Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

«ЗАПОРІЗЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ»

МІНІСТЕРСТВА ОСВІТИ ТА НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ

дипломна РОБОТА

ВПЛИВ ГОСТРОГО ГОЛОДУВАННЯ ТА ОДНОРАЗОВОГО НАВАНТАЖЕННЯ ГЛЮКОЗОЮ НА ГЛІКЕМІЮ, ВМІСТ ЦИНКУ ТА ІНСУЛІНУ В ПАНКРЕАТИЧНИХ ОСТРІВЦЯХ У МИШЕЙ

Запоріжжя

2012

РЕФЕРАТ

У роботі 51 сторінки, 4 таблиці, 4 рисунки, було використано 45 літературних джерел, із них 6 іноземних.

Об'єкт дослідження - проби периферичної крові та зрізи підшлункової залози мишей в умовах гострого голодування та одноразового навантаження глюкозою.

Метою досліджень було встановити зміни вмісту цинку та інсуліну в панкреатичних клітинах мишей, та рівень глюкози в периферичній крові при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою. З метою виконання поставлених завдань були зібрані, оброблені й проаналізовані дані досліджень вмісту цинку та інсуліну в панкреатичних клітинах мишей, та рівню глюкози в периферичній крові мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою.

Методи дослідження - цитохімічні методи виявлення цинку та інсуліну за допомогою дитизону, альдегідфуксину та реакція 8-ТСХ, та визначення рівню глюкози а периферичній крові за методом Хаггедорна-Йенсена. У результаті досліджень були встановлені зміни, які можна віднести до ознак неспецифічного адаптаційного синдрому клітинної системи.

Наукова новизна роботи полягає в використані для проведення досліджень розробленої в нашій лабораторії цитохімічної реакції на цинк -дитизонової реакції, яка характеризується високою селективністю відносно цього металу.

Теоретичне значення роботи розширення уявлень про функціонування острівцевого апарату підшлункової залози.

Практичне значення роботи полягає в можливості діагностики патологічних станів острівцевого апарату підшлункової залози.

ЗМІСТ

• РЕФЕРАТ
• ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ СКОРОЧЕНЬ, ТЕРМІНІВ
• ВСТУП
• 1. ОГЛЯД НАУКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ
• 1.1 Ендокринна функція підшлункової залози
• 1.1.1 Концепція «панкреатичний острівець, як міні-орган»
• 1.1.2 Гормони острівців підшлункової залози
• 1.1.2.1 Проінсулін - попередник інсуліну
• 1.1.2.2 Інсулін
• 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
• 2.1 Об'єкт дослідження
• 2.2 Визначення рівня цукру в крові за методом Хаггедорна-Йенсена
• 2.3 Цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних клітинах В
• 2.4 Цитохімічна реакція альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В
• 2.5 Дитизонова реакція у панкреатичних клітинах В
• 2.6 Оцінка результатів постановки цитохімічних реакцій
• 2.7 Статистична обробка отриманих результатів
• 3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
• 3.1 Дослідження рівня глюкози в периферичній крові
• 3.2 Цитохімічні дослідження підшлункової залози мишей
• 4. ОХОРОНА ПРАЦІ
• 4.1 Загальні вимоги до безпечного проведення робіт
• 4.2 Вимоги безпеки перед початком робот
• 4.3 Вимоги безпеки під час роботи
• 4.4 Вимоги безпеки по закінченню робіт
• 4.5 Вимоги безпеки в екстремальних ситуаціях
• 4.6 Вимоги пожежної безпеки
• ВИСНОВКИ
• ПЕРЕЛІК ПОСИЛАНЬ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ, СИМВОЛІВ, ОДИНИЦЬ СКОРОЧЕНЬ, ТЕРМІНІВ

цАМФ - аденілатциклаза;

АТФ - аденінтрифосфат;

НАД - нікотинаміддинуклеотид;

НАДФ - нікотинаміддинуклеотидфосфат;

ШКТ - шлунково - кишковий тракт;

ФЕП-КК - фосфоенолпіруваткарбоксикіназа;

ФЕП - фосфоенолпіруват;

ЕПР - ендоплазматичний ретикулюм;

Дитизон - дифенілтиокарбазон;

8-ТСХ - 8-(п-толуолсульфоніламіно)-хінолін ;

ЕДТОК - етилендіамінтетраоцтової кислоти;

ДЕДТКН - диетилдитіокарбамат натрію.

ВСТУП

Підшлункова залоза відноситься до залоз зі змішаною секрецією. Ендокринна активність підшлункової залози забезпечується панкреатичними острівцями - острівками Лангерганса. В острівцевому апараті представлено декілька типів клітин:

1) б-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону;

2) в-клітини, які виробляють інсулін;

3) д-клітини, які продукують соматостатин;

4) G-клітини, які виробляють гастрин;

5) РР-клітини, які виробляють невелику кількість панкреатичного поліпептиду.

Основну масу острівцевого апарату підшлункової залози складають в-клітини приблизно 60-80%; б-клітини складають приблизно 15-20% острівцевого апарату підшлункової залози; д-клітини та РР-клітини складають приблизно 5-10% острівцевого апарату.

У в-клітинах синтезується гормон інсулін (у формі проінсуліну), в б-клітинах - глюкагон, у д-клітинах - соматостатин.

Інсулін синтезується в в-клітинах острівцевого апарату підшлункової залози, цей гормон впливає на всі види обміну речовин, він сприяє анаболічним процесам, збільшує синтез глікогену, жирів та білків, гальмує ефекти багаточисленних контрінсулярних гормонів (глюкагону, кетахоламінів, глюкокортикоїдів і соматотропіну).

Другий гормон підшлункової залози - глюкагон - виділяється б-клітинами білих отрівчатих епідермоцитів. Глюкагон являється контрінсулярним гормоном і його ефекти реалізуються в тканинах через систему вторинного посередника цАМФ. На відміну від інсуліну, глюкагон підвищює рівень цукру в крові.

Утворення інсуліну, а також глюкагону регулюється рівнем глюкози в крові. Збільшення вмісту глюкози в крові після прийому її в великих кількостях, а також при гіперглікемії, повязаній з напруженною фізичною роботою і емоціями, підвищує секрецію інсуліну. Навпаки, пониження рівня глюкози в крові гальмує секрецію інсуліну, але підвищує секрецію глюкагону. Глюкоза впливає на б- і в-клітини підшлункової залози безпосередньо.

Найбільш презентативним є визначення рівня глюкози в периферичній крові та визначення вмісту цинку в панкреатичних клітинах. Одночасно з рівнем мікроелементу визначали і рівень секреторного матеріалу, що знаходиться в комплексі із цинком.

