Вплив мутагенів на виживання та антибіотичну активність продуцента тейкопланіну Actinoplanes teichomyceticus Lv95

Размещено на http://www.allbest.ru/

5

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив мутагенів на виживання та антибіотичну активність продуцента тейкопланіну Actinoplanes teichomyceticus Lv95

ЗМІСТ

ВСТУП

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Методи отримання мутантів актиноміцетів із підвищеною продукцією антибіотика

1.1.1 Спеціальні методи селекції

1.1.2 Загальні характеристики мутаційного процесу в бактерій

1.1.3 Використання деяких видів мутагенезу для отримання мутантних штамів

1.1.4 Пошкодження ДНК, спричинені УФ-опроменями та N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином

1.2 Загальна характеристика актиноміцетів роду Actіnoplanes

1.3 Actinoplanes teichomyceticus продуцент тейкопланіну

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1 Визначення оптимального агаризованого середовища для ростута синтезу антибіотика A. teichomyceticus Lv95

2.2 Визначення резистентності штаму A. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків

2.3 Визначення антибіотичної активності штаму A. teichomyceticus Lv95

2.4 Опромінення штаму A. teichomyceticus Lv95 ультрафіолетовими променями (УФ)

2.5 Обробка штаму A. teichomyceticus Lv95 N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ)

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

3.1 Підбір тест-культури та оптимального середовища для вирощування штаму Actinoplanes teichomyceticus Lv95

3.2 Визначення резистентності штаму A. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків різної дії

3.3 Визначення антибіотичної активності штаму A. teichomyceticus Lv95

3.4 Вплив УФ на виживання штаму A. teichomyceticus Lv95

3.5 Вплив N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідину (НГ) на виживання A. teichomyceticus Lv95

ВИСНОВКИ

ЛІТЕРАТУРА

ВСТУП

Боротьба з інфекціями продовжує залишатися одним із пріоритетних завдань у галузі охорони здоров'я в усьому світі. Антибактеріальні препарати, які на сьогодні складають одну з найбільш чисельних груп лікарських засобів, посідають провідні позиції у цій боротьбі. Практично щороку на фармацевтичному ринку з'являються нові антибіотики з різними спектром активності та механізмом дії, їх успішно використовують у багатьох галузях медицини.

Чи не найбільшу загрозу сьогодні становлять “внутрішньолікарняні” інфекції, викликані грам-позитивними бактеріями. Більшість із збудників набули мультирезистентності до багатьох препаратів, які використовуються для лікування хворих.

На сьогоднішній день найбільш ефективними антибіотиками у лікуванні важких інфекцій дихальних, сечовивідних шляхів, шкіри та м'яких тканин, кісток і суглобів є глікопептидні антибіотики, зокрема ванкоміцин та тейкопланін. Ванкоміцин використовується в клінічній практиці з 1958 року, тейкопланін - з середини 80-х років [7]. Вони активні проти грам-позитивних аеробних і анаеробних мікроорганізмів: стафілококів, стрептококів, пневмококів, ентерококів, лістерій, коринебактерій, клостридій. Грам-негативні бактерії є стійкими до дії глікопептидних антибіотиків.

В останні роки в ряді європейських країн, а також в Україні, були виділені штами Staphylococcus aureus, які мають понижену чутливість до дії ванкоміцину. Тому постало важливе завдання збільшити синтез потужнішого антибіотика - тейкопланіну. В фармакології цей препарат також відомий під назвою «Таргоцид». Висока вартість цього антибіотика (близько 700,0 грн. за ін'єкцію, яка містить 400 мг тейкопланіну) зумовлена дорогими складниками ферментаційного середовища для продуцентів, а також тривалим терміном ферментації. Створення вітчизняного виробництва тейкопланіну дало б змогу здешевити препарат на його основі і зробити його доступнішим для населення.

Продуцент тейкопланіну Actinoplanes teichomyceticus міститься в Колекції культур мікроорганізмів - продуцентів антибіотиків Львівського національного університету імені Івана Франка під номером Lv95. Цей штам був об'єктом нашої роботи.

Метою роботи було дослідити вплив мутагенів на виживання та антибіотичну активність Actinoplanes teichomyceticus Lv95.

Для цього були поставлені такі основні завдання:

1. Визначення оптимального середовища для росту та синтезу антибіотика штаму A. teichomyceticus Lv95;

2. Визначення доз ультрафіолетового опромінення та N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідину, оптимальних для виділення мутантів A. teichomyceticus Lv95 з підвищеною антибіотичною активністю.

антибіотик штам мутант teichomyceticus

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Методи отримання мутантів актиноміцетів із підвищеною продукцією антибіотика

1.1.1 Спеціальні методи селекції

Для того, щоб вдосконалити штам, потрібно змінити ДНК таким чином, щоб підвищити рівень ферментів, які беруть участь у біосинтезі, нейтралізувати негативний вплив контролюючих елементів у схемі біосинтезу, створити новий ефективний шлях біосинтезу антибіотика. На сьогоднішній день є широкий спектр мутагенів, серед яких можна вибрати той, що викликає певний тип мутацій.

За умови низької частоти появи надпродуцентів, доцільно тестувати кілька тисяч клонів у найкоротші строки. До того ж експрес-методи селекції дозволяють виявити тільки значні зміни в антибіотичній активності, а дрібні залишаються непоміченими. Саме тому є розроблені спеціальні методи селекції.

Чашковий метод селекції. Найпоширенішим варіантом цього методу є заливання поверхні агаризованого середовища, на якому ростуть окремі колонії досліджуваного штаму 0,7% агаром з тест-культурою. Антибіотик, який дифундує в середовище, утворює зони пригнічення росту тест-культури. Іншим варіантом методу є вирощування окремих клонів досліджуваного штаму на агарових блоках з подальшим перенесенням на попередньо засіяні тест-культурою чашки. Велика кількість клонів, які можна перевірити основна перевага даного методу. Головним недоліком є низька роздільна здатність. Погано, коли продукція антибіотика збільшується на малі величини. Якщо така проблема виникає, то необхідно провести заходи по зменшення діаметру зони. Іншим обмеженням чашкового методу є те, що важко відділити біомасу (розмір колонії і її морфологію) від продуктивності. Для цього визначають індекс продуктивності ? відношення діаметру зони до діаметру колонії.

Метод з використанням рідкої культури. Пряме використання методу ? це розсів мутагенізованої суспензії спор. Перевагами рідких культур для вирощування клонів є використання біомаси для TLC, електрофотометрії, методу дифузії антибіотиків в агар тощо. Недолік методу ? високий рівень мімікрії при проведенні перевірки в промислових масштабах, адже культура, яка показала себе у двохлітровому ферментері, може бути неефективною при вирощуванні у 100-літровому ферментері.

Якщо мутант, який був виділений у ході даної селекції, стабільно має підвищений синтез антибіотика, то його далі використовують у промислових масштабах. Якщо ж він розщеплюється на клональні культури, то його використовують для подальших раундів селекції, так званої циклічної селекції. ЇЇ принцип полягає у тому, що вивченню піддають велике число клонів в одному повторі і виділяють фіксований відсоток культур, які використовують як первинну групу для наступного раунду мутагенезу. З цієї культури також виділяють відсоток культур і все повторюють. На певному етапі відсоток кращих надпродуцентів вивчається окремо. В такій системі постійно надпродукуючий штам буде переходити з циклу в цикл і поступово збільшувати кількість надпродукуючих клонів.

