Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи In Vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи In Vitro

03.00.20 -- біотехнологія

доктора біологічних наук

Сатарова Тетяна Миколаївна

Київ -2002 рік

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті зернового господарства УААН, м. Дніпропетровськ.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Чугункова Тетяна Володимирівна, Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,

доктор біологічних наук, професор Мітрофанова Ольга Володимирівна, Нікітський ботанічний садНаціональний науковий центр УААН, головний науковий співробітник біотехнології і вірусології рослин,

доктор біологічних наук Попова Антоніна Федорівна, Інститут ботаніки ім.М.Г.Холодного, старший науковий співробітник відділу клітинної біології і цитології.

Провідна установа: Національний ботанічний сад ім. М.М. Гришка НАН України, м.Київ

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою м. Київ, вул. Заболотного, 148.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, к.б.н. О.А. Кравець

Анотація

Сатарова Т.М. Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи in vitro. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 -- біотехнологія. -- Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2002 рік.

Визначено генетичні, екологічні, цитологічні та морфологічні особливості індукції андрогенезу в культурі пиляків різних генотипів кукурудзи, охарактеризовано процеси калусогенезу і регенерації в культурі пилкових ембріоїдів та особливості рослин-регенерантів андрогенетичного походження. Показано, що здатність до індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи визначається різним співвідношенням адитивних і домінантних ефектів, а також взаємодією неалельних генів, причому умови зовнішнього середовища здатні впливати на наявність та силу прояву генних ефектів.

Розроблено методичні основи пророщування незрілих зародків кукурудзи в ембріокультурі in vitro, яка використовується при переведенні ліній кукурудзи на цитоплазматичну чоловічу стерильність та в інших селекційних програмах.

Створено біологічні технології отримання андрогенних рослин кукурудзи в культурі пиляків in vitro та одержання додаткових генерацій рослин протягом року за рахунок використання ембріокультури in vitro.

Ключові слова: андрогенез, культура пиляків in vitro, ембріоїдогенез, калусогенез, регенерація, ембріокультура, кукурудза.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Кукурудза - це культура, яка володіє великими потенційними можливостями в одержанні високих врожаїв, а також різноманіттям господарського використання. Проблема збільшення виробництва її зерна залишається одним з актуальних завдань аграрного виробництва. Головний резерв збільшення валових зборів зерна кукурудзи полягає у підвищенні врожайності на основі ефективного використання генетичних можливостей нових внесених до “Реєстру сортів рослин України” і перспективних гібридів. Їх створення вимагає інтенсифікації селекційного процесу на основі широкого використання результатів досліджень з біотехнології, молекулярної біології, генетичної інженерії.

Відомо, що результати біотехнологічних розробок здатні суттєво впливати на різні сторони селекційного процесу. Це може бути збільшення генетичного різноманіття вихідного матеріалу, оптимізація процесів добору, розмноження цінних генотипів та інші технології, що базуються на використанні методів генетичної та клітинної інженерії (Кучук, Глеба, 1997; Созинов, 1997). Серед цих напрямків особливе місце займають біотехнології, націлені на прискорення процесу селекції. Значне прискорення створення нових ліній і гібридів у кукурудзи може бути досягнуто за рахунок використання явищ андрогенезу і ембріокультури in vitro. Експериментальний андрогенез в культурі пиляків - це комплекс процесів, пов'язаних з переходом пилкового зерна з гаметофітного на спорофітний шлях розвитку. Він полягає в одержанні новоутворень з гаплоїдних пилкових зерен, а з них - рослин-регенерантів, які після обробки поліплоїдизуючими речовинами перетворюються на гомозиготні диплоїдні рослини, що можуть використовуватися в селекції як інбредні лінії. Процес одержання такої лінії традиційними методами потребує 5-7 років, а в разі використання андрогенезу термін створення гомозиготного матеріалу скорочується до одного року. Ембріокультура, тобто культивування ізольованих зародків з метою пророщування на різних етапах їх розвитку, здатна скоротити витрати часу на вирощування рослин в селекційних програмах переведення ліній на цитоплазматичну чоловічу стерильність, проведення насичуючих схрещувань та інших.

На початку нашої роботи існували відомості про можливість культивування пиляків кукурудзи з одержанням рослин-регенерантів, були розроблені склади живильних середовищ та деякі умови культивування (Anon., 401 Research Group, 1975; Genovesi, Collins, 1982; Petolino, Jones, 1986), однак відтворення одержаних результатів виявилося для цієї культури серйозною проблемою. Спроби зрозуміти особливості індукції розвитку пилкових зерен за спорофітним шляхом, процесів калусогенезу, соматичного ембріогенезу та регенерації, які при цьому відбуваються, зіткнулися з відсутністю теоретичного обґрунтування характеру їх протікання та взаємозв'язків на клітинному, тканинному та організменому рівнях.

У теперішній час існують суперечливі думки щодо генетичного контролю ознак, які складають явище андрогенезу in vitro, слабо вивчено вплив зовнішніх і внутрішніх факторів на процеси, що відбуваються при культивуванні пиляків, не визначено співвідношення та характер взаємодії генетичних і середовищних факторів у виникненні і розвитку андрогенних структур. Дискусійним лишається питання про типи розвитку пилкового зерна починаючи з різних етапів генезису пиляка. Не розкриті можливі шляхи морфогенезу, що приводять до регенерації рослин, та інші процеси, які відбуваються в постіндуктивний період. Все це веде до неспроможності оптимізувати параметри процесу андрогенезу і виходу регенерантів. Постає необхідність розробки комплексу умов, спрямованих на збільшення одержання андрогенних рослин, який ув'язував би між собою різні етапи цього процесу. Актуальним завданням стає вивчення усіх перелічених питань для розширеного кола ліній і гібридів. Таким чином, дослідження загальних теоретичних основ процесів соматичного ембріогенезу, калусогенезу та морфогенезу, спрямовані на підвищення ефективності андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи, тобто розроблення наукових основ створення біотехнології одержання андрогенних рослин у кукурудзи, є актуальними.