Мета роботи - дослідити фізіологічні показники роботи підшлункової залози в мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні завдання:

1) визначити рівень глюкози в периферичній крові мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою;

2) визначення інтенсивності цитохімічної реакції 8-ТСХ в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою;

3) визначення інтенсивності цитохімічної реакції дитизону в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою;

4) визначення інтенсивності цитохімічної реакції альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою.

Наукова новизна роботи полягає у використанні для проведення розроблених у нашій лабораторії цитохімічних реакцій 8-ТСХ, дитизону та альдегідфуксину, та модифікованого методу на цинк у панкреатичних клітинах В мишей, та модифікованого методу Хаггедорна-Йенсена для визначення рівню глюкози в периферичній крові.

Теоретичне значення роботи розширення уявлень про функціонування острівцевого апарату підшлункової залози.

Практичне значення роботи полягає в можливості діагностики патологічних станів острівцевого апарату підшлункової залози.

ендокринний підшлунковий залоза глюкоза панкреатичний

1 ОГЛЯД НАУКОВОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Ендокринна функція підшлункової залози

Гістологічними дослідженнями підшлункової залози було встановлено, що в ній на ряду з секреторним епітелієм, існують особливі групи клітин - білі острівцеві епідерміоцити, які розташовані серед екзокринної тканини і називаються острівцями підшлункової залози, або острівцями Лангерганса. Ці епідерміоцити виділяють свій секрет безпосередньо в кров [3].

Маса панкреатичних острівців не перевищує 1-2% від загальної маси залози. Найбільше їх міститься у хвостовому відділі залози та невелику кількість в головному відділі. В острівцевому апараті представлено декілька типів клітин:

1) б-клітини, в котрих відбувається вироблення глюкагону;

2) в-клітини, які виробляють інсулін;

3) д-клітини, які продукують соматостатин;

4) G-клітини, які виробляють гастрин;

5) РР-клітини, які виробляють невелику кількість панкреатичного поліпептиду.

Основну масу острівцевого апарату підшлункової залози складають в-клітини приблизно 60-80%; б-клітини складають приблизно 15-20%; д-клітини та РР-клітини складають приблизно 5-10% [1].

1.1.1 Концепція «панкреатичний острівець, як міні-орган»

Було встановлено, що б-, в- і д-клітини в панкреатичних острівцях людини та щура розташовані в визначеному порядку. У поверхневому кірковому шарі б- та д-клітини лежать вперемішку та прилягають до зовнішнього шару в-клітин. «Мозковий шар», або сердцевина острівця, повністю складається з в-клітин [5,2].

Показано, що в кірковому шарі острівцевих клітин поблизу дванадцятипалої кишки синтезується панкреатичний поліпептид. Функція панкреатичного поліпептиду невідома.

Взаємодія між острівцевими клітинами досить різноманітна: одні клітини утворюють з сусідніми щільні контакти, тоді як інші з'єднуються щільовими контактами. Щільові контакти володіють низьким опором і забезпечують безперервність цитоплазми сусідніх клітин. Такі щілини існують не тільки між клітинами одного типу (в-в), але і між клітинами різних типів (б-в; б-д), і завдяки цьому більшість клітин можуть одночасно отримувати загальну інформацію та реагувати на неї одночасно. Електрофізіологічні дослідження острівцевих клітин показують, що хвилі деполяризації легко розповсюджуються від однієї клітини до іншої.

Значення щільних контактів невідомо, але логічно передбачити, що вони забезпечують функціональне розділення внеклітинних рідин, на окремі компартменти і тим самим грають визначену фізіологічну роль. Ймовірно, що розташування щільних контактів впливає на виведення продуктів секреції в венозну кров, яка дренує острівець. Крім того, можливо, що завдяки таким контактам секреторні сигнали і субстрати надходять переважно до визначеної сторони клітини [5,6].

На основі морфологічних і функціональних взаємовідносин острівцевих клітин було висунуто припущення, що острівець Лангерганса представляє собою маленький орган, всі клітини котрого координовано відповідають на багато секреторних і інгібуючих стимулів. Згідно з цією точкою зору, гормональна реакція острівця - це комплекс відповідних реакцій всіх острівцевих клітин не тільки на надходячі до них гуморальні і нервові сигнали, але і на паракринний вплив, котрий вони проявляють один на одного [5,2,7].

Фізіологічне значення паракринної взаємодії острівцевих клітин ставиться під сумнів, хоча аргументи на користь паракринної регуляції представляються досить переконливими.

У наш час неможливо дати більш точні описи концепції «острівець, як міні-орган», але і в такому вигляді вона володіє естетичною привабливістю (Рис. 1.1).

Примітка: - стимуляція; інгібування.

Рисунок 1.1 - Функціональна організація острівців Лангерганаса, як «міні-органу».

1.1.2 Гормони острівців підшлункової залози

У в-клітинах синтезується гормон інсулін (у формі проінсуліну), в б-клітинах - глюкагон, у д-клітинах - соматостатин. Крім того, iз екстрактів тканини підшлункової залози виділено гормони ваготонін, центропеїн, бомбезин і ліпокаїн [2].

1.1.2.1 Проінсулін - попередник інсуліну

Проінсулін - білок попередник інсуліну. Проінсулін має більш складну будову ніж інсулін.

Проінсулін накопичується в незрілих гранулах. По мірі того, як гранули проходять через апарат Гольджі практично весь проінсулін перетворюється в інсулін та з'єднувальний пептид під дією внутрігранулярної трипсинододаткової тіолової протеази, котра вирізає з'єднувальний пептид. Інсулін і з'єднувальний пептид зберігається і звільняється при екзоцитозі в стехіометричних кількостях. Мембрани секреторних гранул в процесі секреції зливається з плазматичною мембраною клітини, а їх вміст, вивільняється в позаклітинний простір [5].

Глюкоза, маноза і лейцин - потужні стимулятори синтезу проінсуліну і секреції інсуліну. Таким чином, в нормі процеси синтезу і секреції зазвичай пов'язані, але це не означає, що вони регулюються одними і тими ж внутрішньоклітинними сигналами, оскільки секреторну реакцію можна викликати в умовах блокади синтезу, і навпаки. Більше того, порогова концентрація глюкози, необхідна для стимуляції синтезу проінсуліну, приблизно вдвічі менше тієї, яка потрібна для стимуляції секреції (4-6 ммоль) [5,8].

До інших стимуляторів синтезу відносяться гормон росту, а також глюкагон (і близькі до нього гормони), які підвишюють рівень цАМФ. Глюкагон або дб-цАМФ стимулюють синтез проінсуліну тільки в присутності глюкози. У той же час синтез проінсуліну інгібується адреналіном і похідними сульфонілсечовини, підсилюють секрецію інсуліну принаймні в першу фазу відповідної реакції на глюкозу.