Використання мутацій стійкості до антибіотиків. В останні роки для отримання мутантів, що мають підвищений рівень синтезу антибіотика, часто використовують мутації стійкості до різних антибіотиків. Особливо ефективними у селекції, що спрямована на отримання надпродуцентів, є мутації стійкості до аміноглікозидних антибіотиків, рифампіцину, хлорамфеніколу, еритроміцину [13]. Багато робіт присвячено отриманню та використанню актиноміцетів стрептоміцин-стійких (Str^r) мутантів. Вивчення їхніх властивостей виявило, що окремі мутації, які призводили до Str^r-фенотипу, спричинювали підвищення рівня синтезу антибіотиків. Конструювання подвійних (Str^rGen^r, Str^rRif^r) та потрійних мутантів (Str^rGen^rRif^r) дає значне зростання синтезу антибіотика, порівняно з мутантами, що містять лише одну з мутацій [3].

Штами-продуценти мають певний ступінь стійкості до власного антибіотика, який знаходиться у прямій залежності від рівня їхньої антибіотичної активності. Функціонування генів стійкості як до власних, так і до інших антибіотиків є одним із механізмів регуляції рівня біосинтезу антибіотика. Це можна пояснити тим, що гени стійкості і біосинтезу розташовуються в одних кластерах. Введення мутацій у ці гени може спричинювати підвищення рівня біосинтезу антибіотика [6].

Багаторівневі скринінгові системи селекції. У цьому методі культури проходять через ряд скринінгових методів, починаючи з таких, що мають низьку роздільну здатність, але високу пропускну і закінчуючи високороздільноздатними з низькою пропускною здатністю. Наприкінці кожного етапу скринінгу певний відсоток найперспективніших культур відбирається і вивчається у кількох повторах. Типовий експеримент включає швидкий чашковий скринінг, який буде супроводжуватись другим чашковим скринінгом з повтором, а далі метод рідких культур і на завершення скринінг у малих ферментерах.

Біохімічна і генетична характеристика надпродукуючих мутантів дає інформацію для створення ефективних систем скринінгу та підбору ефективних умов ферментації. Також є можливим вивчати природу блоку шляху додаючи до середовища, в якому вирощують мутанти, інтермедіати шляху біосинтезу.

Використання блок-мутантів дає значні переваги у порівнянні з чашковим методом, оскільки там важко відмітити амплітуду коливання ознаки синтезу антибіотика, адже вихідна продуктивність дуже низька. На одній чашці Петрі, залежно від продуктивності блок-мутантів і чутливості тест-культури, можна перевірити щонайменше 100 колоній.

Вигідно індукувати мутації, які викликають втрату продукції антибіотика у надпродуцентів, адже реверсія таких мутантів є найбільш корисною на фоні високопродуктивного генотипу.

Всі вище описані методи селекції вимагають проведення мутагенезу.

Чим більше стає відомо про біосинтез антибіотика, тим впливовішими стають методи генної інженерії у вдосконаленні штамів [2, 4].

1.1.2 Загальні характеристики мутаційного процесу в бактерій

Виникнення мутантів - досить рідкісне явище. Щоб дізнатися як часто вони виникають, визначають кількість клітин, які утворюють мутантні клони. Кількість мутантів в культурі може залежати від частоти актів мутування і швидкості розмноження мутантів. Для кількісного аналізу мутаційного процесу найчастіше використовують такі два показники:

1. Частота мутантів (r). Визначається як відношення кількості мутантних клітин до загальної кількості клітин.

2. Частота мутацій (б) на один поділ клітини, що визначається відношенням кількості актів мутування до кількості поділів клітини бактерій, або відношенням кількості актів мутування до кількості клітинних генерацій, які сформували досліджувану популяцію.

Частоту отримання мутантів можна збільшити, обробивши клітини мутагенами. Вони індукують мутації в дозах, які одночасно спричиняють летальний ефект. Одні з них, наприклад, N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідин (НГ) виявляють найбільший мутагенний ефект у дозах, при яких виживання клітин становить від 10 до 50 %. Інші, наприклад, ультрафіолетові промені (УФ), ефективні в дозах, при яких виживання становить від 0,1 до 1,0 %.

Дія мутагенів залежить, насамперед, від таких факторів:

· концентрації мутагену в середовищі, дози опромінення УФ чи іонізуючими променями;

· тривалості дії мутагену;

· хімічного складу та pH середовища, в якому містяться клітини;

· температури;

· титру клітин у середовищі;

· типу клітин (вегетативні клітини чи спори) і стадії їхнього життєвого циклу.

Саме тому оброблення мутагенами намагаються зробити стандартними. Бажано, щоб великі популяції організмів, на які діють мутагеном в експерименті, знаходилися на однаковій стадії життєвого циклу. Також необхідно забезпечити рівномірний розподіл мутагену в середовищі, де знаходяться клітини, та ефективне припинення його дії.

Перш за все встановлюють, як впливають різні дози мутагену на виживання клітин. Отриману залежність відображають графічно, відкладаючи на осі абсцис дозу, що для УФ, наприклад, може бути подана в дж/м² або ерг/мм², або час опромінення в секундах. На осі ординат відкладають відсоток клітин, які вижили після обробки мутагеном. Такі графіки називають "кривими виживання". Використовуючи арифметичну шкалу відсотків виживання, отримують шкалу у вигляді експоненти, яка спочатку стрімко падає, а потім її нахил стає меншим і вона поступово переходить у майже горизонтальну лінію. Якщо ж на осі ординат відкласти lg% виживання, то залежність буде мати вигляд прямої лінії.

Експерименти з хімічними мутагенами проводять в двох варіантах:

1) виготовляють суміші з різними концентраціями мутагену й інкубують клітини з однакові проміжки часу. Наприклад, концентрації мутагену 1, 3, 5 мг/мл, а час інкубації у всіх випадках становить 20 хв.

2) виготовляють суміші з однаковою концентрацією мутагену й інкубують клітини різні проміжки часу. Наприклад, концентрація мутагену 3 мг/мл і час інкубації 10, 30, 60 хв.

Також будують графік залежності дози мутагену і частоти мутантів. В такому випадку на осі абсцис відкладають дозу мутагену, а на осі ординат ? відсоток мутантів.

Щоб отримати достовірні результати, досліди по вивченню летальних та мутагенних впливів різних доз мутагенів слід повторити. Дані про вплив кожної дози, отримані в декількох дослідах, статистично опрацьовують як варіаційний ряд. На графіку відкладають середні величини і вказують межі їх відхилень.

Максимальну кількість мутантів можна виділити, знаючи оптимальні умови мутагенної обробки і визначивши залежності "доза ? летальний ефект" і "доза мутагенний ефект".

Для виділення і аналізу мутантів необхідний певний стандарт, з яким слід порівнювати отримані дані. Цим стандартом виступає так званий "дикий тип", тобто організм виділений з природи. Слід детально проаналізувати якісні та кількісні ознаки дикого типу, щоб мати можливість чітко відрізняти мутант від дикого типу за фенотипом.

Щоб у фенотипі виявилася мутація, спричинена мутагенами, необхідний певний час лаг-період вияву мутацій. В цей час відбувається експресія мутацій. У більшості методів відбору мутантів є передбачено вирощування мутагенізованої культури протягом певного часу на повноцінному середовищі, а потім висів клітин для відбору мутантів на селективне середовище. Для перетворення пошкоджень ДНК у мутації необхідна реплікація. Найчастіше мутагенами обробляють клітини, що знаходяться в експоненціальній фазі росту, де вони є найбільш чутливими до дії мутагену [6].

