультиекспоненційне затухання флуоресценції Trp-цвітеріону в швидкорелаксуючому водному оточенні є результатом гетерогенності основних станів (наявність множинних обертальних конформерів); 2) неекспоненційне затухання флуоресценції індолу, який не має ротамерних форм, у суміші вода?гліцерин є результатом релаксації розчинника.

У той час як для триптофану (Trp) не виявлено залежності затухання флуоресценції від збудження, подібна залежність є суттєвою для індолу в гліцерині. Таким чином, залежність затухання від довжини хвилі збудження може бути використана як критерій розрізнення альтернативних механізмів, які призводять до відхилення від експоненційного затухання флуоресценції білків. Показано, що затухання флуоресценції Trp-19 мелітину для різних його конформацій має риси як конформаційної гетерогенності, так і реакції збудженого стану залежно від конформаційного стану білка. Так, для мелітину в метанолі було продемонстровано існування від'ємної передекспоненційної експоненти, яка є достатнім (хоч і не необхідним) показником реакції збудженого стану. Характерно, що розчин мелітину в метанолі часто розглядається як модель його мембранозв'язаної конформації, оскільки в обох випадках мелітин є б-cпіральним і знаходиться в середовищі зі зменшеною полярністю порівняно з водним. Той факт, що затухання флуоресценції мелітину в оточенні, яке імітує мембранне, безпосередньо віддзеркалює вплив конформаційної динаміки, є важливою передумовою для коректної інтерпретації механізмів затухання флуоресценції МБ.

Триптофаново-октиловий ефір (ТОЕ) як низькомолекулярна модель для вивчення триптофанової флуоресценції мембранних білків. Для успішного вивчення МБ флуоресцентними методами треба спочатку вирішити питання щодо впливу ліпідного бішару на спектроскопічні властивості природних флюорофорів. Для цього ми використали зручну модельну сполуку ? ТОЕ, яка містить індольний хромофор і добре зв'язується з ліпідними мембранами. Найголовніше питання, яке слід було розв'язати, ? це експериментальне визначення механізму гасіння флуоресценції в мембранах, який без достатніх підстав вважався суто статичним (Сhattopadhaya, London, 1987). Для цього ми виміряли кінетику затухання флуоресценції ТОЕ в ПОФХ (1-пальмітоїл-2-олеоїлфосфатидилхолін) везикулах та в мембранах, сформованих із бромованих ліпідів, здатних гасити флуоресценцію. Результати наших досліджень наведено в табл. 1. Той факт, що час затухання флуоресценції скоротився в присутності бромоліпідів, однозначно свідчить про динамічний механізм гасіння. Додатковим підтвердженням цього є та обставина, що гасіння стає більш ефективним із підвищенням температури. Було визначено енергію активації гасіння, яка дорівнювала 1,3 ккал/моль. Описано такі принципові властивості флуоресценції мембранозв'язаного ТОЕ, як час життя, квантовий вихід, анізотропія, спектральний розподіл і червоний крайовий зсув.

Таблиця 1. Параметри затухання флуоресценції ліпіднозв'язаного триптофаново-октилового ефіру (ТОЕ)

* 1-пальмітоїл-2(дибромостеароїл)фосфатидилхолін з атомами брому в 9,10-му положеннях; ? середній час затухання флуоресценції.

Ці дані забезпечують корисні контрольні точки для множини даних зі стаціонарної та кінетичної флуоресценції МБ. Той факт, що молекули ТОЕ, повністю експоновані в ліпід, зазнають повільної структурної релаксації, є важливою відправною точкою для подібних вимірювань на МБ. На противагу цьому експоновані залишки Trp у водорозчинних білках не викликають ефекту червоного краю. Таким чином, ліпідна мембрана є середовищем, яке модулює динаміку білкової конформації.

Оскільки попередні методи структурного аналізу з використанням гасіння флуоресценції були основані на ідеї статичного гасіння (Сhattopadhyay, London, 1987), постає необхідність теоретичної розробки нових, адекватних методів, чому і присвячено наступний підрозділ.

Структурні дослідження білково-мембранних комплексів

Визначення глибини занурення білків у мембрани. Необхідною умовою дослідження білково-мембранних комплексів було створення теорії гасіння флуоресценції в мембранах, яка б відбивала сучасне розуміння структурно-динамічної організації мембран. Наші уявлення стосовно структури мембран зазнали суттєвих змін в останнє десятиріччя, зокрема, окреслилися важливі складові трансверсної організації, які спостерігаються як експериментально (White and Wiener, 1995), так і з використанням розрахункових методів (Pastor et al., 1991).