Механізми, за допомогою яких глюкоза стимулює (а цАМФ полегшує) транскрипцію гена проінсуліну, невідомі. Можна сказати лише, що для прояву ефекту глюкоза повинна метаболізуватися. Невідомим є те чи формується стимулюючий сигнал зміною окислювально-відновного потенціалу НАД(Ф)-Н: НАД(Ф) або енергетичного заряду, що виникають при окисленні глюкози.

Постійний (високий або низьний) рівень синтезу проінсуліну може зберігатися досить довго (дні і тижні). Це пов'язано або зі збільшенням, або зі зменшенням кількості в-клітин. Синтез проінсуліну помітно знижується при голодуванні або низькому вмісті вуглеводів і високому вмісті жирів в їжі, він збільшується при споживанні їжі з високим вмістом вуглеводів, експериментальному і клінічному ожирінні, вагітності та в умовах хронічного надлишку гормону росту. Збільшення синтезу проінсуліну при вагітності обумовлене, можливо, підвищеним споживанням їжі (включаючи вуглеводи) або високим рівнем соматомаммотропіну (плацентарного гормону росту), що може викликати гіперглікемію і глюкозурію [5].

1.1.2.2 Інсулін

Інсулін - білковий гормон, до складу якого входить цинк. Він є першим гормоном і першим білком синтезованим штучно [4].

Інсулін синтезується в в-клітинах острівцевого апарату підшлункової залози, цей гормон впливає на всі види обміну речовин, він сприяє анаболічним процесам, збільшує синтез глікогену, жирів та білків, гальмує ефекти багаточисленних контрінсулярних гормонів (глюкагону, кетахоламінів, глюкокортикоїдів і соматотропіну). Всі ефекти інсуліну по швидкості їх реалізації розділяються на чотири групи: дуже швидкі (через декілька секунд) - гіперполяризація мембрани клітин за виключенням гепатоцитів, підвищенням проникності для глюкози, активація Na-K-АТФази, входу К⁺ та виходу Na⁺, пригніченням Са-насосу і затримки Са²⁺; швидкі ефекти (протягом декількох хвилин) - активація і гальмування різних ферментів, які пригнічують катаболізм і підсилюють анаболічні процеси; повільні процеси (на протязі декількох годин) - підвищене поглинання амінокислот, зміна синтезу РНК і білків ферментів; дуже повільні ефекти (від годин до діб) - активація мітогенезу і розмноження клітин [5].

Дія інсуліну на вуглеводний та білковий обмін проявляється: підвищенням проникності мембран в м'язах і жировій тканині для глюкози. Внаслідок цього швидкість переходу глюкози всередину цих клітин збільшується приблизно в 20 разів в порівнянні з швидкістю переходу глюкози в клітини в середовище яке не містить інсуліну [4,6].

Підсиленням процесів фосфорилювання та окислення, які приводять до утилізації глюкози, а також процес утворення глікогену протікають всередині клітини. Сприяючи транспорту глюкози всередину клітини, інсулін тим самим забезпечує її утилізацію. Разом з тим він не впливає на утилізацію вуглеводів без клітинними гомогенатами тканин (гомогенати отримують шляхом розтирання клітин, при якому руйнується клітинні мембрани), так як механізм впливу інсуліну на вуглеводний обмін пов'язаний саме з дією його на проникність клітинних мембран [5].

Збільшення транспорту глюкози через мембрани м'язових волокон при дії інсуліну сприяє синтезу глікогену і накопиченню його в м'язових волокнах. В клітинах жирової тканини інсулін стимулює утворення жиру із глюкози.

Під впливом інсуліну збільшується проникність клітинної мембрани і для амінокислот, із котрих в клітинах синтезується білки. Інсулін стимулює синтез інформаційної РНК і цим також сприяє синтезу білків [2,3,5].

У механізмі дії інсуліну на вуглеводний обмін важливу роль відіграють специфічні рецептори, розташовані на плазматичній мембрані клітин-мішеней. Взаємодія інсуліну з рецепторами реалізується через пригнічення аденілатциклази i активації тирозинкінази, яка сприяє проникненню інсуліну в клітину i підвищенню активності гексокінази (перша стадія гліколізу). Kpiм цього, активізується пентозний шунт з наступним утворенням НАД та НАДФ, котрі потрібні для здійснення ліпогенезу [2,5,8].

Виникаючий після введення великих кількостей інсуліну перехід значної кількості глюкози з плазми крові всередину клітин скелетної мускулатури, серцевого м'язу, гладких м'язів, молочних залоз і деяких інших органів викликає падіння рівня глюкози в крові і внаслідок цього недостатнє надходження глюкози в клітини нервової системи (на проникність яких інсулін не діє). Через це головний і спинний мозок починає відчувати гостру нестачу глюкози, котра є основним джерелом енергії для нервових клітин [6].

Вплив інсуліну на жировий обмін виражається в посиленні процесів ліпогенезу і відкладенні жиру в жирових депо. Оскільки під впливом інсуліну збільшується утилізація тканинами і використання глюкози в якості енергетичного субстрату, визначена частина жирних кислот зберігається від енергетичних трат і використовується в подальшому для ліпогенезу. В жирових депо інсулін пригнічує активність ліпази і стимулює утворення тригліцеридів [4,6,8].

Хоча на вивчення механізмів дії інсуліну витрачено величезні зусилля, поки неможливо говорити про достовірність тих чи інших даних. Якщо розділити весь процес дії інсуліну на три стадії: 1) гормон-рецепторна взаємодія, 2) виникнення в результаті такої взаємодії численних сигналів і 3) біологічні ефекти цих сигналів, то стане ясно, що певний прогрес відбувся в першій області та багато зроблено в останній. Однак, яким чином взаємодія інсуліну з рецептором сполучається з наслідками такої взаємодії, все ще недостатньо зрозуміло [2,5].

Метаболічні процеси, що відбуваються в печінці, жировій тканині та м'язах контролюються інсуліном та його антагоністами: глюкагоном, катехоламінами, глюкокортикоїдами і гормоном росту. Як правило, при підвищенні концентрації інсуліну секреція його антагоністів пригнічується, і, навпаки, при дефіциті інсуліну виникає тенденція до збільшення кількості антагоністів. Надлишок інсуліну сприяє анаболічним процесам, тобто синтезу глікогену, жирних кислот і тріацілгліцеролів, а також синтезу білку; в той же час підвищена кількість антагоністів полегшує катаболічні процеси, тобто гідроліз триацилгліцеролів, окислення жирних кислот, кетогенез, протеоліз, глікогеноліз. Слід відмітити, що інсулін не тільки стимулює анаболічні процеси, а й збільшує відношення вуглеводи/жири в суміші енергетичних речовин, що надходять у тканини, особливо м'язову та жирову [2,5].