1.1.3 Використання деяких видів мутагенезу для отримання мутантних штамів

Спонтанний мутагенез. Мутагенез - це процес виникнення в організмі спадкових змін - мутацій. Основа мутагенезу ? зміни в молекулах нуклеїнових кислот, які зберігають та передають інформацію. Відповідно з фізіологічною гіпотезою мутаційного процесу мутації розглядають як наслідок випадкових помилок або індукованих порушень звичних процесів клітинної фізіології і в першу чергу так званих «трьох Р»: реплікації, рекомбінації, репарації. Ферменти цих найважливіших процесів забезпечують функціонування в клітинні багатьох систем захисту структури ДНК. Дякуючи наявності таких захисних механізмів будь-які молекулярні зміни молекулярної організації генетичного матеріалу не слід вважати мутаціями [1].

Все різноманіття мутацій поділяють на групи. За походженням розрізняють спонтанні та індукованні мутації. Спонтанними називаються мутації, поява яких викликана невідомим фактором, без втручання зі сторони. Для таких мутацій характерна випадковість, низька частота виникнення (1Ч10^-10 - 1Ч10^-5) та наявність лаг-фази. Тобто вони проявляються після декількох циклів клітинного поділу.

Було встановлено, що в природі існують фактори спонтанного мутагенезу. До них відносять природну радіацію, хімічні сполуки, які виникають спонтанно та здатні викликати мутаційний процес, вплив екстремальних температур та гени-мутатори.

Спонтанні мутації виникають в результаті помилок репарації, реплікації і рекомбінації ДНК під впливом природного фону опромінення, дії хімічних речовин або УФ променів.

Спонтанний мутагенез є наслідком різних впливів, що можуть привести до пошкодження генетичних структур під час життєвого циклу організму. Даний процес є основним джерелом природної мінливості мікроорганізмів і лежить в основі еволюції. Однією з причин виникнення спонтанних мутацій є помилки у функціонуванні ДНК-полімерази, що виникають під час реплікації ДНК, коли цей фермент вводить у новосинтезовану нитку замість комплементарної азотистої основи некомплементарну.

Природу спонтанного мутагенезу ще достовірно не з'ясовано. Одним з факторів спонтанного мутагенезу є хімічні сполуки, які утворюються в організмі як проміжні продукти обміну речовин. Багато вчених вважають основною причиною спонтанного мутагенезу помилки ферментів, які беруть участь в взаємодії ДНК при поділі клітини, репарації пошкодженої ДНК або в процесі обміну генами. Експериментально доведено, що частота спонтанного мутагенезу близька до частоти помилок ферментів, які беруть участь в генетичних процесах.

Індукований мутагенез. Сьогодні є одним із основних шляхів отримання нових вихідних форм для селекції. Водночас штучний мутагенез став частиною аналізу, бо використання мутацій для маркування генетичного матеріалу стало традицією генетичних досліджень.

Слід зазначити, що в ділянках хромосом з різною послідовністю нуклеотидів інсерції мобільних генетичних елементів відбуваються з різною частотою. Крім того, показана певна вибірковість у дії хімічних мутагенів і опромінення на ДНК. Цим пояснюється той факт, що окремі райони хромосом і певні послідовності нуклеотидів у межах окремого гену мутують частіше, ніж сусідні ділянки геному. Так, наприклад, вивчення природного мутагенезу в районі rII фага Т4 показало існування в генах «гарячих» точок, тобто місць або сайтів високої мутабільності.

Індуковані мутації виникають під впливом пошкоджуваної дії на генетичний апарат клітини деяких хімічних та фізичних агентів.

Мутагени взаємодіють з молекулами ДНК, змінюючи їх структуру, або діють на них. Пряма дія на ДНК супроводжується пропорційним підвищенням частоти мутацій при збільшені дози чи часу дії мутагену. Проте часто залежність мутагенезу від дози опромінення, часу обробки або від концентрації хімічних сполук є більш складною, що зумовлено двома основними причинами. Першою причиною є те, що при взаємодії мутагенів з ДНК в багатьох випадках для появи мутацій однократної дії мутагенного фактору виявляється недостатньо і мутація виникає тільки після двох або більше разів. А другою причиною є те, що мутагени можуть взаємодіяти не тільки з ДНК, а проявляти непряму дію. Наприклад, мутаген здатен викликати утворення в клітинах значної кількості проміжних хімічних сполук, які далі взаємодіють з хромосомами і ДНК, тим самим змінюючи їх структуру. Багато мутагенів здатні зберігатися в клітині протягом тривалого часу, проявляючи наслідки. Встановлено, що пошкодження, які виникають в ДНК і залишаючись в незміненому стані протягом тривалого часу, здатні проявлятися у вигляді нових мутацій в нащадків особин, які піддавалися впливу мутагену.

Під дією мутагенів у мікроорганізмів виникають в основному ті ж мутації, що і при спонтанному мутагенезі, однак з більшою частотою. Зміни можуть бути різними: морфолого-культуральними та фізіологічними. Також під впливом мутагенів виникають і такі мутації, що не виникають при спонтанному мутагенезі. До них відносяться мутації, що призводять до порушення синтезу пігментів, антибіотиків, амінокислот.

Мутагенами зазвичай обробляють спори, які знаходяться в стані спокою. Проте відомо, що мікроорганізми знаходяться в різних фізіологічних станах - стадії спокою і стадії ініціації, після визначеного часу проростання, мають різну чутливість до зовнішніх факторів дії, що зумовлено різними станами ДНК. Наприклад, в період реплікації стан ДНК-фагів, бактерій і клітин тварин різняться від стану в інші періоди життя. ДНК за рахунок локальних пошкоджень водневих зв'язків володіє ознаками, що характерні для денатурованих або однониткових молекул ДНК. Денатурована ДНК реагує з хімічними мутагенами значно краще, ніж нативна.

Головні закономірності індукованої зміни мікроорганізмів зводять до наступного:

1) частота фізіологічних і морфологічних мутантів при збільшенні дози мутагену спочатку збільшується, а потім зменшується;

2) морфологічні і низькоактивні варіанти спостерігаються при високих дозах, а максимальна кількість викоактивних - при менш токсичних дозах мутагену;

3) у високоактивних штамів індукується більше низькоактивних варіантів, а в малоактивних штамів частота високоактивних перевищує частоту низькоактивних;

4) в результаті довготривалої селекції з використанням мутагенів темп відбору по якій-небудь незначній оцінці знижується.

Фізичний мутагенез. При дії фізичних мутагенів спочатку виникає первинне пошкодження ДНК. Якщо воно не буде повністю виправлено в результаті репарації, то при наступному реплікативному синтезі ДНК виникатимуть мутації. Фізичні фактори - це короткохвильові випромінювання і дія температури, частки різної природи, які володіють високою енергією: б-, в-випромінювання радіоактивних речовин. Вплив температури є слабким мутагеним фактором, проте її підвищення на кожні 10єС збільшує частоту генних мутацій в декілька разів також підсилює дію інших фізичних та хімічних мутагенів.

Досить детально вивчені пошкодження ДНК, які виникають в результаті електромагнітних випромінювань різної довжини хвилі. Таке магнітне випромінювання з довжиною хвилі більш ніж 300 нм не поглинається ДНК, проте в деяких випадках все-таки викликає мутагенну дію, механізм якої полягає в поглинанні квантів світла хромофорними групами ДНК. При дії світла з довжиною хвилі 200-300 нм проходить поглинання квантів світла хромофорними групами ДНК і перехід останніх у збуджений стан.

