Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи In Vitro

У обводнених безкольорових новоутворень специфічні умови живлення та аерації рідкого середовища, де вони переважно виникають, приводять до набухання і лопання щитка, а також поганої диференціації або заростання точок росту. Значна частина ембріоїдів цієї категорії мала дуже малі розміри (менше 1мм), оскільки виникала у високопродуктивних пиляках. У молодому віці обводнені безкольорові ембріоїди, як і цупкі, мали щільноупаковані клітини, хоча цитоплазма була дещо більш вакуолізованою. Зрілі ембріоїди, одержані на рідкому середовищі мали велику кількість міжклітинників, інколи навіть великі розриви усередині, їх клітини були округлої форми, бідноплазмені, часто спостерігалися клітини без цитоплазми. В клітинах обводнених безкольорових ембріоїдів крохмаль не накопичувався або відмічався у значно меншій кількості, ніж у цупких.

Стінка пиляка на момент експлантації була складена з епідермісу, ендотецію, середнього шару і залишків тапетальних клітин. Як в період раннього, так і в період пізнього андрогенезу in vitro стінка пиляка була представлена сильно вакуолізованими клітинами епідермісу, ендотецію, інколи середнього шару, і тапетальною плівкою. Ми не спостерігали розвиток ембріоїдів або калусів зі стінки пиляка ні при окомірній оцінці, ні на мікроскопічних препаратах.

В обговоренні з позицій власних та літературних відомостей розглядаються питання початку спорофітних поділів у пилковому зерні, ролі клітин пилкового зерна у розвитку андрогенних структур, обговорюється проблема відповідності розвитку соматичних зародків розвитку статевого зародка у квіткових рослин.

Постіндукційний розвиток пилкових новоутворень та регенерація рослин

Як видно з попереднього підрозділу, в культурі пиляків кукурудзи у великій кількості індукувалися ембріоїди та у незначній калуси. Ці калуси після трансплантації практично не росли і гинули через 2-4 тижні після виходу з пиляка. Таким чином основну участь в постіндукційних подіях брали ембріоїди. Ми спостерігали декілька шляхів розвитку ембріоїду після трансплантації на постіндукційне середовище. По-перше, пряму, тобто без фази калусу, регенерацію рослин. По-друге, утворення на ембріоїдах вторинних калусів, які у подальшому також могли регенерувати рослини (непряма регенерація) і формувати третинні калуси. Багатоваріантність шляхів морфогенетичних перетворень в культурі пилкових ембріоїдів кукурудзи представлена на схемі шляхів індукційного і постіндукційного розвитку, одержаних нами в культурі пиляків кукурудзи (рис.3, пунктиром показано потенційно можливий шлях регенерації). Нами були вивчені особливості основних шляхів постіндукційного морфогенезу.

Пряма регенерація рослин з пилкових ембріоїдів

Після пересадки ембріоїдів на середовища для регенерації спостерігали сполучене утворення пагона з пагонового та кореня із кореневого апексів. Щиток у проростаючих ембріоїдів, як правило, не піддавався калусогенезу. У деякої частини ембріоїдів спостерігалося порушення утворення одного з органів проростка. Відмічено вплив на регенерацію шляхом проростання ембріоїду його розміру та ступеня цупкості. Морфогенетичні реакції ембріоїдїв з рідкого індуктивного середовища (обводнених безкольорових) були майже відсутні, лише 1,62±0,43% на середовищі для регенерації виявили пагоно- та коренеутворення. Цупкі жовто-білі ембріоїди з твердого середовища індукції значно частіше реагували (17,17±1,75%) і мали значно більший регенераційний потенціал (10,09±1,40%).

У ряді випадків регенерація була одержана не тільки унаслідок розвитку меристем на зародковій осі, але і за рахунок несполученого розвитку пагонів та корінців на щитку. Останнє вказує на розвиток проростків шляхом прямого органогенезу. Внесок таких проростків у загальну регенерацію був незначним (1,16±0,22% від кількості трансплантованих ембріоїдів).

Тестування декількох видів середовищ для регенерації та розробка загальної стратегії пророщування різних за розміром та ступенем сформованості ембріоїдів показали, що оптимальною є двоетапна схема регенерації. За цією схемою всі одержані цупкі ембріоїди на першому етапі трансплантували на середовище YРr, яке складається з мінеральної основи YP, 30 г/л цукрози і 7 г/л агару, причому крихітні ембріоїди висаджували разом з пиляками. Через тиждень у деякої кількості ембріоїдів спостерігався розвиток пагону і корінця, повну регенерацію давали 17,15±1,65% ембріоїдів. Крихітні, слабко диференційовані ембріоїди за 7-добовий період після трансплантації підростали так, що в них можна було розрізнити щиток та точки росту. На другому етапі дрібні, з аномальною будовою ембріоїди, що не дали регенерацію на YРr, а також маленькі слабкі регенеранти пересаджували на середовище YРr2, яке додатково вміщувало 1 мг/л індолілмасляної кислоти і 25 мг/л яблучної кислоти. На другому етапі з усіх висаджених структур 55,51±3,30% виявляли морфогенетичні реакції у вигляді пагоно- та коренеутворення. Для їх значної частини (28,19±2,99%) вдалося одержати нормально сформовані проростки. Таким чином поетапне пророщування дозволяє одержувати рослини і з маленьких, погано розвинутих ембріоїдів.

Вплив генотипу на здатність пилкових ембріоїдів до проростання відмічено у двох з трьох років дослідження. Вивчення генетичного контролю ознак, що характеризують регенерацію рослин шляхом проростання пилкових ембріоїдів, в поколіннях від схрещування двох вихідних форм (табл.7) показало, що для ознаки “кількість рослинок на 100 чутливих пиляків” адекватною була адитивно-домінантна модель з негативною адитивністю і негативним домінуванням. На визначення ознак “кількість рослинок на 100 експлантованих пиляків” та “частота повної регенерації” істотно впливала неалельна взаємодія. Адитивність, домінування та взаємодія гомозиготно-гомозиготного типу (i-ефекти) призводили до зменшення ознаки “кількість рослинок на 100 експлантованих пиляків”. “Частоту повної регенерації” визначала взаємодія неалельних генів за типом дуплікатного епістазу, що характеризується різнонаправленістю домінування та дії l-ефектів.

Особливості вторинного калусогенезу в культурі пиляків кукурудзи

Одним із шляхів постіндукційного розвитку ембріоїдів, окрім їх проростання, був розвиток вторинних калусів на ембріоїдах. Як правило, калуси розвивалися на щитку і дуже рідко -- на зародковій осі ембріоїду.

Таблиця 7 Оцінки ефектів генів для ознак, що характеризують регенерацію рослин кукурудзи шляхом проростання пилкових ембріоїдів

*, ** - ефект є достовірним відповідно для рівнів значущості 0,05 і 0,01.

Калуси, що утворювалися на щитку, мали різну морфологію і неоднакові регенераційні можливості. Усіх їх перш за все можна розділити на два типи за здатністю підтримуватися в культурі: короткоживучі і довгоживучі.

Короткоживучі калуси з'являються на щитках пилкових ембріоїдів приблизно через два тижні після пересадки з середовища індукції на середовище для калусогенезу. Ми спостерігали утворення двох основних видів таких калусів. По-перше, це безкольоровий обводнений калус. Такий калус на мікроскопічних препаратах мав наступні особливості: поверхня калусу гладка або хвиляста, чітка епідерма відсутня, в паренхімі клітині крупні, ближче до поверхні -- витягнуті, а при просуванні усередину ембріоїду -- округлої форми, прилягають одна до одної відносно щільно, ядра проглядаються не у всіх клітинах, цитоплазма сильно вакуолізована, у багатьох клітинах відсутня, крохмаль у клітинах або присутній у невеликій кількості у вигляді дрібних зерен, або не виявляється зовсім. Руйнування клітин у центрі ембріоїду приводить до появи порожнини з залишками загиблих клітин. Безкольорові обводнені калуси під час подальшого пасивування у більшості випадків ознак морфогенності не виявляли, підтримувалися не більше 1-2 місяців, після чого буріли і гинули. Таким чином, короткоживучий безкольоровий обводнений калус є нерегенеруючим.

Інший тип короткоживучого калусу був цупким, за кольором білим або жовтим. Гістологічно ембріоїд з даним типом калусу може бути охарактеризований наступним чином. На поперечному зрізі за градієнтом надходження живильних речовин чітко виділяються три зони: основа, середня зона і верхня зона. Основа складається з відмираючих клітин з товстими клітинними оболонками і виглядає як зона деструкції. Середня зона складається з щільноупакованих клітин правильної форми з товстими оболонками, клітини сильно вакуолізовані, в центрі цієї зони є зруйновані клітини. Верхня зона має вирости на поверхні, що виникли за рахунок інтенсивних антиклінальних поділів епідермального шару та антиклінальних і периклінальних поділів в клітинах субепідермального та глибших шарів. Епідерма одношарна, її клітини густоплазмені, без крохмалю. Субепідермальний і глибші шари складаються з меристематичного типу дрібних клітин правильної форми з крупними ядрами і густою цитоплазмою. В клітинах цієї зони має місце дуже велика кількість крохмальних зерен, представлених крупними глобулами. Цупкі біло-жовті калуси у другому-третьому пасажі переходили до регенерації. Таким чином, короткоживучі цупкі біло-жовті калуси є регенеруючими. Регенерація з цього типу калусу йшла шляхом закладання численних пагонових меристем і значно меншої кількості корінців. Пагони і корінці у такому калусі розвивалися несполучено, що вказує на регенерацію шляхом непрямого органогенезу (геморизогенезу).

Проведені експерименти дозволяють вважати оптимальними наступні умови утворення короткоживучих калусів та регенерації з них: культивування цупких і безкольорових ембріоїдів на середовищі YРd3, яке вміщує 690 мг/л проліну, 10 мг/л азотнокислого срібла, 1 мг/л 2,4-Д, 30 г/л цукрози, або середовищі N6-1, яке включає 690 мг/л проліну, 10 мг/л азотнокислого срібла, 1 мг/л 2,4-Д, 20 г/л цукрози з подальшим пасивуванням отриманих на щитках калусів на середовище того ж складу і культивуванням у темряві. Для одержання регенерації цупкі калуси після закладки меристематичних пломенів необхідно пересадити на середовища YРr або YРr2 у широкі склянки, витримати 3-7 діб у темряві, а потім винести на світло. У середньому вдається одержати від одного до трьох і більше регенерантів на калус.

В сезон 1991 року у генотипу Wf9xH99 нами був одержаний і трохи інший тип короткоживучого регенеруючого калусу. Цей калус через 5 тижнів перейшов до рясного пагоноутворення. Розвиток корінців у отриманих пагонів було одержано тільки після їх пересадки на середовища для укорінення. За ознакою несполученого розвитку пагонів і корінців даний випадок морфогенезу у калусній тканині, треба віднести до непрямого гемогенезу (на короткоживучому калусі).

Якщо з цупких білих або жовтих калусів, що підтримувалися на середовищі YРd3, в четвертому-п'ятому пасажах відселектовували специфічні ділянки свіжої тканини, то під час багатократного пересаджування вони давали калусну тканину, яка була здатна підтримуватися тривалий час (третинні калуси). Таким шляхом у 1995, 1996 і 1999 роках було відібрано і розмножено довгоживучі калусні тканини генотипів Wf9xB14, B14xWf9 і Wf9xAnd44, які підтримувалися протягом 3-4 років. Усі три тканини розрізнялися за зовнішнім виглядом, що могло бути пов'язане з впливом генотипу, бути результатом відбору специфічних секторів на калусі або залежати від віку тканини. Для тканини Wf9xAnd44 на середовищі для калусогенезу і субкультивування відмічено окремі випадки утворення безкольорових і зелених листоподібних структур. Довгоживучі калуси характеризувалися морфологічним різноманіттям, а в гістологічному відношенні відрізнялися гетерогенністю ділянок, серед яких відмічено меристематичні зони.

андрогенез ембріокультура кукурудза vitro

Морфобіологічні особливості андрогенних рослин-регенерантів

Необхідно відзначити, що дорощування андрогенних регенерантів, отриманих з польових донорних рослин, приходиться на жовтень - грудень і можливе тільки в умовах штучного клімату. У зв'язку з тим, що кліматичні камери в Інституті зернового господарства УААН було цілком відключено в 1993 році, а теплиці -- в 1994 році, у даній роботі представлено результати спостережень за розвитком пилкових регенерантів, отриманих до 1994 року.

Вибірковий підрахунок кількості хромосом у кінчиках корінців показав, що андрогенні регенеранти мають половинний їх набір (n=10). Серед регенерантів були виявлені також міксоплоїдні рослини. Рослини з диплоїдною кількістю хромосом знайдені не були. В значної кількості проаналізованих рослин визначити число хромосом не вдалося через низьку мітотичну активність корінців. Гаплоїдний статус одержаних андрогенних регенерантів підтверджується також анатомо-морфологічними методами діагностики гаплоїдів. Так, довжина замикаючих клітин продихів андрогенних регенерантів була достовірно меншою, а кількість продихів достовірно більшою, ніж у контрольних диплоїдних рослин. Пилкові регенеранти мали ці показники на рівні 0,0240±0,0001 мм та 60,66±0,68 шт., тоді як контрольні рослини на рівні відповідно 0,0360±0,0002 мм та 26,03±0,40 шт. Тобто, довжина замикаючих клітин продихів у пилкових регенерантів в цілому на 33,3% менша, ніж у контрольних рослин, а кількість продихів більш, ніж у 2 рази більша, що згідно з літературними даними (Зайцева, 1968; Хохлов, Тырнов, 1976) свідчить про гаплоїдний статус рослин, отриманих в культурі пиляків.

Відомо, що через порушення в мейозі у гаплоїдів суцвіття розвиваються аномально, а самі дорослі рослини мають комплекс ознак, обумовлених наявністю тільки одного хромосомного набору (Тырнов, 1976; Тоцький, 1998). Серед отриманих нами андрогенних регенерантів більшість рослин мала зближені міжвузля, невелику висоту, низько прикріплений качан, листкові пластинки були вужчими за звичайні. Волоті у цих рослин були сухими, щуплими, не викидали пиляки, качани також були тонкими і щуплими. З 39 вивчених гаплоїдів 32 мали в пиляках стерильні пилкові зерна (стиснуті, без крохмалю), а у 7 -- спостерігали часткове викидання пиляків на волоті і наявність серед стерильного пилку виповнених, із крохмалем пилкових зерен. Потрібно відзначити, що ці останні рослини за морфологією мали “гаплоїдний” габітус, тобто відрізнялися маленькими розмірами, мали невеликі щуплі волоті, характерну для гаплоїдів форму листків. Розвиток нормальних пилкових зерен у приведених випадках ми відносимо за рахунок невеликого відсотка мікроспор, що нормально формуються в мейозі у гаплоїда. Це явище неодноразово описувалося в літературі і є результатом розподілу хромосом 0 - 10 в анафазі I мейозу (Звержанская, Шишкинская, 1976). Такий же перерозподіл хромосом гаплоїдів, що приводить до появи життєздатних гамет, імовірно, відбувався в наших експериментах і у тих квітках волоті, що розвивалися за жіночим типом. У двох таких рослин волоті ізолювали, а потім запилювали пилком довільно узятого диплоїду. На цих волотях було отримано насіння: на рослині Ando24 -- 1 зерно, на рослині Ando32 -- 9 зерен. Самі рослини при цьому мали типовий “гаплоїдний” габітус і пиляки на волотях не викидали.

У 6 дигаплоїдів, одержаних після обробки пилкових регенерантів 0,05% розчином колхіцину, волоті та качани розвивалися на своєму місці цілком нормально, випадки появи двостатевих суцвіть не відзначено. Розміри і загальний “диплоїдний” габітус дозволяли легко відрізняти ці рослини від гаплоїдів. Основною перешкодою до одержання насіння у пилкових дигаплоїдів був значний розрив у термінах квітування волоті і качана. У дигаплоїда Ando44, отриманого з гібрида H99xWf9, шляхом самозапилення було одержано 12 зерен, у дигаплоїда Ando45 з B14xWf9 - 3 зерна від самозапилення. Пилковий дигаплоїд з B14xWf9, Ando46, схрещували з квітуючими в той же період диплоїдами кукурудзи. Було запилено три качани цієї рослини й отримано насіння від схрещувань Ando46xAndo46,(H99xWf9) - 127 зерен, Ando46x(B14xWf9) - 12 зерен, Ando46x(B14xWf9) - 45 зерен. Крім того сумішшю пилку регенерантів Ando45 і Ando46 було запилено рослину гібрида B14xWf9, і отримано качан з 200 зернами генотипу (B14xWf9)xAndo45, Ando46. У інших дигаплоїдів розрив у цвітінні волоті і качана не дозволив одержати насіння.

Таким чином, у ході роботи з вивчення андрогенетичної здатності in vitro було отримано дигаплоїди, здатні зав'язувати насіння. Значна частина гаплоїдів була нездатна до розмноження, хоч в окремих випадках насіння вдалося одержати й у деяких представників цієї групи.

Для аналізу гомозиготності регенеранту Аndо44 порівнювали електрофоретичні спектри зеїнів насіння, отриманого від першого самозапилення, тобто насінин And144 між собою, а також насінин And144 і And244 (перше і друге самозапилення). Порівняння електрофоретичних спектрів усіх проаналізованих зерен And144 свідчить про їх ідентичність один одному і зернам від другого самозапилення And244. Це говорить про відсутність розщеплення за даною ознакою. Спектр пилкового регенеранту був близький, але не ідентичний спектрам ліній H99 і Wf9. Крім того, у зоні мінорних компонентів регенерант мав лінію, що не виявлялася ні в батьківської, ні в материнської ліній. Морфобіологічний аналіз показав, що дигаплоїдна лінія And44 займає проміжне положення за висотою рослин між H99 i Wf9. За кількістю діб від сходів до квітування волоті і качана And44 перевищує обидві ліній. Коефіцієнти варіації лінії And44 для вивчених показників достовірно не відрізнялися від коефіцієнтів варіації ліній H99 i Wf9. Таким чином, вирівняність й ідентичність електрофоретичних спектрів запасних білків (зеїнів) у зерен, отриманих від першого і другого самозапилень пилкового регенеранту Andо44, можуть бути доказом його гомозиготності, що добре узгоджується з результатами морфобіологічної оцінки. Електрофоретичний спектр регенеранту відрізняється від спектрів донорного гібрида і його батьківських ліній, що свідчить про одержання нової лінії.

Обговорюються власні і літературні дані стосовно впливу різноманітних факторів на калусогенез і регенерацію в культурі пилкових ембріоїдів, порівнюються особливості калусогенезу в культурі пилкових ембріоїдів і культурі зиготичних зародків кукурудзи, обговорюються характеристики пилкових рослин-регенерантів покоління А0.

Технологія одержання андрогенних регенерантів кукурудзи через культуру пиляків in vitro

У даному підрозділі наводиться біологічна технологія одержання андрогенних регенерантів кукурудзи через культуру пиляків in vitro, складена за результатами власних досліджень автора та з урахуванням літературних відомостей. Запропонована технологія ставить своєю метою отримання з пилкових зерен рослин, які можуть використовуватися в селекційних програмах з прискореного створення чистолінійного матеріалу. Окрім того, не лише рослини, але і різноманітні андрогенні структури, що виникають в ході реалізації даної технології (андрогенні пилкові зерна, пилкові ембріоїди, різні типи калусів, що походять від пилкових ембріоїдів), можуть бути застосовані в роботах з генетичної трансформації, для модельних експериментів та теоретичних досліджень в генетиці, фізіології і біотехнології рослин.

Для успішного одержання рослин кукурудзи через культуру пиляків необхідним є дотримання технологічних вимог в період вирощування та підготовки донорних рослин (підготовчий період), в період одержання з пилкових зерен ембріоїдів (індуктивний період) і в період отримання регенерантів (постіндуктивний період).

1. ПІДГОТОВЧИЙ ПЕРІОД

1.1 Визначення мети та задач роботи. На цьому етапі необхідно визначити, з якою метою проводиться одержання андрогенних регенерантів. Можливими цілями є 1) одержання гомозиготного матеріалу для використання в селекції; 2) роботи з генетичної трансформації; 3) використання гаплоїдів в якості об'єктів в модельних експериментах в генетиці, фізіології і біотехнології рослин, тощо.

1.2 Вибір донорного матеріалу. Для одержання гомозиготного матеріалу необхідно використовувати пиляки гібридів, полігібридних та синтетичних популяцій. На етапі створення останніх рекомендується вводити донори генів андрогенезу - лінії And44, B14 і Wf9. Для прогнозування андрогенетичної активності генотипів рекомендується застосовувати підрахунок андрогенних пилкових зерен після культивування пиляків зі стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна протягом 15 діб. Для робіт з генетичної трансформації структур пилкового походження у кукурудзи переважніше вводити в культуру пиляки генотипів з високою андрогенетичною здатністю: B14xWf9, Wf9xLH148, And44, And44xB14, Wf9xAnd44, Wf9xB14, Ando46x(B14xWf9). Їх також можливо використовувати у якості модельних для теоретичних досліджень у різних галузях біології. При створенні інших високочутливих генотипів відбір за фенотипом в популяціях на підвищену андрогенетичну здатність in vitro необхідно проводити з урахуванням наявності ефектів домінування і неалельної взаємодії, які приводять до неповної відповідності експресії андрогенезу у батьків і нащадків. Оцінку комбінаційної здатності за показниками “частота реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків” рекомендується проводити за методом 4 Гріффінга.

1.3 Сівба та вирощування донорних рослин. Вирощування донорних рослин проводять у полі або у штучному кліматі.В полі використовують прийняту технологію вирощування рослин кукурудзи (Методические рекомендации…, 1980). Рослини вирощують на 2-рядних ділянках по 2 рослини у гнізді. Сівбу в полі проводять в кінці квітня - на початку травня і продовжують до першої декади червня. Генотипи, для яких очікується висаджування більше 5-10 тис. пиляків, висівають у 2-3 терміни з інтервалом у тиждень. Вирощувати донорні рослини в теплиці слід з січня по квітень, використовуючи прийняту для кукурудзи методику вирощування рослин в умовах штучного клімату (Столяренко та ін., 1992). При цьому особливу увагу слід приділити вибору ламп для доосвітлення. Рекомендується використовувати типи ламп ДРИ-2000-6, ДНаТ-400 і не використовувати лампи ДРЛ-700. Кількість вирощуваних у ґрунті рослин повинна приблизно у 2 рази перевищувати кількість рослин, пиляки яких потрібно залучити на один варіант досліду.

1.4 Зрізання рослин. Рослини зрізають нижче вузла волоті у той момент, коли волоть вже прощупується, але ще не показалася у раструбі листків.

1.5 Визначення стадії розвитку пилкового зерна і відбір матеріалу для введення в культуру in vitro. На центральному стрижні визначають ділянки, де колоски мають приблизно однаковий розмір, розрізають центральний стрижень на ділянки. На початку та на кінці кожної виділеної ділянки визначають стадію розвитку пилкового зерна у пиляках. Для науково-дослідної роботи відбирають тільки пиляки верхньої квітки колоска, для отримання андрогенних регенерантів у селекційних програмах можна використовувати пиляки обох квіток, якщо вони не вміщують велику кількість стерильних пилкових зерен. Для культивування залишають ті ділянки волоті, де пиляки знаходяться на стадії молодого 2-клітинного пилкового зерна.

2. ІНДУКТИВНИЙ ПЕРІОД

2.1 Стерилізація. Матеріал стерилізують у 0,1% розчині сулеми протягом 10 хвилин або у насиченому розчині хлорного вапна протягом 12 хвилин. Промивають 5 разів стерильною дистильованою водою.

2.2 Посадка на живильне середовище для індукції. Культивувати пиляки слід на середовищі YP за Genovesі, Collins (1982), куди можливо додавання 0,025 мг/л колхіцину або 5 м/л аміпрофосметилу. За індуктивне слід використовувати тверде середовище, оскільки воно у подальшому сприяє повноцінній регенерації. Використання рідкого середовища виправдане лише тоді, коли треба дослідити потенційні можливості генотипу відносно індукції новоутворень.

2.3 Холодова передобробка. Одразу після посадки пиляки у чашках Петрі або склянках піддають холодовій передобробці температурою 8оС протягом 14 діб.

2.4 Культивування. Після завершення холодової передобробки посудини з пиляками переносять у культуральну кімнату з температурою 27оС і культивують перші 7 діб у темряві, а потім на світлі невеликої інтенсивності.

2.5 Аналіз результатів індукції. Перші новоутворення починають з'являтися через 21-24 доби від початку культивування, а останні через 42-50 діб культивування. Ембріоїди, що вже повністю вийшли з пиляка, можливо витримати на індуктивному живильному середовищі ще не більше 3 діб. Після цього терміну їх треба негайно пересадити на постіндукційне середовище. В іншому разі ембріоїд буде погано проростати або повільно утворювати калус. При аналізі результатів індукції через 6-7 тижнів культивування реєструють по кожній склянці і по кожній волоті враховуючи вже відсаджені пиляки і новоутворення: 1) кількість пиляків, що культивувалися; 2) кількість чутливих пиляків; 3) кількість новоутворень. Потім розраховують “частоту реакції пиляків” і “кількість новоутворень на 100 пиляків”.

3. ПОСТІНДУКТИВНИЙ ПЕРІОД

Хід виконання робіт в постіндуктивний період дещо відрізняється в залежності від того, очікується одержати пряму регенерацію шляхом проростання ембріоїду, чи передбачається отримати непряму регенерацію через фазу калусу.

3.1 Трансплантація з метою пророщування пилкових ембріоїдів та одержання регенерантів. Для одержання регенерації шляхом проростання пилкових ембріоїдів використовують двоетапну схему пророщування. На першому етапі чутливі пиляки разом з ембріоїдами, розміри яких не перевищують 5 мм, пересаджують у біологічні пробірки або високі склянки на середовище YPr. Ембріоїди, що не дали регенерацію, але підросли на цьому середовищі, через тиждень відсаджують в пробірки на середовище YPr2 для пророщування.

3.2 Трансплантація з метою одержання короткоживучих регенеруючих калусів на щитках пилкових ембріоїдів. Ембріоїди (без пиляків), що мають розмір більше 5 мм, трансплантують щитком догори у чашки Петрі на середовища YРd3 або N6-1 +1 мг/л 2,4-Д з подальшим пересаджуванням отриманих на щитках калусів на середовище того ж складу і культивуванням у темряві.

3.3 Одержання регенерації з короткоживучих регенеруючих калусів. Цупкі калуси після закладки меристематичних пломенів необхідно пересадити на середовища YРr або YРr2 у широкі склянки, витримати 3-7 діб у темряві, а потім винести на світло. Після розвитку значної кількості пагонових меристем та невеликих пагонів їх можна розсадити на середовища для укорінення YPr, MSзар. або PRM-1 без 6-БАП.

3.4 Пересадка регенерантів у ґрунт. Проростки андрогенних регенерантів пересаджують в пакети з 1,5 кг чорнозему, добре зволожують, накривають на 2 доби склянками та виставляють у камеру штучного клімату з температурою 27оС, 16-годинним фотоперіодом та освітленістю не менше 10 тис.люкс.

3.5 Колхіцинування та вирощування регенерантів. З метою одержання подвоєних гаплоїдів рослини-регенеранти у пакетах через тиждень після пересадки обробляють 0,125% розчином колхіцину за методикою Е.Р.Забірової та ін. (1996). Через 1-2 тижні після колхіцинування у фазі 5-6 листків рослини пересаджують разом з ґрунтом пакета у вегетаційні посудини об'ємом 10-12 літрів, заповнені чорноземом, ретельно зволожують з розрахунку 5 л на посудину при першому зрошенні, потім по 0,5 л через добу. Вирощування рослин починаючи з фази 6-ти листків і до появи волотей необхідно проводити при температурі 22оС для скорочення розриву між датами квітування волоті та качана. Після появи волоті вирощування проводять при 27оС. Режим освітлення передбачає 16-годинний фотоперіод, освітленість від 10 до 50 тис. люкс.

3.6 Самозапилення та одержання насіння. В фазі квітування у дигаплоїдів ізолюють волоть і качан та самозапилюють. Якщо волоть починає квітування раніше появи ниток качана, її зрізають і ставлять у посудину з водою у холодильник з температурою 10-15оС до появи ниток качана. Якщо у деяких рослин провести самозапилення не вдається, качани запилюють пилком донорної лінії або гібриду, з якого одержано андрогенні рослин, а отримане насіння використовують для вирощування донорних рослин для культури пиляків. Також вчиняють, якщо андрогенний регенерант має волоть, яка не викидає пиляки і не цвіте, відрізняється малою висотою рослини та має інші риси, що свідчать про його гаплоїдний, а не дигаплоїдний статус. Насіння регенерантів збирають після появи чорного шару. В разі необхідності насіння можливо підсушити при температурі 36оС протягом 2 діб.

3.7 Отримання довгоживучої калусної тканини. На базі короткоживучої калусної тканини отримують довгоживучу калусну тканину, яка витримує пасивування протягом декількох років і може використовуватися для розробки на її базі системи регенерації, створення колекції калусних культур пилкового походження у різних генотипів, одержання суспензійних культур, тощо. Для отримання такої тканини дуже важливим є відбір на короткоживучому калусі специфічних секторів свіжої тканини, здатних до швидкого росту, пересадка їх на середовище YPd3 та пасивування через 4-6 тижнів.

Запропонована технологія одержання андрогенних регенерантів кукурудзи через культуру пиляків in vitro була апробована в Інституті зернового господарства УААН. Вона дозволяє одержати залежно від генотипу до 40% частоти реакції пиляків, до 70 - 200 новоутворень на 100 пиляків та до 30 % частоти повної регенерації. Витрати часу на дану технологію від сівби донорів до збирання насіння у андрогенних регенерантів складають 9-12 місяців. Отриманий за даною технологією вихідний матеріал включено до селекційних програм Інституту зернового господарства УААН.

Розробка та застосування методу ембріокультури для вирішення завдань генетики і селекції кукурудзи. Методичні основи ембріокультури кукурудзи in vitro

У ході розробки методичних основ пророщування нестиглих зародків кукурудзи in vitro було встановлено вплив генотипу, віку і розміру зародка, складу живильного середовища та умов культивування на морфобіологічні показники проростків. Оптимальною довжиною нестиглого зародка для одержання добре розвинутих і швидкоростучих проростків є 4,5-5 мм. Ця довжина притаманна зародкам на 14-18 добу після запилення в залежності від умов культивування. Спосіб розташування зародка на живильному середовищі (щитком або зародковою віссю до середовища) не мав значення для індукції проростання, але останній варіант призводив до деформації проростків. Для пророщування незрілих зародків у якості базового нами було запропоновано використовувати модифіковане середовище MS, назване MSзар., яке вміщує неорганічні компоненти MS, 0,25 мг/л тіаміну, 0,25 мг/л піридоксину, 1,30 мг/л нікотинової кислоти, 0,25 мг/л пантотенату кальцію, 7,70 мг/л гліцину, 30 г/л цукрози та 3,5 г/л агару. Визначення ефективності додавання до цього середовища органічних домішок показало, що гідролізат казеїну в концентраціях 0,5 г/л і 1 г/л негативно впливає на ріст і розвиток проростків. 6-БАП у концентраціях 0,5 мг/л і 1 мг/л залежно від генотипу і віку зародка оказує стимулюючий або інгібуючий вплив на морфобіологічні показники проростків або не оказує ніякого впливу. Для селекційних програм з одержання додаткових генерацій за вирощування наступного покоління з незрілих зародків 6-БАП в концентрації 1 мг/л може бути використаний для 12-добових зародків. Для пророщування 14-18-добових зародків 6-БАП слід застосовувати лише після з'ясування реакції на нього конкретного генотипу. Для одержання проростків з 21-добових зародків використання 6-БАП є недоцільним. Встановлено, що оптимальна температура культивування при пророщуванні ізольованих незрілих зародків становить 270С цілодобово або 270С вдень і 150С вночі.

Застосування методу ембріокультури у генетико-селекційних дослідженнях кукурудзи

Визначення комплексу оптимальних умов пророщування нестиглих зародків дозволило використати даний метод для одержання додаткових генерацій рослин протягом року при переведенні ліній кукурудзи на цитоплазматичну чоловічу стерильність та запропонувати інші аспекти його використання в селекційному процесі.

У даному підрозділі дисертаційної роботи наведено технологію одержання додаткових генерацій за рахунок використання ембріокультури in vitro на прикладі створення стерильних аналогів ліній, яка вміщує методику відбору зернівок для пророщування, склад живильного середовища, умови стерилізації, посадки та культивування, методику пересадження регенерантів у ґрунт та параметри штучного клімату для вирощування рослин. Особливу увагу приділено заходам, що забезпечують збіг квітування материнської форми та форми-запилювача (викладення технології див. Т.Н.Сатарова, Г.Р.Пиралов Способ выращивания растений кукурузы in vitro: А.с.1695855, СССР; Сатарова, Пиралов, Дзюбецкий, 1993). Запропонована технологія порівнюється з існуючими технологіями одержання додаткових генерацій, показано ефективність використання розробки у порівнянні з наявними аналогами.

В процесі випробування даної технології були одержано додаткові генерації рослин протягом року при переведенні на ЦМС (табл.8), що суттєво прискорило створення стерильних аналогів перспективних ліній. У теперішній час прискорення переведення на ЦМС одержано для 14 ліній, дана технологія застосовується також для створення аналогів-відновлювачів і може використовуватися для скорочення часу при проведенні насичуючих схрещувань, для розмноження пізньостиглих селекційних форм і проведення відборів серед проростків, одержаних з незрілих зародків.

Таблиця 8 Вирощування додаткових генерацій протягом року при переведенні на стерильну основу ліній кукурудзи

В обговоренні до даного розділу розглядаються механізми забезпечення спокою незрілих зародків у зернівці та його порушення при ізоляції і культивуванні, а також перспективи застосування методу ембріокультури у різноманітних розділах селекційно-генетичних досліджень кукурудзи.

Висновки

В результаті виконання поставлених в даній роботі задач розроблено теоретичні основи андрогенезу і ембріокультури у кукурудзи in vitro та створено біологічні технології отримання рослин в культурі пиляків та зародків.

1. Здатність до індукції андрогенезу в культурі пиляків кукурудзи має генотипову специфічність. Донорні рослини гібридної природи більш чутливі, ніж самозапилені лінії. Охарактеризовано андрогенетичну здатність 84 генотипів кукурудзи.

2. Головна роль у визначенні здатності до індукції андрогенезу належить ядерним генам. Комплексний аналіз компонентів генетичної варіації, графіка Хеймана і генетичних параметрів засвідчує, що у розвитку ознак “частота реакції пиляків” та “кількість новоутворень на 100 культивованих пиляків” приймають участь як адитивні, так і домінантні ефекти генів. Ступінь домінування - неповний, причому сила його прояву відрізняється для двох ознак. Домінантні гени неоднаково розподілені між лініями, їх кількість перевищує рецесивні, рівень домінування варіює у різних локусах.

3.Оцінка успадкування здатності до індукції новоутворень в культурі пиляків у поколіннях батьківських ліній свідчить про існування як адитивності і домінування, так і взаємодії між гомозиготно-гомозиготним, гетерозиготно-гетерозиготним та гомозиготно-гетерозиготним станами неалельних генів. Умови зовнішнього середовища обумовлюють наявність та силу прояву окремих ефектів генів. Стабільними у розвитку індукції новоутворень незалежно від умов оточуючого середовища є негативні ефекти гомозиготно-гетерозиготної взаємодії.

4. Засвідчено ефективність відборів на підвищену андрогенетичну здатність через культуру пиляків та можливість розширення генетичної бази андрогенезу за рахунок гібридів між вихідним матеріалом андрогенетичного походження та самозапиленими лініями кукурудзи.

5. За оцінками загальної та специфічної комбінаційної здатності донором генів андрогенезу при створенні високочутливих гібридів може слугувати лінія And44, а при закладанні синтетичних популяцій для виведення ліній, чутливих в культурі пиляків, -- лінії B14 та Wf9.

6. Андрогенетична здатність в культурі пиляків кукурудзи визначається генотипом, факторами середовища та взаємодією генотип х фактор. При цьому найбільшою силою впливу на індукцію відрізняється генотип донорної рослини. Визначено оптимальні для ініціації андрогенезу умови вирощування донорних рослин, холодової передобробки, стадію розвитку пилкового зерна, склади живильних середовищ та умови культивування пиляків.

7. При вивченні цитологічних та морфологічних особливостей індукції новоутворень встановлено, що такі проандрогенетичні події як поділи генеративної і вегетативної клітин та рівний поділ в 1-клітинному пилковому зерні відбуваються ще в період холодової передобробки. При експлантації пиляків на 1-клітинній вакуолізованій стадії переважно розвивається вегетативна клітина за ценоцитним шляхом з переходом до клітиноутворення. При експлантації на 2-клітинній стадії превалює розвиток генеративної клітини за первинно клітинним шляхом.

8. Основним типом новоутворень в культурі пиляків кукурудзи є ембріоїди, які на твердому індуктивному середовищі стають цупкими біло-жовтими, а на рідкому -- обводненими безкольоровими. Зрілий андрогенний зародок має зародкову вісь з епікотилем та зародковим коренем і щиток. Відмічено порушення будови андрогенних зародків.

9. Постіндуктивний період розвитку пилкових ембріоїдів кукурудзи характеризується багатоваріантністю шляхів морфогенетичних перетворень. Пилкові ембріоїди можуть переходити до прямої регенерації за рахунок проростання або розвитку рослин з клітин щитка, до щиткового калусогенезу різних типів та непрямої регенерації в культурі калусної тканини.

10. Інтенсивність регенерації шляхом проростання пилкових ембріоїдів кукурудзи залежить від їх генотипу, розміру і консистенції, а також від складу живильного середовища. Генетичний контроль ознаки “частота повної регенерації” визначається взаємодією неалельних генів за типом дуплікатного епістазу. Адитивність, домінування та взаємодія неалельних генів гомозиготно-гомозиготного типу призводять до зменшення ознаки “кількість рослинок на 100 експлантованих пиляків”. Ознака “кількість рослинок на 100 чутливих пиляків” контролюється негативною адитивністю і негативним домінуванням.

11. Серед одержаних в постіндуктивний період пилкових калусів виділено короткоживучі та довгоживучі. Інтенсивність утворення калусів першого типу визначається консистенцією материнського ембріоїду та складом живильного середовища. Короткоживучі пилкові калуси гетерогенні за зовнішнім виглядом, гістологічною структурою та здатністю до регенерації. Окремі ділянки цупкого короткоживучого калусу здатні продукувати довгоживучі калуси, які характеризуються морфологічним різноманіттям і гістологічною гетерогенністю ділянок, серед яких відмічено меристематичні зони.

12. Дані каріологічного та морфо-анатомічного аналізу свідчать про гаплоїдний статус рослин-регенерантів кукурудзи, отриманих через культуру пиляків. Морфологічна та біохімічна оцінка дигаплоїдної лінії андрогенетичного походження And44 підтверджує її гомозиготність. Насіння отриманих андрогенних дигаплоїдів розмножено та запропоновано до використання у селекційному процесі.

13. В дослідженнях з ембріокультури кукурудзи встановлено вплив генотипу, віку і розміру зародка, складу живильного середовища та умов культивування на показники росту та розвитку проростків з незрілих зародків.

14. Дослідження впливу генетичних, онтогенетичних та зовнішніх факторів на процеси індукції новоутворень та регенерації рослин в культурі пиляків дозволило виявити оптимальні їх градації, що знайшло відображення у запропонованій біологічній технології одержання андрогенних рослин в культурі пиляків кукурудзи. На основі методу ембріокультури розроблено технологію одержання додаткових генерацій рослин та запропоновано форми її застосування в генетико-селекційних дослідженнях кукурудзи.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

Satarova T. Anther culture of maize: to the conception of responsive genotype // Abstr.II Int.Symp. on Plant Biotechnology. -- Kyiv (Ukraine), 1998. -- P.110.

Satarova T.N. Anatomical analysis of maize androgenic structures // Maize Genet. Coop. Newslett. -- 1999. -- Vol.73. -- P.27 - 28.

Satarova T.N. Cytoembryological aspects of early embryoidogenesis in maize anther culture // Frontiers in Sex.Plant Rep.Research. XIII Int. Cong. on Sex.Plant Rep. -- Vienna (Austria), 1994. -- P.148.

Satarova T.N. Types of structures induced in anther culture of maize // Abstr.XII Int.Cong. on Sex. Plant Rep. -- Columbus (USA), 1992. -- P.60.

Satarova T.N., Chernousova N.M. Relationship between cytological and cultural indices of corn anther culture ability // Maize Genet.Coop.Newslett. -- 1997. -- Vol.71. -- P.33 - 34.

Satarova T.N., Chernousova N.M. The role of weather conditions of donor plant cultivation in corn anther culture // Maize Genet.Coop.Newslett. -- 2002. -- Vol.76. -- P. 21 - 22.

Satarova T.N., Savchenko M.P., Pismenetskaya I.Y., Chernousova N.M. Biochemical and morphological estimation of the progeny of a maize anther culture regenerant // Maize Genet.Coop.Newslett. -- 2000. -- Vol.74. -- P. 26 - 27.

Сатарова Т.М. Генетичний контроль індукції андрогенезу in vitro у кукурудзи // Бюл.Інституту зернового господарства УААН. -- 2002. --№ 18-19. -- С.93 - 96.

Сатарова Т.М., Сенчішина І.В., Рак О.С. Визначення типів ефектів генів, що контролюють індукцію андрогенезу у кукурудзи // Бюл.Інституту зернового господарства. -- 2001. -- №17. -- С.37 - 41.

Сатарова Т.М., Черноусова Н.М. Андрогенез в культурі пиляків в залежности від умов та сезону вирощування донорних рослин // Питання біоіндикації та екології. -- 2002. -- Вип.7, №1. -- С.22 - 27.

Сатарова Т.М., Черноусова Н.М. Культура пиляків кукурудзи // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть. Т.1. -- К.: Логос, 2001. -- С.596 - 603.

Сатарова Т.М., Черноусова Н.М. Оценка способности к индукции андрогенеза in vitro в реципрокных гибридов кукурузы // Матеріали I-ї Всеукр.наук.-практ.конф. "Україна наукова, 2001". -- Дніпропетровськ, 2001. -- Т.9. -- С.31.

Сатарова Т.Н. Аномалии в развитии пыльцевых зерен кукурузы в связи с андрогенезом in vitro // Сельскохозяйственная биология. -- 2002. -- №3. -- С.99 - 103.

Сатарова Т.Н. Влияние 6-бензиламинопурина на эмбриокультуру кукурузы // Тр.Всесоюз.конф.по сельскохоз.биотехнологии. -- Целиноград, 1991. -- С.79-80.

Сатарова Т.Н. Влияние консистенции питательной среды на культивирование пыльников кукурузы // Тези. доповідей Міжнар.конф., присвяченої 90-річчю від заснування Інституту рослинництва імені В.Я.Юр'єва УААН. -- Харьків: Магда LTD, 1999. -- С.256 - 257.

Сатарова Т.Н. Влияние некоторых факторов на индукцию и регенерацию растений в культуре пыльников кукурузы // Бюл. Інституту зернового господарства. -- 1998. -- №6-7. -- С.72-76.

Сатарова Т.Н. Влияние полиплоидизирующих агентов на культуру пыльников кукурузы // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. -- 2001. -- Вип.9. -- Т.2. -- С.42 - 46.

Сатарова Т.Н. Влияние различных факторов на эмбриокультуру кукурузы // Вісник аграрної науки. -- 2002 . -- №4. -- С.51 - 53.

Сатарова Т.Н. Влияние способа предобработки на андрогенез в культуре пыльников кукурузы // Физиология и биохимия культ.растений. -- 2001. -- Т.33, №5. -- С.421 - 427.

Сатарова Т.Н. Влияние температуры на развитие незрелых зародышей кукурузы in vitro // Тезисов. докл. IV Всесоюз. науч.конф. "Экологическая генетика растений, животных и человека" -- Кишинев: Штиинца, 1991. -- С.429.

Сатарова Т.Н. Генетическая трансформация у кукурузы (обзор) // Вісник аграрної науки. -- 2000. -- №6. -- С.42 - 45.

Сатарова Т.Н. Генетический анализ кукурузы по способности к андрогенезу в системе диаллельных скрещиваний. -- Цитология и генетика. -- 2002. -- Т.36, № 4. -- С.49 - 52.

Сатарова Т.Н. Доращивание незрелых метелок кукурузы in vitro //Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. -- 2000. -- Вип.8. -- Т.2 . -- С.135 -143.

Сатарова Т.Н. Использование культуры пыльников для получения гаплоидов у кукурузы // Кукуруза и сорго. -- 2001. -- №4. -- С.21 - 23.

Сатарова Т.Н. Использование пыльников и пыльцы в биотехнологии кукурузы // Бюл. Інституту зернового господарства. -- 1997. -- №5. -- С.18-19.

Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников кукурузы // Материалы Междунар.конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". -- Новосибирск, 1988. --Т.2. -- С.217.

Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников кукурузы на жидкой питательной среде // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. -- 1999. -- Вип.6. -- С.135 -143.

Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников различных генотипов кукурузы // Сельскохозяйственная биология. -- 1993. -- №1. -- С.71-76.

Сатарова Т.Н. Некоторые генотипические и онтогенетические особенности реакции кукурузы в культуре пыльников // Цитология и генетика. -- 1997. -- Т.31, №3. -- С.60-65.

Сатарова Т.Н. Особенности культивирования пыльников кукурузы на примере генотипа B14xWf9 // Известия РАН. Сер.биол. -- 1994. -- №.5. -- С.771-779.

Сатарова Т.Н. Перенос чужеродных генов и наследование при генетической трансформации у кукурузы (обзор)// Цитология и генетика. -- 2001. -- Т.35, №2. -- С.60 - 65.

Сатарова Т.Н. Прямая регенерация растений в культуре пыльников кукурузы // Физиология и биохимия культ. растений. -- 2002. -- Т.34, №2. -- С.152 - 157.

Сатарова Т.Н. Ранние этапы развития структур пыльцевого происхождения в культуре пыльников кукурузы // Бот. журн. -- 2001. -- Т.86, №6. -- С.72 - 80.

Сатарова Т.Н. Способы регенерации в культуре пыльников кукурузы // Тезисы докладов Междунар.конф. по агробиотехнологиям растений и животных. -- К: Ярмарок, 1997. -- С.103.

Сатарова Т.Н., Лихолат Ю.В., Мицик Л.П., Лисовец О.И. Цитоэмбриологическое исследование эмбриоидогенеза в культуре пыльников кукурузы // Матеріали наук.читань, присвячених 100-річчю відкриття подвійного запліднення у покритонасінних рослин професором університету Святого Володимира С.Г. Навашиним. -- К., 1998. -- С.47 - 50.

Сатарова Т.Н., Пиралов Г.Р. Влияние гидролизата казеина на развитие проростков из незрелых зародышей кукурузы // Тезисы.докладов VI cъезда Укр.об-ва генетиков и селекционеров. -- Полтава, 1992. -- С.133.

Сатарова Т.Н., Пиралов Г.Р., Дзюбецкий Г.Р. Ускорение селекционного процесса кукурузы с помощью метода эмбриокультуры // Вісник аграрної науки. -- 1993. -- №8. -- С.50 - 53.

Сатарова Т.Н., Столяренко В.С., Бондарь П.С. Влияние световых условий на андрогенез кукурузы in vitro // Физиология и биохимия культ.растений. -- 1996. -- Т.28, №4. -- С.218 -222.

Способ выращивания растений кукурузы in vitro: А.с.1695855 СССР, МКИ А 01 Н 4/00/ Т.Н. Сатарова, Г.Р. Пиралов (СССР). -- № 4719631/13; Заявлено 06.05.89; Опубл. 07.12.91, Бюл.№45. -- 3 с.

Размещено на Allbest.ru