Молекулярно-біологічні аспекти білково-мембранних взаємодій: термодинамічний і кінетичний контроль вбудовування

Наявність двох чи більше станів при мембранній взаємодії нагадує попередні спостереження двох типів взаємодії b₅ з мембранами. Тому здавалося логічним порівняти обмінюваність b₅ у передінкубованому та інтактному станах. Експериментальний протокол був таким: b₅ (нативний або мутантний) змішували з ПОФХ везикулами в молярному співвідношенні 1:400, що забезпечує повне зв'язування білка. Після інкубації протягом 3 год при температурі 25 ^оС пробу розділяли на дві частини; одну порцію інкубували ще 4 год при 25 ^оС, другу ? витримували протягом 20 хв при 50 ^оС, щоб мембранозв'язуючий домен набув свою кінцеву конформацію (подальше нагрівання могло б призвести до суттєвої втрати гему). Далі проби повертали до 25^оС і до кожної з них додавали рівні кількості 9,10-БФХ везикул, так що білково-ліпідне співвідношення складало 1:800. Втрату інтенсивності флуоресценції вимірювали з огляду обміну білка з ПОФХ у БФХ везикули.

Як видно з цього рисунка, після початкового падіння інтенсивності флуоресценції внаслідок розведення подальше зменшення відбувалося зі швидкістю, яка залежала від попередньої термічнoї обробки зразка. Швидкість обміну мутантного цитохрому b₅ між ПОФХ і БФХ везикулами є повільнішою у випадку зразка, що зазнав попередньої інкубації при підвищеній температурі.

Ми передбачаємо таку послідовність подій у процесі зв'язування b₅ з ліпідною везикулою. Спочатку білок зв'язується з мембраною в метастабільному “передзв'язаному” стані. На цій стадії зв'язування дуже нестійке, і білок може легко обмінюватися. Для переходу до справді зв'язаного стану необхідно подолати енергетичний бар'єр, однак як тільки він пройдений, ця нова конформація білка стає переважаючою. Таким чином, посилена динаміка флуктуацій, індукована нагріванням (яке було описане раніше), сприяє подоланню енергетичного бар'єра. У цей момент білок міцно зв'язаний і може обмінюватися лише дуже повільно. Структурною особливістю остаточно вбудованої “міцно зв'язаної” форми порівняно з метастабільною “вільно зв'язаною“ може бути транслокація С-кінця NPP на транс-сторону мембрани.

Кінетика переходу мелітину з поверхневої в транс-мембранну конформацію у цвітеріонних мембранах. Кінетику зв'язування мелітину з мембранами можна спостерігати або по збільшенню інтенсивності флуоресценції після додавання ПОФХ, або по зменшенню її після додавання БФХ. Кінетика зв'язування є складною і залежить від виду ліпіду. Після початкового падіння інтенсивності спостерігається повільне відновлення у випадку менш глибокого залягання гасника (4, 5-БФХ) або повільне зменшення ? у випадку глибше розташованих гасників (6, 7; 9, 10 і 11, 12- БФХ). При зв'язуванні з ПОФХ повільна компонента кінетики не виявляється. Інкубація при більш високій температурі навіть призводить до сильнішої взаємодії з глибинними гасниками порівняно з поверхневими.

Для кількісного вивчення залежного від глибини гасіння флуоресценції мелітину було застосовано розроблений раніше РА. Усі параметри характеризуються складною кінетикою через переходи між різними популяціями з різною глибиною проникнення. Додатковим свідченням множинних конформацій є той факт, що дисперсія профілю гасіння на рис. 14 набагато ширша від такої для модельної сполуки, ТОЕ.

Важливо підкреслити, що кінетика гасіння ліпідом не пов'язана з кінетикою зв'язування, оскільки ніяких змін інтенсивності флуоресценції мелітину не було помічено через 10 с після додавання ПОФХ мембран. Кінетика обміну мелітину між ПОФХ і БФХ везикулами, доданими згодом (даних не наведено), демонструє наявність обмінюваної і необмінюваної форм пептиду подібно до цитохрому b₅ (див. попередній підрозділ). Включення мелітину в мембрану може бути представлено так:

*- швидке зв'язування з мембраною (часова шкала в секундах);

*- повільне занурення у бішар, що видно по збільшенню інтенсивності у випадку 4,5-БФХ та по зменшенню її у випадку інших бромоліпідів (часова шкала у хвилинах і годинах).