Іонізуючі промені проникають у клітину і провокують іонізацію атомів і молекул речовин. Рентгенівські промені, як і світло ? електромагнітні хвилі, виключно з дуже малою довжиною хвилі. Електромагнітні хвилі проникають у вигляді окремих квантів, енергія яких тим більша, чим коротша довжина хвилі. Кванти з високою енергією глибоко проникають у тканини і там поглинаються компонентами клітини. Їхня висока енергія спричинює до того, що вони пошкоджують молекули ДНК або видозмінюють інші молекули, які ті, в свою чергу, пошкоджують ДНК. УФ промені не володіють високою енергією для іонізації атомів, проте поглинаються пуриновими та піримідиновими молекулами ДНК, переводячи їх у збуджений стан.

Хімічний мутагенез. Хімічні мутагени - це речовини, що викликають хімічні перетворення, які супроводжуються змінами в структурі ДНК. До них належать: аналоги азотистих основ; інгібітори синтезу попередників ДНК; алкілючі сполуки; похідні акридину; речовини, які змінюють структуру азотистих основ. Хімічні мутагени набагато кращі, ніж іонізуючі випромінювання за своєю мутагенною дією.

Відомо 9 класів алкілюючих сполук, які відрізняються за типом алкільних груп, які може віддавати одна молекула алкілюючого агента. Дуже часто алкілуванню підлягає атом азоту в 7-му положенні гуаніну. Виявлено, що в структурі подвійної спіралі ДНК алкілуванню підлягають в першу чергу вільні від водневих зв'язків атоми азоту гуаніну та аденіну і рідше зв'язані водневими зв'язками атоми азоту аденіну та гуаніну. Алкільні групи можуть вступати в реакцію з залишком фосфорної кислоти, заміщуючи водень в групі ОН, в результаті відбувається розрив по ефірному зв'язку між фосфатом і декарбоксилазою - порушується цілісність молекули ДНК. Мутагенна дія деяких нітрозо сполук дуже значна, загальна частота викликаних ними мутацій може досягати 100%. З групи цих сполук найчастіше використовують N-метил-N'нітро-N-нітрозогуанідин, який індукує мутації в ділянках хромосоми E. сoli, які в момент обробки знаходяться в реплікативній вилці. В результаті мутагенної дії алкілюючих агентів є поява мутацій типу транзицій, трансверсій та зсуву рамки зчитування. Гідроксил амін має строго специфічну мутагенну дію він індукує транзиції ГЦ - АТ пар. Взаємодіє з цитозином, приєднуючи до нього аміногрупу. Такий модифікований цитозин помилково спарюється з аденіном, що призводить до утворення транзицій.

Отже, для отримання високоактивних штамів, які є продуцентами антибіотиків, необхідно вивчати, ефективно та вміло використовувати метод направленого індукованого мутагенезу, що призводить до зміни структури та експресії генів біосинтезу антибіотиків та первинних метаболітів [2].

1.1.4 Пошкодження ДНК, спричинені УФ-опроменями та N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином

Летальні та мутагенні ефекти УФ-опромінення та механізми репарації УФ-пошкоджень ДНК є добре вивченими. Найчастіше використовують УФ з довжиною хвилі 260 нм, адже саме за таких умов він поглинається азотистими основами ДНК. Основні пошкодження ? поява в ДНК ковалентних зв'язків між піримідиновими азотистими основами, що розташовуються поряд, в одному полінуклеотидному ланцюзі. Утворюються циклобутанові піримідинові димери (ЦПД) "Т - Т", "Ц - Т" і "Ц - Ц". Від нуклеотидного складу ДНК залежить співідношення між різними типами димерів. Димери "Т - Т" найчастіше утворюються в АТ-багатій ДНК за рахунок зв'язків між атомами С5 і С6 залишків тиміну. Рідше в такій ДНК утворюються "Ц - Т" і "Ц - Ц". В ГЦ-багатій ДНК, навпаки, утворюється більше димерів "Ц - Т" і "Ц - Ц", ніж "Т - Т".

Кількість утворених ЦПД є прямопропорційною дозі опромінення у діапазоні доз УФ від 100 до 500 дж/м2. Проте утворення ЦПД є зворотним процесом. Наприклад, якщо ДНК E. coli тривалий час опромінювати УФ з довжиною хвилі 254 нм, то тимін-вмісні димери становитимуть не більше 7 % від загального вмісту тимінів у ДНК. Це показує динамічну рівновагу між утворенням та розщепленням циклобутанових димерів.

Після УФ-опромінення в ДНК утворюються також піримідин - (6 - 4) ? піримідон-фотопродукти (скорочено (6 ? 4) ? фотопродукти) за рахунок утворення зв'язку між С6 одного піримідину і С4 іншого, розміщеного з 3'-боку відносно першого. Найчастіше зустрічаються (6 - 4) - фотопродукти 5'Т - Ц3' та 5'Ц - Ц3', тоді як димери 5'Т - Т3' виникають дуже рідко, а 5'Ц - Т3' не виявляють.

Циклобутанові димери, (6, 4) фотопродукти та спорові фотопродукти традиційно розглядають як пошкодження, які суттєво порушують структуру подвійної спіралі ДНК і зупиняють її реплікацію, що є основною причиною летальної дії УФ. Проте доведено, що у В-ДНК ЦПД знаходяться переважно в ізомерній формі cis-syn, що не приводить до значних порушень подвійної спіралі. До того ж, деякі димери можуть утворювати водневі зв'язки з аденіном. Димери в конформації trans-syn викликають більш значні порушення подвійної спіралі ДНК.

До інших фотохімічних реакцій, спричинених УФ-опроміненням, відносять:

· гідратація 5,6-подвійного зв'язку в молекулі цитозину з утворенням його 5,6-дигідро-6-гідрокси-похідного (цитозин-гідрату);

· поява 5,6-дигідроксидигідротиміну (тимінового гліколю);

· поява з низькою частотою ковалентних зв'язків між нитками ДНК та між білками та ДНК;

· розриви ланцюгів ДНК.

НГ належить до найсильніших з хімічних мутагенів, а саме до сполук, які алкілюють ДНК. Також до цієї групи належать диалкілсульфати (диметилсульфат, диетилсульфат), алкілалкансульфати (метилметансульфонат, етилметансульфонат), N-нітрозосполуки та діазоалкани (N-алкіл-N-нітрозосечовини, N-алкіл-N'-нітро-N- нітрозогуанідини, діазометан), епоксиди (етиленоксид, пропіленоксид), бетапропіолактон, етиленіміни, іприти (сірчистий іприт, азотистий іприт). Ці сполуки електрофіли, що є спорідненими до нуклеофільних центрів біологічних макромолекул. Реакція НГ з цистеїновим залишком глутатіону викликає утворення діазометану, що є високореактивною метилуючою сполукою, яка і викликає мутагенний ефект.

Сайтів, здатних реагувати з алкілуючими агентами, є багато в азотистих основах ДНК. У залишку аденіну це N1, N3, N6 та N7; гуаніну N1, N2, N3, N6, N7 та О6; цитозину N3, N4 та О2; тиміну N3, О2 та О4. Найбільш реактивними є сьмий атом азоту в гуаніні та третій атом азоту в аденіні. Алкілування підлягають також і залишки фосфорної кислоти, в результаті чого виникають фосфотриефіри. Близько 85 % пошкоджень ДНК, викликаних дією НГ, становлять метильовані азотисті основи та близько 14 % фосфотриефіри. 73 % від загальної кількості метильованих азотистих основ становить 7-метилгуанін. Також утворюються 3-метиладенін, О6-метилгуанін, 3-метилгуанін, 3-метилцитозин, 1-метиладенін та О4-метилтимін.