Через велику термічну неупорядкованість, характерну для рідких бішарів, “структура” мембрани може бути визначена лише як усереднене за певний час розподілення основних структурних груп, спроектованих на вісь, нормальну до площини бішару, і представлених Гауссовими функціями. Згідно з уявленнями щодо такого “розподільного” характеру структури бішару, розроблений нами метод “розподільного аналізу” (РА) гасіння флуоресценції в мембранах використовує Гауссовий розподіл для апроксимації профілів гасіння. Розроблені нами теоретичні основи цього методу враховують також динамічний характер гасіння в мембранах, описаний у попередньому підрозділі.

Теорія. В експериментах щодо гасіння, залежного від глибини, інтенсивність флуоресценції, F, вимірюється як функція відомої глибини гасника, h. Інтенсивність за відсутності гасіння ? F₀. У найзагальнішій формі РА описує профіль гасіння за допомогою суми двох дзеркально-симетричних Гауссових розподілiв, G (з трьома незалежними параметрами):

ln(F0/F(h))= G(h) + G(-h),

Необхіднїсть у двох симетричних Гауссіанах диктується необхідністю враховування транс-бішарового гасіння. Незалежно від того, буде хромофор розподілений в одному моношарі або в двох, у протилежному моношарі завжди знайдеться гасник. Три вільних параметри РА, використані в процесі мінімізації, мають наступний зміст: 1) середня глибина, h_m, відповідає найвірогіднішому положенню флуоресцентної проби на перетині бішару; 2) дисперсія, ?, залежить від таких складових, як кінечність розмірів зонда і гасника та їхнi термічні флюктуації.

Додаткова гетерогенність може бути внесена множинними білковими конформаціями, як, наприклад, у випадку поверхневозв'язаного і вбудованого мелітину; 3) площа під кривою, S, пропорційна загальному гасінню. Вона може бути представлена добутком власної константи гасіння, ?, яка визначається природою механізму, що викликає гасіння; часу життя збудженого стану за відсутності гасіння, ?; ступеня експонування зонда в ліпідне середовище, ?, і концентрації гасників,С. (S= C).

Параметр S може бути використаний для визначення експонування флюорофору в ліпідну фазу. Докладніше це буде розглянуто в наступному підрозділі.

Індивідуальні профілі гасіння для одного моношару подані на рис. 2Б для чіткішого уявлення. Профіль для ТОЕ в МБВ показано для порівняння пунктирною лінією. Виявилося, що розподіл пептидів у двох мембранних системах має однакове середнє положення ? близько до центра бішару. Розподілення у ВБВ є ширшим, ніж у МБВ, що дозволяє припустити наявність різниці в поперечній гетерогенності, можливо, у зв'язку з розбіжностями в ліпідній упаковці. В обох випадках ширина розподілення менша, аніж така для ТОЕ. Останнє вказує на можливу обмеженість поперечної рухомості пептиду на перетині бішару, що є наслідком його б -спіральної конформації.

Oтримані результати демонструють, що роз'єднання параметрів площі та ширини в профілі гасіння флуоресценції, залежного від глибини, згідно з РА, призводить до 1) мінімізації систематичних помилок у визначенні глибини проникнення зонда в мембрану та 2) отримання додаткової інформації щодо поперечної гетерогенності і експонування зонда в ліпід. Метод РА використано в подальшому для описання проникнення в мембрану деяких білків.

Визначення ступеня експонування триптофану в ліпідну фазу. Згідно з теорією, запропонованою в попередньому підрозділі, площа під профілем гасіння, S, пов'язана зі ступенем експонування хромофора в ліпідну фазу, ?. Відносне експонування можна отримати шляхом порівняння абсолютного експонування досліджуваного пептиду (NPP) мутантного цитохрому b₅ із значенням для ТОЕ:

Якщо немає можливості виміряти часи життя, то їхнє співвідношення можна апроксимувати співвідношенням квантових виходів, Q, для білка, що вивчається, і модельної сполуки ТОЕ в ліпідній мембрані:

.