Ембріокультуру, як основу технологій прискорення селекційного процесу, у кукурудзи не досліджено, не розроблено теоретичні та методичні засади проростання ізольованих зародків різного віку і одержання з них проростків та дорослих рослин, а також не розкриті потенційні можливості використання цього процесу в селекції. Отже актуальною є розробка основних принципів одержання рослин кукурудзи з ізольованих незрілих зародків та залучення їх до генетико-селекційних досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у лабораторії біотехнології Інституту зернового господарства Української академії аграрних наук відповідно до тематичних планів досліджень:

“Ввести кукурузу в культуру in vitro и разработать теоретические основы воспроизводимой системы “растение-клетка-растение” с целью использования в селекции” (1986-1990 р.р., N держреєстрації 01870042463),

“Розробити методи вирощування кукурудзи в культурі in vitro, створити на їх основі біологічні технології в селекції і впровадити ці технології в селекційні програми” (1992-1995 р.р., N держреєстрації UA01000781P) в рамках етапів - Н3. “Розробити методики і технології одержання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній за допомогою культури пиляків кукурудзи” і Н4. “ Використати метод ембріокультури кукурудзи для одержання додаткових генерацій на рік при створенні стерильних аналогів”,

“Створити і впровадити в селекційний процес біологічні (клітинні) технології селекції високоврожайних, стійких до хвороб, шкідників і абіотичних стресів форм кукурудзи, які базуються на використанні культури ізольованих органів, тканин і клітин” (1996-2000р.р., N держреєстрації 0197U000089) в рамках етапу - 02. “Розробити і впровадити в селекційні програми біологічні технології відбору високоврожайних, стійких до хвороб, шкідників і абіотичних стресів форм кукурудзи, які базуються на використанні культури гаплоїдних тканин та клітин”.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було визначено розроблення теоретичних основ андрогенезу та ембріокультури у кукурудзи in vitro та створення біологічних технологій одержання рослин в культурі пиляків та зародків.

Виходячи з цієї мети було визначено задачі дослідження:

Дослідити генетичні основи процесу індукції андрогенезу у кукурудзи на базі:

вивчення андрогенетичного потенціалу різних генотипів,

визначення характеру успадкування здатності до індукції андрогенезу,

визначення комбінаційної здатності за ознаками, що характеризують індукцію андрогенезу, та виявлення генотипів-донорів високої чутливості у культурі пиляків.

Вивчити характер впливу внутрішніх та зовнішніх факторів на процес індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи.

Визначити співвідношення генетичної детермінації та паратипової мінливості у розвитку андрогенезу in vitro.

Проаналізувати морфологічні, цитоембріологічні та гістологічні особливості розвитку андрогенних пилкових зерен, ембріоїдів і калусів кукурудзи.

Дослідити вплив генотипу та зовнішніх факторів на процеси калусогенезу і регенерації в культурі пилкових ембріоїдів.

Вивчити біологічні особливості рослин-регенерантів кукурудзи пилкового походження.

На основі теоретичного обґрунтування процесів індукції андрогенезу та постіндукційного розвитку андрогенних структур розробити біологічну технологію одержання рослин в культурі пиляків кукурудзи.

Визначити роль генетичних, онтогенетичних та зовнішніх факторів у прояві здатності до проростання in vitro ізольованих незрілих зародків різних генотипів кукурудзи.

Оцінити форми застосування методу ембріокультури та розробити технологію одержання додаткової генерації рослин для залучення до генетико-селекційних досліджень у кукурудзи.

Об'єкт дослідження - процеси андрогенезу та ембріокультури in vitro.

Предмет дослідження - процеси андрогенезу та ембріокультури у різних генотипів кукурудзи in vitro.

Методи дослідження. Основним методом, використаним у роботі, є метод культури клітин, тканин та органів на штучному живильному середовищі. На базі цього методу досліджувалося широке коло питань функціонування ізольованих пиляків та зародків різних генотипів кукурудзи. При вивченні особливостей успадкування застосовували генетичний аналіз. Для з'ясування структурно-функціональних закономірностей генезису пилкових зерен, ембріоїдів, калусів та рослин-регенерантів на клітинному та тканинному рівнях використовували цитоембріологічний та гістологічний методи, а для контролю за процесами росту та розвитку різноманітних структур - морфометричний метод спостережень. Цитологічний метод було вжито для підрахунку кількості хромосом у регенерантів. Біохімічний метод прикладали для аналізу гетерогенності потомства пилкових регенерантів.

Вирощування донорних рослин та потомства рослин-регенерантів проводили польовим методом, а також в умовах вегетаційного досліду у теплицях та камерах штучного клімату. Для одержання конкретного генотипу донорних рослин, а також для апробації та застосування результатів роботи у селекційному процесі використовували методи селекції - гібридизацію та відбір.

Методи варіаційної статистики було використано для оцінки достовірності та імовірності прояву тих чи інших закономірностей.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено аналіз андрогенетичної здібності вісімдесяти генотипів кукурудзи. Дістало подальший розвиток обґрунтування особливостей генетичної обумовленості андрогенетичних процесів in vitro у кукурудзи. Вперше здійснено вивчення успадкування здатності до індукції андрогенезу в системі діалельних схрещувань. Вперше аналіз генетичного контролю індукції новоутворень в культурі пиляків кукурудзи проведено за участю вихідного матеріалу андрогенетичного походження. Визначено комбінаційну здатність самозапилених ліній у відношенні андрогенезу. Показано, що індукція новоутворень та регенерація рослин визначаються адитивною, домінантною дією алельних генів, а також взаємодією неалельних генів, причому умови зовнішнього середовища здатні суттєво впливати на наявність та силу прояву окремих генних ефектів.

Вивчено вплив різноманітних факторів на індукцію андрогенезу і охарактеризовано роль та співвідношення впливу генотипу, паратипових факторів та їх взаємодії. Вперше детально вивчено дію умов вирощування донорних рослин у польовий і тепличний періоди на ефективність культивування пиляків різних генотипів, визначено оптимальні умови холодової передобробки та оптимальну стадію експлантації пиляків. Вперше показано різний характер андрогенетичної активності пиляків кукурудзи при культивуванні на контрастних за консистенцією живильних середовищах, вивчено характер дії таких регуляторів росту як 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота та аміпрофосметил.