Алкілування пуринів викликає неферментативний гідроліз глікозидних зв'язків та появу в ДНК апуринових сайтів. Швидкість руйнування глікозидного зв'язку 3-метиладеніну приблизно у 5 разів вища, ніж 7-метилгуаніну, отже, кінцевий внесок цих метилувань пуринів у виникнення апуринових сайтів є майже однаковим [6].

1.2 Загальна характеристика актиноміцетів роду Actіnoplanes

Актиноміцети відіграють важливу екологічну роль, проте увагу привертають як найголовніші об'єкти біотехнології. Відомо, що більше 60 % біологічно активних сполук мікробного походження та дві третини антибіотиків є метаболітами актиноміцетів. Більше 50 років актиноміцети використовуються як промислові продуценти ферментів та антибіотиків.

Для ДНК актиноміцетів характерний високий Г+Ц-склад. Нуклеоїди містять одну лінійну хромосому розміром 8 - 9 млн. п. н., з довгими інвертованими повтореннями нуклеотидних послідовностей та білками, що ковалентно зв'язані до 5'-кінців хромосомної ДНК. Як за розмірами, так і за кількістю генів актиноміцети мають одні з найбільших геномів серед прокаріотичних організмів [6].

Родина Actinoplanaceae, до якої входить рід Actynoplanes, відноситься до другого порядку Actinomycetales класу Actinobacteria.

Систематичне положення:

· рід Actinoplanes;

· родина Actinoplanaceae;

· порядок Actinomycetales;

· клас Actinobacteria;

· відділ Actinobacteria;

· домен Bacteria.

Родина Actinoplanaceae включає в себе роди актиноміцетів, які утворюють свої спори всередині спорангіїв. Термін "спорангій" був вперше застосований до актиноміцетів в 1949 році Коучем і з того часу став широко застосовуватися. Родина поділяється на дві групи. Роди першої групи утворюють незначний повітряний міцелій і їхні клітинні стінки містять гліцин та 2,6-діазопімелінову кислоту. Ця група включає роди Actinoplanes, Ampullariella і Dactylosporangium. Роди другої групи формують значний повітряний міцелій і мають клітинні стінки з 2,6-діазопімеліновою кислотою, але без гліцину. Сюди відносять роди Planomonospora, Planobispora, Spirillospora та Streptosporangium [23]. Міцелій, зазвичай, забарвлений в коричнево-помаранчевий колір, у мутантних штамів він може бути білий [15, 25]. Дослідження, проведені за допомогою світлової мікроскопії, показали, що спрорангії можуть мати різні розміри, форму і число спор всередині. Спорангії мають оболонку та різняться за формою: грушеподібна у представників роду Ampullariella (Рис. 1,а), бочкоподібна у - Pilimelia (Рис. 1,б) [4]. Представники роду Actinoplanes мають спорангії від кулястої до неправильної форми з багатьма спорами. Спори та клітини мають джгутики, число яких у різних представників варіює.

Спорангії утворюються на гіфах повітряного міцелію, які на відміну від гіфів субстратного міцелію мають оболонку над клітинною стінкою. Закінчення повітряних гіфів потовщується і їх діаметр зростає від 0,2-0,5 мкм до 1,0 і 2,0 мкм. Від них відходять численні відгалуження діаметром 0,2 - 0,5 мкм, які стають оболонками для батьківських гіфів. Ця стадія - це початок росту клітинної стінки і формування молодих спорангіїв. Ріст гілок не припиняється і це викликає збільшення розмірів спорангіїв, які на цій стадії складаються із тісно спакованих скупчень гіфів, кожен з яких має діаметр близько 1,0 мкм. Наступне розбухання спорангіїв відбувається, напевне, як результат накопичення електроннощільного аморфного матеріалу між гілками гіф. В цей період часу стінка гіфів починає перетворюватися на ланцюжок спор. Коли спорангій дозріває, аморфний внутрішньо-споральний матеріал переходить в менш однорідний електроннощільний і спори розміром 10 - 15 нм викидаються [23].

Представники роду Actinoplanes, так як і представники роду Streptomyces, розвиваються виключно у формі мультинуклеотидного міцелію. Розмножуються і розповсюджуються за допомогою спор [6]. Міцеліальний ріст забезпечує пристосування цих сапрофітних організмів до основного середовища їх проживання ґрунту. У таких умовах живлення здійснюється шляхом розчеплення органічних решток за допомогою гідролітичних ферментів, які виділяє міцелій.

Рис. 1,а. Морфологічна різноманітність спорангіїв представників роду Ampullariella



Рис. 1,б. Морфологічна різноманітність спорангіїв представників роду Pilimelia

1.3 Actinoplanes teichomyceticus продуцент тейкопланіну

Тейкопланін - це ліпоглікопептидний антибіотик, що належить до ристоцетинового типу [18]. Також до родини глікопептидів належить ванкоміцин, що володіє подібними властивостями. До середини 80-х років ванкоміцин був єдиним глікопептидом, що застосовувався в клінічній практиці. Багаторазові дослідження показали його високу клінічну ефективність при важких лікарняних інфекціях, викликаних грам-позитивними мікроорганізмами, наприклад, метицилін-резистентних штамів Staphylococcus aureus та іншими видами роду Staphylococcus. Проте токсичність ванкоміцину лімітує і заважає його використанню для лікування хворих у тяжкому стані. В такому випадку застосовують відносно новий глікопептидний антибіотик тейкопланін, яких має деякі переваги перед ванкоміцином. Зокрема його можна застосовувати для лікування дітей, включаючи і новонароджених [7].

Тейкопланін використовується у медицині для боротьби з важкими інфекціями, викликаними грам-позитивними мікроорганізмами, наприклад, Staphylococcus spp., включаючи метицилін-стійкі штами, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Listeria monocytogenes, Peptostreptococcus spp., Corynebacterium jeikeium, Propionibacterium acnes, Clostridium spp., включаючи C. difficile [7]. До його складу входять п'ять основних компонентів позначених А, А, А, А і А, один гідролізований компонент позначений А, і чотири малих компоненти, позначених RS-1, RS-2, RS-3 і RS-4 [10, 22, 26]. Центральною частиною аглікону виступає лінійний семипептид з окисленими зв'язаними сімома ароматичними амінокислотами, п'ять з яких є спільними для усіх членів групи (Рис. 2.) . Ацильна частина представлена залишком жирної кислоти, що містить від дев'яти до дванадцяти атомів карбону. Вона несе на собі б-D-манозу, N-ацетил-в-D-глюкозамін, і один з дев'яти N-ацил-в-D-глюкозамінів, які є С жирними кислотами [8, 10, 11]. А - А компоненти складають від 89% до 95% комплексу тейкопланіну [8, 10]. Кожен з А компонентів мають подібну in vitro антибактеріальну активність. Проте А компонент, який володіє аналогічною активністю проти Staphylococcus sp, є менш активний проти Streptococcus sp і Entherococcus sp. Співвідношення кожного з компонентів тейкопланіну в комплексі може відрізнятися зі змінами в складі середовища для росту штаму-продуцента [16].

