Принципы твердофазного иммунферментного анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

ПРИНЦИПЫ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

В. Н. Вербов.

г. Санкт-Петербург, НИИ

эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Введение

Использование современных аналитических методов в диагностике различных заболеваний явилось мощным рычагом повышения эффективности научных исследований, а также необходимым условием успешной профилактики и лечения. Одним из таких методов является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), в котором используется комбинация высокоспецифичной иммунологической реакции с чувствительным каталитическим действием ферментного маркера.

Интерес к ИФА в последние годы неуклонно возрастает, о чем свидетельствует появление ряда обзоров, посвященных методическим аспектам анализа [1, 8, 19, 40, 43, 63, 65,69] и его применению в различных областях инфекционной [2, 15, 19, 27, 35] и неинфекционной диагностики [2, 19]. Предложено большое количество различных вариантов проведения ИФА, многими фирмами выпускаются готовые тест-системы. При их использовании необходимо знать особенности проведения различных стадий анализа, что поможет устранить причины возможных ошибок. Аналогичные проблемы стоят и перед исследователями, использующими конкретные методики для разработки новых тест-систем.

1. Общие этапы в различных вариантах ИФА

В твердофазном ИФА один их специфических реагентов иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Поэтому ферментативная активность образовавшегося на твердой фазе специфического комплекса будет пропорциональна концентрации каждого компонента этого комплекса, один из которых подлежит определению.

Разработанные варианты ИФА различаются типом твердой фазы и способами присоединения к ней первого специфического реагента, числом и последовательностью добавления остальных специфических реагентов, способом промывки твердой фазы, способом получения конъюгата, природой фермента в конъюгате, типом используемого субстрата, способом выражения результатов анализа и т.д. Тем не менее, в каждом варианте ИФА можно выделить следующие общие этапы:

- получение иммуносорбента;

- формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет последовательного проведения специфических реакций;

- удаление неспецифически связавшихся компонентов, а также их избытка;

- получение ферментного конъюгата;

- измерение ферментативной активности специфического комплекса на твердой фазе;

- интерпретация результатов анализа.

Каждый из этих этапов будет рассмотрен более подробно с целью выявления общих закономерностей их проведения.

2. Получение иммуносорбента

Присоединение первого специфического реагента к твердой фазе может осуществляться путем физической сорбции, ковалентного связывания или комбинированного использования этих подходов.

2.1 Методы физической сорбции

Физическая сорбция специфического реагента на твердой фазе происходит за счет гидрофобных, донорно-акцепторных взаимодействий или водородных связей. Величина отрицательного поверхностного заряда твердой фазы не коррелирует с интенсивностью взаимодействия пластик белок, что указывает на отсутствие электростатической адсорбции [41].

Изучение изотерм адсорбции показало [3], что при взаимодействии белка с полимером вначале образуется мономолекулярный слой, при этом конформация белка не претерпевает заметных денатурационных изменений. Избыток белка приводит к многослойной сорбции за счет белок-белковых взаимодействий.

Многослойная сорбция должна быть сведена к минимуму. В противном случае слабо связанный специфический реагент реагирует с добавляемыми иммунореактантами и образующийся комплекс удаляется после каждого этапа промывки. Это приводит к уменьшению чувствительности анализа и увеличению разброса результатов. Количество десорбированного реагента может составлять до 60 - 70% от первоначального [38]. Устранение многослойной сорбции достигается за счет многократной промывки твердой фазы. Вторым подходом, уменьшающим многослойную сорбцию, является использование оптимальной концентрации специфического реагента, которая лежит, например, для IgG в интервале 1 - 10мкг/мл.

Количество сорбированного белка, а тем самым и чувствительность анализа. определяется природой твердой фазы и природой (гидрофобностью) специфического реагента [13]. Гладкие полимерные поверхности полистирола, поливинилхлорида, полипропилена и др., выполненные в виде 96-луночных планшетов, шариков, пробирок и других литьевых форм обладают удовлетворительной сорбционной емкостью, составляющей 1,5 - 4 нг/мм² [12, 40].

Более высокую сорбционную емкость имеют суспензии за счет увеличения суммарной поверхности [22]. Гораздо большей сорбционной способностью обладают пористые мембраны из нитроцеллюлозы или полиамидов [66].

Внутри каждого типа твердых фаз существуют различия в сорбционной емкости, обусловленные различиями состава и технологии получения. Так изучение 11 видов планшетов от 4 фирм позволило разделить их на 2 типа, один из которых плохо сорбирует, а второй хорошо сорбирует альбумин. IgG хорошо сорбируют оба типа планшетов [32]. Отличаются друг от друга не только планшеты разных типов, но и внутри одного типа, а также лунки одного и того же планшета [57]. Коэффициент вариации составляет около 5% для лунок и до 30% для планшетов одной и той же партии [33].

Величина гидрофобности сорбируемого белка зависит не только от его природы, но и от рН, ионной силы раствора или температуры. Это обусловлено тем, что при отклонении рН от изоэлектрической точки белка, при увеличении ионной силы раствора или при нагревании происходит изменение третичной структуры белковой глобулы и обнажение ее гидрофобных участков. Увеличение гидрофобности приводит к более прочному связывания белка с твердой фазой. Его меньше десорбируется на последующих стадиях инкубации и промывок и, тем самым, увеличивается чувствительность анализа [15, 28]. Однако, денатурационные изменения должны быть таковы, чтобы еще сохранялась способность к специфическому взаимодействию. В некоторых случаях имеет значение также состав буферного раствора. Так, адсорбция липидных антигенов на полистироле увеличивается в присутствии дезоксихолата натрия[31], а при инкубации липополисахаридов требуется наличие до 10 - 20 мМ МgCl₂ [29].