На цитоембріологічному рівні з'ясовано процеси, що відбуваються у пилкових зернах під час холодової передобробки. Дістало подальший розвиток уявлення про морфофізіологічні процеси, що мають місце у проембріональний та ембріональний періоди розвитку пилкових зерен за спорофітним шляхом. Вперше охарактеризовано гістологічні особливості будови різних типів пилкових ембріоїдів.

Вперше вивчено вплив внутрішніх та зовнішніх факторів на процеси калусогенезу і регенерації в постіндуктивний період розвитку пилкових ембріоїдів. Виявлено різноманіття шляхів морфогенезу в постіндуктивний період та запропоновано їх класифікацію, охарактеризовано гістологічні особливості різних типів калусів пилкового походження. Оптимізовано комплекс умов культивування, направлений на підвищення індукції новоутворень і регенерації, та представлено технологію одержання андрогенних рослин в культурі пиляків кукурудзи.

Вперше охарактеризовано вплив генотипу та віку незрілих зародків кукурудзи на проростання в умовах in vitro. Розроблено оптимальні режими культивування для одержання міцних проростків. Розроблено технологію скорочення періоду вирощування рослин та одержання додаткових генерацій, запропоновано шляхи використання ембріокультури кукурудзи в генетико-селекційних дослідженнях.

Практичне значення одержаних результатів. Виділено генотипи, які можуть служити донорами високої здатності до індукції андрогенезу. Виявлений характер успадкування та інші запропоновані методи оцінки дозволяють прогнозувати андрогенетичну здатність селекційних форм кукурудзи, вести відбір на підвищення цієї ознаки. Виявлені шляхи морфогенезу в культурі пиляків можуть бути застосовані в програмах з одержання гаплоїдів, клонування, сомаклональної мінливості. Запропоновано до практичного використання комплекс оптимальних умов передобробки, склади живильних середовищ для індукції соматичного ембріогенезу, калусогенезу, регенерації, умови культивування пиляків, ембріоїдів, калусів, регенерантів, терміни експлантації та трансплантації, що складає технологію одержання андрогенних рослин. Розроблений метод ембріокультури дозволяє скорочувати період вирощування рослин кукурудзи і на цій базі одержувати додаткові генерації протягом року, що значно скорочує селекційний процес. Розроблені методи використовуються в селекційних програмах Інституту зернового господарства УААН та рекомендовані науковим установам, що займаються селекцією кукурудзи.

Вихідний матеріал андрогенетичного походження використовується в селекційних програмах Інституту зернового господарства. Гібриди кукурудзи Дніпровський 335 МВ та Дніпровський 453 СВ, створені з використанням ембріокультури, передано до системи Держсортовипробування. Гібрид Дніпровський 335 МВ за підсумками випробувань 2001 року визнано перспективним, випробування гібрида Дніпровський 453 СВ тривають.

Результати, одержані в роботі, розвивають уявлення про генетичний контроль, співвідношення генотипової та паратипової мінливості ознак, структурно-функціональні особливості та різноманіття морфогенетичних процесів у розвитку андрогенезу та ембріокультури in vitro і вносять вклад в розробку генетичних та фізіологічних основ теорії культивування ізольованих клітин, тканин та органів квіткових рослин, зокрема злаків.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто досліджені генетичні, екологічні та морфофізіологічні аспекти індукції андрогенних структур і регенерації рослин в культурі пиляків та зародків різних генотипів кукурудзи, розроблено комплекс оптимальних умов культивування, запропоновано шляхи впровадження результатів досліджень в селекційний процес. Автор приймав безпосередню участь у плануванні, проведенні експериментів та аналізі результатів лабораторних і польових досліджень. Окремі види аналізів виконано спільно зі співробітниками лабораторій біотехнології, селекції, штучного клімату та біохімії Інституту зернового господарства УААН.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідалися на Міжнародній конференції “Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибірськ, 1988), IV Всесоюзній науковій конференції “Экологическая генетика растений, животных и человека” (Кишинів, 1991), Всесоюзній конференції з сільськогосподарської біотехнології (Цілиноград, 1991), VI з'їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів (Полтава, 1992), XII Міжнародному конгресі зі статевої репродукції у рослин (Коламбус, 1992), XIII Міжнародному конгресі зі статевої репродукції у рослин (Відень, 1994), Міжнародній конференції з агробіотехнологій рослин та тварин (Київ, 1997), II Міжнародному Симпозіумі з рослинної біотехнології (Київ, 1998), Міжнародній конференції, присвяченій 90-річчю від заснування Інституту рослинництва імені В.Я.Юр'єва УААН (Харків, 1999), Науково-практичній конференції Придніпровського наукового центру “Аграрна наука - виробництву” (Дніпропетровськ, 2000), Міжнародній конференції “Достижения и проблемы использования гаплоидии в селекции кукурузы” (Краснодар, 2000), I Всеукраїнській науково-практичній конференції “Україна наукова, 2001” (Дніпропетровськ, 2001), VII з'їзді Українського товариства генетиків та селекціонерів (Крим, 2002), на наукових семінарах відділу селекції Інституту зернового господарства УААН і кафедри фізіології рослин та екології Дніпропетровського національного університету.

Публікації. Результати дисертації опубліковано у 39 друкованих роботах, в тому числі в 27 статтях (20 в фахових виданнях), 11 матеріалах і тезах конференцій, одержано 1 авторське свідоцтво на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 537 сторінках машинописного тексту. Вона складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, двох розділів (п'яти підрозділів), що вміщують власні дослідження та їх обговорення, висновків та переліку використаних джерел літератури. До тексту дисертації входять 137 таблиць та 45 малюнків. Перелік використаних джерел вміщує 514 найменувань.

Основний зміст

В огляді літератури розглядаються публікації щодо культивування пиляків та зародків кукурудзи in vitro з різноманітними цілями, аналізується стан вивченості проблем андрогенезу та ембріокультури, обґрунтовується вибір мети та задач дослідження.