Тейкопланін впливає на кінцеву стадію біосинтезу пептидоглікану, яка включає полімеризацію глікану і поперечне зшивання по зв'язку кінцевого аміно ацил-D-аланіл-D-аланіну в ростучому пептидоглікані чи його попередниках. Біосинтез пептидоглікану відбувається в три стадії.



Рис. 2. Структурна формула тейкопланіну

Перша стадія включає перехід UDP-GlcNAc до UDP-MurNAc-п'ятипептиду в цитоплазмі. Друга стадія включає перенесення цих попередників на ліпідні переносники і уже перенесення утворених амфіфільних молекул на зовнішню поверхню мембрани. Третя стадія являє собою ретикуляцію (сітчасту побудову) між окремими попередниками завдяки транспептидації і трансглікозилюванню, що супроводжується вивільненням ліпідних переносників і їх перехід на внутрішню поверхню мембрани.

Введення попередників пептидоглікану блокується беспосередньо, що спричиняє нагромадження цитозольного попереднику UDP-MurNAc-п'ятипептиду в бактерії, обробленій тейкопланіном. В той час синтез інших макромолекул не знаходиться під впливом і тому вважають, що тейкопланін заважає утворенню пептидоглікану і, особливо, реакціям трансглікозилювання [21]. На молекулярному рівні тейкопланін здатен зв'язуватися з D-аланіл-D-аланіном, який виступає субстратом для реакцій трансглікозилювання і транспептидації [16].

Тейкопланін виявляє активність in vitro проти 190 грам-позитивних коків [9].

Тейкопланін і ванкоміцин розглядають як препарати першого ряду при лікуванні важких інфекцій, викликаних ентерококами. Стійкості ентерококів до ванкоміцину не було зареєстровано до 1987 року, проте в останні роки спостерігається тенденція до збільшення кількості виділених ванкоміцин-стійких штамів ентерококів. Наприклад, в лікарнях США в період з 1989 до 1993 років частота ванкоміцин-стійких ентерококів зросла від 0,3 до 7,9%, а в відділеннях інтенсивної терапії - до 13,6%.

Антибактерійний спектр антибіотика є подібним до ванкоміцину, проте є деякі відмінності в активності проти деяких мікроорганізмів (Табл. 1.) [7]. Тейкопланін є активніший, ніж ванкоміцин, проти метицілін-стійкого Staphylococcus aureus. Стрептококи є чутливіші до дії тейкопланіну, ніж S. aureus. Тейкопланін також діє проти Corynebacterium spp, включаючи C. jeikeium. Він є активніший проти Listeria monocytogenes і Bacillus cereus [14, 16, 17, 20, 25].

Варто заначити, що в клінічній практиці не спостерігається виникнення резистентних до дії ванкоміцину стафілококів; існують лише дані про штами S. аureus з пониженою чутливістю (8 мг/л). В той час розвиток стійких стафілококів до тейкопланіну є описано і літературі і зниження чутливості бактерій в процесі використання даного антибіотику проходить швидше. Основні риси подібності і відмінності ванкоміцину і тейкопланіну наведені в Табл. 2.

Таблиця 1.

Антимікробна активність in vitro (мг/л) тейкрпланіну та ванкоміцину по відношенню до грам-позитивних бактерій [7].

Мікроорганізми	Тейкопланін	Ванкоміцин
MSSA*	0,5	2
MRSA**	0,5	2
Staphylococcus spp. (SCN)***	0,25-4,0	1-4
Streptococcus viridans	0,25	1
Streptococcus pyogenes	0,12	1
Streptococcus pneumoniae	0,125	0,5
Streptococcus agalactiae	0,125	0,5
Enterococcus faecalis	0,5	4
Streptococcus faecium	1	4
Listeria monоcytogenes	0,25	0,5
Peptostreptococcus spp.	0,12-0,25	0,12-0,5
Corynebacterium jeikeium	0,5-1	0,5-2
Clostridium perfringens	0,03-0,12	0,12-0,5
Clostridium difficile	0,03-0,25	0,06-1

* MSSA - метицилін-чутливі штами Staphylococcus aureus;

** MRSA - метицилін-стійкі штами S. aureus;

*** SCN - коагулазо-негативні стафілококи (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus). Для S. haemolyticus характерні більш високі значення.

Таблиця 2.

Порівняльна характеристика тейкопланіну і ванкоміцину [7].

Показник	Тейкопланін	Ванкоміцин
Антимікробна активність in vitro	Більш висока по відношенню до S.aureus, Streptococcus spp., Enterococcus spp.	Більш висока по відношенню до коагулазонегативних стафілококів
Резистентність стафілококів	Можливий розвиток стійкості	Можливе зниження чутливості
Резистентність ентерококів	Деякі штами зберігають чутливість до тейкопланіну	Частота резистентних ентерококів збільшилась в декілька разів в останні роки

Actinoplanes teichomyceticus є на сьогоднішній день єдиним відомим продуцентом антибіотика тейкопланіну. Цей штам чутливий до власного антибіотика. При наявності в агаровому середовищі концентрації тейкопланіну 20 мг/л бактерії уже не ростуть. Джунг зі співавторами (Jung et al., 2008) відбирали тейкопланін-стійкі мутанти на середовищі з концентрацією 100 мг/л. Ці мутанти здатні продукувати близько 3 г/л антибіотика. Тобто рівень синтезу збільшився у 6 разів, порівняно із батьківським штамом [15]. Лі та співавтори (Lee et al., 2003), а також Джунг зі співавторами (Jung et al., 2008) для отримання штамів з підвищеним рівнем синтезу антибіотика використовували обробку різними мутагенами, зокрема здійснювали опромінення ультрафіолетовим світлом (УФ) та дію N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ). За одних обставин, дії УФ піддавали спорову суспензію протягом 60 с [15], а за інших - опромінювали чашки засіяні штамом протягом 60-120 с. Обробка НГ здійснювалась протягом 1 години за концентрації мутагену 0,5-2 мг/мл [17]. Отримані мутанти мали втричі більший рівень синтезу антибіотика, ніж батьківський штам. В літературі є дані про підбір оптимальних поживних середовищ для ефективної ферментації A. teichomyceticus.

Вчені довели, що найкращим джерелом вуглецю для ферментації є дектрин. Також до середовища додають глюкозу. Поряд з цим Ріва зі співробітниками (Riva et al., 1987) показали ефективність додавання манози до середовища [17]. Найкращими джерелами азоту визнані рапсова мука та дріжджовий екстракт.

Основними складниками ферментаційного середовища на сьогодні є глюкоза, декстрин, пептон, рапсова мука, MgSO4 Ч7H 2О, NaCl.

Для вирощування актиноміцета у ферментерах встановлено оптимум температури 34 С та pH - 7,0 [15].

Описано, що при додаванні до середовища певних амінокислот, а саме аргініну, проліну і лізину, підвищується синтез антибіотика. Як найкращу амінокислоту було вибрано пролін. Найоптимальніша концентрація - 0,05% [24].

Описані вище дані вказують на те, що тейкопланін є на сьогоднішній день одним із найпотужніших антибіотиків, які застосовуються у боротьбі з важкими інфекційними захворюванняи. У його використанні є деякі негативні аспекти, проте важко оцінити переваги, які він має у боротьбі проти мультирезистентних штамів S. aureus, Streptococcus spp., Enterococcus spp. Важливим є те, що тейкопланін можна застосовувати для лікування сепсисів, інфекцій нижніх дихальних шляхів, шкіри, м'яких тканин, кісток та суглобів у новонароджених дітей.