Другим важным моментом для стадии получения иммуносорбента, кроме величины сорбционной емкости, является время достижения равновесия: специфический реагент твердая фаза. Оно зависит от концентрации специфического реагента. Увеличение концентрации приводит, как уже указывалось, к многослойной сорбции, поэтому используют оптимальную величину, найденную в предварительных опытах. С увеличением температуры время достижения равновесия за счет увеличения коэффициента диффузии белка уменьшается. Однако значительное повышение температуры недопустимо из-за возможной инактивации специфического реагента. Обычно рекомендуемый интервал температур 4 - 40^оС, при этом равновесие достигается через 30 - 120 минут. Уменьшение этого времени может быть достигнуто за счет использования различных встряхивателей.

С температурным влиянием связан, так называемый, краевой эффект, заключающийся в большей величине ферментативной активности краевых лунок планшета после проведения анализа по сравнению с внутренними [33].

Природа этого эффекта может быть обусловлена либо различиями в поверхностных характеристиках этих лунок [11], либо различиями в температурных режимах [17]. Критический анализ, проведенный в работе [57], однозначно показал, что причина эффекта заключается в существовании температурного градиента между краевыми и внутренними лунками. Особенно отчетливо это проявляется при 30 минутной инкубации, когда температура повышается от 20 ^оС до 37^оС.

Важным практическим моментом при получении иммуносорбента кроме величины сорбционной емкости и времени достижения ее максимума является степень чистоты специфического реагента. В инкубационном растворе не должны присутствовать посторонние белки или детергенты, которые являются активными конкурентами за места связывания на твердой фазе. Так 100-кратный избыток неспецифического белка или детергента полностью подавляет адсорбцию специфического антигена [32].

Для пористых мембран это условие не является обязательным, т.к. они обладают большой сорбционной емкостью. Допустимая концентрация детергента составляет в этом случае 0,1% [47].

2.2 Методы ковалентного связывания

Основные недостатки методов физической сорбции, такие как десорбция на последующих стадиях анализа, малая величина сорбционной емкости для некоторых белков, олиго-пептидов и гаптенов могут быть устранены за счет ковалентного присоединения специфического реагента к твердой фазе.

С этой целью в такие полимеры как полистирол вводят новые реакционные группы типа амино-, гидразидо- или диазо-групп. Твердые фазы из нейлона или капрона подвергают частичному кислотному гидролизу, приводящему к образованию амидных групп. Суспензионные твердые фазы уже содержат реакционноспособные гидроксильные, амидные или карбоксильные группы. Ковалентное присоединение к ним специфического реагента, содержащего амино-группы, может быть осуществлено с помощью таких реагентов, как глутаровый альдегид, бромциан, гидразин, 1.4-ди-эпоксипентан, дивинилсульфон, эпихлоргидрин, гидрохинон, периодат натрия, водорастворимые карбодиимиды, N-гидроксисукцинимид и др.

Сравнение методов физической сорбции и ковалентного связывания показало [38], что десорбция специфического реагента составила 30% для полистирола, 60% для нейлона и только 13% для бромциан-активированной бумаги. В то же время сорбционная емкость при ковалентном связывании была 5 - 10 раз выше, чем при физической сорбции. Чувствительность же анализа при использовании в качестве твердой фазы бромциан-активированной бумаги только в 2 раза выше, чем при использовании полистирола [38]. Ковалентное присоединение к частично гидролизованному нейлону обеспечивает 30-кратное увеличение сорбционной емкости по сравнению с физической сорбцией на полистироле. Однако, и в этом случае увеличение чувствительности анализа было значительно меньше, чем увеличение количества сорбированного специфического реагента [26]. Это обусловлено, по-видимому, стерической недоступностью многих эпитопов при слишком плотном ковалентном связывании специфического реагента.

Поэтому основными преимуществами ковалентного связывания следует считать более высокую воспроизводимость результатов и возможность многократного использования иммбилизованной твердой фазы. Первое обусловлено устранением различий в характере поверхности разных лунок, шариков или пробирок, а также прекращением неконтролируемой десорбции на последующих этапах анализа. Второе преимущество связано с возможностью разрыва связи между иммуносорбентом и последующими специфическими реагентами за счет понижения рН или увеличения концентрации хаотропных ионов при условии, что это не приводит к потере специфической активности иммуносорбента.

2.3 Методы комбинированной сорбции

При всей привлекательности методов химической сорбции они не получили широкого распространения из-за трудоемкости проведения. Поэтому в тех случаях, когда специфический реагент плохо сорбируется на твердой фазе, используют комбинацию физической сорбции вещества с высокой сорбционной способностью и простейших способов ковалентного присоединения к нему нужного специфического реагента.

Известно, что бычий сывороточный альбумин хорошо сорбируется на многих типах планшетов [32]. Связь между ним и специфическим реагентом осуществляется с помошью глутарового альдегида или водорастворимого карбодимида [59]. Вместо альбумина можно использовать его метилированное производное [21]или полилизин [18]. Кроме белков функцию вещества с высокой сорбционной способностью может выполнять полимер глутарового альдегида. Его получают, полимеризуя мономер в лунках планшета при низких значениях рН [18]. После добавления специфического реагента рН раствора повышают до 8 - 9,5, что приводит к образованию иминовых связей между альдегидными группами на твердой фазе и аминогруппами специфического реагента.

3. Получение специфического комплекса на твердой фазе

После получения иммуносорбента к нему последовательно добавляют специфические реагенты, в результате чего на твердой фазе формируется многослойный комплекс. Природа специфических реагентов может быть разной. Определяющими моментами на этих стадиях ИФА являются специфичность реакции, характеризующаяся величиной константы связывания и кинетика процессов.

3.1 Типы специфических реакций

иммунофазный анализ сорбция реакция

3.1.1 Реакция антиген - антитело

В ИФА основной специфической реакцией является взаимодействие антигена с антителом.

