Вплив мутагенів на виживання та антибіотичну активність продуцента тейкопланіну Actinoplanes teichomyceticus Lv95

32±1,4

22±1,0

Рифампіцин

33±1,8

26±0,9

19±1,2

Тетрациклін

40±2,1

42±1,8

39±2,0

Поліміксин

0

0

0

3.3 Визначення антибіотичної активності штаму A. teichomyceticus Lv95

Для визначення антибіотичної активності штаму ми проаналізували 167 клонів A. teichomyceticus Lv95. Індекс продуктивності (ІП) проаналізованих клонів знаходився в межах від 3 до 7, причому майже 70% з них мали ІП в межах 5,1 - 6,0. Значення коефіцієнту CV (коефіцієнт варіації ознаки антибіотикоутворення) дорівнювало 15,7%. Частка “плюс”-варіантів, ІП яких перевищував значення М+2д, та “мінус”-варіантів, ІП яких був меншим за М-2д, становила по 2,8% (Рис.3.). Це свідчить, що штам володіє низькою варіабельністю за ознакою антибіотикоутворення.

Размещено на http://www.allbest.ru/

5

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. Розподіл клонів Аctinoplanes teichomyceticus Lv95 за антибіотичною активністю (12 доба росту). Частка “плюс”-варіантів - 2,8%, “мінус”-варіантів - 2,8%, CV = 15,7%

3.4 Вплив УФ на виживання штаму A. teichomyceticus Lv95.\

Опромінення ми здійснювали протягом 10-100с (Рис. 5.). Після 10 с опромінення ми отримували рівень виживання спор, що дорівнював 60%. При 20 с опромінення ми спостерігали різке зменшення виживання, яке становило уже 16%. Опромінення протягом 40-80 с спричинювало поступове зниження виживання культури від 5,0 до 1,2%. Після 100 с опромінення ріст штаму A. teichomyceticus Lv95 ми не спостерігали.

За літературними даними оптимальними дозами УФ для отримання мутантів з підвищеним рівнем синтезу антибіотика є такі дози, при яких виживання культури становить 0,1-1%. На 60 і 80 с опромінення нами були досягнуті потрібні відсотки виживання клонів A. teichomyceticus Lv95.

Рис 5. Вплив опромінення УФ на виживання спор штаму A. teichomyceticus Lv95. За віссю абсцис - час (с), завіссю ординат - log% виживання

3.5 Вплив N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідину (НГ) на виживання A. teichomyceticus Lv95.\

Суспензію, що містила спори та міцеліальні фрагменти штаму A. teichomyceticus Lv95, ми обробляли розчином НГ, що мав концентрацію 3 мг/мл та 5 мг/мл, протягом 5, 10 та 20 хв (Рис. 6.). Під час обробки мутагеном протягом 5 хвилин за концентрації 3 мг/мл виживання становило 13,75%, тоді як за концентрації 5 мг/мл - 1,9%. За концентрації мутагену 3 мг/мл, обробляючи суспензію протягом 10 хвилин, ми отримали виживання, що дорівнювало 10%, а після обробки протягом 20 хвилин - 2%. За концентрації мутагену 5 мг/мл, протягом 10 і 20 хвилин обробки, ми отримали відповідно 0,02% та 0,01% виживання клітин A. teichomyceticus Lv95.

Рис. 6. Вплив обробки НГ на виживання спор штаму A. teichomyceticus Lv95 в концентраціях 3 (1), 5 (2) мг/мл. За віссю абсцис - час експозиції, хв; за віссю ординат - lg % виживання

За літературними даними оптимальними дозами НГ для отримання мутантів з підвищеним рівнем синтезу антибіотика є такі концентрації мутагену, при яких виживання культури становить менше 50%. За концентрації НГ 3 мг/мл потрібний рівень виживання ми отримали при обробці мутагеном протягом 10 і 20 хвилин.

ВИСНОВКИ

1. Найкращою тест-культурою обрано Bacillus cereus ATCC 1457, а найоптимальнішим агаризованим середовищем для росту штаму A. teichomyceticus Lv95 та синтезу тейкопланіну середовище Беннета.

2. Визначено спектр стійкості штаму A. teichomyceticus Lv95 до антибіотиків різної дії. Зокрема штам виявився чутливим до дії тетрацикліну, олеандоміцину, хлорамфеніколу та еритроміцину, що відрізняє його від інших актиноміцетів роду Streptomyces.

3. Варіабельність окремих клонів A. teichomyceticus Lv95 за ознакою антибіотикоутворення є низькою, що характеризує досліджуваний штам як стабільну культуру по цій ознаці.

4. Під час обробки ультрафіолетовим опроміненням та N-метил-N'-нітро-N-нітрозогуанідином було підібрано оптимальні дози для виділення мутантів A. teichomyceticus Lv95. Для УФ це час опромінення протягом 60 - 80 с, а для НГ час обробки 10 - 20 хвилин.

ЛІТЕРАТУРА

1. Браун В. Генетика бактерій / В. Браун // М.: Мир. - 1968. ? 536 с.

2. Девис Р. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий / Р. Девис, Д. Ботстайн, Дж. Рот // М.: Мир. - 1984. ? 174 с.

3. Жукова Р.А. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов / Р.А. Жукова, А.Д. Коммунарская, М.И. Пронина, И.М. Терешин, Н.П. Журавлева, М.Н. Шабас // Л.: Медицина. - 1978. - 160 с .

4. Калакуцкий Л.В. Развитие актиномицетов / Л.В. Калакуцкий, Н.С. Агре // М.: Наука. - 1977. ? 285 с.

5. Семенов С.М. Лабораторние среды для актиномицетов и грибов. Справочник / С.М. Семенов // М.: Агропромиздат. - 1990. - 240 с.

6. Федоренко В.А. Генетические механизми устойчивости актиномицетов к аминогликозидним антибиотикам / В.А. Федоренко // Антибиот. химиотер. - 1999. - Т.44, №9. - С.29-35.

7. Яковлев С.В. Тейкопланин. Новые возможности лечения грамположительных инфекций в стационаре / С.В. Яковлев //Антибиот. и химиотер. - 1992. - № 2. - С. 3-8.

8. Barna J.C.J. Structure and conformation of epimers derived from the antibiotic teicoplanin / J.C.J. Barna, D. H. Williams, P. trazzolini, A. Malabarba, T.-W. C. Leung // J. of Antib. - 1984. - Р. 1204.

9. Bauernfeind A. In Vitro Activity of Teichomycin A2 in Comparison with Penicillin and Vancomycin against Gram-Positive Cocci / A. Bauernfeind, C. Petermьller // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1982. - Vol. 82, № 5. - P. 278-281.

10. Borghi A. Teichomycins, new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. IV. Separation and characterization of the components of teichomycin (teicoplanin) / A. Borghi, C.Coronelli, L. Faniuolo, A. Giancarlo, R. Pallavanza, G. G. Gallo. // J. of Antibiot. Via Durando 38, 20158 Milano, Italy, 1984.

11. Coronelli C. Teicoplanin, antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. V. Aromatic constituents / C. Coronelli, M. R. Bardone, A. DePaoli, P. Ferrari, G. Tuan, G. G. Gallo // J. of Antib. - 1984. - Vol. 37, № 6. P.

12. Hopwood D.A. Genetic contributions to understanding polyketide synthase / D.A. Hopwood // Chem.Rev. - 1997. - Vol .97. - P.2465-2497.

13. Hu H. Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutation / H. Hu, K. Ochi // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol.67. - P.1885-1892.

14. Jin Z. H. Production of teicoplanin by valine analogue-resistant mutant strain of Actinoplanes teichomyceticus. / Z. H. Jin, M. R. Wang, P. L. Cen // Appl. Microbiol Biotechnol. - 2002. - DOI 10.1007/s00253-001-0872-9. - P. 63-66.

15. Jung H.-M. Optimisation of culture conditions and scale-up to plant scales for teicoplanin production by Actinoplanes teichomyceticus / H.-M. Jung, S.-J. Kim, P. Prabhu, H.-J. Moon, I.-W. Kin, J.-K. Lee // Appl Microbiol Biotechnol. - 2008. - 80:21-27. DOI 10.1007/s00253-008-1530-2.

16. Jung H.-M. Biosynthesis, biotechnological production, and application of teicoplanin: current state and perspectives / H.-M. Jung, M. Jeya, S.-J. Kim, H.-J. Moon, R. K. Singh, Y.-W. Zhang, J.-K. Lee // Appl Microbiol Biotechnol. - 2009. - DOI 10.1007/s00253-009-2107-4.

17. Lee J.-C. Production of teicoplanin by a mutant of Actinoplanes teichomyceticus / J.-C. Lee, H.-R. Park, D.-J. Park, K. H. Son, K.-H. Yoon, Y.-B. Kim, C.-J. Kim // Biotechnology Letters. - 2003. - Vol. 25. - P. 537-540.

18. Parenti F. Teichomycins, new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. I. Description of the produser strain, fermentation studies and biological properties / F. Parenti, G. Beretta, M. Berti, V.Arioli // The Journal of Antibiotics. Via Durando 38, 20158 Milano, Italy. Apr. 1978.

19. Park H.-R. Glycerol affects the acyl moieties of teicoplanin components prodused by Actinoplanes teichomyceticus MS12210 / H.-R. Park, J.-C. Lee, J.-H. Hwang, D.-J. Park, C.-J. Kim Microbiological Research. - 2007.

20. Peter A. Clinical Pharmacokinetics of Teicoplanin / A. Peter, R. Wilson // Clin Pharmacokinet. - 2000. - Sep: 39 (3): 167-183. 0312-5963/00/0009-0167/s20.00/0.

21. Piyasena M.E. Magnetic microsphere-based methods to study the interaction of teicoplanin with peptides and bacteria / M.E. Piyasena, L.J. Real, R.A. Diamond, H.H. Xu, F.A. Gomez // Anal. Bioanal. Chem. - 2008. - 392:877-886. DOI 10.1007/s00216-008-2327-y.

22. Riva E. Column Purification and HPLC Determination of Teicoplanin and A40926 / E. Riva, M. Zanol, E. Selva, A. // Borghi Chromatographia. - 1987. - Vol. 24,. 0009-589/87 0295-07 03.00/0.

23. Sharples G.P. Spore Formation in the Actinoplanaceae (Actinomycetales) / G.P. Sharples, S.T. Williams, R.M. Bradshaw // Arch. Microbiol. - 1974. - Vol. 101. - P. 9-20.

24. Song J.-M. Production of Teicoplanin from Actinoplanes teichomyceticus ID9303 by Adding Proline / J.-M. Song, J.-T. Park, H.-S. Lee, J.-H. Kang, D.-J. Kang // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2008. - Vol. 72 ,№ 6. - P. 1635-1637.

25. Wink J.M. Actinoplanes liquriensis sp. nov. and Actinoplanes teichomyceticus sp. nov / J.M. Wink, R.M. Kroppenstedt, P. Schumann, G. Seibert, E. Stackebrandt // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2006. - Vol. 56. - P. 2125- 2130. DOI 10.1099/ijs.0.84240-0.

26. Zanol M. Isolation and Structure Determination of Minor Components of Teicoplanin / M. Zanol, A. Cometti, A. Borghi, G.C. Lancini. Chromatographia // Vol. 26 (1988). 0009-5893/88 0234-03 03.00/0.

Размещено на Allbest.ru