Висока вартість тейкопланіну імпортного виробництва, відсутність вітчизнаних промислових продуцентів цього антибіотика є передумовою для розробки власного біотехнологічного виробництва цього антибіотика. Першим кроком для досягнення цієї мети є розробка ефективної системи селекції штамів з високим рівнем синтезу тейкопланіну.

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

В роботі був використаний штам Actinoplanes teichomyceticus Lv95. Як тест-культуру для перевірки антибіотичної активності штаму використовували Bacillus cereus ATCC 14579.

Для вирощування A. teichomyceticus використовували середовище Беннета [12]:

· Глюкоза 10 г

· Пептон 1 г

· Дріжджовий екстракт 1 г

· Триптон 2 г

· Агар 18 г

· Вода дистильована 1000 мл

рН 7,5 - 8,0

Температура вирощування 28⁰С

Тест-культуру вирощували на L-агарі [12]:

· Триптон 5 г

· Дріжджовий екстракт 5 г

· NaCl 5 г

· Агар 18 г

· Вода дистильована 1000 мл.

Температура вирощування 32⁰С

2.1 Визначення оптимального агаризованого середовища для росту та синтезу антибіотика A. teichomyceticus Lv95

Для визначення оптимального середовища для росту штаму було використано такі середовища:

1. Середовище Чапека [5]:

· Крохмаль 30 г

· NaNO3 2 г

· K2HPO4 1 г

· MgSO4Ч7H2O 0,5 г

· KCl 0,5 г

· Агар 15 г

· Вода водопровідна 1000 мл

Після стилізації на 1000 мл 1 мл 1% розчину FeSO4

2. Гліцериново-пептонне середовище [5]:

· Гліцерин 20 г

· Пептон 2,5 г

· K2HPO4 1 г

· NaCl 3 г

· MgSO4 0,25 г

· FeSO4 0,01 г

· CaCO3 0,04 г

· Вода 1000 мл

3. середовище Беннета [17].

4. середовище АІ [24]:

· Глюкоза 10 г

· Malt extract 20 г

· Pharmamedia 10 г

· Дріжджовий екстракт 5 г

· Агар 17 г

· Вода дистильована 1000 мл

5. Середовище АІІ:

· Глюкоза 10 г

· Malt extract 20 г

· Pharmamedia 10 г

· Сухі дріжджі 5 г

· Агар 17 г

· Вода дистильована 1000 мл

6. Середовище АІІ+pro [24]:

· Глюкоза 10 г

· Malt extract 20 г

· Pharmamedia 10 г

· Сухі дріжджі 5 г

· Агар 17 г

· Вода дистильована 1000 мл

· Пролін 0,5 г

pH 7,5 - 8,0

2.2 Визначення резистентності штаму A. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків

Спектр стійкості до антибіотиків визначали методом дифузії в агар з використанням дисків з антибіотиками. Диски накладали на верхній шар середовища Беннета зі спорами та міцеліальними фрагментами культури. Виміри діаметрів зон пригнічення росту штаму антибіотиками, що дифундували з дисків, проводили на третю, п'яту та сьому доби інкубації.

2.3 Визначення антибіотичної активності штаму A. teichomyceticus Lv95

Експрес-аналіз антибіотичної активності штаму проводили шляхом визначення індексу продуктивності (ІП). З газону штаму, що ріс 5, 8, 10, 12 і 14 діб вирізали агарові блоки і клали на газон тест-культури. ІП визначали як відношення діаметра зони пригнічення росту тест-культури антибіотиком до діаметра блока.

2.4 Опромінення штаму A. teichomyceticus Lv95 ультрафіолетовими променями (УФ)

Спори досліджуваного штаму обробляли УФ-променями з довжиною хвилі 260 - 280 нм.; відстань від джерела променів до поверхні суспензії - 10 см; джерело Уф-променів - лампа Medicor BLM - 12. Час обробки становив 10-100 с. Після обробки мутагеном проводили послідовні десятикратні розведення суспензії, що містила спори і міцеліальні фрагменти культури, і висівали її на середовище Беннета. Порівнювали число утворених колоній, які вижили після опромінення, з числом колоній, що виникли із неопромінених спор, і визначали відсоток виживання.

2.5 Обробка штаму A. teichomyceticus Lv95 N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином (НГ)

Спори штаму Actinoplanes teichomyceticus NRRL-B16726 обробляли НГ в концентрації 3, 5 мг/мл протягом 10, 20 і 30 хв. Мутаген розчиняли в трис-малеїновому буфері (0,05 мМ триса; 0,05 мМ малеїнової кислоти). Щоб зупинити дію мутагену в потрібний час, ми кожну пробу, а також контроль двічі відмивали дистильованою водою. Для цього осаджували суспензію, що містилася в розчині НГ; зливали цей розчин; спори та міцеліальні фрагменти ресуспендували в 1 мл з дистильованою водою і знову осаджували. Після обробки НГ проводили послідовні десятикратні розведення суспензії, що містила спори і міцеліальні фрагменти культури, і висівали її на середовище Беннета. Порівнювали число колоній, утворених спорами, які вижили після опромінення, з числом колоній, що виникли із неопромінених спор, і визначали відсоток виживання.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

3.1 Підбір тест-культури та оптимального середовища для вирощування штаму Actinoplanes teichomyceticus Lv95

На першому етапі роботи ми дослідили антибіотичну активність штаму Actinoplanes teichomyceticus Lv95 на різних поживних середовищах з метою відбору оптимального для росту досліджуваної культури і синтезу тейкопланіну. Для цього ми використали середовища АІ і АІ з проліном, запропоновані Song [24], Чапека, Беннета, гліцериново-пептонне, а також модифіковане нами АІ, у якому дріжджовий екстракт замінили на пекарські дріжджі. Також у цьому експерименті ми підбирали оптимальну тест-культуру для застосування її в експрес-методі з вивчення антибіотичної активності окремих клонів A. teichomyceticus Lv95та його мутантів. Антибіотичну активність досліджуваного штаму визначали починаючи з 5 доби росту шляхом вирізання з газону блоків діаметром 10 мм та викладання їх на середовище з попередньо засіяними тест-культурами (Табл. 3,а, 3,б).

На п'яту добу штам A. teichomyceticus Lv95 виявляв антибіотичну активність лише проти Sarcina lutea ATCC 4698 на середовищі Беннета, АІІ та АІІ+pro. Уже на восьму добу на середовищах АІ, АІІ, АІІ+pro та Беннета ми спостерігали зони пригнічення росту усіх тест-культур. На середовищі Чапека штам виявляв активність лише проти Sarcina lutea ATCC 4698, а на гліцериново-пептонному проти Sarcina lutea ATCC 4698 та Bacillus cereus ATCC 1457. На дванадцяту добу на усіх середовищах ми спостерігали активність проти усіх тест-культур, причому на середовищах Чапека, гліцериново-пептонному, Беннета спостерігали досягнення максимуму синтезу антибіотика проти Bacillus subtilis ATCC 31324 та Sarcina lutea ATCC 4698. Штам, вирощений на АІ, АІІ, АІІ+pro середовищах, утворював більші зони пригнічення росту тест-культур, ніж на Чапека чи гліцериново-пептонному середовищі. Також на цих середовища штам продовжував нагромаджувати антибіотик до чотирнадцятої доби. Антибіотична активність досліджуваного штаму на середовищі Беннета мало відрізнялася від тієї, яку ми спостерігали на середовищах АІ, АІІ та АІІ+pro. Однак ці середовища значно дорожчі у виготовленні, ніж середовище Беннета. Тому в наступних експериментах для вирощування A. teichomyceticus Lv95 ми використовували середовище Беннета. На цьому середовищі досліджуваний штам приблизно однаково пригнічував усі використані тест-культури. Для подальшим експериментів з вивчення антибіотичної активності ми використали Bacillus cereus ATCC 1457.