Антитела или иммуноглобулины представляют собой белки, реагирующие с антигеном, который индуцировал их образование. Они состоят из 2 пар цепей, соединенных между собой десульфидными связями. Внутри каждой пары (легкая L и тяжелая H) цепи между собой идентичны. В зависимости от Н-цепей иммуноглобулины подразделяют на 5 классов. Легкие цепи делят на 2 типа, обозначаемые ч (капа) и л (лямбда). Оба типа L-цепей входят в состав всех 5 классов иммуноглобулинов. Такие классы как IgG, IgD, IgE находятся в виде мономеров, IgM встречаются преимущественно в виде пентамера, а IgA - в виде моно-, ди- и тетрамеров. По результатам протеолиза такими ферментами, папайи и пепсин, в иммуноглобулинах выделяют Fab- b Fc-фрагменты. Специфической активностью по отношению к антигену обладают Fab-фрагменты, Fc-участок отвечает за основные эффекторные функции антител.

Антигенами называются вещества или структуры, способные вызывать иммунный ответ. Как правило, антигены имеют многочисленные детерминанты (эпитопы), к которым специфичны активные центры Fab- фрагментов образующихся антител. Набор детерминант определяет специфичность антигена, а их число его валентность. Для антигенной специфичности белков имеет значение их конформация. Изменение конфорации при денатурации белка приводит к потере некоторых детерминант. В основе взаимодействия перекрестно реагирующих антител с антигенами лежит структурное сходство с детерминантами специфического антигена.

Прочность связи Fab-фрагмента с антигенной детерминантой называется аффиностью и определяется величиной константы равновесия данной реакции. Для поликлональной сыворотки эта величина будет различной для тех молекул антител, которые являются продуктами разных В-клеток. В случае моноклональных антител такие различия исчезают. Так как антитела многовалентны (от 2 для IgG до 10 для IgM), то для характеристики прочности связывания антител с соответствующим антигеном вводят термин авидность. Она зависит от аффинности Fab-фрагментов и валентности антител.

3.1.2 Реакция белок А-иммуноглобулин

Наряду с реакцией антиген - антитело широкое распостранение в ИФА получил белок А из-за своей способности специфически взаимодействовать с Fc-фрагментами многих иммуноглобулинов [34].

Белок А имеет молекулярную массу 4200 - 5600 Д и изоэлектрическую точку рI=5,1. Он стабилен в широком интервале температуры, рН (2 - 10) и имеет 4 сайта связывания с Ig [58]. Однако, в реакцию с IgG из-за стерических затруднений вступает только 2 сайта [37]. Величина константы связывания белка А с иммуноглобулинами сильно зависит от их видовой принадлежности, класса и подкласса. Связывание антигена Fab-фрагментами увеличивает аффинность между Fc-областью IgG и белком А [56]. Это расширяет возможность использования белка А в твердофазном ИФА, позволяя применять IgG, тех животных, которые слабо взаимодействуют с ним. Так козьи и овечьи IgG, связанные с антигеном, в 100 раз более сильно взаимодействуют с белком А, чем без антигена [57],

3.1.3 Реакция авидин-биотин

В последние годы широкое распространение в ИФА получила реакция между авидином и биотином (стрепта-видином), позволяющая осуществлять связь между различными компонентами специфического комплекса на твердой фазе. Для нее характерны высокое значение константы связывания (10¹⁵ М^-1), легкость присоединения биотина к антителам без заметного нарушения их антительной активности, высокая стабильность авидина и наличие у него реакционных групп, позволяющих ковалентно присоединять его к различным реагентам.

Биотин представляет собой один из многих водорастворимых компонентов комплекса витамина В и является коферментом для ферментов карбоксилирования. Его молекулярная масса равна 244,3 Д.

Авидин, получаемый из яиц, представляет собой белок с молекулярной массой 62400 Д и изоэлектрической точкой рI=10,5. Один мг авидина связывает до 14 мкг биотина. Образующийся при этом комплекс устойчив в интервале рН 2 - 13. Авидин имеет 4 сайта связывания с биотином. Однако, из-за стерических напряжений может взаимодействовать только с двумя молекулами биотинилированного белка [23].

3.1.4 Реакция лектин-углевод

В ИФА используется также специфическая реакция между пектинами и углеводными остатками различных гликопротеинов.

Наиболее широкое распространение получил конканавалин А. Он связывается с Д-маннозой или Д-глюкозой углеводных остатков пероксидазы [10]. Конканавалин А состоит из 4 субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу 26000 Д и содержит катионы Са²⁺ и Мg²⁺, ответственные за его активность по отношению к углеводам.

3.1.5 Реакция С_1q, компонента комплимента с иммунными комплексами

Комплемент представляет собой набор около 20 сывороточных белков и ответственен за иммунный цитолиз. При классическом пути активации комплемента на первом этапе происходит взаимодействие между С₁ компонентом комплимента и иммунными комплексами или агрегированными IgG. С₁ компонент состоит из трех функционально различных единиц С_1q, С_1r, С_!s, которые через катион Са²⁺ соединяются в активированный комплекс С₁^а (активированный С_i). С Fc-фрагментами антител, класса IgG и IgM, находящимися в составе иммунных комплексов или в агрегированном состоянии, взаимодействует С_1q. Именно это свойство С_1q используют в ИФА при обнаружении иммунных комплексов или агрегированных IgG.

3.2 Характеристика специфических реакций

Основным параметром, определяющим чувствительность и специфичность ИФА, является аффинность используемых реагентов. Время проведения анализа во многом определяется скоростью достижения равновесия в специфических реакциях.

3.2.1 Влияние величины константы равновесия на чувствительность анализа

Понятие константы равновесия легче всего рассмотреть на примере реакции одновалентного антитела с одновалентным антигеном.

Ат + Аг - Ат - Аг (3 -1)

Если |Ат|_о - начальная концентрация антитела, |Аг|_о - начальная концентрация антигена и |Ат - Аг| = |х| - концентрация специфического комплекса, то в момент равновесия, когда скорость прямой и обратной реакции равна, константа равновесия К будет определяться следующим выражением

(3-2)

Рассмотрим какие количества антигена необходимы для достижения постоянного уровня насыщения антител, связанных с твердой фазой при различных значениях К. Это будет характеристикой зависимости чувствительности анализа от К. Переписав уравнение (3 -2) в виде:

(3-3)

Умножим числитель и знаменатель на

(3-4)

Отношение есть отношение молярных концентраций связанных и свободных антител, обозначим его за А. Тогда уравнение (3-4) примет вид:

(3-5)

Для достижения постоянного уровня насыщения антител при разных значениях К будут требоваться различные начальные концентрации антигена. Пусть этот уровень составляет 50%, т. е. А=0,5, тогда уравнение (3-5) примет вид:

|Аг|_о= (3-6)

Величина сорбционной емкости белков на полистироле составляет около1,5 нг/мм² [12]. В том случае, когда этим белком является IgG (М.м. 150000 Д) и поверхность лунки планшета, покрытая раствором IgG, составляет 0,6 см², это соответствует поверхностной концентрации10^-7М.(1,5нгIgG соответствует =10⁹молекул). На 60 мм² будет сорбировано 6х10¹⁰ молекул, при условии, что объем раствора составляет 0,1мл. В 1 л раствора содержится 6х10¹⁴ молекул, что составит 10^-7М). Тогда начальная концентрация атигена, обеспечивающая одинаковое насыщение иммуносорбента составит по уравнению (3-6) 6х10^-8М, 1,5х10^-7 М и 10,5х10^-7 М при К=10⁸, 10⁷, 10⁶ М^-1 сооиветственно. Из этих цифр видно, что чувствительность анализа резко зависит от величины К.

3.2.2 Кинетика специфических реакций

После каждого добавления нового специфического реагента к иммуносорбенту происходит установление равновесия за счет уравнения скоростей образования специфического комплекса на твердой фазе и его разрушения

(3-7)

где k _пр и k _обр константы скоростей прямой и обратной реакций.

В тех случаях, когда антигеном является гаптен с высоким значением коэффициента диффузии , равна 10⁷ -- 10 ⁸ М^-1 х с ^-1 [62]. Величина k _обр сильно зависит от аффинности атител и имеет значения от 10^-4 М^-1с^-1для высокоаффинных до 10³ М^-1с^-1 для низкоаффинных антител [62]. Поэтому скорость достижения равновесия определяется величиной k _обр

или (3-8)

Интегрирование этого уравнения дает следующее:

(3-9)

Введем понятие времени полужизни t?. Тогда уравнение (3-9) можно записать в виде:

ln 0,5=k _обр t?, т. е. t?= (3-10)

Пусть k_пр= 10 ⁷ М^-1 с^-1, тогда для высокоаффинных антител с К= 10 ⁹М^-1

k _обр = = 0,01 М ^-1 с^-1 (3-11)

В этом случае t? = 69,3 с. Для низкоаффинных антител с К= 10 ⁶ М^-1 k_пр = 10 М ^-1с^-1 и t?=0,07с.

В твердофазном ИФА с использованием высокомолекулярных антигенов скорость достижения равновесия значительно уменьшается прежде всего за счет того, что реакция идет не в растворе, а на поверхности твердой фазы. Следовательно время установления равновесия определяется диффузионными параметрами, а не кинетическими. Для определения этих параметров рассмотрен закон Фика, по которому количество вещества (w), подходящее за время к площади s определяется уравнением

( 3-12)

где m - количество вещества, Д - коэффициент диффузии, s - площадь твердой фазы, ДС - разность концентраций в растворе и на поверхности, Дх - разность в расстояниях, соответствующих, t - время. Коэффициент диффузии с учетом предположения, что диффундируемая молекула имеет сферическую форму, выражается уравнением Энштейна:

(3-13)

где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, N_о - число Авагадро, м - вязкость раствора, r - радиус диффундируемой молекулы. Из уравнений ( и ( видно, скорость достижения равновесия на каждой стадии инкубации в основном будет определяться температурой и временем инкубации. Экспериментальные данные свидетельствуют о том [14], что это время лежит в интервале 30 -120 мин при температуре 20 - 40 ^оС и резко сокращается при перемешивании раствора.

4. Устранение неспецифических взаимодействий на этапе промывки

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой следует этап промывки. Ее цель заключается в получении мономолекулярного слоя первого специфического реагента и устранении взаимодействий реагент -- твердая фаза после инкубации последующих реагентов, а кроме того в уменьшении количества перекрестно реагирующих антигенов со специфическим реагентом.

4.1 Получение мономолекулярного слоя первого специфического реагента и устранение последующих взаимодействий реагент -- твердая фаза

Как уже указывалось, в результате сорбции первого специфического реагента (С.Р.) происходит образование вначале мономолекулярного слоя на твердой фазе, а затем многослойной сорбции за счет белок - белковых взаимодействий [38]. Каждый процесс характеризуется своей константой равновесия, причем К₁ > К₂

(4-1)

Добавление в промывной раствор неионных детергентов типа Твин-20 позволяет осуществлять эффективную конкуренцию между белок-белковыми взаимодействиями за счет взаимодействия белок-детергент. Это же взаимодействие уменьшает сорбцию белка на твердой поверхности после частичного разрушения мономолекулярного слоя. Так как все эти процессы равновесные, то для более полного устранения многослойной сорбции необходима многократная промывка твердой фазы до 5-6 раз вместо 2-3 кратной, как обычно рекомендуют.

Для заполнения части образовавшихся свободных активных центров после этапа промывки иммуносорбента иногда проводят этап их блокирования с помощью неспецифических реагентов, таких как различные белки (бычий сывороточный альбумин, овальбумин и др.)казеин и т.д. С этой целью балластные белки в концентрации 1 - 2% вводят в некоторых случаях в состав промывных и инкубирующих растворов на последующих стадиях анализа. Этого можно избежать, используя промывной раствор, в котором наряду с детергентами содержатся хаотропные ионы типа Сl- в высокой концентрации (0,01 М Nа-фосфатный буфер, рН=7,2 - 7,4, содержащий 0,05% твина и 0,65 М NaCl).

4.2 Устранение перекрестно реагирующих антигенов

После каждого этапа инкубации специфического реагента с твердой фазой устанавливается динамическое равновесие иммуносорбент - специфический реагент, положение которого зависит от величины константы равновесия. Добавление каждой новой порции промывного раствора вызывает установление этого равновесия заново. В результате количество удаляемого специфического реагента будет определяться величиной К и числом промывок. Рассмотрим, как влияют эти величины на степень насыщения специфическим реагентом иммуносорбента на модели взаимодействия одновалентного антигена и одновалентного антитела.

Пусть поверхностная концентрация первого специфического реагента в лунке полистиролового планшета составляет 1,5 нг/мм², что соответствует 10^-7 М [12], а первоначальная степень насыщения иммуносорбента после стадии инкубации равна 90%. В этом случае начальная концентрация специфического комплекса на твердой фазе равна 0,9х10^-7М

После установления равновесия в результате первой промывки концентрация комплекса составит (0.9х10^-7 - х), а концентрация свободного антигена и ставших свободными антител будет равна х. Тогда уравнение (3-2) примет вид:

 или (4-2)

Найдем значения :

(4-3)

Подставив в это уравнение различные значения К=10⁶, 10⁷, 10⁸,10⁹, М^-1, получим следующие значения =0,83х10^-7, 0,57х10^-7, 0,25х10^-7 и 0,09х10^-7 М^-1 соответственно. Для расчета степени насыщения необходимо рассчитать соотношение . Это составляет 7%, 23%, 65%, и 81%. Для второй промывки в уравнении (4-2) вместо 0,9х10^-7 следует подставить разность (0,9-)х10^-7, где - величина десорбции после промывки. Это составляет, как показывают расчеты, 25%, 11%, 44% и 72,5% для соответствующих значений К. Графическая зависимость влияния числа промывок на степень насыщения иммуносорбента в зависимости от величины К дана на рисунке.

На основании этих модельных расчетов можно сделать следующие выводы:

1 - перекрестно реагирующие антигены, имеющие низкие значения констант связывания, почти полностью удаляются с иммуносорбента после многократных промывок;

2 - при образовании специфического комплекса нельзя использовать специфические реагенты с низкими значениями К;

3 - чувствительность анализа определяется наименьшей величиной К при образовании многослойного специфического комплекса;

4 - для получения воспроизводимых результатов необходимо стандартизовать этапы прмывки.

5. Способы получения конъюгатов

Способы получения конъюгатов, т.е. комплекса фермента со специфическим реагентом, могут быть разделены на три группы. К первой группе относятся методы химического связывания. Вторая группа методов основана на образовании иммунохимического комплекса между ферментом и специфическим антителом к ферменту. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируется реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между модифицированными ферментом и специфическим реагентом, приводящую к образованию конъюгата по типу реакции антиген-антитело.

5.1 Методы химического связывания

Методы химического связывания можно, в свою очередь, разделить на следующие группы:

1 - методы периодатного окисления, основанные на образовании новых реакционных групп на ферменте и их последующем взаимодействии с реакционными группами специфического реагента;

2 - методы соединения фермента и специфического реагента за счет гомобифункционального реагента;

3 - методы соединения фермента и специфического реагента гнтеробифункционального реагента.

5.1.1 Методы периодатного окисления

Пероксидаза содержит 6 лизиновых остатков из, примерно, 300 аминокислот, но только 1 или 2 из них стерически доступны (связывают 1-фтор-2,4-динитробензол). Недостаток активных NН₂-групп может быть устранен путем окисления углеводных остатков до альдегидных групп, т.к. пероксидаза содержит 8 углеводных цепей, составляющих 21% от молекулярной массы фермента [67]. Альдегидные группы вступают в реакцию с амино-группами белков с образованием основания Шиффа. Для того, чтобы не происходило полимеризации окисленной пероксидазы, ее амино-группы предварительно блокируют либо с помощью 1-фтор-2,4-динитробензола [46], либо с помощью протона [68]. Тем не менее, оба эти способа не обеспечивают полной блокировки амино-групп и степень полимеризации пероксидазы составляет 35% и 5% соответственно. За счет уменьшения избытка окислителя можно подобрать условия, не требующие блокировки амино-групп [64].

Для каждой стадии проведения этих методов важно соблюдение таких условий как рН, температура, время и молярное соотношение реагентов.

Так взаимодействие 1-фтор-2,4-динитробензола с амино-группами пероксидазы происходит при рН 9 - 10. Блокировку же протоном проводят при рН 4 - 5. Понижение рН ниже 4 приводит к инактивации фермента.

На стадии окисления важным моментом является молярное отношение пероксидаза : периодат натрия. Это обусловлено следующими факторами. Во-первых, при значительном избытке окислителя или длительном времени окисления может произойти дальнейшее превращение альдегидных групп до карбонильных, т.к.они более легко окисляются, чем группы углеводного кольца. Во-вторых, при увеличении концентрации периодата натрия происходит постепенная инактивация пероксидазы вследствии окисления некоторых аминокислотных остатков типа метионина и нарушения, тем самым, третичной структуры фермента[25]. В-третьих избыточное окисление увеличивает процесс полимеризации.

Для стадии взаимодействия окисленной пероксидазы со специфическим реагентом также важно их молярное соотношение и время реакции. Обычно рекомендуемый двойной весовой избыток IgG, как специфического реагента, позволяет получать наибольший выход фракции конъюгата, в которой на одну молекулу IgG приходится 1 - 2 молекулы фермента. Значительное отклонение от этого соотношения в сторону большего числа молекул специфического реагента приводит к уменьшению ферментативной активности конъюгата, а увеличение числа молекул фермента снижает его иммунохимическую активность.

После стадии образования основания Шиффа необходимо восстановление иминовой связи, чувствительной к гидролизу в щелочной среде, с помощью боргидрата натрия. Кроме того, это необходимо для восстановления непрореагировавших альдегидных групп пероксидазы и уменьшения, тем самым, степени полимеризации конъюгата.

Периодатные способы получения конъюгатов кроме пероксидазы могут быть сипользованы и для других гликопротеиновых ферментов, таких как амилгликозидаза [17], глюкозидаза [36] и др.

5.1.2 Методы с использованием гомобифункциональных реагентов

Небольшое количество доступных аминогрупп характерно не только для пероксидазы, но и для щелочной фосфатазы и других ферментов. Поэтому их взаимодействие с одной из реакционных группировок гомобифункционального реагента не приводит к преобладающей полимеризации за счет взаимодействия оставшейся реакционной группы сшивающего реагента с другими молекулами фермента. После добавления специфического реагента, содержащего амино-группы, образуется конъюгат сложного молекулярного состава [7]. Менее гетерогенный конъюгат и с более высоким выходом получают после предварительного удаления избытка гомобифункционального реагента с помощью гель хроматографии или диализа [9].

В качестве гомобифункциональных реагентов используют различные соединения, такие как глутаровый альдегид, 4,4^/-дифтор-3,3^/-динитро-дифенилсульфон, водорастворимые карбодиимиды, N,N-о-фенилендималемид, n-бензохинон, ди-N-гидроксисукцинимидиловый эфир янтарной кислоты, 2,4-диизоционаттолуол. Наиболее широко используется глутаровый альдегид для пероксидазы [7,9] и щелочной фосфатазы [24].

5.1.3 Методы с использованием гетеробифункциональных реагентов

Это наиболее прогрессивная группа методов, основанная на использовании сшивающих реагентов с двумя различными реакционными группировками. Одна из них взаимодействует с амино-группой фермента или специфического компонента. После удаления избытка непрореагировавшего реагента модифицированный белок присоединяется к другому специфическому компоненту за счет взаимодействия второй реакционной группы сшивающего реагента с тиольной группой белка. Это позволяет контролировать каждую стадию реакции и получать конъюгаты заданного молекулярного состава [5].

В качестве таких гетеробифункциональных соединений используют: N-сукцинимидиловый эфир 3-(2-пиридилдитио)-пропионовой кислоты; N-гидроксинимидиловые эфиры различных малеимидных производных.

5.1.4 Очистка конъюгатов

Во всех перечисленных методах реакционная смесь наряду с конъюгатами различной молекулярной массы содержит непрореагировавшие исходные компоненты, а в некоторых случаях и их полимеры. Для выделения из конъюгата наиболее активной фракции обычно используют гель-хроматографию на сефадексе G-200, ультрагеле АсА-44, сефакриле S-300 и др.

Для пероксидазных конъюгатов устранение избытка свободного фермента осуществляют с помощью высаливания 50% сульфатом аммония или аффинной хроматографией на белок А-сефарозе [10]. Удаление свободных IgG может быть осуществлено аффинной хроматографией на конканавалин А-сефарозе [10]. При этом необходимо помнить, что пероксидаза, окисленная периодатом натрия, не взаимодействует с конканавалином А, следовательно этот способ очистки нельзя применять для периодатных конъюгатов. Кроме того, небольшое количество IgG (около 5%) взаимодействует с конканавалином А [6], поэтому перед конъюгированием IgG следует пропустить через колонку с конканавалином А.

Необходимость проведения стадии очистки конъюгата во многом зависит от способа его получения. Обязательно следует чистить конъюгаты, полученные с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов, т.к. их выходы очень низки. Как правило подвергают очистке конъюгаты, полученные с помощью других методов, хотя в них степень гомогенности и выход целевого продукта значительно выше. Пероксидазные конъюгаты, полученные периодатным методом, по нашим данным, можно использовать без очистки. Это обусловлено тем, что вступают в реакцию до 70% пероксидазы и более 90% IgG . Свободная пероксидаза не приводит к значительному увеличению фонового сигнала при использовании такого промывного раствора, как натрий-фосфатный буфер, рН 7,2 - 7,4, содержащий 0,65М NaCl и 0,05% твина -20.

5.2 Методы иммунохимического связывания

Эта группа методов основана на образовании фермент-нтиферментного комплекса, который затем присоединяется к иммунохимическому комплексу на твердой фазе за счет анти-имуноглобулинов. Для фермент-антиферментного комплекса характерно максимальное сохранение ферментативной активности.

Его образование может быть осуществлено двумя способами: в ходе последовательного добавления к иммобилизованной твердой фазе сначала антиферментных антител и затем фермента или путем предварительного получения такого комплекса.

5.2.1 Последовательное образование фермент-антиферментного комплекса на твердой фазе

Этот подход имеет ряд ограничений. Во-первых. при использовании поликлональной антисыворотки только часть антител из связавшихся с анти-иммуноглобулинами будут взаимодействовать с ферментом. Во-вторых, такой способ получения конъюгата требует проведения лишних стадий инкубации и промывки. Это увеличивает длительность и трудоемкость анализа.

5.2.2 Предварительное получение фермент-антиферментного комплекса

Перечисленные недостатки могут быть устранены за счет предварительного получения фермент-антиферментного комплекса. Его получают смешиванием антиферментной сыворотки и фермента. При этом сначала образуется нерастворимый преципитат, который растворяется при низких значения рН. Последующая нейтрализация уже не приводит к его выпадению в осадок [61]. При использовании моноклональных антиферментных антител растворимый комплекс образуется сразу [42].

6. Измерение ферментативной активности

Последним компонентом специфического комплекса на твердой фазе является конъюгат. Его ферментативная активность, а следовательно и концентрация, будет пропорциональна концентрации остальных компонентов комплекса, один из которых подлежит определению.

6.1 Основные понятия ферментативной кинетики.

Ферментативное превращение субстрата (С) в продукт (П) происходит через образование промежуточного комплекса (Ф--С)

(6-1)

Зависимость начальной скорости реакции (V_о) от экспериментальных параметров дает уравнение Михаэлиса - Ментен

(6-2)

где V_макс - максимальная скорость реакции, достигаемая при условии, что все количество фермента связано в комплексе с субстратом; |С| - концентрация субстрата; К_м - константа Михаэлиса - Ментен, представляющая собой комбинацию констант скоростей образования комплекса |k₁| и разрушения |k₁ и k₂|. При этом К_м равна:

(6-3)

Другой величиной оценки фермента являются единицы ферментативной активности (Е). Е - это такое количество фермента, которое катализирует превращение субстрата 1мкмбль/мин. Удельная активность равна ферментативной активности, отнесенной к 1 мг фермента. Физический смысл К_м заключается в следующем: при 50% насыщении субстратом активных центров фермента V_о=0,5V_макс, тогда уравнение (6-2) примет вид:

или К_м = |С| (6-4)

Таким образом, К_м равна такой концентрации субстрата, которая необходима для связывания половины активных центров фермента.

Наряду с одноферментными реакциями могут быть использованы циклические ферментные реакции. Этот подход, разработанный для щелочной фосфатазы и получивший название «каскадного» усиления [60], позволяет обнаруживать 10^-17 М фермента [30].

Принцип метода заключается в том, что конъюгат со щелочной фосфатазой катализирует дефосфорилирование NАДР⁺ в NАД. Затем добавляют усиливающий раствор, в котором содержится два фермента. Один из них -- алкогольдегидрогеназа--превращает этанол в ацетальдегид, при этом NАД выступает в роли кофактора и превращается в NАДН. Другой фермент--диафораза--превращает производное тетразолия в окрашенный формазан, при этом NАДН регенерируется в NАД.

6.2 Факторы, определяющие величину ферментативной активности

На величину ферментативной активности влияет рН, температура, концентрация субстата и конформационные изменения в ферменте. Рассмотрим эти факторы в отдельности.

Механизм влияния ионов Н⁺, на активность фермента очень сложен, так как включает в себя многие процессы, такие как изменение конформации белка, протонирование реакционных групп в активном центре, химические изменения в фермент-субстратном комплексе и др. Большинство ферментов имеет колоколообразную зависимость от рН, при этом оптимальные значения рН и ширина колокола определяются природой фермента. Так пероксидаза относительно мало чувствительна к изменениям рН (1 - 2 единицы от оптимального значения), лишь понижение рН ниже 4 и повышение выше 11 приводит к ее денатурации. Лизоцим наоборот очень чувствителен к незначительным изменениям рН.

Температура влияет на величину К_м, которая является комбинацией трех скоростей реакции (6-3). По уравнению Аррениуса это влияние имеет степенной характер.

Где R - газовая постоянная, Т - абсолютная температура, ДЕ_акт - энергия активации, е - основание натурального логарифма, z - частота столкновений. Однако, в отличие от неферментативных реакций, увеличение скорости наблюдается лишь в сравнительно небольшом температурном интервале. Причиной снижения скорости ферментативных реакций за температурным оптимумом является денатурация белковой молекулы фермента, сопровождающаяся падением каталитической активности. Для щелочной фосфатазы этот оптимум лежит в районе 37^оС, для пероксидазы он равен 15^оС. Добавление неионных детергентов уменьшает инактивацию фермента и позволяет использовать более высокую температуру.

Концентрация субстрата также должна быть оптимальной для каждой конкретной пары фермент--субстрат. Превышение концентрации субстрата выше оптимального значения приводит к торможению активности фермента за счет так называемого субстратного торможения.

Состав буферного раствора важен для кинетики ферментативной реакции, прежде всего из-за возможного наличия в нем ингибиторов или кофакторов. Для щелочной фосфатазы необходимо присутствие в буфере 2-х валентных ионов и отсутствие фосфатных анионов. Для пероксидазы ингибиторами являются ионы S , N₃, CN-, J . Важна также ионная сила раствора, которая влияет на конформацию фермента.

На конформационные изменения белковой молекулы фермента кроме рН, температуры и ионной силы раствора сильное влияние оказывет способ получения конъюгата. При его получении необходимо стремиться к максимальному сохранению нативной конформации фермента.

6.3 Эффект иммобилизации конъюгата на иммуносорбенте

В твердофазном ИФА конъюгат проявляет свою ферментативную активность, будучи иммобилизованным на твердой фазе. Это приводит к появлению ряда особенностей по сравнению с ферментативными реакциями, протекающими в растворе [4].

Основное отличие заключается в появлении диффузионных ограничений. Высокая каталитическая активность конъюгата приводит к изменению концентраций субстрата и продукта в его микроокружении, в результате чего возникают градиенты концентраций субстрата и продукта между раствором и твердой фазой с иммобилизованным конъюгатом. Другой причиной возникновения таких градиентов является наличие возле твердой фазы неперемешиваемого слоя раствора, так называемого слоя Нернста. Эти ограничения диффузии накладывают особенности на процесс ингибирования ферментативной реакции субстратом или продуктом, что может приводить при изменении концентрации субстрата к резким переходам реакции из кинетического режима в диффузионный и наоборот.

Второй отличительной особенностью в поведении иммобилизованных конъюгатов является изменение рН-зависимости фермента. Характер изменения ферментативной активности от рН хорошо изучен для большинства ферментов, находящихся в разбавленных растворах. Однако, эта зависимость может резко измениться, если фермент находится в гетерогенной среде. Причиной таких изменений служит перераспределение протонов между фазой свободного раствора и микроокружением фермента в силу рассмотренных диффузионных ограничений.

Поэтому интенсивность перемешивания раствора вокруг твердой фазы, как на этой стадии, так и на других рассмотренных стадия ИФА, играет весьма важную роль.

6.4 Типы используемых субстратов

Наряду с ферментативной активностью конъюгата большое влияние на чувствительность анализа оказывает тип используемого субстрата. Продукт ферментативного превращения субстрата должен обладать новым физико-химическим параметром, позволяющим детектировать его с высокой чувствительностью. Такими параметрами являются: поглощение света в видимой области (хромофорные субстраты), флуоресценция в видимой области (флуоресцентные субстраты) и хемилюминисценция (хемилюминисцентные субстраты).

6.4.1 Хромофорные субстраты

В качестве хромофорных субстратов могут быть использованы как индивидуальные вещества, так и смеси веществ, вступающих в последовательные реакции друг с другом и образующих, в конечном счете, окрашенный продукт. Перечень наиболее часто используемых ферментов и субстратов приведен в табл.1. Использование таких субстратов дает возможность проводить как инструментальный, так и визуальный учет результатов анализа. Последнее очень важно при качественной диагностике инфекционных заболеваний.

6.4.2 Флуоресцентные субстраты

К флуоресцентным субстратам относятся вещества, которые становятся флуорохромами после ферментативного превращения. К ним предъявляется ряд жестких требований: полное отсутствие флуоресценции для немодифицированного субстрата, высокий квантовый выход и большой стоксовский сдвиг для продукта ферментативной реакции. Эти ограничения приводят к тому, что перечень используемых флуоресцентных субстратов в значительной степени более ограничен, чем перечень хромофорных субстратов.

Примеры используемых ферментов и флуоресцентных субстратов приведены в табл.2. Все флуоресцентные субстраты обеспечивают более высокую чувствительность анализа по сравнению с хромофорными (табл.3) и, несмотря на невозможность визуального учета результатов анализа, они получают в последние годы все более широкое распространение.

6.4.3 Хемилюминисцентные субстраты

Наиболее широко применяемыми хемилюминисцентными субстратами являются люминол и изолюминол. На стадии измерения ферментативной активности имеет место реакция их окисления перекисью водорода в присутствии пероксидазных конъюгатов.

Для этой реакции, оптимальные параметры которой изучены в работе [52], характерно сначала быстрое возрастание интенсивности хемилюминисценции после смешиваний реагентов (растворов перекиси водорода и люминола), прохождение через максимум, а затем быстрый спад.

Излучение света в результате люминол - пероксидазной реакции может быть усилено в несколько сот раз за счет использования усилителей хемилюминисценции, которыми являются 6-гидроксибензотиазол, п-иодфенол, п-фенилфенол, 1-бром-2-нафтол и др.[53]. Этот подход обеспечивает значительное усиление хемилюминисценции и соответствующее повышение чувствительности анализа [54]. Кроме того, имеет место и другое практически важное преимущество. В результате добавления усилителей интенсивность хемилюминисценции остается постоянной в течение примерно 20 минут. Это приводит к большей стандартизации результатов и позволяет проводить учет результатов уже через 30 секунд после добавления раствора субстрата [55].

Таблица 1. Ферменты и субстраты, используемые в хромофорном ИФА.

Фермент	Субстрат	Спектральная характеристика продукта превращения субстрат (НМ)
1	2	3
Пероксидаза	о-фенилендиамин о-дианизидин 3,3/5,5/-тетрааминобензидин 4-аминоантипирин + фенол 2,2/-азино-ди-3этилтиазолин-сульфонат-6 (АВТS) 5-аминосалициловая кислота о-толуидин гидразон 3-метил-2-бензотиазолина + 3-диметиламинобензойная кислота 4-хлорнафтол 3,3/-диаминобензидин	492 400 490 490 414 450 620 590 585* *
Щелочная фосфатаза	n-нитрофенилфосфат о-нитрофенилфосфат 5-бром-4-хлор-индолилфосфат + нитроголубой тетразолиум нафтол Аs-МХ фосфат + быстрый голубой ВВ нафтол Аs-МХ фосфат + быстрый красный TR 2-нафтилфосфат+быстрый голубой В нафтол Аs фосфат + быстрый голубой ВВ нафтол Аs-В1 фосфат + быстрый красный TR	420 405 * * * * *
в-Д-галактозидаза	n-нитрофенил-в-Д-галактопиранозид о-нитрофенил-в-Д-галактопиранозид 5-бром-4-хлор-3-индолил-в-Д-галактопиранозид 6-бром-2-нафтил-в-Д-галактопиранозид	420 405 * *
в-Д-глюкозидаза	n-нитрофенил-в-Д-глюкопиранозид о-нитрофенил-в-Д-глюкопиранозид	420 406
Пирофосфатаза	малахитовый зеленый + пирофосфат	430
в-лактамаза	йод
Уреаза	рН-индикаторы: бромкрезоловый пурпурный

· Образуют нерастворимые окрашенные соединения.

Таблица 2. Ферменты и субстраты, используемые во флуоресцентном ИФА

Фермент	Субстрат	Спектральные характеристики продукта превращения субстрата
		Возбуждение макс. (НМ).	Эмиссия макс. (НМ)
Пероксидаза хрена	тирамин n-гидроксифенилпропионовая кислота	320 320	405 405
Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа	глюкоза-6-фосфат + NАДР	360	460
в-Д-галактозидаза	4-метилумбеллиферил-в-Д-галактопиранозид	365	450
в-Д-глюкозидаза	4-метиламбеллиферил-в-Д-глюкопиранозид	365	450
Щелочная фосфатаза	4-метилумбеллиферилфосфат	365	450

Таблица 3. Чувствительность ИФА при использовании хромофорных и флуорохромных субстратов.

Фермент	Субстрат	Тип анализа	Чувствительность, амоль-трубку	Литература
			10 мин анализ	100 мин анализ
в-Д-галактозидаза	4-метилумбеллиферил-в-Д-галактопиранозид о-нитрофенил-в-Д-галактопиранозид	фл. хр.	0,2 1000	0,02 100	48 48
Щелочная фосфатаза	4-метилумбеллиферилфосфат n-нитрофенилфосфат	фл. хр.	10 10000	1,0 -	48 48
Пероксидаза	n-гидроксифенилпропионовая кислота о-фенилендиамин тетраметилбензидин	фл. хр. хр.	5 25 50	0,5 25 10	51 49 50

Примечание: фл. - флуоресцентный ИФА,

хр. - хромофорный ИФА.

7. Интерпретация результатов ИФА