Отримано такі значення квантових виходів для пептиду і ТОЕ, зв'язаних з ПОФХ везикулами (виражені відносно квантового виходу для ТОЕ за температури 20 ^оС): Q_ТОЕ (60 ^оС) = 0,66; Q_NPP (20 ^оС) = 1,65; Q_ТОЕ (60 ^оС) = 0,92. Ці величини були використані разом з результатами з табл. 2. для визначення відносного експонування Trp-109 в NPР.

Таблиця 2. Результати застосування роздільного аналізу (РА) до гасіння флуоресценції триптофану (Trp) у мембранах

*Цитохром b₅.

Значення, отримані згідно з РА, склали: ? (20 ^оС) = 0,69; ? (60 ^оС) = 0,95. Ці розрахунки показали, що пептид зазнає температурозалежної конформаційнoї зміни. За низької температури Trp-109 частково закритий рештою білкової структури. При нагріванні Trp-109 повністю експонується в ліпід. Нагрівання призводить до збільшення ширини профілю гасіння, що вказує на значну гетерогенність поперечного положення хромофора. Ця конформаційна зміна пов'язана з температурно-індукованою інверсією обмінюваної (“вільно” зв'язана) в необмінювану (“міцно” зв'язана) форму цитохрому b₅, яка радикально відрізняється швидкістю обміну між мембранами.

Дослідження термодинамічного контролю білкового вбудовування в мембрани

Дослідження термодинамічного контролю вбудовування білків у мембрани становить (разом з кінетичним) центральну частину даної роботи. Воно охоплює кілька окремих завдань: встановлення співвідношення електростатичних і гідрофобних взаємодій на поверхні мембрани та кількісну характеристику енергетики формування різних типів вторинних структур.

Гідрофобні та електростатичні взаємодії на поверхні мембрани. Адитивність різних компонентів вільної енергії є фундаментальною концепцією в біохімії, яка, проте, не досліджена адекватно у випадку зв'язування білків з мембранами. Хоча гідрофобні і електростатичні взаємодії окремо добре охарактеризовані за допомогою різноманітних наборів модельних пептидів, але все ж малозрозумілим залишається їхній взаємозв'язок. Адитивність гідрофобних (?G^ГФ) і електростатичних (?G^ЕС) внесків у вільну енергію зв'язування допускається часто з огляду на зручність, а не на основі експериментальних доказів.

Щоб вивчити в деталях різні аспекти мембранних взаємодій, ми обрали природний пептид індоліцидин як матричний пептид. Природний індоліцидин має незвичайний амінокислотний склад, у якому переважають п'ять триптофанів, три проліни і чотири катіонні групи. Така комбінація гідрофобних, заряджених і деструктуючих залишків робить його привабливою моделлю для вивчення пептидно-мембранних взаємодій. Ми синтезували та дослідили низку індоліцидинових мутантів, у яких змінювали заряд і гідрофобність (табл. 3).

Таблиця 3. Індоліцидинові мутанти, використані в роботі: послідовності, заряд і вільна енергія зв'язування, ?GWW, передбачена шкалою гідрофобності (Wimley and White, 1996)

* Шкала гідрофобності

Дані щодо вільної енергії зв'язування індоліцидинових мутантів з нейтральними, ПОФХ, і аніонними мембранами, ПОФГ (1-пальмітоїл-2-олеоїлфосфатидил-гліцерин). Експериментальні точки зв'язування пептиду з ПОФХ лягають на пряму з нахилом 1,04±0,04 та перетином на ?0,1±0,3 ккал/моль. Це означає, що шкала гідрофобності точно описує абсолютні значення вільної енергії відповідно до замін амінокислот. Ми не виявили суттєвої різниці у зв'язуванні пептидів одного й того ж складу, але з різним положенням залишку Trp. Зроблено висновок стосовно наявності групової адитивності компонентів вільної енергії в широкому діапазоні гідрофобності.

Природний індоліцидин зв'язується міцніше з аніонними ПОФГ везикулами, аніж з нейтральними ПОФХ, внаслідок додаткових сприятливих електростатичних взаємодій. Це справедливо для всіх варіантів індоліцидину, і дані щодо вільної енергії для індоліцидинів -W, -Y, -F, -L також лягають на пряму. Її нахил, однак, не дорівнює одиниці, що свідчить про відсутність простих адитивних внесків гідрофобних і електростатичних взаємодій.

У випадку ідеальної адитивності співвідношення ефективності заряду (Z_eff) до номінального заряду (Z) не повинно залежати від ?G^ГФ та дорівнює одиниці. Однак отримані співвідношення для індоліцидинових мутантів менші за одиницю, а прямі для відповідних пар характеризуються суттєвим від'ємним нахилом. Чим більша гідрофобність, тим більше відхилення від ідеальної поведінки. Екстраполяція даних в зону низької гідрофобності показує, що чисто електростатичне зв'язування пропорційне номінальному зарядові. Така поведінка відповідає модельним даним на заряджених пептидах низької гідрофобності.

Причини відсутності адитивності вільних енергій остаточно не з'ясовані, але видається доцільним припустити, що вони пов'язані зі структурними вимогами для максимізації гідрофобних і електростатичних взаємодій. Виявилося, що індоліцидиноподібні пептиди в змішаних ліпідних бішарах не можуть задовольнити цим вимогам одночасно. Щоб передбачити кількісне зв'язування гідрофобних і заряджених пептидів зі змішаними аніонно-цвітеріонними мембранами, необхідно зменшувати номінальний заряд на 20 % нa кожнi 3 ккал/моль у гідрофобному зв'язуванні.

Енергетика формування a-структури в мембранних білках. Для визначення вільної енергії формування ?-спіральної конформації в поверхневому шарі мембрани використовували нативний мелітин та його синтетичний енантіомер, D₄,L-мелітин, який містить D-амінокислотні залишки в положеннях 5, 8, 17, 21. Введення D-амінокислот у мелітин значно зменшує вірогідність формування вторинної структури (про що свідчать спектри КД на рис. 5), зберігаючи при цьому загальну гідрофобність.

Вільні енергії переходу двох форм мелітину з водної фази на поверхню мембрани ПОФХ ВБВ вимірювали в умовах, які забезпечують мономерний стан мелітину як у водній, так і в мембранній фазах. Молярно-часткові коефіцієнти зв'язування К_? для мелітину i D₄,L-мелітину складають (80±30)?10⁵ і (4±2)?10⁵ відповідно. Ці значення дають наступні величини вільної енергії: 2,6±0,3 ккал/моль для D₄,L-мелітину і ?7,6±0,4 ккал/моль для нативного мелітину (рис. 6). Різниця у вільній енергії ?5,0±0,7 ккал/моль між “симульованим” незгорнутим і реальним згорнутим мелітином узгоджується з малою популяцією нативного мелітину в незгорнутому мембранозв'язаному стані та відповідає гіпотезі про те, що утворення вторинної структури забезпечується зниженням вільної енергії зв'язування пептидних груп внаслідок формування водневих зв'язків. Оскільки D₄,L-мелітин не може легко утворювати вторинну структуру на поверхні, він не здатний знижувати вільну енергію переходу з водної фази в мембрану шляхом утворення водневих зв'язків, які беруть участь у формуванні вторинної структури.

Розрахунок ?G_{залишок} для утворення мелітинової спіралі потребує даних щодо середнього числа залишків, які утворюють спіраль, для двох форм мелітину, зв'язаних з ПОФХ мембранами. Проте еліптичність D₄,L-мелітину в ПОФХ мембранах не може бути виміряна безпосередньо через його дуже слабке зв'язування. Тому ми використали менш прямий підхід. Встановлено, що еліптичність нативного мелітину на 222 нм є практично ідентичною у випадку повного гідрофобного зв'язування з ПОФХ та повного електростатичного зв'язування з аніонним ліпідом ПОФГ (1-пальмітоїл-2-олеоїлфосфатидил-гліцерин). Припустивши, що подібна ситуація спостерігається для D₄,L-мелітину, ми використали значення еліптичності (?) для двох форм мелітину в метанолі та при зв'язуванні з ПОФГ для визначення різниці в ступені їхньої спіралізації. Фракційну спіральність розраховували за формулою f_a = (? ? ?_RC)/(?_H ??_RC), де ?_RC i ?_H ? граничні значення еліптичності для повністю розгорнутої і повністю спіральної конформацій відповідно. Обрахування спектрів, наведених на рис. 5, виявило, що середній вміст спіральних ділянок (f_a) у складі нативного мелітину втричі перевищує спіральність D₄,L-мелітину: 0,69 та 0,22 відповідно. До складу спіралі нативного мелітину входять біля 18, а D₄,L-мелітину 6 амінокислотних залишків.

Таким чином, наведені вище результати (рис. 6) дають значення ?G_{залишок}, яке дорівнює ?0,41±0,06 ккал/моль для зниження вільної енергії на залишок, яке промотує утворення спіралі при зв'язуванні мелітину з поверхнею ПОФХ бішару.

Енергетика формування b-структури в мембранних білках. Для кількісного визначення вільної енергії формування ?-конформації на мембрані було використано синтетичний пептид АсWL₅, який може існувати в трьох станах: як невпорядкований мономер у розчині та на мембрані, а також як ?-структурний мембранозв'язаний агрегат при високій власній концентрації. Спектри КД цих агрегатів є типовими для ?-структури з максимумом на 198 нм і мінімумом на 215 нм.

Експерименти з рівноважного діалізу дали перші вказівки на неочікувані властивості AсWL₅ у мембранах, коли його зв'язування з везикулами різко зростало зі збільшенням концентрації. Зв'язування починає зростати при співвідношенні пептид:ліпід (П:Л) більше 0,01 і різко підвищується при П:Л більше 0,05, сягаючи 40 К_? для П:Л ? 0,03. Таке безпрецедентне зростання зв'язування при збільшенні П:Л передбачає високий ступінь кооперативності. Для підтвердження кооперативності процесу агрегації отримані дані щодо зв'язування було проаналізовано за допомогою моделі “зародження?ріст”, описаної Terzi (1994), згідно з якою ріст великих агрегатів розміром n йде за стадією утворення димерного ядра.

Результати застосування цієї моделі до даних щодо ПОФХ і ОБФХ показують, що при проникненні у фосфатидилхолінові везикули AсWL₅ агрегує кооперативно у великі комплекси (n ? 10). Вільна енергія формування цих ?-структурних агрегатів є досить значною і в перерахунку на один залишок становить ?0,46?0,61 ккал/моль залежно від ліпіду. Наведені величини є дуже близькими до вільної енергії формування ?-спіралі, розглянутої в попередньому підрозділі. Це свідчить про універсальність термодинамічної концепції мембранної взаємодії білків з різними структурними мотивами. Варто зазначити, що значні витрати на зв'язування пептидних груп з мембранами є рушійною силою формування вторинної структури в мембранах, причому ідея полягає в тому, що пептидна група, зв'язана водневим зв'язком, має вищий коефіцієнт розподілу порівняно з вільною пептидною групою. Такий фундаментальний процес позначають як спряженість зв'язування і згортання.

Таблиця 4. Результати застосування моделі Терці (Terzi et al., 1994, 1995) до даних із зв'язування AсWL5 з ПОФХ та ОБФХ везикулами

Примітка. К? ? розподільний коефіцієнт, ?GМА ? вільна енергія переходу мономер-агрегат. *1-олеоїл-2-(дибромостеароїл)фосфатидилхолін.

Принцип конформаційної селективності та формування “поворотів” у мембранних білках. Необхідно було з'ясувати, як саме спряженість зв'язування і згортання проявляє себе в тих випадках, коли первинна структура не передбачає легкого формування ?-спіральної або ?-складчастої структури. Знову зручною моделлю стали аналоги індоліцидину, які через значну кількість залишків проліну не здатні утворювати регулярну вторинну структуру.

Температурна залежність спектра КД індоліцидину в SDS показує, що від'ємна смуга на 227 нм спряжена з піком на 217 нм, який знаходиться між мінімумами на 202 і 227 нм. Таку поведінку можна очікувати при екситонному розщепленні, обумовленому стекінгом ароматичних хромофорів. Спектри кругового дихроїзму індоліцидину-F мають риси спектрів обох індоліцидинів ? L i W. Основна від'ємна смуга знаходиться на 202 нм, як і для індоліцидину-W, але загальна температурна залежність нагадує таку для індоліцидину-L і свідчить про те, що можливий екситоновий дуплет між Phe залишками набагато слабший, ніж для Trp залишків. Цього можна було чекати з огляду на більш низьку осциляторну силу Phe. В усякому разі Phe може робити свій внесок у загальний вигляд спектрів КД у дальній УФ зоні.

Представлені спектри КД індоліцидинових варіантів з одним Trp. Ці варіанти з Trp в положеннях 4, 8 і 11 (А, Б і В відповідно) поводять себе подібно до індоліцидину-L, але не індоліцидину-W, що дає підставу припустити відповідальність сумарних властивостей множинних Trp індоліцидину-W за його незвичайний спектр КД. Безпосередні ЯМР вимірювання і моделювання молекулярної динаміки малих пептидів у воді чітко показують, що пролінові (Pro) залишки в оточенні ароматичних залишків (Ar) формують повороти типу VI через стекінг ароматичних залишків з проліновим кільцем. Індоліцидин містить дві Ar-Pro-Ar послідовності (Trp⁶-Pro⁷-Trp⁸ i Trp⁹-Pro¹⁰-Trp¹¹) на додаток до Leu²-Pro³-Trp⁴ послідовності. Можна сподіватися, що всі ці три ділянки формують повороти. Більш того, дві сусідні Ar-Pro-Ar можуть зближувати їхні Trp залишки і тим самим створювати умови для екситонового спарювання між Trp. Досить сильний дуплет спостерігається в спектрах КД для індоліцидину-W у міцелах SDS і дуплет у половину цієї сили ? для індоліцидину-W у мембранах. Останнє узгоджується з можливістю того, що в мембранах лише одна з двох Ar-Pro-Ar ділянок має стекінг-конформацію, в той час як у міцелах таку конформацію мають обидві послідовності. Передбачається, що подібний стекінг стабілізує структуру індоліцидину-W порівняно з іншими аналогами, що відповідає температурній інваріантності спектра КД для пептиду дикого типу в межах 195?200 нм.

Щоб унаочнити конформацію мембранозв'язаного індоліцидину, ми розробили молекулярні моделі, використовуючи ? кути, які відповідають поворотам типу VІa. Одну таку модель з Trp⁶-Pro⁷-Trp⁸ у подібній конформації показано на рис. 11. Вона демонструє, що Trp залишки дійсно можуть бути упакованими навколо цис-Pro, стабілізуючи поворот. Цікаво, що конформація індоліцидину, яка показана на рис. 11, містить триптофани і заряджені залишки на протилежних поверхнях. Це дає підставу вважати, що амфіпатична конформація є важливим чинником його високої мембранної активності.

Оскільки Trp залишки мають винятково виражену спорідненість до мембранних поверхонь, проникненню індоліцидину-W у мембрани повинні сприяти максимальні контакти Trp з поверхнею. Ми припускаємо, що такі контакти стабілізують Ar-Pro-Ar повороти на поверхні, яка вже має перевагу над водною фазою, ? процес, позначений нами як “конформаційна селективність”. Ця “конформаційна селективність” і є проявом загального принципу спряженості зв'язування і згортання для білкових систем з “нерегулярними” вторинними структурами.

Дослідження кінетичного контролю білкового вбудовування в мембрани

За визначенням, кінетичний контроль полягає в існуванні залежності енергії системи від того шляху, яким ця система опинилася в даній точці конформаційного простору. На відміну від цього, за термодинамічного контролю енергія залежить лише від конформаційної координати, в якій ця система перебуває зараз. Характерною рисою кінетичного контролю є існування перехідних “метастабільних” конформацій у процесі вбудовування білків у мембрану. Наступним завданням була ідентифікація таких конформацій при взаємодії нативного і мутантних форм цитохрому b₅ i мелітину з різними ліпідними мембранами.

Термічна активація переходу між двома кінетично відмінними формами цитохрому b5. Характеризацію переходу цитохрому b₅ з вільної у міцно зв'язану форму, існування яких пов'язувалося або з вибором ліпіду, або з методом реконструкції білка в ліпідний бішар (Enoch, Strittmatter, 1979; Tennyson, Holloway, 1986), проводили шляхом вимірювання температурної залежності відносних квантових виходів флуоресценції нативного і мутантного неполярного пептиду цитохрому b₅ (NPP) у ПОФХ. Перше температурне сканування (відкриті символи) проходить через незворотний перехід. Однак, якщо тільки проба була один раз нагріта, температурна залежність укладалася в пряму лінію (затемнені символи) незалежно від того, гріється проба чи охолоджується. Наведені вище дані показують, що взаємодія цих двох пептидів з мембраною не може бути описана одноступінчастим процесом. До досягнення кінцевої конформації білок має проходити через метастабільний “передзв'язаний” стан. Перехід із цього стану в стабільнішу конформацію досягається лише нагріванням до температури вище 50 ^оС і є незворотним.