Ми передбачаємо таку низку подій при зв'язуванні мелітину з бішаром. Мелітин зв'язується з поверхнею мембрани. Така конформація є метастабільною, і білок може обмінюватися між везикулами. Утворення стабільної конформації призводить до переміщення Trp-19 ближче до центра бішару і залучає переорієнтацію (можливо, і агрегацію) мелітинових молекул поперек бішару. Зв'язаний мелітин характеризується повільним встановленням рівноваги між різними конформаціями білка. Зростання температури або безпосередньо полегшує транслокацію частини молекул у бішар, або робить це за рахунок збільшення латеральної дифузії у випадку залучення агрегації.

Структурно-функціональні прояви дії кінетичного контролю вбудовування мелітину в аніонні та цвітеріонні мембрани. Здатність мелітину набувати транс-бішарову орієнтацію і, як наслідок, переходити в барельно-агрегаційний стан передбачалася у вигляді основи пермеабілізації фосфохолінових везикул. Таким чином, вирішальним є питання, чи здатний мелітин набувати транс-бішарову конформацію. Відомо, що орієнтація ?-спіралі відносно мембран може бути визначена шляхом вимірювань КД спіральних пептидів, вбудованих у ліпідні бішари, орієнтовані на кварцовій пластині (орієнтований КД ОКД). Коли пластину зорієнтованo перпендикулярно оптичній осі, спіральні пептиди, розміщені паралельно поверхні мембрани, мають спектри з мінімумами на 208 і 222 нм. Пептиди, орієнтовані перпендикулярно поверхні, мають спектр з єдиним мінімумом на 222 нм.

Спектри мелітину в орієнтованих ПОФХ і ПОФГ бішарах за високого ступеня гідратації показано на панелях А і В відповідно (рис.15). Для зразків, підготовлених і врівноважених при температурі 23 ^оС, спектри ОКД мелітину як у ПОФХ, так і в ПОФГ відповідають спектрам, очікуваним для спіралей, орієнтованих паралельно поверхні бішару, про що можна судити по домінантному мінімуму на 208 нм. Після нагрівання зразків з подальшим досягненням рівноваги при 23 ^оС спектр мелітину для ПОФГ не змінювався, у той час як для ПОФХ спектр змінювався на такий з домінантним мінімумом на 222 нм (криві 2 на панелях А і В, рис. 15). Ми використали в моделюванні відносні популяції поверхневого (su) i вбудованого (in) мелітину для описання спектра пептиду в ПОФХ до нагрівання. Панель Б (рис. 15) показує, що співвідношення su:in = 1,1 задовільно пояснює спектр. Тому ми можемо зробити досить обгрунтований висновок, що мелітин здатний набувати транс-мембранну орієнтацію в ПОФХ, але не в ПОФГ. Те, що він знаходиться лише в орієнтації, паралельній ПОФХ бішарам, за відсутності нагрівання, відповідає наявності кінетичного бар'єра вбудовування, який, без сумніву, збільшується у в'язкому оточенні орієнтованих бішарів.

Функціональне значення кінетичного контролю транслокації мелітину було досліджено за допомогою розробленого нами методу визначення механізму мембранної пермеабілізації. Метод грунтується на диференційному вивільненні співінкапсульованих маркерів різного розміру. Попередньо везикули навантажували флуоресцентно міченими декстранами ФД-4 (4,4 кДа) і ФД-70 (50,7 кДа), а потім інкубували з мелітином. Відносне вивільнення двох маркерів кількісно визначається за допомогою проточної кювети, розміщеної в спектрофлюориметрі. Пептиди, що утворюють пори, які є каналами будь-якого типу з обмеженими отворами, будуть викликати витікання вмісту везикул у залежності від розмірів присутніх молекул. Однак, якщо пептид діє як детергент і “розчиняє” мембрану, то різниці у вивільненні маркерів різного розміру не повинно бути.

Встановлено, що мелітин при взаємодії зі цвітеріонними ПОФХ мембранами стимулює вивільнення обох маркерів, але пік ФД-4 значно більший від піка ФД-70 у профілі елюції (рис. 17). Це вказує, найімовірніше, на утворення за цих умов пор діаметром 25?30 Е. Показано, що, на відміну від ПОФХ, пермеабілізація аніонних ПОФГ мембран характеризується низькою селективністю ? відношення виходу ФД-4 до ФД-70 зменшується до 1,2?1,4 (порівняно з 3,8 для ПОФХ). Показано також, що ефективність пермеабілізації значно нижча в аніонних мембранах. Таким чином, можливість транслокації мелітину в транс-бішарову конформацію, зафіксована методами КД, корелює з функціональними характеристиками дії на різні мембрани. Варто додати, що розуміння природи ліпідної специфічності мембранної пермеабілізації є важливим аспектом розробки пептидних антибіотиків, які мають бути активними проти бактеріальних мембран, що несуть значний негативний заряд, і нейтральними до клітинних мембран організму. Подані нами результати висвітлюють важливість розуміння термодинамічного і кінетичного контролю мембранного вбудовування для цих і багатьох інших теоретичних і практичних завдань.

Концептуальна модель пост-трансляційного вбудовування білків у мембрану

Отримані нами результати з вивчення термодинаміки і кінетики взаємодії нативних та модельних білків і пептидів з мембранами дозволяють запропонувати наступну концептуальну модель спонтанного пост-трансляційного вбудовування білків у ліпідні мембрани.

Основною рисою моделі є наявність проміжного стану (фолдингового інтермедіату) при переході від початкової водорозчинної до остаточної мембрановбудованої форми білка. Він являє собою аналог стану “розплавленої глобули”, що є необхідним проміжним етапом фолдингу глобулярних білків, і так само характеризується високим рівнем вторинної структури і низьким рівнем нативних третинних контактів. По відношенню до ліпідного бішару білок у цьому стані знаходиться в поверхневій зоні, яка має суттєву товщину. Другою важливою рисою моделі є наявність як термодинамічного, так і кінетичного контролю над вбудовуванням білків у мембрани та формуванням функціонально активної конформації. Перехід від водорозчинної до проміжної форми перебуває під термодинамічним контролем. На противагу цьому, остаточне вбудовування відбувається здебільшого за кінетичного контролю. Поширюючи цю концептуальну модель на співтрансляційне вбудовування конституційних мембранних білків, ми пропонуємо вважати, що функція комплексу транслокону з термодинамічної точки зору полягає в подоланні кінетичного бар'єра на шляху до остаточного вбудовування, підвищуючи тим самим ефективність формування функціонально активної конформації білкової молекули.

Висновки

1. Запропоновано і обґрунтовано структурно-термодинамічну концепцію вбудовування білків в мембрани, згідно з якою спонтанне вбудовування неодмінно проходить через фолдинговий інтермедіат. Останній має конформацію, близьку до “розплавленої глобули”, і розміщується в поверхневій зоні ліпідного бішару. Передбачається, що у випадку співтрансляційного вбудовування транслоконовий комплекс призводить до зниження кінетичного бар'єра і тим самим сприяє мембранному вбудовуванню та набуттю білком активної конформації.

2. Встановлено, що вбудовування білків у мембрани та формування функціонально активної конформації перебувають як під термодинамічним, так і кінетичним контролем:

а) термодинамічний контроль здійснюється на початкових етапах вбудовування, які включають взаємодію з поверхневою зоною ліпідного бішару та формування вторинної структури білка;

б) кінетичний контроль здійснюється на подальших етапах вбудовування, а саме на стадіях формування третинної/четвертинної структури білка та встановлення остаточної (цис або транс) мембранної топології.

3. Доведено, що взаємодія білків з поверхневою зоною мембрани характеризується неадитивністю електростатичних та гідрофобних взаємодій. Запропоновано правила, які дозволяють обраховувати вільну енергію мембранного зв'язування, враховуючи обидві компоненти. Показано, що ефективний заряд пептиду обернено пропорційний його гідрофобності. Щоб обрахувати його величину, треба зменшити номінальний заряд на 20 % на кожні 3 ккал/моль гідрофобної енергії.

4. Кількісно охарактеризовано енергетичну спряженість процесу взаємодії білок-поверхнева зона мембрани з формуванням вторинної структури білка. Порівнянням енергетики мембранного зв'язування нативного та енантіомерного мелітину встановлено, що вільна енергія формування -структури в поверхневому шарі мембрани становить 0,410,06 ккал/моль на амінокислотний залишок. Аналіз енергетики кооперативного зв'язування модельного пептиду WLLLLL дозволив встановити величину вільної енергії формування -структури, яка дорівнює 0,50.1 ккал/моль на залишок.

5. Розроблено, вдосконалено та впроваджено в науково-дослідну практику низку флуоресцентних методів вивчення термодинамічних, кінетичних і структурно-функціональних характеристик білково-мембранних взаємодій. Створено експериментальні і обчислювальні підходи, що дозволяють мінімізувати і коригувати артефактні ефекти розсіювання світла у флуоресцентних експериментах з мембранами. Запропонований метод розподільного аналізу, який дає змогу визначати не лише глибину занурення флуоресцентного зонда в мембрани, а й ступінь його експонованості в ліпідну фазу. Розроблено флуоресцентні методики характеризації білкових пор у мембранах.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Ladokhin A.S. Fluorescence spectroscopy in peptide and protein analysis // Encyclopedia of Analytical Chemistry: Instrumentation and Applications / Ed. R.A. Meyers. - New York: John Wiley and Sons, 2000. - P. 57625779.

2. Ladokhin A.S. Distribution analysis of depth-dependent fluorescence quenching in membranes: a practical guide // Meth. Enzymol. 1997. - Vol. 278. - P. 462473.

3. Ladokhin A.S., Wimley W.C., Hristova K., White S.H. Mechanism of leakage of contents of membrane vesicle determined by fluorescence requenching // Meth. Enzymol. 1997. - Vol. 278. - P. 474486.

4. White S.H., Wimley W.C., Ladokhin A.S., Hristova K. Methods for determining the energetics of peptide-bilayer interactions // Meth. Enzymol. 1998. - Vol. 295. - P. 6287.

5. Ладохин А.С. Равновесная динамика белка. Изучение собственной флюоресценции мелитина // Биополимеры и клетка. - 1990. - Т. 6, № 4. _ C. 8490.

6. Ladokhin A.S., Wang L., Steggles A.W., Holloway P.W. Fluorescence study of a mutant cytochrome b5 with a single tryptophan in the membrane binding domain // Biochemistry. 1991. - Vol. 30, N 42. - P. 1020010206.

7. Ladokhin A.S., Malak H., Johnson M.L., Lakowicz J.R., Wang L., Steggles A.W., Holloway P.W. Frequency-domain fluorescence of mutant cytochrome b₅ // Time-resolved laser spectroscopy in biochemistry III. Proceedings SPIE. - 1992. - Vol. 1640. - P. 562569.

8. Ladokhin A.S., Holloway P.W., Kostrzhevska E.G. Distribution analysis of membrane penetration by depth dependent fluorescence quenching // J. Fluorescence. 1993. - Vol. 3, N 2. P. 195197.

9. Ladokhin A.S., Wang L., Steggles A.W., Malak H., Holloway P.W. Fluorescence study of a temperature induced conversion from the "loose" to the "tight" binding form of membrane-bound cytochrome b5 // Biochemistry. 1993. - Vol. 32, N 27. - P. 69516956.

10. Tretyachenko-Ladokhina V.G., Ladokhin A.S., Wang L., Steggles A.W., Holloway P.W. Amino acid substitutions in the membrane-binding domain of cytochrome b5 alter its membrane-binding properties // Biochim. et biophys. acta. 1993. - Vol. 1153, N 2. - P. 163169.

11. Ladokhin A.S., Wimley W.C., White S.H. Leakage of membrane vesicle contents: Determination of mechanism using fluorescence requenching // Biophys. J. 1995. - Vol. 69, N 5. - P. 19641971.

12. Ladokhin A.S., Holloway P.W. Fluorescence of membrane-bound tryptophan octyl ester. A model for studying intrinsic fluorescence of protein-membrane interactions // Biophys. J. 1995. - Vol. 69, N 2. - P. 506517.

13. Ladokhin A.S., Holloway P.W. Fluorescence quenching study of melittin-membrane interactions // Укр. біохім. журн. 1995. - Т. 67, № 2. - С. 3440.

14. Ladokhin A.S., Brand L. Evidence for an excited-state reaction contributing to NADH fluorescence // J. Fluorescence. 1995. - Vol. 5, N 1. - P. 99106.

15. Petrushenko Z.M., Negrutskii B.S., Ladokhin A.S., Budkevich T.V., Shalak V.F., El'skaya A.V. Evidence for the formation of an unusual ternary complex of rabbit liver EF-1 with GDP and deacylated tRNA // FEBS Lett. 1997. - Vol. 407, N 1. - P. 1317.

16. Ladokhin A.S., Selsted M.E., White S.H. Bilayer interactions of indolicidin, a small antimicrobial peptide rich in tryptophan, proline, and basic amino acids // Biophys. J. 1997. - Vol. 72, N 2. - P. 794805.

17. Ladokhin A.S., Selsted M.E., White S.H. Sizing membrane pores in lipid vesicles by leakage of co-encapsulated markers: Pore formation by melittin // Biophys. J. 1997. - Vol. 72, N 4. - P. 17621766.

18. White S.H., Wimley W.C., Ladokhin A.S., Hristova K. Protein folding in membranes: pondering the nature of the bilayer milieu // Biol. skr. Kgl. dan. Vid. selsk. 1998. - Vol. 49. - P. 99106.

19. Wimley W.C., Hristova K., Ladokhin A.S., Silvestro L., Axelsen P.H., White S.H. Folding of -sheet membrane proteins: a hydrophobic hexapeptide model // J. Mol. Biol. 1998. - Vol. 277, N 5. - P. 10911110.

20. Ladokhin A.S. Evaluation of lipid exposure of tryptophan residues in membrane peptides and proteins // Anal. Biochem. 1999. Vol. 276, N 1. P. 6571.

21. Ladokhin A.S., Selsted M.E., White S.H. CD spectra of indolicidin antimicrobial peptides suggest turns, not polyproline helix // Biochemistry. 1999. - Vol. 38, N 38. - P. 1231312319.

22. Ladokhin A.S., White S.H. Folding of amphipathic -helices on membranes: Energetics of helix formation by melittin // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 285, N 4. - P. 13631369.

23. Ladokhin A.S. Analysis of protein and peptide penetration into membranes by depth-dependent fluorescence quenching: Theoretical considerations // Biophys. J. 1999. - Vol. 76, N 2. - P. 946955.

24. Ladokhin A.S. Red-edge excitation study of non-exponential fluorescence decay of indole in solution and in a protein // J. Fluorescence. 1999. - Vol. 9, N 1. - P. 110.

25. Ladokhin A.S., Jayasinghe S., White S.H. How to measure tryptophan fluorescence in mem branes properly, and why bother? // Anal. Biochem. 2000. - Vol. 285, N 2. - P. 235245.

26. Osapay K., Tran D., Ladokhin A.S., White S.H., Henschen A.H., Selsted M.E. Formation and characterization of a single Trp-Trp crosslink in indolicidin that confers protease stability without altering antimicrobial activity // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, N 16. - P. 1201712022.

27. Ladokhin A.S., White S.H. Protein chemistry at membrane interfaces: Non-additivity of electrostatic and hydrophobic interactions // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 309, N 3. - P. 543552.

28. Ladokhin A.S. On the interpretation of decay-associated spectra in proteins // Біополімери і клітина. - 2001. Т. 17, № 3. - С. 221224.

29. White S.H., Ladokhin A.S., Jayasinghe S., Hristova K. How membranes shape protein structure // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276, N 35. - P. 32395-32398.

30. Ladokhin A. S., White S. H. Alphas and taus of tryptophan fluorescence in membranes // Biophys. J. - 2001. - Vol. 81, N 3. - P. 1825-1827.

31. Ladokhin A.S., White S.H. `Detergent-like' permeabilization of anioinic lipid vesicles by melittin // Biochim. et biophys. аcta. - 2001. - Vol. 1514, N 2. - P. 253260.

32. Ladokhin A.S. Structural dynamics of aqueous and membrane-bound melittin // Book of Abstracts III Congr. Eur. Soc. Photobiology. Вudapest, 1989. - Р. 243.

33. Ladokhin A.S., Wang L., Steggles A.W., Malak H., Lakowicz J.R., Holloway P.W. Fluorescence study of a mutant cytochrome b5 with a single tryptophan in the membrane-binding domain // Abstracts of the Fifth Symposium of the Protein Society. - Baltimore, 1991. - P. 129.

34. Ladokhin A.S., Chikishev A.Yu., Kamalov V.F., Lebedeva N.V. Equilibrium dynamics of melittin studied by intrinsic fluorescence // Biophys. J. 1991. - Vol. 59. - P. 359a.

35. Ladokhin A.S., Kostrzhevska E.G., Shcherbatska N.V., Demchenko A.P., Holloway P.W. Study of melittin-membrane complex. Evidence for heterogeneity in depth distribution of protein // FASEB J. - 1992. - Vol. 6. - P. A85.

36. Ladokhina-Tretyachenko V.G., Ladokhin A.S., Wang L., Steggles A.W., Holloway P.W. Studies of cytochromes b5 with amino acid residues in the membrane binding domain replaced by leucine // FASEB J. - 1992. - Vol. 6. - A85.

37. Ladokhin A. S., Brand L. Steady-state and dynamic fluorescence of NADH in solution and bound to liver alcohol dehydrogenase // Biophys. J. - 1993. -Vol. 64, N 2. - P. A53.

38. Ladokhin A.S. Distribution analysis of membrane penetration by depth dependent fluorescence quenching // Biophys. J. - 1993. - Vol. 64, N 2. - P. A290.

39. Ladokhin A.S. Configurational relaxation of the solvent shell of the indole fluorophore in solution and in a protein // Biophys. J. 1995. - Vol. 68, N 2. P. A192.

40. Ladokhin A.S., Selsted M.E., White S. H. Interaction of antimicrobial peptide with membranes // Biophys. J. - 1996. -Vol. 70, N 2. - P. A447.

41. El'skaya A.V., Negrutskii B.S., Petrushenko Z.M., Ladokhin A.S., Budkevich T.V., Shalak V.F. A possible role of EF-1 in tRNA/aminoacyl-tRNA channeling during higher eukaryotic protein synthesis // FASEB J.- 1997. -Vol. 11. - P. A1233.

42. Ladokhin A.S., White S.H. Partitioning-folding coupling: Energetics of melittin folding on membranes // Biophys. J. 1998. - Vol. 74, N 2. - P. A305.

43. Ladokhin A.S., White S.H. Interplay of hydrophobic and electrostatic interactions in membrane partitioning of unfolded peptides // Biophys. J. 1999. - Vol. 76, N 1. - P. A68.

44. Ladokhin A.S. Evaluation of lipid exposure of tryptophan residues in membrane proteins and peptides // Biophys. J. 2000. - Vol. 78, N 1. - P. A162.

45. Ladokhin A.S., White S.H. Protein folding in membranes: Thermodynamic measurements of helix insertion // Biophys. J. 2000. - Vol. 78, N 1. - P. A14.

46. Ladokhin A.S., Jayasinghe S., White S.H. How to measure tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? // Biophys. J. - 2000. -Vol. 78, N 1. - P. 127A.

47. Ladokhin A.S., Isas J.M., Haigler H.T., White S.H. Interface-directed membrane insertion of proteins: from a general concept to an insertion pathway // Biophys. J. - 2001. -Vol. 80, N 1. - P. 539A.

Размещено на Allbest.ru