Утворення інсуліну регулюється рівнем глюкози в крові (Рис. 1.2). Збільшення вмісту глюкози в крові після прийому її в великих кількостях, а також при гіперглікемії, повязаній з напруженною фізичною роботою і емоціями, підвищує секрецію інсуліну. Навпаки, пониження рівня глюкози в крові гальмує секрецію інсуліну. Глюкоза впливає на в-клітини підшлункової залози безпосередньо [4,9,10].



Рисунок 1.2 - Схема системи регуляції, яка контролює концентрацію цукру в крові і тканинних рідинах.

Панкреатична в-клітина може служити еталоном клітин, що синтезують пептидні гормони або аміни і запасаючи їх в електроміцних секреторних гранулах в готовій для секреції формі. До в-клітин застосована загальна модель стимуляції секреції, згідно з якою безпосереднім стимулом секреторного процесу, незалежно від ініціюючого фактору, служать іони Са²⁺. Експерименти з інгібіторами мікротрубочок (наприклад, колхіцином) свідчать про участь останніх у секреції як інсуліну, так і багатьох інших гормонів [5].

Поява радіоімунологічних методів зумовило можливість похвилинної оцінки секреторної активності в-клітин (а також б- і д-клітин). У інтактних тварин і людини раптові зміни концентрації гормону майже завжди обумовлені зміною швидкості його секреції, судячи з того, що виникають занадто швидко, щоб визначатися зміною швидкості елімінації гормону. Характер реакції залишається постійним: 1) у перші 2-5 хв після стимуляції відзначається різке підвищення секреції гормону; 2) при тривалій стимуляції глюкозою концентрація інсуліну в крові збільшується поступово. При цьому перша фаза секреції не вимагає синтезу білку, однак більш тривала друга фаза з часом стає все більш залежною від білкового синтезу.

Перебіг секреторної реакції у дві фази припускає, що в в-клітині існують легко і важко мобілізовані гранули інсуліну. Мабуть, деякі гранули розташовуються в очікуванні секреції безпосередньо біля плазматичної мембрани, тоді як інші повинні ще переміститися з глибини клітини, а треті містять щойно синтезований гормон.

Незважаючи на численні експерименти, механізми дії глюкози на секрецію інсуліну вивчені недостатньо.

в-клітина є сенсором глюкози так само, як термостат - сенсором тепла. Коли температура в приміщенні зростає, вмикається кондиціонер, що знижує її. Коли в крові збільшується концентрація глюкози, секретується інсулін, щоб відновити її вихідну рівноважну концентрацію. У свій час деякі дослідники вважали, що основний датчик, який реєструє рівень глюкози, локалізований в плазматичній мембрані. Проте в наш час більшість авторів вважають, що перш, ніж викликати секрецію інсулину, глюкоза (або манноза) в в-клітині повинна окислитися. Довгі пошуки конкретного проміжного метаболіту глюкози, активуючого секреторний процес, привели до створення численних гіпотез, але не встановили істину. Кожна з цих гіпотез в чомусь може бути правомірною [5,9,10].

Метаболізм глюкози в в-клітині протікає своєрідно: подібно до клітин печінки, в-клітина містить високоспецифічну глюкокіназу і менш специфічну (і меншої потужності) гексокіназу. Через відсутність фруктозо-1,6-біфосфатази глюконеогенез в в-клітині неможливий. Однак оскільки вона містить ФЕП-КК, то при окисленні глюкози по гліколітичному шляху в в-клітині накопичується велика кількість ФЕП.

Крім ФЕП, знайдено ще кілька потенціальних сигналів, що генеруються при окисленні глюкози. До них відносяться зрушення окисно-відновного потенціалу, збільшенням доступності АТФ і зміщенням рН в кислу сторону. Є вагомі докази можливої ролі кожного з цих факторів у секреції інсуліну, що відбувається під дією глюкози [2,5].

Деякі реакції або їх поєднання, пов'язані з окисленням глюкози в в-клітині, призводять і до активації цАМФ, викликаючи збільшення рівня цАМФ; підвищують концентрацію іонів Са²⁺ в цитозолі і активують кругообіг поліфосфатидилінозитолу з утворенням інозітолполіфосфатов і діацилгліцеролу. Є надійні докази участі кальмодуліну в секреції інсуліну, а для переміщення гранул необхідні як агрегація тубуліну в мікротрубочки, так і скорочення мікрофіламентів. Активація системи фосфатділінозітола-4,5-бісфосфату в цьому випадку - реакція унікальна, оскільки вона обумовлюється окисленням глюкози, а не (як завжди) звичними змінами плазматичної мембрани. (Такі зміни мають місце, але під дією іншого стимулятора секреції інсуліну - ацетилхоліну, которий через мембранний рецептор теж активує кругообіг фосфатидилінозитолу-4,5-бісфосфату). Далі цАМФ, Са₄-кальмодуліни і протеінкіназа С повинні приймати участь в фосфорилюванні багатьох регуляторних білків і призводити до підвищення [Са²⁺]_ц і екзоцитозу. До цих пір серед субстратів фосфорилювання вдалося ідентифікувати тільки тубулін (фосфорилювання сприяє його агрегації в мікротрубочки), пов'язаний з мікротрубочками білок і міозінкіназу (необхідно для скорочення мікрофіламентів). Ймовірно, іони Са²⁺ роблять і прямі ефекти, тобто не опосередковані кальмодуліном [5].

Значна кількість глюкози (до 25% від максимального) може окислюватися в в-клітині не викликаючи стимуляції секреції інсуліну. Тільки після перевищення цього порогу спостерігається різке збільшення секреції гормону. Саме через це фруктоза, яка фосфорилюється гексокіназою так повільно, що не досягається цей поріг швидкості окислення, сама по собі не стимулює секрецію інсуліну. Однак фруктоза може підкріплювати глюкозний сигнал, тому що дія її метаболітів, змін окислювально-відновного потенціалу, рівня АТФ та ін, що виникає з підпорогової швидкості, підсумовується з ефектами глюкози. Іншими словами, попередній вплив фруктози підвищує чутливість в-клітини до глюкози [2,5,8].

Виділення інсуліну білими епідермоцитами відбувається безперервно, але інтенсивність його утворення не завжди однакова.

Утворення інсуліну підвищується під час травлення і зменшується надщесерце. Збільшена секреція інсуліну під час травлення забезпечує посилення утворення в печінці і мязах глікогену із глюкози, яка надходить в цей час в кров з кишечнику [4].

Концентрація інсуліну в крові залежить не тільки від інтенсивності утворення цього гормону, але і від швидкості його руйнування [1].

Інсулін руйнується ферментом інсуліназою, яка знаходиться в печінці і скелетних м'язах. Найбільшою активністю володіє інсуліназа печінки. При однократному перетіканні через печінку крові може зруйнуватися до 50% інсуліну, який в ній міститься. Інсулін може бути не тільки зруйнований інсуліназою, але і інактивований присутніми в крові його антагоністами. Один із них -- синальбумін -- перешкоджає дії інсуліну на проникність клітинних мембран.

Встановлено, що зміна рівня глюкози в кpoвi сприймається спеціалізованими клітинами -- глюкорецепторами підшлункової залози, каротидного синусу, паравентрикулярних ядер гіпоталамуса. При підвищеннні piвня глюкози в крові відбувається активізація рецепторів -- клітин підшлункової залози, які відповідають на цей стимул підвищенням синтезу i виділенням інсуліну в кров. Описаний ефект відбувається лише при окисленні глюкози в в-клітині i активації цАМФ, підвищенні рівня Са²⁺ у цитозолі за наявності кальмодуліну i активізації поліфосфоінозитидної системи [5,2].

У разі зниження рівня глюкози в кpoвi подразнюються рецептори б-клітин залози, що призводить до синтезу i секреції глюкагону, підвищення рівня цукру. Ця реакція відбувається лише при попередньому окисленні глюкози і підвищеній концентрації Са²⁺ в б-клітинах залози.

Глюкорецептори каротидного синусу реагують як на підвищення, так i на зниження рівня цукру в крові інформація від них передається дорсальним ядрам блукаючого нерва, які розташовані в довгастому мозку. Від нервових клітин ядра імпульси волокнами блукаючого нерву поширюються до гангліїв, котрі локалізуються в тканині підшлункової залози, а потім до в-клітин острівців підшлункової залози. Під впливом інсуліну глюкоза, що міститься в печінці, м'язах, перетворюється на глікоген, і рівень цукру в крові відновлюється до нормальних величин. Якщо рівень глюкози в кpoвi знижується, то відбувається гальмування активності нервових клітин паравентрикулярних ядер гіпоталамусу і як наслідок цього -- зниження секреції інсуліну. [2-5].

Добре відомо, що цукровий діабет розвивається після психічної травми. Доведено, що умовнорефлекторні подразники, які сигналізують про надходження цукру, гіпнотичне навіювання про введення цукру зумовлюють зниження глікемії (внаслідок підвищеної секреції інсуліну). Вегетативна нервова система (парасимпатична i симпатична) також має значення для регуляції ендокринної функції підшлункової залози.

У регуляції секреції інсуліну бере участь ряд гормонів. Так, секрецію інсуліну стимулюють гормон росту (соматотропін) аденогіпофізу, гормони щитовидної залози, травного каналу (кишковий глюкагон, секретин, холецистокінін та iн.). Утворений у д-клітинах острівцевого апарату та гіпоталамусу, соматотропін гальмує секрецію інсуліну [5,8,10].

У дорослих секреція інсуліну може бути пригніченою (особливо в початковій стадії захворювання) внаслідок стійкості (резистентності) до інсуліну, яка пов'язана з недостатністю рецепторів інсуліну на клітинах-мішенях, або утворенням комплексу білок -- інсулін, котрий є неактивною формою гормону [7].

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1 Об'єкт дослідження

Впродовж 2011-2012 років були проведені дослідження на мишах. Всього було досліджено 144 тварини. 48 тварин були контрольними (інтактними), інші - зазнавали експериментальних впливів. В окремих серіях досліджувані миші голодували 12 годин. Глюкозу вводили внутрішньобрюшинно в дозі 10 г/кг у вигляді 40% розчину.

Після закінчення терміну голодування, через 2 години ін'єкції глюкози у тварин з хвоста брали кров та зрізи підшлункової залози. Проби крові використовували для визначення рівня глюкози. Зрізи підшлункової залози використовували для постановки цитохімічних реакцій на цинк та секреторний матеріал.

2.2 Визначення рівня цукру в крові за методом Хаггедорна-Йенсена

Рівень цукру за модифікованим методом Хаггедорна-Йенсена визначається за наступною методикою. В мікропіпетку набирали 0,1 мл крові й видували в пробірку, що містить 5 мл 0,45% розчину сульфату цинку та 1 мл 0,1 н розчину гідроксиду натрію. Для рівномірного перемішування крові з сумішшю вміст кожної пробірки струшували. Далі пробірки поміщали в металевий штатив, який переносили на 3 хвилини на водяну баню з киплячою водою. По закінченні цього строку пробірки вилучали. Вміст кожної пробірки фільтрували в окрему широкогорлу пробірку, куди додавали по 2 мл розчину червоної кров'яної солі. Пробірки поміщали в штатив, який поміщали на водяну баню з киплячою водою. Через 15 хвилин штатив з пробірками знімали з бані. В кожну пробірку наливали по 3 мл потрійного розчину та 2 мл 3% розчину оцтової кислоти.

Для готування потрійного розчину 1г йоду розчиняли в 40 мл подвійного розчину, що являє собою суміш 2г сульфату цинку, 10г хлориду та 40 мл дистильованої води. Вміст пробірки титрували розчином гіпосульфату натрію й по таблиці, яку запропонували С.Д. Балаховський та І.С. Балаховський, на підставі даних титрування встановлювали концентрацію глюкози в крові в ммоль/л.

2.3 Цитохімічна реакція 8-ТСХ у панкреатичних клітинах В

Для цитохімічного визначення цинку шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин в холодному ацетоні (+4⁰С) та витримували по 15 хвилин в 2-х порціях ксилолу. Потім промивали шматочки протягом 30 хвилин в суміші 50% парафіну та 50% ксилолу при температурі 37⁰С. Із такої суміші (каши) шматочки переносили в один, потім в другий рідкий парафін. Тривалість інфільтрування в кожному парафіні - 1,5 години при 56⁰С. Потім шматочки заливали в парафін.

Із приготовлених блоків підшлункової залози готували парафінові зрізи товщиною 5-10 мкм. Зрізи фарбували 0,01% ацетоновим розчином 8-ТСХ після попереднього депарафінування. Парафінові зрізи переносили прямо з ножа на предметне скло, яке вкрите шаром яєчного білка. Для цього за допомогою скляної палички на предметне скло наносили тонким шаром яєчний білок. Останній прожигали над полум'ям спиртівки. На шар яєчного білка поміщали парафіновий зріз і прижимали до предметного скла. Така процедура забезпечувала найкращу фіксацію на предметному склі парафінового зрізу. Виключення розплавлення зрізу в теплій воді перед виловлюванням його на предметне скло покращує відтворюваність результатів.

Депарафінування зрізів проводили в такий спосіб: зрізи витримували в двох частинах ксилолу (по 3 хвилини в кожній), двох частинах ацетону (по 3 хвилини в кожній). Зрізи, які вилучають із другого ацетона стають на повітрі білісуватими в результаті того, що ацетон випаровується. На поверхню зрізу наносили за допомогою піпетки 0,01% ацетоновий розчин 8-ТСХ. Через 1 хвилину промивали дистильованою водою, занурювали в гліцерин і розглядали під люмінесцентним мікроскопом. Для збудження люмінесценції застосовували світлофільтр ФС-1, а у якості захисного (окулярного) використали світлофільтр зі скла ЖС-18. На препаратах у цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася зернистість, яка люмінесціювала жовто-зеленим світлом.

Для доказу специфічності цитохімічної реакції 8-ТСХ із цинком на де парафіновані зрізи наносили 0,1М розчин ЕДТОК і розчин ДЕДТКН або 0,1М розчин ДЕДТКН. При послідовній обробці зрізів 8-ТСХ, у них не виявлялося люмінесцентної реакції.

Пояснюється це тим, що ЕДТОК і ДЕДТКН утворюють із цинком нефлуоресцуючий комплекс. Обробка ЕДТОК і ДЕДТКН зрізів із люмінесцентною реакцією 8-ТСХ призводила до гасіння цієї реакції внаслідок витиснення 8-ТСХ із комплексу з цинком.

Після обробки з хлороформом зрізів, позитивною реакцією 8-ТСХ повторне фарбування острівцевих клітин цим реагентом не вийшло. Це явище пов'язано із екстракцією 8-ТСХ-цинкового комплексу, який добре розчиняється у хлороформі, із клітин.

2.4 Цитохімічна реакція альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В

Для цитохімічного визначення інсуліну в панкреатичних клітинах В шматочки підшлункової залози фіксували в рідині Буена. Рідину Буена готували шляхом змішування 15 мл насиченого розчину пікринової кислоти, 5 мл нейтрального формаліну, 1 мл льодяної оцтової кислоти. Тривалість фіксації - 24 години.

Потім шматочки підшлункової залози проводили через спирти зростаючої міцності (70⁰, 80⁰, 90⁰, 96⁰, абсолютний спирти) - по 4 години в кожному. Абсолютний спирт отримували перемішуванням 96⁰ спирту з прокаленим мідним купоросом. Після цього шматочки залози витримували у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰ С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰ С). Далі шматочки підшлункової залози заливали в парафін.

Із парафінових блоків підшлункової залози готували зрізи товщиною 5-10 мкм. Депарафінування зрізів проводили шляхом їхньої обробки у двох ксилолах (по 3 хвилини в кожному), потім відбувалась обробка в спиртах міцності, що знижується, (абсолютний спирт, 96⁰, 90⁰, 80⁰, 70⁰) - по 3 хвилини в кожному і промивали у водопровідній воді (5 хвилин).

Після цього зрізи поміщали в окислювач (до порудіння) і відновник (до знебарвлення). Окислювач готували безпосередньо перед його застосуванням у такий спосіб: змішували одну частину 2,5% розчину перманганату калію, одну частину 5% розчину сірчаної кислоти та 4 частини дистильованої води. У відновник зрізи поміщали без попереднього їхнього промивання у водопровідній воді після окислювання. Відновником слугував 2,5% розчин щавлевої кислоти або бісульфату натрію до повного знебарвлення.

Після відновлення зрізи промивали в дистильованій воді протягом 5 хвилин та фарбували протягом 6 хвилин розчином альдегідфуксину, у герметично зачиненій посудині. Барвник готували таким чином: розчиняли 250 мг альдегідфуксину в 25 мл 70⁰ спирту, потім ще додавали 75 мл 70⁰ спирту і 1 мл льодяної оцтової кислоти. Після закінчення зазначеного строку фарбування зрізи витягали з посудини, на них наносили трохи крапель 96⁰ спирту. Зрізи промивали протягом 5 хвилин у водопровідній воді. Потім зрізи проводили через 96⁰ спирт (1-2 хвилини), абсолютний спирт (1-2 хвилини), два ксилоли (по 1-2 хвилині в кожнім) і занурювали в бальзам [29].

На препаратах в цитоплазмі панкреатичних клітин В виявлялася синьо-фіолетова зернистість. ЇЇ кількість слугувала показником вмісту в клітинах гормону інсуліну.

2.5 Дитизонова реакція у панкреатичних клітинах В

Для дослідження цитохімічного визначає мого цинку, шматочки підшлункової залози фіксували протягом 12 годин у холодному ацетоні. Потім шматочки залози доводили до парафіну наступним чином: витримували їх у двох ксилолах (по 15 хвилин в кожному), суміші 50% ксилолу та 50% парафіну (30 хвилин при 37⁰С), двох рідких парафінах (по 1,5 години у кожному при 56⁰С). Далі шматочки підшлункової залози заливали в парафін. Парафінові зрізи підшлункової залози готували товщиною 5-10 мкм. Депарафінування зрізів проводили наступним чином: обробка у двох ксилолах - по 3 хвилини у кожній, обробка у двох ацетон ах - по 3 хвилини у кожному. Промивали у дистильованій воді 5 хвилин.

У випадку постановки цитохімічної реакції дитизону використовували 0,2% (робочий) його розчин. Тривалість забарвлення - 3 години. Розчин готували таким чином. У колбочку з притертою (яка герметично замикається) пробкою наливали 30 мл дистильованої води, додавали 0,6 мл 25% розчина гідроксиду амонію та 400 мг дитизону. Суміш перемішували на водяній бані впродовж 10 хвилин при 70⁰С. Потім фільтрували через беззольний фільтр. Так як на фільтрі залишалась приблизно чверть наважки реагенту, що не розчинився, фільтрат представляв собою 1% водно-аміачний розчин дитизону. Це основний розчин фарбника. Його робочий розчин готували п'ятикратним розведенням дистильованою водою його основного розчину. По закінченні терміну забарвлювання препаратів, зрізи промивали у двох порціях дистильованої води (по 5 хвилин у кожній) і замикали в гліцерин-желатин. Зрізи розглядали під світловим мікроскопом. На препаратах у цитоплазмі острівцевих клітин тварин виявлялися гранули червоного кольору.

Специфічність цитохімічної реакції дитизону перевіряли наступним чином. Обробка де парафінованих зрізів 0,1М, що була проведена заздалегідь розчином ЕДТОК, попереджувала отримання кольорової дитизонової реакції у панкреатичних острівцях. Пояснюється це явище тим, що ЕДТОК утворює з цинком безкольоровий комплекс. Цей реагент має більш високі константи стабільності комплексів із цинком, аніж дитизон. У результаті цього, останній не здатний відокремити цинк від комплексу із ЕДТОК і не здібний внаслідок цього забарвити клітини.

Якщо ЕДТОК обробляти зрізи, на яких уже вийшла позитивна кольорова реакція дитизона, проходило скоріше (протягом 1 хвилини) знебарвлення зрізів. Пояснюється це явище також конкурентним взаємовідношенням даної речовини із дитизоном. Володіє більш високим константами стабільності комплексів із цинком, він легко витискує дитизон у поєднанні із цим металом.

Нарешті, при обробці зрізів із кольоровою реакцією дитизону хлороформом продукт цитохімічної дитизонової реакції екстрагується зі зрізів, і при повторній обробці дитизоном зрізи не забарвлюються ним. Ці дані говорять на користь селективності цитохімічної дитизонової реакції із цинком. Для підвищення цієї селективності, ми використовували замість дистильованої води 0,2% розчин ДЕДТКН.

2.6 Оцінка результатів постановки цитохімічних реакцій

Інтенсивність цитохімічних реакцій оцінювали напівкількісним методом. Напівкількісний метод полягає у визначенні інтенсивності реакції за трибальною системою, запропонованою В.В. Соколовським (1971), Ф. Хейхоу та Д. Квагліно (1983). За один бал приймали слабопозитивну, два бали- помірну, три бали- виражену за інтенсивністю реакцію. На підставі підрахунку на 100 клітинах виводили середню величину інтенсивності реакції.

2.7 Статистична обробка отриманих результатів

Статистичну обробку результатів проводили методом обчислення середньої арифметичної, помилки середньої арифметичної, середнього квадратичного відхилення. Вірогідність відмінностей між середніми величинами оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Основним показником, що характеризує сукупність за величиною ознаки, яка вивчається, є середня арифметична ( X ). Прямий спосіб її обчислення полягає в складанні усіх варіант ( X₁ + Х₂ + . . . X_h) з наступним діленням суми на число варіант сукупності ( N ):

, (2.1)

де - сума варіант, n - кількість випадків.

Далі підраховували відхилення кожного з отриманих результатів від середньої арифметичної , ()², після чого розраховували середнє квадратичне відхилення за формулою:

, (2.2)

Потім знаходили величину середньої помилки (т), яка прямо пропорційна середньому квадратичному відхиленню та обернено пропорційна числу проведених досліджень:

, (2.3)

Вірогідність різниці (t_d):

, (2.4)

Показник вірогідності (р) встановлювали по таблиці Ст'юдента на підставі даних t_d і (n₁+n₂-2).

3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

3.1 Дослідження рівня глюкози в периферичній крові

У таблиці 3.1 наведені дані рівню глюкози в периферичній крові мишей після гострого голодування та одноразового навантаження глюкозою.

Таблиця - 3.1 - Рівень глюкози в крові мишей після гострого голодування та одноразового навантаження глюкозою (ммоль/л)

№	Контроль	Гостре голодування	Одноразове навантаження глюкозою
1	6,3	3,7	13,2
2	5,6	3,5	12,7
3	6,0	3,8	13,1
4	5,9	4,0	13,3
5	6,2	3,9	13,0
6	6,0	3,3	13,7
7	5,4	3,8	13,1
8	5,8	4,1	12,8
9	6,3	3,9	13,0
10	5,7	4,2	13,4
11	5,9	3,4	13,1
12	6,5	4,3	12,5
Х	6,0	3,8	13,1
у	0,320	0,312	0,319
mx	0,09	0,09	0,09
td		17,2	52,8
P		<0,001	<0,001

Як видно з таблиці 3.1 рівень глюкози в периферичній крові мишей у тварин контрольної групи (інтактних) у середньому 6,0+0,09 ммоль/л. Гостре голодування призводило до зниження рівню глюкози в периферичній крові мишей порівняно з контролем на 37% (Р<0,001). Одноразове навантаження глюкозою призводило до підвищення рівня глюкози в периферичні крові на 118% (Р<0,001).

3.2 Цитохімічні дослідження підшлункової залози мишей

У таблицях 3.2 - 3.4 наведені дані інтенсивності цитохімічної реакції альдегіфуксину, дитизону та 8-ТСХ в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою (ум. од.).

Таблиця - 3.2 - Інтенсивність цитохімічної реакції альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою (ум. од.)

№	Контроль	Гостре голодування	Одноразове навантаження глюкозою
1	1,3	1,6	0,8
2	1,0	2,0	1,2
3	1,4	2,5	0,9
4	1,6	2,1	0,5
5	0,9	2,2	0,8
6	1,5	1,9	1,1
7	1,2	2,3	0,9
8	1,3	1,8	0,6
9	2,0	2,0	0,8
10	1,4	1,5	1,2
11	1,8	2,1	0,9
12	1,5	2,4	0,8
Х	1,4	2,0	0,9
у	0,309	0,302	0,215
mx	0,09	0,09	0,06
td		5,5	5,9
P		<0,001	<0,001

Як видно з таблиці 3.2 інтенсивність цитохімічної реакції альдегідфуксину у панкреатичних клітинах В мишей вкладає у тварин контрольної групи (інтактних) у середньому складала 1,4+0,09 ум. од. Гостре голодування викликало підвищення інтенсивності цитохімічної реакції альдегідфуксину у досліджуваних клітинах порівняно з контролем на 42% (Р<0,001). Одноразове навантаження глюкозою призводило до зменшення інтенсивності цитохімічної реакції порівняно з контролем на 36% (Р<0,001).

сс.

Примітка: * Р<0,001.

Контр. - контрольна група тварин; Р. Г. - рівень глюкози в периферичній крові мишей; А. Р. - інтенсивність цитохімічної реакції альдегідфуксину.

Рисунок 3.1 - Рівень глюкози в периферичній крові мишей та інтенсивність цитохімічної реакції альдегідфуксину в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою у відсотках порівняно з контролем.

Таблиця - 3.3 - Інтенсивність цитохімічної реакції дитизону в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою (ум. од.)

№	Контроль	Гостре голодування	Одноразове навантаження глюкозою
1	1,7	2,8	1,3
2	1,9	2,5	1,6
3	2,1	2,2	1,0
4	1,6	2,6	1,4
5	2,0	2,9	1,7
6	1,3	2,5	1,5
7	2,1	2,3	1,1
8	1,9	2,5	1,3
9	2,5	2,8	1,6
10	2,0	2,6	1,4
11	1,8	2,5	1,2
12	2,2	2,2	1,5
Х	1,9	2,5	1,4
у	0,308	0,227	0,213
mx	0,09	0,06	0,06
td		5,5	5,9
P		<0,001	<0,001

Як видно з таблиці 3.3 інтенсивність цитохімічної реакції дитизону у панкреатичних клітинах В мишей вкладає у тварин контрольної групи (інтактних) у середньому складала 1,9+0,09 ум. од. Гостре голодування викликало підвищення інтенсивності цитохімічної реакції дитизону у досліджуваних клітинах порівняно з контролем на 31% (Р<0,001). Одноразове навантаження глюкозою призводило до зменшення інтенсивності цитохімічної реакції альдегідфуксину порівняно з контролем на 27% (Р<0,001).

Таблиця - 3.4 - Інтенсивність цитохімічної реакції 8-ТСХ в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою (ум. од.)

№	Контроль	Гостре голодування	Одноразове навантаження глюкозою
1	1,9	2,5	1,1
2	2,2	2,2	1,5
3	2,0	2,8	1,8
4	1,6	2,6	1,4
5	2,1	2,3	1,2
6	1,9	2,7	1,5
7	2,5	2,9	1,7
8	1,3	2,5	1,5
9	2,0	2,8	2,1
10	2,4	2,6	0,9
11	1,8	2,4	1,5
12	2,1	2,7	1,4
Х	2,0	2,6	1,5
у	0,327	0,212	0,317
mx	0,09	0,06	0,09
td		5,5	3,9
P		<0,001	<0,001

Як видно з таблиці 3.4 інтенсивність цитохімічної реакції 8-ТСХ у панкреатичних клітинах В мишей вкладає у тварин контрольної групи (інтактних) у середньому складала 2,0+0,09 ум. од. Гостре голодування викликало підвищення інтенсивності цитохімічної реакції 8-ТСХ у досліджуваних клітинах порівняно з контролем на 30% (Р<0,001). Одноразове навантаження глюкозою призводило до зменшення інтенсивності цитохімічної реакції порівняно з контролем на 25% (Р<0,001).

и

Примітка: * Р<0,001.

Контр. - контрольна група тварин; 8-ТСХ - інтенсивність цитохімічної реакції 8-ТСХ; Д. Р. - інтенсивність цитохімічної реакції дитизону.

Рисунок 3.1 - Інтенсивність цитохімічної реакції 8-ТСХ, дитизону в панкреатичних клітинах В у мишей при гострому голодуванні та одноразовому навантаженні глюкозою у відсотках порівняно з контролем.

4. ОХОРОНА ПРАЦІ

Тема моєї роботи: «Вплив гострого голодування та одноразового навантаження глюкозою на глікемію, вміст цинку та інсуліну в панкреатичних острівцях у мишей».

Основні небезпечні виробничі фактори при виконанні роботи - це електроприлади, хімічні і біологічні матеріали а також легкозаймисті й пожежнонебеспечні реактиви та матеріали. Так як в лабораторії забороняється працювати по одному, тому всі досліди я проводила в присутності викладача або лаборанта.

Перед початком роботи зі мною був проведений інструктаж з охорони праці та пожежної безпеки за інструкцією № 276 з Охорони праці при роботі в лабораторії № 310 для студентів кафедри фізіології з курсом ЦО.

4.1 Загальні вимоги до безпечного проведення робіт

Враховуючи те, що для оформлення даної роботи неможливо обійтись без комп'ютерної техніки, я дотримувалась при роботі певних правил. До роботи на комп'ютері допускаються особи, що пройшли навчання та інструктаж з охорони праці. Усі особи, що працюють на комп'ютері, повинні знати міри захисту та прийоми надання першої до лікарської допомоги при ураженні електричним струмом.

Вмикання комп'ютерів до електричної мережі здійснюється тільки через спеціально встановлені електричні розетки або вилки із заземленням.

Площа, що припадає на працюючого з дисплеєм, повинна бути не менше 6,0 м², відстань між робочими місцями повинна бути не менше 1,5 м в ряду, і не менше 1,25 м між рядками. В приміщеннях, обладнаних відеотерміналом, стіни слід фарбувати фарбами пастельних тонів. Фарбованим поверхням слід придавати матову фактуру. Допустимі рівні температури повітря в дисплейних залах +22⁰ С - +24⁰С і швидкості руху повітря не менше 0,2 м/с.

Щоб запобігти впливу шкідливих променів я не сідала ближче до екрану ніж 50 - 70 см, це високочастотні електромагнітні випромінювання,що виникають в процесі одержання зображення на екрані монітору.

Враховуючи, що тривала робота з комп'ютером призводить до іонізації приміщення позитивними та негативними іонами, я через кожну годину 20 хвилин робила перерви. В цей час провітрювалась кімната. Так як робота з комп'ютером є роботою з тривалим перебуванням в фіксованій позі, я виконувала під час перерви фізичні вправи та вправи для очей.

При виникненні аварійної ситуації металоконструкції ЕОМ опинилася під напругою. При доторканні до неї відчувається проходження струму. При спалахуванні проводки в середині апаратури - необхідно вимкнути електроспоживання ЕВМ, вимкнувши вилку. При необхідності гасіння пожежі використати вогнегасник. При виникненні аварійної ситуації повідомити підрозділ. Після закінчення робіт необхідно від'єднати апаратуру від електромережі.

На всі види робіт, що являють собою потенціальну небезпеку повинна бути підготовлена документація, що узгоджується з керівником робіт. Щоб запобігти виникненню нещасних випадків, пожеж і вибухів студентам слід вивчити і чітко виконувати правила з техніки безпеки, виробничої санітарії й пожежної профілактики. З метою запобігання нещасним випадкам в навчальній лабораторії, експерименти треба проводити акуратно, уважно та з достатнім знайомством із приладами, інструментами, властивостями речовин і правилами безпеки робіт. Допуск до самостійної роботи студентів проводиться після проходження ввідного інструктажу з охорони праці з документальним оформленням у журналі. Студенти, лаборанти та викладачі повинні бути в спеціальному одязі (халат, окуляри, маска, рукавички) в залежності від виду роботи, котра безпосередньо виконується під час лабораторної роботи. Під час проведення експериментальних робіт, що пов'язані з використанням лабораторних тварин, хімічних реактивів, газів, необхідно проводити спеціальний інструктаж з охорони праці для студентів що приймають участь в досліді та обов'язково реєструвати інструктаж у відповідних журналах. Всі прилади, котрі використовуються в лабораторії повинні бути заземлені. Утримання та використання в лабораторії для наукових та навчальних цілей кислот, горючих рідин, газів і інших матеріалів, що являють собою небезпеку не повинно перевищувати добових норм. В лабораторії палити заборонено. Студент може відмовитись від дорученої роботи, якщо склалася виробнича ситуація, що небезпечна для життя чи здоров'я, або оточуючих його товаришів.

4.2 Вимоги безпеки перед початком робот

Студенти повинні одягти спеціальний одяг і отримати дозвіл на виконання роботи. Не дозволяється знаходитись в лабораторії у верхньому одязі. Перевірити захисне заземлення (занулення) на приладах, котрі будуть задіяні у роботі. Упевнитись в наявності засобів гасіння вогню і надання першої долікарської допомоги. Перед початком роботи уважно ознайомитись із правилами безпеки робіт, обладнанням та отримати дозвіл викладача розпочати роботу.