Матеріали та методи

Матеріалом для дослідження служили різні генотипи кукурудзи (Zea mays L.), серед яких були лінії, гібриди і популяції. Випробування і впровадження розроблених технологій проведено на матеріалі, що входить у селекційні програми Інституту зернового господарства УААН. Основним експериментальним матеріалом були ізольовані пиляки і незрілі зародки кукурудзи.

Вирощування донорних рослин і рослин-регенерантів проводили польовим методом, а також в теплицях і камерах штучного клімату відповідно до методики В.С. Столяренка та ін. (1991, 1992). Холодову передобробку волотей і пиляків здійснювали при температурі 8оС протягом 14 діб. У залежності від задач дослідження до культивування залучали пиляки від стадії вакуолізованої мікроспори до стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна. Основними середовищами у культурі пиляків були середовища YP за A. Genovesi, G. Collins (1982) та N6 за C.Chu et al. (1975), різні модифікації яких представлено в описах відповідних експериментів. Спостереження за розвитком пилкових зерен, ембріоїдів і калусів проводили на тимчасових та постійних мікроскопічних препаратах, виготовлених за загально прийнятою методикою (Паушева, 1970). Вивчення аномалій розвитку пилку до і після холодової передобробки проводили на свіжому нефіксованому матеріалі. Розвиток пилкових зерен, ембріоїдів і калусів in vitro вивчали на матеріалі, фіксованому фіксаторами FAA і Карнуа. Тимчасові препарати пилку фарбували гематоксиліном за Генденгайном та фуксинсірчистою кислотою за Фьольгеном. Постійні препарати фарбували фуксинсірчистою кислотою за Фьольгеном, гематоксиліном за Генденгайном, Ерліхом, сафраніном за Картисом, алціановим синім. Для виявлення запасних речовин використовували реактив Люголя для фарбування крохмалю і проціонові барвники для одночасного забарвлювання білків і вуглеводів за В.Б. Івановим і Т.К. Литинською (1967). Число хромосом у клітинах корінців регенерантів підраховували після фарбування ацетоорсеїном. Електрофоретичний аналіз запасних білків - зеїнів у потомства пилкового регенеранту і вихідних форм проводили за методикою Ф.А. Поперелі та ін. (1989).

Зародки кукурудзи у віці 12 - 21 доби після запилення висаджували на живильне середовище MSзар., яке вміщувало неорганічні компоненти MS, 0,25 мг/л тіаміну, 0,25 мг/л піридоксину, 1,30 мг/л нікотинової кислоти, 0,25 мг/л пантотенату кальцію, 7,70 мг/л гліцину, 30 г/л цукрози та 3,5 г/л агару і на базі якого проводили оптимізацію одержання проростків у ембріокультурі.

Вирощування регенерантів проводили при температурі 22-27оС і 16- годинному фотоперіоді.

Основними показниками, за якими характеризували період індукції в культурі пиляків кукурудзи, були “частота реакції пиляків (%)” і “кількість новоутворень на 100 культивованих пиляків (шт.)”. “Частоту повної регенерації (%)” визначали як процентне відношення кількості ембріоїдів, що утворили пагін і корінці, до числа трансплантованих ембріоїдів. В окремих випадках регенерацію характеризували ще і за кількістю рослин на 100 експлантованих або чутливих пиляків.

Генетичний аналіз успадкування здатності до індукції андрогенезу і регенерації рослин за половинною діалельною схемою та для потомств двох батьківських ліній здійснювали за М.О. Федіним та ін.(1980), К. Мазером, Дж. Джинксом (1985) та П.П. Літуном, М.В. Проскурніним (1992). Визначення комбінаційної здатності вели за методами 2 і 4 B.Griffing (1956) у викладенні Н.В. Турбіна та ін. (1966) і П.П. Літуна, Н.В. Проскурніна (1992).

Математичну обробку методами дисперсійного та кореляційного аналізу проводили за Б.О. Доспєховим (1965), М.О. Плохінським (1970), Г.П. Лакіним (1990). При визначенні кореляційного зв'язку між здатністю до андрогенезу і погодними умовами року користувалися даними, наданими метеостанцією м.Дніпропетровська. Основні терміни культури клітин, тканин та органів in vitro вжито згідно з (Калинин, Сарнацкая, Полищук, 1980; Терминология роста и развития высших растений, 1982; Батыгина, 1984).

Андрогенез в культурі пиляків кукурудзи. Особливості індукції андрогенезу in vitro. Генетичні особливості процесу індукції новоутворень

Оцінку здатності до індукції андрогенезу у різних генотипів кукурудзи проводили при дотриманні однакових умов культивування (польове вирощування донорних рослин, холодова передобробка волотей протягом 14 діб при 8 С, тверде живильне середовище індукції YP).

В результаті досліджень встановлено, що здатність до індукції новоутворень в культурі пиляків кукурудзи значною мірою детермінується генотипом. З 84 досліджених генотипів новоутворення були одержані у 52, що складає 61,9%. Приблизно 70% реагуючих генотипів у зазначених умовах були низькочутливими. Лінії в цілому мали дуже слабку здатність до індукції новоутворень або взагалі їх не давали. Виняток склала лише лінія андрогенетичного походження And44. Пиляки донорних рослин гібридної природи були більш чутливими, ніж лінійний донорний матеріал, а гібриди, складені з двох нечутливих ліній, були здатні продукувати новоутворення. Середньо- і високочутливими генотипами визначено В14Wf9 (максимальна “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків”, відповідно, 17,70 % і 38,46 шт.), And046 (В14 Wf9) (7,00 % і 9,67 шт.), Wf9 LН148 (5,68 % і 8,40 шт.), And44 (12,14 % і 29,57 шт.), Wf9 В14 (10,99 % і 28,13 шт.), Wf9 And44 (4,41 % і 8,32 шт.) та деякі інші. Гібридні комбінації, складені з чутливих простих гібридів, були чутливими, хоч мали показники індукції нижчі або інколи на рівні батьківських гібридів. Одержана через культуру пиляків лінія And44 мала підвищену у порівнянні з вихідним гібридом здатність до андрогенезу (за даними 1995 року “частота реакції пиляків” And44 -- 12,14%, “кількість новоутворень на 100 пиляків” -- 29,57 шт., вихідного гібрида H99xWf9, відповідно, 1,32% і 1,70 шт.). Порівняння показників індукції новоутворень для And44, батьківського гібрида та її гібридів із самозапиленими лініями (табл.1) свідчить про ефективність відборів на підвищену андрогенетичну здатність через культуру пиляків і про можливість розширення генетичної бази андрогенезу за рахунок гібридів між одержаною в культурі пиляків лінією і самозапиленими лініями.