Таблиця 3,а

Антибіотична активність A. teichomyceticus Lv95 на поживних середовищах АІ, АІІ, АІІ+pro

Середовище	АІ	АІІ	АІІ+pro
Доба	5	8	10	12	14	5	8	10	12	14	5	8	10	12	14
Bacillus subtilis ATCC 31324	0	14*	19	19	20	0	13	18	19	21	0	14	18	20	21
Bacillus cereus ATCC 14579	0	18	20	23	23	0	15	19	21	23	0	15	19	21	23
Sarcina lutea ATCC 4698	0	18	22	25	25	19	19	22	24	24	15	18	21	24	25
Staphylococcus albus ATCC 25923	0	16	19	23	26	0	16	19	22	26	0	16	19	25	27

Таблиця 3,б

Антибіотична активність A. teichomyceticus Lv95 на поживних середовищах Чапека, гліцериново-пептонне, Беннета

Середовище	Чапека	гліцериново-пептонне	Беннета
Доба	5	8	10	12	14	5	8	10	12	14	5	8	10	12	14
Bacillus subtilis ATCC 31324	0	0	0	13*	15	0	0	0	13	15	0	15	16	16	16
Bacillus cereus ATCC 14579	0	0	13	15	16	0	13	13	14	17	0	18	18	19	20
Sarcina lutea ATCC 4698	0	15	18	18	18	0	15	15	16	17	13	18	18	18	20
Staphylococcus albus ATCC 25923	0	0	0	13	17	0	0	0	15	17	0	15	16	16	20

* - діаметри зон пригнічення росту тест-культури, мм.

3.2 Визначення резистентності штаму A. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків різної дії.

Штам A. teichomyceticus Lv95, як і більшість актиноміцетів, виявився стійким до дії в-лактамних антибіотиків та чутливим до дії аміноглікозидних - канаміцину, мономіцину, стрептоміцину та гентаміцину (Табл. 4.). Серед аміноглікозидних антибіотиків штам виявився найбільш чутливим до дії канаміцину та стрептоміцину. Цікавим виявився той факт, що A. teichomyceticus Lv 95 є чутливим до тетрацикліну, олеандоміцину, хлорамфеніколу та еритроміцину, що відрізняє його від інших актиноміцетів.

Таблиця 4.

Визначення спектру стійкості А. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків

Антибіотик	Діаметр зони пригнічення росту, мм
	3 доба росту	5 доба росту	7 доба росту
Олеандоміцин	40±1,1	40±0,9	38±0,9
Лінкоміцин	16±0,9	12±0,3	11±0,7
Еритроміцин	41±1,0	46±1,6	44±1,6
Пеніцилін	0	0	0
Оксацилін	0	0	0
Карбеніцилін	0	0	0
Ампіцилін	0	0	0
Цефалексин	0	0	0
Канаміцин	33±2,0	35±1,2	35±2,1
Мономіцин	25±1,2	25±0,9	26±1,1
Стрептоміцин	33±1,0	35±1,8	36±0,9
Гентаміцин	20±1,2	20±1,0	20±0,6
Неоміцин	19±0,6	18±0,2	18±0,3
Хлорамфенікол	35±2,0

Подобные документы

• Радіоактивні мікроорганізми

  Дія радіації на живі організми. Радіочутливість живих систем. Дози радіації. Вплив умов довкілля та аварії на ЧАЕС на навколишнє середовище. Модифікація ультрафіолетового опромінення властивостей фітопатогенних бактерій Pectobacterium carotovorum.
  
  курсовая работа [164,6 K], добавлен 11.02.2015
  

• Репродукція вакцинного штаму 1062 метапневмовірусу птиці в ембріонах перепелів

  Лабораторні дослідження виділення вірусу на курячих ембріонах (КЕ). Можливость використання перепелиних ембріонів (ПЕ) для культивування МПВ на моделі вакцинного штаму 1062. В трахеї інфікованих ПЕ запальні та деструктивні процеси, слизової оболонки.
  
  статья [11,3 M], добавлен 26.09.2010
  

• Біосинтез антибіотика доксорубіцину

  Обґрунтування вибору біологічного агента та поживного середовища для його культивування. Розрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу, об’єму ферментера та кількості виробничих циклів. Біотрансформація ростового субстрату у цільовий продукт.
  
  дипломная работа [274,0 K], добавлен 09.02.2017
  

• Технологія біосинтезу амінокислот

  Дослідження штамів мікроорганізмів. Використання мутантів мікроорганізмів. Промисловий синтез амінокислот. Мікробіологічний синтез глутамінової кислоти, лізину, метіоніну, треонина, ізолейцину та триптофану. Ход реакцій і блокуванням етапів синтезу.
  
  реферат [34,9 K], добавлен 25.08.2010
  

• Біологічна дія іонізуючих випромінювань

  Процеси утворення іонів з нейтральних атомів або молекул. Альфа-випромінювання, бета-випромінювання, гамма-випромінювання. Джерела зовнішнього опромінення. Внутрішнє опромінення людини. Ступінь впливу іонізуючих випромінювань на живий організм.
  
  презентация [228,4 K], добавлен 28.10.2013
  

• Вплив факторів навколишнього середовища на популяції гідробіонтів

  Гідробіонти як переважно первинноводні тварини, які все життя проводять у воді. Вплив середовища існування на гідробіонтів: температури, прозорості води, газового режиму водоймища, вуглекислого газу, водневого показника (рН), різних речовин, організмів.
  
  курсовая работа [27,0 K], добавлен 28.10.2010
  

• Характеристика біосинтетичної активності мікробних продуцентів органічних кислот та вплив на неї основних факторів (на прикладі обраної культури)

  Ідентифікація лимонної кислоти в якості продукту метаболізму цвільових грибів. Реалізація синтезу лимонної кислоти у мікроорганізмів. Варіанти синтезу в виробництві кислоти (незмінний, незмінний із доливами, метод плівок). Характеристика умов ферментації.
  
  контрольная работа [23,3 K], добавлен 12.03.2016
  

• Стимулятори клітинного поділу в рослинництві

  Механізми дії регуляторів росту рослин, їх роль в підвищенні продуктивності сільськогосподарських культур. Вплив біологічно-активних речовин на площу фотосинтетичної поверхні гречки, синтез хлорофілів в її листках, формування його чистої продуктивності.
  
  реферат [19,0 K], добавлен 10.04.2011
  

• Зміна активності ферментів системи антиоксидантного захисту у нирках щура за дії гістаміну

  Антиоксидантна система як захист проти вільних радикалів. Гістамін:історія вивчення, структура, шляхи синтезу і вивільнення. Визначення активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, вплив на неї наявності гістаміну в нирці щура.
  
  курсовая работа [1,7 M], добавлен 22.06.2014
  

• Система виділення, функції нирок

  Біологічне значення процесів виділення. Анатомічна будова, структурна і функціональна одиниця нирки. Фільтраційно-реабсорбційна теорія утворення сечі нирками, механізм канальцевої реабсорбції та виведення сечі. Гормональна регуляція діяльності нирок.
  
  реферат [14,5 K], добавлен 29.11.2009
  

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам