Принципы твердофазного иммунферментного анализа

Зависимость величины ферментативной активности специфического комплекса с ферментной меткой от количества любого компонента комплекса изображается в виде доза-ответной кривой, где на оси ординат отложена интенсивность сигнала субстрата после его ферментативного превращения, измеренная в момент времени t, а по оси абсцисс концентрация определяемого реагента в пробе.

Под чувствительностью анализа понимается та минимальная концентрация определяемого реагента, при которой заметно различие сигнала для этой концентрации и нулевого стандарта, т.е. образца заведомо не содержащего определяемого реагента. Эта разница в величинах сигналов должна составлять 2 - 3 величины стандартного отклонения (СО) для нулевого стандарта, рассчитываемого по формуле:,

(7-1)

где СО - стандартное отклонение, n - число измерений, x_i - величина сигнала для данного измерения, m - среднее арифметическое от x_i.

7.1 Методы выражения концентрации антигена

В тех случаях, когда антиген можно получить в очищенном виде, готовят стандартные растворы с известной концентрацией антигена и строят калибровочную кривую. По ней, зная величину сигнала для неизвестной пробы, можно рассчитать концентрацию определяемого антигена, которая выражается обычно в нг/мл или М Точность результатов максимальна в линейной области доза-ответной кривой, так как чем больше наклон кривой, тем выше точность анализа.

Для неочищенного антигена его концентрация выражается в относительной величине - титре, который представляет собой степень разведения раствора антигена. Разновидностью этого метода является полуколичественный учет результатов ИФА, когда интенсивность сигнала оценивается в «крестах» (++++, +++, ++, + и -- ).

Для качественной диагностики, когда важно наличие или отсутствие антигена в исследуемой пробе, используют положительно - отрицательный метод. Положительным значением (+) считают величину сигнала, которая в 2 - 3 раза превышает сигнал от контрольного образца, не содержащего определяемый антиген или содержащий гетерологичный антиген ( - ). Процент положительных проб представляет собой выявляемость метода. Иногда выявляемость отождествляют с чувствительностью, что ошибочно.

7.2 Методы выражения концентрации антител

Количественное измерение концентрации антител в твердофазном ИФА невозможно. Это связано с тем, что количество антител в специфическом комплексе зависит не только от концентрации антител в исследуемой пробе, но и от их аффинности, при этом имеет место конкуренция между низко- и высокоаффинными антителами за антигенные детерминанты иммуносорбента. Поэтому положение и наклон доза-ответной кривой будет отличаться как для сывороток, содержащих разное соотношение иммуноглобулинов различных классов, так и для сывороток с одинаковым соотношением иммуноглобулинов, но с различной аффинностью. Кроме того, концентрация антител в исходных сыворотках может меняться в широком интервале, достигающем 6 lg. Это приводит к тому, что вместо абсолютной концентрации антител проводят оценку их антительной активности.

Положительно - отрицательный метод. Сущность этого метода заключается в том, что рассчитывают средние значения величин сигналов от 100 - 120 заведомо отрицательных, по данным клиницистов, сывороток и вычисляют величину стандартного отклонения. Тогда превышение величины сигнала для исследуемой сыворотки, взятой в том же измерении, на 2 - 3 СО по сравнению со средним значением сигнала отрицательного пула позволяет считать эту сыворотку положительной ( + ). Процент положительных сывороток называется выявляемостью и не имеет отношения к чувствительности анализа.

Метод титрования (Т). В этом методе измеряют сигналы серийных разведений каждой сыворотки. Разведение, при котором сигнал равен сигналу контроля плюс 2 - 3 СО, называется титром (Т).

Метод эффективной дозы (ЭД). Этот метод является разновидностью метода титрования. После титрования референсной и исследуемых сывороток продолжают линейные участки кривых до пересечения с осью абсцисс и рассчитывают разность в IgТ.

Метод зоны. Принцип метода заключается в вычислении площади между кривыми титрования парных сывороток. Критерием положительной зоны, свидетельствующей о нарастании специфических антител, является превышение вычисляемой площади над определенным числом. Это число рассчитывается как средняя зона доза-ответных кривых, получаемых из многократного анализа низкоположительных и высокоположительных сывороток плюс удвоенные средние квадратичные отклонения от ширины кривых , а также площадь зоны, измеренной для парных сывороток с достоверным нарастанием титров антител в 4 и более раз по данным серологических методов.

Метод величины сигнала (ВС). Метод заключается в измерении величины сигнала для одного и того же разведения исследуемых сывороток и референсного пула. По ВС больные могут быть разбиты на группы с различными особенностями протекания инфекционного процесса.

Метод отношения (П/О). В этом методе рассчитывают отношение ВС исследуемых и пула отрицательных сывороток, взятых в одинаковом разведении. При П/О больше, чем 2 - 3,сыворотку считают положительной.

Метод многократной нормальной активности (МНА). Он представляет собой попытку улучшить корреляцию получаемых результатов с титром, используя, тем не менее, одно разведение используемой сыворотки. После титрования положительного референсного пула сывороток строится доза-ответная кривая и ее завершающая часть аппроксимируется параболой. Для мест пересечения параболы с сигмо-идной кривой (точки А и В) рассчитывают значение величин сигнала и lg Ti. На основании этих величин рассчитывается константа (я) сигмо-идной кривой по формуле:

(7-2)

где lgT_B, lgT_A - логарифмы разведения положительного референсного пула в точках А и В, lgBC_B, lgBC_A - логарифмы интенсивностей сигналов в этих же точках.

Затем измеряют величины сигналов для исследуемых сывороток (Bd) и положительного референсного пула (BCn), взятых в одинаковом разведении, которое лежит в интервале lgT_B-lgT_А. Величина МНА для каждой исследуемой сыворотки рассчитывается по формуле:

(7-3)

Метод стандартной кривой (СК). Сущность метода заключается в том, что для большого набора сывороток (от отрицательных до сильноположительных) получают доза-ответные кривые. На основании полученных кривых строится «средняя» кривая. Тогда, зная значения величин сигнала для исследуемых сывороток при одинаковом разведении, можно рассчитать по «средней» кривой величины их титров.

Сравнительный анализ некоторых из перечисленных методов с методом титрования показал, что только методы эффективной дозы стандартной кривой позволяют получить результаты, пропорциональные титру. Удовлетворительные результаты дает также метод многократной нормальной активности. Результаты остальных методов слабо коррелируют с титром исследуемых сывороток (табл.4)

Таблица 4. Методы оценки активности антител в ИФА.

Список литературы

1. Ссылки см. в оригинальной статье: Вербов В.Н. Принципы твердофазного анализа. // Твердофазный иммуноферментный анализ. Труды института имени Пастера, том 64, 1998. С 3-27.

Размещено на Allbest.ru