Таблиця 1. Індукція новоутворень в культурі пиляків лінії кукурудзи андрогенетичного походження And44 і гібридів за її участю

* - дані в одній колонці з однаковою літерою недостовірно розрізняються на рівні значущості 0,01; ** - гібрид, в культурі пиляків якого було одержано лінію And44.

Під час аналізу показників індукції андрогенезу прямих та зворотних гібридів реципрокний ефект відмічено лише в окремих комбінацій в окремі роки. У одних і тих же реципрокних гібридів в різні роки позитивний материнський ефект виказували різні батьківські лінії, при цьому перевищення показників за рахунок реципрокних ефектів було незначним (для “частоти реакції пиляків” воно становить 0,34-4,07%, для “кількості новоутворень на 100 пиляків” -- 0,34 - 9,87 шт.). Все це вказує на нестабільність реципрокного ефекту і на головну роль ядерних генів у визначенні андрогенетичної здатності.

Аналіз успадкування здатності до індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи проведено в системі діалельних схрещувань з одночасним визначенням комбінаційної здатності ліній, а також на основі оцінки середніх потомств, одержаних від схрещування двох вихідних форм.

Генетичний аналіз в системі діалельних схрещувань 5 ліній -- And44, Wf9, B14, LH148 i H99 проводився за ознаками “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків” для ліній і прямих гібридів F1. Він включав визначення компонентів генетичної мінливості, графічний аналіз регресії (Wr/Vr) та визначення генетичних параметрів. В нашому експериментальному матеріалі батьківські форми були представлені інбредними лініями. Інформація щодо впливу цитоплазматичних генів на андрогенетичну активність кукурудзи в літературі відсутня, а в наших дослідженнях реципрокний ефект був нестабільним. Дані щодо множинного алелізму та порушень розщеплення у мейозі відсутні. Об'єднаний коефіцієнт регресії коваріанси на варіансу (Wr/Vr) для кожного параметра був суттєвим (b=0,84±0,14 для “частоти реакції пиляків”, b=0,65±0,16 для “кількості новоутворень на 100 пиляків”, t0,01=5,8 при df=n--2=3) і достовірно не відрізнявся від одиниці, тобто, ефекти неалельної взаємодії та залежного розподілу генів відсутні.Таким чином, обидві ознаки у даній експериментальній схемі визначаються адитивно-домінантною генетичною системою.

Достовірність середніх квадратів a i b (табл.2) свідчить про наявність адитивності і домінування. Несуттєвість b1 вказує на те, що ефекти домінування неоднонаправлені. Достовірність b2 свідчить, що домінантні гени неоднаково розподілені між лініями. Звідси, середній квадрат a включає не тільки адитивну варіансу, але і долю варіанси, пов'язану з ефектами домінування. Достовірність b3 вказує на існування специфічних для кожного схрещування домінантних ефектів, які не пов'язані з b1 i b2.

Таблиця 2. Дисперсійний аналіз даних діалельної таблиці показників індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи

* - достовірно для рівня значущості 0,01.

Графіки регресії Wr/Vr для ознак “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків” представлено на рис.1 і 2. Так як лінії регресії на графіках перетинають позитивну частину осі Wr, середній ступінь домінування за усіма локусами неповний, причому сила його прояву дещо розрізняється для двох досліджуваних ознак. Середній ступінь домінування вказує, що в успадкуванні здатності до індукції андрогенезу у даної групи ліній визначену роль відігріють адитивні ефекти, хоч і не дуже велику, оскільки лінії одиничного нахилу перетинають позитивну частину осі Wr на невеликій відстані від початку координат, тобто, домінування наближається до повного (проходження лінії через початок координат свідчить про наявність повного домінування). На графіках точки ліній H99, LH148 і Wf9 розташовані на початку ліній регресії таким чином, що співвідношення між домінантними і рецесивними алелями у них наближається до 100:0. Для “частота реакції пиляків” у B14 таке співвідношення дещо менше за 50:50, а у And44 наближається до 25:75. Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” у B14 і And44 співвідношення домінантних і рецесивних генів близьке до 25:75. Лінія And44 несе найбільшу частку рецесивних алелів, які визначають збільшення індукції андрогенезу, на що вказує, зокрема, розташування її координатних точок на найбільш віддаленій ділянці регресії.

Розрахунок генетичних параметрів для двох досліджуваних ознак (табл.3) показує, що для “частоти реакції пиляків” відношення H1/D незначно менше одиниці, тобто має місце неповне домінування, але різниця між “повним” і “неповним” його проявом невелика. Ще менша вона в кожному локусі (vH1/D=0,92), тобто, домінування наближається до повного. Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” значення H1/D і vH1/D навіть дещо перевищують одиницю, що свідчить про наявність повного домінування і навіть про незначне зверхдомінування. На провідну роль ефектів домінування вказує і значна різниця між коефіцієнтами спадкоємності в широкому та вузькому розумінні. Величина ?F/vD(H1-H2) для обох параметрів відрізняється від одиниці, тобто рівень домінування змінюється в різних локусах. Оскільки параметри H1 і H2 не дорівнюють один одному, домінантні і рецесивні алелі, що впливають на ознаки, нерівномірно розподілені між батьківськими лініями. Асиметрія їх розподілення підтверджується відхиленням відношення H2/4H1 від 0,25 і достовірністю середнього квадрату b2. Позитивний знак F свідчить про перевищення кількості або ефектів домінантних алелів над рецесивними в даному наборі ліній і гібридів.

Таблиця 3. Генетичні параметри, що характеризують успадкування індукції андрогенезу in vitro у кукурудзи

Оцінка типів ефектів генів у розвитку тієї чи іншої ознаки може також бути проведена на основі аналізу середніх значень ознаки у двох вихідних форм, їх гібридів першого і другого поколінь та двох беккросних генерацій. В роботі було використано дві інбредні батьківські лінії: Wf9 (P1) і And44 (P2), а також їх гібриди F1 i F2 та два беккроси -- F1xP1 (B1) i F1xP2 (B2). В даній експериментальній системі визначали типи ефектів генів в контрастних екологічних умовах, а саме за культивування пиляків на твердому та рідкому живильних середовищах, які суттєво розрізняються за впливом на інтенсивність андрогенезу (Сатарова, 1999), та за вирощування донорних рослин в різні роки (2000 р. і 2001 р.), коли умови польового вирощування донорів відрізнялися. Перевірка отриманих даних за тестами масштабності Мазера показала, що тести А, В, і С суттєво відрізняються від нуля. Тим самим, адитивно-домінантна модель, яка враховує тільки ефекти адитивності та домінування, виявляється неадекватною. В табл.4 представлено оцінки ефектів генів за моделлю, яка враховує наявність взаємодії неалельних генів. Для “частоти реакції пиляків”, яка визначалася за культивування на твердому середовищі, достовірними були негативні ефекти гомозиготно-гетерозиготної і позитивні ефекти гетерозиготно-гетерозиготної взаємодії (j- і l-ефекти). Для “кількості новоутворень на 100 пиляків” розвиток ознаки на твердому середовищі визначався негативним домінуванням, значними негативними j-ефектами і позитивними l-ефектами. Оскільки знаки параметрів [h] i [l] протилежні, в даній експериментальній системі треба констатувати дуплікатний епістаз, тобто той тип взаємодії неалельних генів, який супроводжується зниженням рівня домінування (термін “дуплікатний епістаз” надається у відповідності до термінології, прийнятій у (Мазер, Джинкс, 1985)). Порівняння дії ефектів генів для “кількості новоутворень на 100 пиляків” на рідкому середовищі у різні роки (“частоту реакції пиляків” на рідкому середовищі визначити неможливо) показує стабільний характер успадкування, а саме наявність стійкої негативної адитивності, відсутність домінування, наявність позитивних i-ефектів і негативних j-ефектів. Умови року впливали лише на наявність або відсутність l-ефектів.

Таблиця 4 Оцінки ефектів генів для ознак, що характеризують індукцію андрогенезу in vitro у кукурудзи

*, ** - ефект є достовірним відповідно для рівнів значущості 0,05 і 0,01.

Порівняння характеру генетичного контролю андрогенезу на твердому та рідкому середовищах за показником “кількість новоутворень на 100 пиляків” показує, що стабільними факторами у розвитку даної ознаки є негативні ефекти гомозиготно-гетерозиготної взаємодії ( j-ефекти), а характерними лише для рідкого середовища - відсутність домінування, активізація позитивних i-, l-ефектів та зниження частки негативних j-ефектів, що і приводить до збільшення даної ознаки на рідкому середовищі у порівнянні з твердим.

Таким чином, аналіз успадкування різними методами в цілому засвідчує, що індукція новоутворень в культурі пиляків кукурудзи визначається різним співвідношенням адитивності і домінування, а також взаємодією неалельних генів, причому умови зовнішнього середовища здатні впливати на наявність та силу прояву окремих ефектів генів.

Оцінка комбінаційної здатності в системі діалельних схрещувань ліній And44, Wf9, B14, LH148 i H99 проводилася за методами 2 і 4 Гріффінга (за методом 2 до експериментальної схеми включаються батьківські лінії та прямі гібриди F1, а за методом 4 -- лише прямі гібриди F1). В нашому дослідженні високими ефектом ЗКЗ і варіансою СКЗ володіла лінія And44, яка підтвердила свою здатність до індукції у різних гібридних сполученнях. Лінії, які мають одночасно високий або середній ефект ЗКЗ та низьку варіансу СКЗ, рекомендується використовувати при створенні синтетичних популяцій для проведення нових циклів відборів (Домашнев, Дзюбецкий, Костюченко, 1992). Такими лініями у нашому дослідженні були В14 та Wf9. Лінії And44 та Wf9, варіанса СКЗ котрих більша за варіансу ЗКЗ, в гібридних комбінаціях можуть перевищувати значення, що очікуються на основі середньої цінності ліній. Порівняння результатів аналізу комбінаційної здатності за методами 2 і 4 Гріффінга в цілому дало однаковий прогноз у виборі ліній для специфічних високогетерозисних комбінацій та створення синтетичних популяцій, але виявило розходження для окремих ліній в оцінках ефектів ЗКЗ і варіанс СКЗ. Включення в аналіз батьківських форм значно збільшувало варіанси ЗКЗ та СКЗ, особливо для “частоти реакції пиляків”. Оскільки вихідним матеріалом для одержання андрогенних регенерантів слугують перш за все гібридні комбінації, у подальшому аналіз комбінаційної здатності слід проводити за методом 4, який і розрахований на використання саме прямих гібридів діалельної схеми.

В обговоренні до даного пункту на основі аналізу та порівняння власних та літературних даних обговорюються особливості розподілу генотипів, чутливих в культурі пиляків, серед генофонду кукурудзи, пропонується пояснення різкого розходження чутливості у рослин інбредної і гібридної природи, порівнюється характер успадкування андрогенетичної здатності у кукурудзи та інших культур, обговорюються можливі шляхи розширення кола чутливих генотипів та збільшення андрогенетичної здатності у комерційної зародкової плазми кукурудзи, що витікають з отриманих автором результатів.

Вплив різноманітних факторів на індукцію новоутворень в культурі пиляків кукурудзи

Процес одержання новоутворень в культурі пиляків визначається не тільки періодом культивування експлантата in vitro, а і передкультуральним періодом - періодом вирощування донорних рослин. Тому усі фактори, що так чи інакше зачіпають процес індукції, можна поділити на фактори, що діють на донорну рослину, і умови, що впливають безпосередньо на експлантат in vitro.

З факторів передкультурального періоду ми вивчали вплив умов вирощування донорних рослин, холодової передобробки та стадії розвитку пилкового зерна на індукцію андрогенезу.

В ході роботи з культивування пиляків деякі генотипи вивчалися нами протягом 5-7 років в однакових умовах, що дозволяє характеризувати мінливість індукції андрогенезу залежно від погодних факторів, які складалися у тому чи іншому році. Дисперсійний аналіз засвідчив достовірний вплив такого фактора як “рік досліджень” на показники індукції новоутворень у вивчених генотипів. Було показано наявність суттєвого позитивного зв'язку показників індукції з дією таких складників погоди як максимальна температура повітря червня (r=0,7) i сума опадів за січень - квітень (r=0,8), негативного зв'язку з сумою опадів за травень - липень (r= -0,7), а також комплексного впливу цих погодних факторів.

Порівняння результатів тепличного і польового вирощування донорів показало, що в зоні проведення експериментів рослини кукурудзи, вирощені у осінньо-зимовий тепличний період, дають знижену індукцію новоутворень, а рослини зимово-весняної тепличної генерації мають високу андрогенетичну здатність не тільки у порівнянні з рослинами осінньо-зимової тепличної, але і в порівнянні з рослинами польової генерацій. Аналіз ефективності різних джерел освітлення у період тепличного вирощування показав, що використання лампи ДРЛ-700 з максимумами випромінювання в областях 545 і 577 нм негативно відбивалося на розвитку донорних рослин і приводило до відсутності андрогенетичної реакції. Освітлення лампами ДНаТ-400 (з максимумами в області 560 - 610 нм), ДНаТ-400 + ДНаТЦ-400 (з максимумами в областях 620, 670 і 700 нм) і ДРИ-2000-6 (з максимумами в областях 450, 530, 580 - 590 нм) за здатністю викликати індукцію в культурі пиляків наближається до природного.

Вивчення впливу способу холодової передобробки температурою 80С протягом 14 діб на індукцію новоутворень показало, що для переважної більшості досліджених генотипів холодова передобробка пиляків (після посадки) була більш ефективною, ніж холодова передобробка волотей ( до посадки).

Дослідження впливу стадії розвитку пилкового зерна на процес індукції новоутворень виявило, що пиляки на стадії 1-клітинного вакуолізованого пилкового зерна хоч і більш чутливі, ніж на стадіях невакуолізованої мікроспори і вакуолізації, однак у переважної більшості генотипів дають невелику кількість новоутворень. Набагато ефективнішою виявилася стадія молодого 2-клітинного пилкового зерна (табл.5). На цій стадії були вищими мінімальні та максимальні значення показників частоти реакції і числа новоутворень та зменшився розмах варіювання між окремими рослинами.

З факторів культурального періоду вивчали вплив на індукцію новоутворень складу живильного середовища і температури культивування пиляків. Порівняння мінеральних основ середовищ індукції YP i N6 засвідчило доцільність використання у подальших експериментах солей YP. Застосування 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) у концентраціях 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 і 1 мг/л на фоні середовища YP в цілому мало негативний вплив на індукцію і привело до зниження реакції пиляків і кількості новоутворень порівняно з контролем. Дослідження впливу консистенції живильного середовища показало, що використання рідкого середовища порівняно з твердим того ж складу приводить до помітного зростання кількості новоутворень у переважної більшості вивчених генотипів (табл.6), однак їх морфо-анатомічні особливості перешкоджають повноцінній регенерації.

Таблиця 5. Вплив стадії розвитку пилкового зерна на індукцію новоутворень в культурі пиляків різних генотипів кукурудзи

+ - стадія 1-клітинного вакуолізованого пилкового зерна; ++ - стадія молодого 2-клітинного вакуолізованого пилкового зерна; *,** - достовірне відповідно для рівнів значущості 0,05 і 0,01 перевищення показника на стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна у порівнянні зі стадією 1-клітинного вакуолізованого пилкового зерна.

Вивчення дії поліплоїдизуючих агентів на показники індукції показало, що колхіцин в концентрації 0,025 % не впливає, а в концентраціях 0,05 і 0,1 % пригнічує індукцію. Аміпрофосметил (APM) на фоні рідкого середовища у концентрації 5 /л залежно від генотипу погіршував, не зачіпав або навіть стимулював процес індукції новоутворень. На фоні твердого середовища ця речовина в тій же концентрації не мала суттєвого впливу на показники індукції. При додаванні 10 /л АРМ новоутворення отримані не були.

За підвищеної температури культивування (32С) утворення починали з'являтися з пиляків приблизно на три доби раніше, ніж за температури 27С. Тривалість процесу їх виходу з пиляка скорочувалася з 21 - 51 до 18 - 29 діб. Процес індукції при 32 С в цілому інгібувався і закінчувався появою меншої кількості новоутворень.

Загалом в експериментах з вивчення впливу зовнішніх факторів на індукцію андрогенезу відзначено достовірний вплив генотипу, вивчених середовищних факторів, а також взаємодії генотипового і паратипових факторів. Сила впливу генотипового фактора для “частоти реакції пиляків” коливалася навколо 3,86±0,03% в експериментах з вивчення факторів передкультурального періоду.

Таблица 6. Вплив консистенції живильного середовища на показник “кількість новоутворень на 100 пиляків”

*, ** -- достовірне перевищення показника для даного генотипу для рівнів значущості, відповідно, 0,05 і 0,01; YPтв. -- тверде середовище YP, YPрід. -- рідке середовище YP.

Для показника “кількість новоутворень на 100 пиляків” цей вплив підвищувався у середньому до 8,78±0,03% у передкультуральний і 24,50±0,05% у культуральний періоди. Середній вплив паратипових факторів склав 1,43±0,02% для “частоти реакції” в передкультуральний період, а для “кількості новоутворень на 100 пиляків” - 4,34±0,03% у передкультуральний і 3,63±0,05% у культуральний періоди, тобто в цілому був менший за вплив генотипового. Взаємодія “генотип х фактор” відігравала суттєву роль для всіх досліджених факторів, у деяких експериментах перевищуючи навіть силу впливу генотипу.

В обговоренні до даного пункту розглянуто перелічені вище питання з урахуванням літературних даних, проаналізовано можливі причини значного варіювання показників індукції новоутворень.

Цитологічні та морфологічні особливості індукції андрогенезу у кукурудзи

В даному пункті аналізується процес виникнення і розвитку новоутворень в культурі пиляків. Цитологічні та морфологічні закономірності їх формування, ступінь тотипотентності і диференціації, будова у стані зрілості мають особливе значення, тому що представляють базу для розгортання кінцевого етапу андрогенезу -- регенерації рослин.

Встановлено, що під час холодової передобробки має місце незначний розвиток пилку, причому в разі обробки холодом експлантованих пиляків спостерігається інтенсивне заповнення пилкових зерен крохмалем та іншими сполуками. Природна стерильність незрілого пилку у досліджених генотипів знаходилася на рівні 2-3% і суттєво не змінювалася при холодовій передобробці волотей. За дії холоду на експлантовані пиляки стерильність пилку у всіх вивчених генотипів зростала, причому значно сильніше, якщо пиляки протягом передобробки знаходилися на рідкому, аніж на твердому середовищі.

В процесі холодової передобробки в деякій частині пилкових зерен відбувалися такі проандрогенетичні події, як поділ генеративної клітини, поділ вегетативної клітини та рівний поділ у пилковому зерні. Це вело до виникнення багатоядерних (3-4-ядерних) та 3-клітинних пилкових зерен, нетипових для нормального ходу мікрогаметогенезу.Такі події не спостерігалися в пиляках, що не пройшли холодову передобробку.

Наші дані з вивчення ранніх етапів розвитку за посадки пиляків на стадії 1-клітинного вакуолізованого зерна свідчать, що переважно вегетативна клітина активна і розвивається в культурі. Генеративна клітина при цьому теж поділяється, але швидко дегенерує. Ми спостерігали розвиток вегетативної клітини за типом ценоциту, в якому пізніше проходили процеси клітиноутворення. В рідких випадках відмічено рівний поділ в мікроспорі. За експлантації пиляків на стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна активно поділяється генеративна клітина, причому ці поділи завжди супроводжуються цитокинезом, а клітини, що утворилися, формують новоутворення, які реєструються на виході з пиляка.

На основі аналізу дев'яти генотипів показано зв'язок між кількістю структур пилкового походження у пиляку на 15-у добу культивування зі стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна і кінцевими показниками індукції - “частотою реакції пиляків” і “кількістю новоутворень на 100 пиляків” (r=0,83; r=0,78). Одержані дані дозволяють рекомендувати проведення діагностики андрогенетичної здатності генотипів за відсотком андрогенних пилкових зерен на ранніх етапах культивування.

Кількість новоутворень, що виходять з одного пиляка, складає від одного до тридцяти. За великої кількості новоутворень на пиляк на твердому середовищі вони були і великими, і дрібними, а на рідкому середовищі - в основному дрібними. В цілому модальним класом кількості новоутворень на пиляк був клас з одним, інколи двома новоутвореннями, але генотипи варіювали за максимальною їх кількістю на пиляк, що відбивалося на такому показнику як продуктивності пиляків. Відносно високим цей показник був у лінії And44 (3,30 новоутворень на чутливий пиляк) та гібридів за її участю (до 4,37 шт.).

За нашими спостереженнями розвиток переважної частини новоутворень супроводжується виділенням ембріоїдодерми, появою суспензора та тіла ембріоїду та закінчується формуванням зародкової осі та прокамбіального тяжа, тобто проходить шляхом ембріоїдогенезу (соматичного ембріогенезу). Сформований ембріоїд має у своєму складі щиток та зародкову вісь, на якій розташовані епікотиль та меристема кореня, замкнена в колеоризу, отже за будовою є подібним до зиготичного зародка кукурудзи. У рідких випадках (10 випадків за 14 років досліджень) зустрічалися структури, що не мали упорядкованої будови і які слід віднести до типу первинних безкольорових, повільно ростучих калусів. Такі калуси гинули через 2-4 тижні після виходу з пиляка.

Ембріоїди на виході з пиляка можна розділити на дві категорії, а саме: 1) цупкі, за кольором білі або жовті і 2) обводнені безкольорові. За культивування на твердому живильному середовищі з'являються обидві категорії, але переважають цупкі. На рідкому живильному середовищі цупкі ембріоїди розвиваються у дуже невеликій кількості, переважають безкольорові обводненні. Не встановлено впливу генотипу на частоту формування тієї чи іншої категорії ембріоїдів на твердому середовищі, і відмічено вплив генотипу на їх співвідношення за індукції на рідкому середовищі.

Зрілі цупкі білі або жовті ембріоїди були складені з щільноупакованих клітин багатокутової форми з товстими оболонками і густою цитоплазмою. Щиток мав 1-2 - шарну епідерму з малою кількістю крохмалю. В окремих місцях вона була модифікована у багатошарну епідермальну тканину. Субепідермальний шар звичайно розвивався у багатоклітинну тканину і відрізнявся суперпродукцією крохмалю. Наповнення його клітин безліччю крохмальних зерен вело до різноманітних клітинних аномалій, таких як роздавлювання ядра крохмальними зернами, поява ядер неправильної форми, поява 2-ядерних клітин за рахунок розриву клітинної стінки та злиття ядер. В паренхімі центральної частини щитка також спостерігалося інтенсивне накопичення крохмалю, але ядра тут мали нормальну морфологію, відмічено міжклітинники. Провідний пучок був представлений судинами ксилеми зі спіральними потовщеннями та флоемними елементами. Меристема пагону ембріоїда була, як правило, прикрита лише двома листковими примордіями. Спостерігали аномалії в розвитку точок росту. Часто мала місце сильна проліферація щитка, точки росту в цих випадках, як правило, були пригнічені, закриті тканиною щитка або гіпокотиля. Таким чином, поряд з нормальною будовою цупких ембріоїдів відмічено аномалії в їх структурі, які здатні вести до зниження регенераційного потенціалу.