Биологические мембраны

Размещено на http://www.allbest.ru/

Глава 1. ФУНКЦИИ МЕМБРАН

Все живые клетки отделены от окружающей среды поверхностью называемой клеточной мембраной. Кроме того, для эукариотов характерно образование внутри клеток нескольких компартментов. Они представлены рядом субклеточных органелл, ограниченных мембранами, например, ядро и митохондрии. Мембраны представляют собой не только статически организованные поверхности раздела, но и включают активные биохимические системы, отвечающие за такие процессы, как избирательный транспорт веществ внутрь и наружу клетки, связывание гормонов и других регуляторных молекул, протекание ферментативных реакций, передача импульсов нервной системы и т. д. Существуют различные типы мембран, отличающиеся по выполняемым функциям. Функции мембран обусловлены их строением.

Химический состав

Мембраны состоят из липидных и белковых молекул, относительное количество которых варьирует (от 1/5 - белок + 4/5 - липиды до 3/4 - белок + 1/4 - липиды) у разных мембран. Углеводы содержатся в форме гликопротеинов, гликолипидов и составляют 0,5-10 % вещества мембраны.

Липиды мембран

Основная часть липидов в мембранах представлена фосфолипидами, гликолипидами и холестерином.

Липиды мембран имеют в структуре две различные части: неполярный гидрофобный "хвост" и полярную гидрофильную "голову". Такую двойственную природу соединений называют амфифильной. Липиды мембран образуют двухслойную структуру. Каждый слой состоит из сложных липидов, расположенных таким образом, что неполярные гидрофобные "хвосты" молекул находятся в тесном контакте друг с другом. Так же контактируют гидрофильные части молекул. Все взаимодействия имеют нековалентный характер. Два монослоя ориентируются "хвост к хвосту" так, что образующаяся структура двойного слоя имеет внутреннюю неполярную часть и две полярные поверхности.

Белки мембран включены в липидный двойной слой двумя способами:

1. связаны с гидрофильной поверхностью липидного бислоя - поверхностные мембранные белки погружены в гидрофобную область бислоя - интегральные мембранные белки;

2. поверхностные белки своими гидрофильными радикалами аминокислот связаны нековалентными связями с гидрофильными группами липидного бислоя. Интегральные белки различаются по степени погруженности в гидрофобную часть бислоя. Они могут располагаться по обеим сторонам мембраны и либо частично погружаются в мембрану, либо прошивают мембрану насквозь. Погруженная часть интегральных белков содержит большое количество аминокислот с гидрофобными радикалами, которые обеспечивают гидрофобное взаимодействие с липидами мембран. Гидрофобные взаимодействия поддерживают определенную ориентацию белков в мембране. Гидрофильная выступающая часть белка не может переместиться в гидрофобный слой. Часть мембранных белков ковалентно связаны с моносахаридными остатками или олигосахаридными цепями и представляют собой гликопротеины.

Асимметрия мембран

Хотя каждый монослой образован из липидов, ориентированных одинаковым образом, тем не менее, липидный состав монослоев различен. Например, в плазматической мембране эритроцитов фосфатидилхолины преобладают в наружном слое, а фосфатидилсерины во внутреннем слое мембраны. Углеводные части белков и липидов располагаются на наружной части мембраны. Кроме того, поверхности мембраны отличаются по составу белков. Степень такой асимметрии мембран различна у разных типов мембран и может меняться в процессе жизнедеятельности клетки и ее старения. Подвижность (жесткость) и текучесть мембран также зависят от ее состава. Повышенная жесткость обуславливается увеличением соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, а также холестерина. Физические свойства мембран зависят от расположения белков в липидном слое. Липиды мембран способны к диффузии в пределах слоя параллельно поверхности мембраны (латеральная диффузия). Белки тоже способны к латеральной диффузии. Поперечная диффузия в мембранах сильно ограничена.

Транспорт веществ внутрь и наружу клетки, а также между цитоплазмой и различными субклеточными органеллами (митохондриями, ядром и т. д.) обеспечивается мембранами. Если бы мембраны были глухим барьером, то внутриклеточное пространство оказалось бы недоступным для питательных веществ, а продукты жизнедеятельности не могли бы быть удалены из клетки. В то же время при полной проницаемости было бы невозможно накопление определенных веществ в клетке. Транспортные свойства мембраны характеризуются полупроницаемостью: некоторые соединения могут проникать через нее, а другие - нет.

Одна из главных функций мембран - регуляция переноса веществ. Существуют два способа переноса веществ через мембрану: пассивный и активный транспорт.

Если вещество движется через мембрану из области с высокой концентрацией в сторону низкой концентрации (т. е. по градиенту концентрации этого вещества) без затраты клеткой энергии, то такой транспорт называется пассивным, или диффузией. Различают два типа диффузии: простую и облегченную.

Характерна для небольших нейтральных молекул (H₂O, CO₂, O₂), а также гидрофобных низкомолекулярных органических веществ. Эти молекулы могут проходить без какого-либо взаимодействия с мембранными белками через поры или каналы мембраны до тех пор, пока будет сохраняться градиент концентрации.

Характерна для гидрофильных молекул, которые переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных мембранных белков - переносчиков. Для облегченной диффузии, в отличие от простой, характерна высокая избирательность, так как белок переносчик имеет центр связывания комплементарный транспортируемому веществу, и перенос сопровождается конформационными изменениями белка. Один из возможных механизмов облегченной диффузии может быть следующим: транспортный белок (транслоказа) связывает вещество, затем сближается с противоположной стороной мембраны, освобождает это вещество, принимает исходную конформацию и вновь готов выполнять транспортную функцию. Мало известно о том, как осуществляется передвижение самого белка. Другой возможный механизм переноса предполагает участие нескольких белков-переносчиков. В этом случае первоначально связанное соединение само переходит от одного белка к другому, последовательно связываясь то с одним, то с другим белком, пока не окажется на противоположной стороне мембраны.

Имеет место в том случае, когда перенос осуществляется против градиента концентрации. Такой перенос требует затраты энергии клеткой. Активный транспорт служит для накопления веществ внутри клетки. Источником энергии часто является АТФ. Для активного транспорта кроме источника энергии необходимо участие мембранных белков. Одна из активных транспортных систем в клетке животных отвечает за перенос ионов Na+ и K+ через клеточную мембрану.

ГЛАВА 2. ВОСПРИЯТИЕ СИГНАЛОВ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕМБРАНАМИ: СЕНСОРНЫЕ БЕЛКИ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ

Самые разные изменения в окружающей среде, в режиме питания, возрастные изменения метаболизма, опухолевые заболевания, инфекции приводят к изменениям в структуре мембран, которые, в свою очередь, вызывают нарушения нормального функционирования клеток. Поэтому изучение структуры мембран привлекает к себе внимание исследователей.

Мембраны обладают свойством текучести, которая, изменяясь под действием различных физических и химических воздействий, обеспечивает адаптивные перестройки в мембране и изменение активности мембраносвязанных белков, воспринимающих и передающих внешние сигналы. К числу таких молекул относятся рецепторные протеинкиназы и другие сенсоры, ионные каналы, белки -- переносчики различных молекул. Изменение функционального состояния сенсорных белков влияет на экспрессию генов, отвечающих за адаптацию клеток к стрессовым условиям.

Молекулы липидов в мембране образуют двойной слой, в котором гидрофобные концы жирных кислот (ЖК) обращены друг к другу, а гидрофильные головки образуют заряженный слой на поверхности мембран (рис. 1). При нормальной температуре и оптимальной концентрации веществ в окружающей среде (осмотическом давлении) мембрана представляет собой жидко кристаллическую структуру [1, 2], обладающую определенной степенью текучести. Термин "текучесть" (противоположный "вязкости") используется для описания степени неупорядоченности и физической подвижности внутри липидного бислоя мембран. Однако ни один из терминов не может охватить все различные динамические ЖК с различной степенью не насыщенности [3]. Тем не менее текучесть мембран может быть оценена некоторыми физическими методами, основанными главным образом на измерении флуоресценции маркерных молекул.

Рис. 1. а - изменение структуры и свойств мембран при изменении температуры окружающей среды и осмотического давления. А, - в норме мембрана находится в жидкокристаллической фазе.

При снижении температуры в мембране могут возникать зоны разделения фаз и в конечном счете мембрана может перейти в фазу геля; А₂, А₃ - сближение полярных головок липидов также наблюдается при гиперосмотическом стрессе, когда происходят уменьшение объема клеток и сжатие мембран; А₄ - при повышении температуры может произойти полная или частичная дезинтеграция мембран с их хаотичным слиянием и образованием инвертированных фаз внутри; б - схематическое изображение молекулярной геометрии липидов мембран при изменении температуры; Б₂ - при снижении температуры молекулы жирных кислот сближаются и их подвижность и радиус свободного вращения уменьшаются; Б₃ - при повышении температуры происходит обратный процесс - подвижность и радиус вращения молекул жирных кислот возрастают разом, характеризующих состояние мембраны на разных уровнях заглубления.

Текучесть биологических мембран играет важную роль в восприятии сигналов об изменении температуры окружающей среды или ее осмотических свойств. Если температура снижается либо клетки попадают в среду с повышенной концентрацией осмотически активных веществ (гиперосмотический шок), молекулы ЖК приближаются друг к другу (см. рис. 1). По сути это означает сжатие мембраны, то есть уменьшение ее текучести или увеличение вязкости. При определенных условиях может наступить критический момент, когда большая часть липидов потеряет свою подвижность настолько, что произойдет так называемый фазовый переход из жидкокристаллического состояния в состояние геля (см. рис. 1). Если клетка не способна адаптировать свои мембраны и поддерживать их на определенном уровне текучести, то фазовый переход означает смерть клетки. Главными причинами смертельного исхода являются уменьшение подвижности белков в липидном бислое, их неспособность к изменению конформации и как следствие -- полная потеря своих функций (перенос электронов и веществ, синтез АТФ, транспорт ионов).

При отклонении температуры от нормальной в сторону ее повышения либо при гипоосмотическом шоке, возникающем при сильном разбавлении внешнего раствора, мембраны растягиваются, то есть возрастает подвижность липидных молекул в бислое и текучесть мембран увеличивается (см. рис. 1). Этот процесс может привести к разделению липидной фазы и полному разрушению мембранных структур.

Обычно клетки обладают защитными системами для контроля над состоянием своих мембран и в момент изменения условий среды активируют эти системы, чтобы сохранить состояние мембран на уровне, обеспечивающем физиологическую активность клеток. Так, при снижении температуры активируется синтез десатураз жирных кислот, которые отвечают за образование двойных связей (десатурацию). Десатурация вызывает увеличение подвижности жирнокислотных хвостов в липидах и вследствие этого повышение текучести мембран [3]. При повышении температуры, что ведет к увеличению подвижности липидов в мембране и может привести к разрушению липидного бислоя, степень десатурации липидов в клетке снижается, клетки стремятся уплотнить свои мембраны, растекающиеся под действием высоких температур. Кроме того, при повышении температуры активируется синтез так называемых белков теплового шока, часть из которых связывается с липидами и также предотвращает их растекание. При осмотических стрессах клетки пытаются либо избавиться от избыточного количества воды в цитоплазме, либо синтезировать вещества-протекторы (глицерин, пролин, глицин-бетаин), которые позволяют им регулировать свой объем.

Так или иначе, запуск адаптивных систем, защищающих клетки от стрессовых воздействий, связан с восприятием сигналов о том, что снаружи что-то произошло. Одними из наиболее интересных вопросов современной биологии являются поиск и определение механизмов восприятия сигналов клетками. Очевидно, что сенсорные системы в описанных выше случаях так или иначе связаны с мембранами, поскольку именно физическое воздействие на мембраны приводит к запуску стрессовых ответов.

Осмотическим стрессом можно назвать те неприятности, которые испытывают клетки из-за резкого изменения концентраций растворенных веществ в окружающей среде и цитоплазме. При повышении осмотического давления внешнего раствора клетки теряют воду и уменьшаются в объеме. При снижении накачивают воду внутрь и увеличиваются в объеме. В том и другом случае клетки активируют мембранные белки-переносчики, а также генные блоки, отвечающие за адаптацию и в норме, как правило, молчащие.

Наиболее интересными вопросами в изучении восприятия клетками осмотического стресса являются обнаружение сенсорных белков в цитоплазматической мембране, которые чувствуют изменения свойств мембраны во время гипо- или гиперосмотического стресса, а также выяснение механизмов последующей передачи сигналов, приводящих к активации адаптационных систем. В этих процессах значительную роль играют регуляторные белки -- киназы, свойством которых является присоединение фосфатной группы к другим белкамрегуляторам (фосфорилирование) либо к определенным аминокислотам в составе собственной молекулы (автофосфорилирование). Добавление фосфатной группы обычно кардинальным образом меняет свойства белков, превращая их из неактивной в активную форму. Особую роль в восприятии сигналов играют киназы, относящиеся к семейству гистидинкиназ, в которых (авто)фосфорилируются определенные остатки гистидина.

Одним из известных белков, воспринимающих изменения осмотического давления -- осмосенсоров, в клетках прокариот является гистидинкиназа KdpD, связанная с цитоплазматической мембраной. Ген kdpD, кодирующий этот белок, входит в оперон, состоящий из шести генов. Опероном называют близко расположенные гены, отвечающие за определенный признак или функцию и транскрибируемые под общим контролем одного регуляторного элемента в ДНК -- промотора. Этот оперон, называемый kdpFABCDE, кодирует систему переноса ионов калия, которые сами по себе или во взаимодействии с глутаминовой кислотой участвуют в регуляции объема и ионного баланса в цитоплазме клеток при гиперосмотическом стрессе. Четыре гена этого оперона кодируют АТФазу, транспортирующую ионы К+ (рис. 2). Кроме того, в состав оперона входят два гена, выполняющие регуляторные функции. Так, регуляцию экспрессии этого оперона осуществляет гистидин-киназа KdpD. Под действием гиперосмотического стресса она может фосфорилировать определенный остаток гистидина в своей молекуле и затем передавать фосфатную группу на регулятор ответа KdpE (кодируемый геном kdpE), что приводит к его активации [4]. Регулятор KdpE, в свою очередь, связывается с регуляторной областью промотора рассматриваемого нами оперона, что приводит к его активации. Это ведет к усилению синтеза К+-АТФазы и ускоренному транспорту ионов калия в клетки (см. рис. 2), что помогает им адаптироваться к новым осмотическим условиям. Таким образом, данная регуляторная цепь относится к классу бикомпонентных систем восприятия и передачи сигналов, широко распространенных у бактерий, грибов и растений. Первый компонент этой системы -- сенсор, являющийся гистидиновой протеин-киназой (KdpD). Второй компонент -- регулятор ответа (response regulator) KdpE, выполняющий роль трансфактора, включающего транскрипцию оперона kdpFABCDE. Транскрипция регуляторных генов kdpDB находится под контролем двух промоторов, один из которых является общим промотором для всего оперона и активируется регулятором ответа KdpE при гиперосмотическом стрессе. Второй промотор (так называемый внутренний) находится в кодирующей части оперона и, видимо, обеспечивает постоянный низкий уровень транскрипции только генов kdpDB.

Молекулярные механизмы, приводящие к автофосфорилированию сенсорной киназы KdpD, остаются неясными, однако предполагается, что она воспринимает либо изменение в напряжении мембраны, связанное с осмотическим стрессом, либо изменение ионной силы в цитоплазме. Было обнаружено, что оперон kdpFABCDE можно индуцировать не только осмотическим шоком, но и при нормальных осмотических условиях с помощью химических реагентов прокаина и хлорпромазина, которые реагируют с полярными группами мембранных липидов и вызывают изменение текучести мембран. Эти же реагенты стимулируют фосфорилирование другой сенсорной киназы -- EnvZ, вовлеченной в осморегуляцию, а также вызывают перенос фосфатной группы с гистидинового остатка киназы EnvZ на остаток аспарагиновой кислоты в регуляторе ответа OmpR, который относится к тому же семейству регуляторов, что и KdpE [4]. Эти данные свидетельствуют о том, что осмосенсоры KdpD и EnvZ могут регулироваться через изменение физического состояния мембранных липидов и благодаря этим изменениям запускать сигналы, приводящие к активации генов, необходимых для адаптации клетки к стрессу.

Недавние работы, посвященные осморегуляции АВС-переносчика (от англ. ATP-binding cassette) глицин-бетаина OpuA (от англ. Osmoprotectant uptake) из бактерии Lactococcus lactis, демонстрируют зависимость активности этой системы от текучести цитоплазматической мембраны [5]. Глицин-бетаин (бетаин или триметилглицин) является так называемым осмопротектором -- веществом, накапливающимся в цитоплазме клеток и позволяющим регулировать их объем и тургорное давление при гиперосмотическом стрессе, когда в окружающей среде повышается концентрация осмотически активных веществ. OpuA представляет собой основную систему клеток, отвечающую за транспорт глицин-бетаина внутрь клеток и, таким образом, защищающую их от гиперосмотического стресса (рис. 3). В то время как обычные АВС-переносчики состоят из пяти субъединиц (две АТФ-связывающие, две трансмембранные и одна рецепторная), OpuA из L. lactis состоит из четырех субъединиц (две АТФ-связывающие субъединицы OpuAA и две гибридные субъединицы OpuABC, представляющие собой слитые в один полипептид трансмембранный и рецепторный белки). В случае обычного АВС-переносчика глицин-бетаина субстратсвязывающая субъединица OpuAC, являющаяся гидрофильным белком и присутствующая в периплазме в избытке, взаимодействует с субстратом и доставляет его транспортирующему комплексу OpuAB. Гидролиз АТФ субъединицей OpuAA обеспечивает однонаправленный транспорт глицин-бетаина внутрь клетки (см. рис. 3). В случае L. lactis гибридная трансмембранная субъединица OpuABC отвечает за узнавание, связывание и транспорт субстрата. Исследование OpuA L. lactis в интактных клетках и системе искусственных фосфолипидных мембран показало, что эта система необходима и достаточна для активации транспортаглицин-бетаина внутрь клеток, что обеспечивает устойчивость клеток к гиперосмотическому стрессу. Видимо, OpuA работает как бифункциональная система, являясь одновременно и осмосенсором и осморегулятором.

Природу сигналов, активирующих OpuA, исследовали с использованием реагентов, изменяющих текучесть мембран. При этом было обнаружено, что катионные соединения тетракаин и хлоропромазин, а также анионный дипиримидин, взаимодействующие с полярными группами фосфолипидов, что должно менять их текучесть, активируют OpuA в нормальных изоосмотических условиях в такой же степени, как и гиперосмотический стресс. И хотя текучесть мембран не была напрямую измерена в этих работах, представленные данные позволяют предположить, что активация OpuA происходит в результате изменения физического состояния (текучести) мембран.

Когда бактерии, растения или рыбы подвергаются воздействию низких температур, липиды их мембран становятся более вязкими, однако эти организмы способны увеличивать текучесть мембран посредством образования двойных связей (десатурации) ЖК мембранных липидов. Гипотеза о восприятии сигналов о снижении температуры демонстрируется на рис. 4, А. При снижении температуры уменьшается текучесть мембран, что воспринимается мембраносвязанным сенсором. Сигнал об изменении температуры передается через гипотетические переносчики к промоторам генов десату-раз. Вследствие этого индуцируется экспрессия этих генов, что приводит к усиленному синтезу десатураз в клетке и к ускорению синтеза полиненасыщенных ЖК в мембранных липидах. В конечном итоге восстанавливаются исходная текучесть мембран и физиологическая активность связанных с ними ферментных систем. Эта гипотеза была экспериментально подтверждена на клетках цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis), которая имеет четыре гена, кодирующие различные десатуразы ЖК: desC (А9-десатураза), desA (А12-десатураза), desB (ю3-десатураза) и desD (Аб-деса-тураза). Среди этих четырех генов три (desA, desB и desD) индуцируются низкими температурами [3]. Было установлено, что индукция генов десатураз зависит не от абсолютной температуры, а от разницы температур преадаптации и индукции. Так, если клетки выращивали при пониженных температурах, то они характеризовались повышенным содержанием полиненасыщенных ЖК и индукция генов десатураз наблюдалась при более низких температурах, чем в клетках, выращенных в нормальных температурных условиях.

Роль текучести мембран в регуляции экспрессии генов десатураз была показана в опытах с прямым насыщением водородом двойных связей между атомами углерода в ЖК мембранных липидов (гидрогенизация). Это осуществлялось при нормальной температуре с помощью водорастворимого платино-палладиевого комплекса в качестве катализатора реакции. Таким способом текучесть цитоплазматической мембраны была снижена при нормальной температуре роста клеток in vivo. Гидрогенизация привела к активации транскрипции гена desA, причем степень активации была идентичной той, которая наблюдалась при снижении температуры (рис. 4, Б). Поскольку и каталитическая гидрогенизация при нормальной температуре и снижение температуры окружающей среды приводили к снижению текучести мембран и активации экспрессии гена десатуразы, вероятно, чтоизменение температуры воспринимается клеткой за счет изменения текучести цитоплазматической мембраны, в результате чего в клетке возникает сигнал, приводящий к активации экспрессии генов десатураз [3].

Вероятно также, что сенсор этих изменений локализован в цитоплазматической мембране. При изменении физических свойств мембраны сенсорный белок в мембране может менять конформацию и/или проходить через циклы фосфорилирования--дефосфорилирования в качестве первичных событий при передаче внутрь клетки сигнала об изменении температуры. Мы предположили, что сенсорный белок, локализованный в мембране и запускающий экспрессию генов десатураз, может обладать свойствами гистидин-киназы в случае некоторых описанных выше осмосенсоров (KdpD и EnvZ) или хемосенсоров, обнаруженных в E. coli и других организмах.

Для выяснения возможной природы температурного сенсора в клетках штамма Synechocystis мы провели систематическую инактивацию генов, кодирующих гипотетические сенсорные гистидин-киназы (всего 43 гена). Опыты проводили на штамме, трансформированном введением в его геном гена люциферазы под контролем промотора одного из генов десатураз, desB, индуцируемого низкими температурами. При снижении температуры происходила индукция транскрипции гена люциферазы за счет активации промотора гена desB. Как следствие в клетках накапливалась люцифе-раза, что выражалось более интенсивным свечением, испускаемым клетками. Инактивировав генно-инженерным путем гены гистидин-киназ (с помощью встраивания в них гена устойчивости к спектиномицину), мы наблюдали за изменением люминесценции в му-тантных штаммах. Таким способом были идентифицированы две гистидин-киназы (мембраносвязанная Hik33 (от англ. Histidine kinase) и растворимая Hik19), инактивация которых приводила к утрате низкотемпературной индукции промотора гена десатуразы [6]. Эти результаты были также подтверждены с помощью другого метода, называемого случайным картриджным мутагенезом, данного штамма с помощью гена устойчивости к антибиотику. Суть метода заключается в том, что ген устойчивости к антибиотику известной нуклеотидной последовательности встраивается случайным образом в геном организма, при этом инактивируя гены со случайной выборкой. Таким способом получается библиотека мутантных штаммов, в геном каждого из которых встроено по одной копии гена устойчивости к антибиотику. Задачей при этом является выявление функциональных нарушений в организме и определения места мутации, а следовательно, и гена, поврежденного в результате подобного встраивания. Среди нескольких сот мутантных клонов цианобактерии, гены которых были повреждены за счет случайного встраивания в них гена устойчивости к спектиномицину, у большинства штаммов с нарушенной экспрессией люциферазы под контролем промотора desB были обнаружены повреждения в локусах, кодирующих Hik33 и Hik19.

Кодируемый геном hik33 белок Hik33 имеет консервативный гистидин-киназный домен на карбоксильном конце белковой молекулы (С-конец), два трансмембранных домена в аминоконцевом участке (N-конец молекулы), специфический линкер (последовательность аминокислот, связывающая разные функциональные участки молекулы белка), "лейциновую молнию" (последовательность аминокислот, состоящая в основном из остатков лейцина) в середине полипептидной последовательности белка и так называемый PAS-домен (сигнальная консервативная последовательность аминокислот, встречающаяся во всех группах организмов и отвечающая за восприятие изменений в освещенности, концентрации некоторых молекул и общего энергетического баланса клетки). Специфический линкер характерен для множества эукариотических сенсорных белков. Он расположен обычно между участком белка, отвечающим за восприятие сигнала, и протеинкиназой, которую принятый сигнал активирует. Предполагается, что уплотнение мембраны при снижении температуры приводит к сближению ди-меров Hik33, что ведет к изменению конформации линкерных участков, сопровождающемуся активацией гистидин-киназы и автофосфорилированием Hik33.

Кроме того, с помощью случайного мутагенеза был обнаружен ген белка -- регулятора ответа Rerl (Response regulator), инактивация которого также приводила к утрате клетками способности индуцировать промотор гена десатуразы desB. Предполагается, что система восприятия сигнала о снижении температуры клетками цианобактерий является либо бикомпонентной (Hik33 и Rer1), либо трехкомпонентной (Hik33, Hik19 и Rer1). Однако точного ответа на этот вопрос пока не получено.

Концепция влияния текучести мембран на регуляцию температурозависимой экспрессии генов подтверждается наблюдениями за экспрессией гена теплового шока Hsp90 (от англ. heat shock protein) в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Напомним, что при повышенных температурах происходит повышение текучести мембран, которому способствует десатурация ЖК липидов и препятствует насыщение двойных связей в их молекулах. Клетки дрожжевых мутантов.

Рис. 5. Гипотетическая схема активации температурного сенсора - гистидин-киназы Hik33

А - схематическое изображение доменов Hik33. ТМ, и ТМ2 - трансмембранные домены, специфическая линкерная последовательность, Leu - "лейциновая молния", PAS-домен, гистидин-киназный домен; Б - возможный механизм активации Hik33. При нормальной температуре димер Hik33 находится в неактивной форме. При снижении температуры текучесть мембран уменьшается и за счет сближения молекул липидов происходит сближение трансмембранных доменов Hik33 (показано стрелками). Это приводит к конформационным изменениям на участке белка, соответствующего линкеру. В результате происходит автофосфорилирование сенсорного белка. Далее фосфатная группа передается на белок - регулятор ответа, которым, возможно, является ReM гену А9 десатуразы, были трансформированы этим геном под контролем промоторов различной силы. Мембранные липиды трансформантов отличались между собой по содержанию насыщенных и ненасыщенных ЖК. Уровень экспрессии гена Hsp90 при нормальной температуре (36°С) был тем выше, чем выше содержание ненасыщенных ЖК. Эти результаты показывают, что экспрессия гена теплового шока зависит от степени насыщенности ЖК в липидах мембран, то есть от текучести мембран [7].

Другим подтверждением участия мембран в регуляции генов белков теплового шока являются данные по исследованию стрессового ответа гена hspA, кодирующего низкомолекулярный белок теплового шока HspA в Synechocystis. Данный белок индуцируется при повышении температуры и связывается с липидами мембран, предотвращая таким образом их дезинтеграцию. Экспрессия гена hspA активировалась как тепловым воздействием, так и размягчителем мембран бензиловым спиртом при нормальной температуре. Таким образом, показано, что при увеличении текучести мембран, вызванном либо высокими температурами, либо химическими агентами, происходит активация экспрессии генов теплового шока, некоторые из которых, как, например, ген hspA, кодируют белки, предотвращающие дезинтеграцию мембран при тепловом шоке [7]. Тем не менее сенсорные белки, отвечающие за восприятие сигнала о повышении температуры, пока не идентифицированы.

Непосредственное влияние физического состояния мембран на восприятие или передачу сигналов об изменении параметров окружающей среды было показано на примере активации генов десатураз, некоторых белков теплового шока и осмосенсоров. Однако существует множество работ, показывающих, что мембраны могут быть вовлечены в широкий спектр путей восприятия и передачи сигналов в клетках. Так, изменение текучести мембран приводит к изменениям активности ассоциированной с рецептором фосфолипазы С в клетках сердечной мышцы крыс. Активность специфической протеин-киназы, называемой протеин-киназой С, участвующей в термоадаптации дрожжей, также регулируется через текучесть мембран. Кроме того, показано, что физические свойства мембран определяют регуляцию входа и мобилизацию ионов кальция в клетках сердечной мышцы лягушки и концентрацию цАМФ (циклический аденозинмонофосфат, являющийся одной из основных регуляторных молекул в разных типах клеток и отвечающий за активацию множества генных систем) в культивируемых человеческих клетках.

Участие мембран в восприятии температурных и осмотических сигналов через белки-сенсоры в разных группах организмов является в настоящее время общепринятым фактом, позволяющим расширить и углубить наши представления о механизмах адаптации клеток и целых организмов к меняющимся условиям окружающей среды. Тем не менее остается множество вопросов, ожидающих своего разрешения. Предстоит определить домены и аминокислотные остатки сенсорных белков, которые распознают изменения физического состояния липидов мембран, и выяснить, каким образом меняется конформация сенсорной молекулы при восприятии сигнала. Вполне вероятно, что сенсорные белки ассоциированы со специфическим набором липидных молекул, состав которых может заметно отличаться от общего липидного состава клеток как по набору заряженных групп, так и по составу ЖК. Все эти вопросы важны для понимания молекулярных механизмов адаптации и ждут своих исследователей.

Вся современная биологическая наука вдохновлена и пронизана термином «молекулярный». Ни одна отрасль, даже из числа максимально «традиционных» -- ботаника, зоология, экология -- нынче не обходит своим вниманием молекулярные аспекты изучаемых явлений, стараясь представить суть объектов своего пристального внимания в свете процессов, протекающих на уровне отдельных клеток и молекул. Даже генетика, которая во времена своего «лжебуржуазного» прошлого была едва ли не сельскохозяйственной наукой, стала одной из первых «молекулярщиц», объясняя основополагающие явления жизни -- наследственность и эволюцию -- на языке ДНК, РНК и белков, «дирижирующих» всеми процессами в клетке.

«Родословная» молекулярных наук

Молекулярные науки, объединённые под знамёнами биологии, делятся на биохимический и биофизический лагеря, с разных позиций изучающие примерно одни и те же объекты и явления. Например, биохимию, интересуют больше всего реакции с участием низкомолекулярных веществ, которые можно объединить под общим названием «метаболизм». Её «дочка» -- молекулярная биология -- изучает процессы передачи информации по «классическому» пути ДНК > РНК > белок (а кое-где и в обратную сторону). Вирусология концентрируется исключительно на вирусах, уже потеряв надежду на существование какой-нибудь единой молекулярно-биологической схемы для этого поистине потрясающего своим разнообразием царства «бесклеточной жизни».

В центре внимания молекулярной биофизики находятся структура, динамика и функция биомолекул, их способность к самоорганизации и бесчисленным, но, по-видимому, очень точно скоординированным взаимодействиям между собой. Как синтезированная белковая цепь, изначально «одномерная», принимает уникальную, только ей свойственную, пространственную укладку, обеспечивающую выполнение назначенной этому белку функции? Каким образом молекулы липидов, будучи смешаны с водой, образуют пузырьки и другие структуры, очень напоминающие мембраны живых клеток? Как происходит «перекачка» протонов с одной стороны мембраны на другую в дыхательной цепи, при фотосинтезе или в фотоцикле многих бактерий? Каким образом молекулы, которых в клетке считанные штуки, находят друг друга в «чаще», называемой цитоплазмой, чтобы провзаимодействовать и запустить какой-нибудь жизненно важный процесс? Как транскрипционным белкам удаётся не пропустить нужный сайт в ДНК хромосомы, по сравнению с которой километр запутанной колючей проволоки -- это просто аккуратный «бантик»?

На все эти вопросы отвечает (ну или, по крайней мере, пытается ответить) молекулярная биофизика. Её цель -- описать на строгом языке точных наук, как «живут» биологические молекулы в клетке и каким образом взаимодействуют друг с другом, инициируя сложнейшие последовательности событий, которые уже на более «формальном» уровне -- то есть, не опускаясь до физических деталей межмолекулярных взаимодействий -- изучают молекулярная биология, генетика и другие биологические отрасли более «высокого уровня».

Поставленные молекулярной биофизикой цели очень важны: несмотря на обвинения в редукционизме, понимание молекулярных «тонкостей» кроет в себе фантастическую возможность -- создание новых молекул, которые могли бы желаемым для «создателя» образом играть свою партию во внутриклеточной молекулярной «симфонии», предотвращая болезни или управляя синтезом нужных человеку веществ. А перспективы использования этой способности поистине безграничны -- от инновационных отраслей медицины, пищевой и энергетической промышленностей до совершенно нового технологического уклада всего общества, избавленного от неискоренимых проблем экономики перепроизводства сегодняшнего дня.

У истоков молекулярной биофизики

Молекулярная биофизика стала активно развиваться в 1950-1960-х годах, когда идеи и подходы молекулярной физики, коллоидной химии и химии высокомолекулярных соединений стали пытаться применять к изучению строения белковых молекул, важность которых для любых жизненных процессов уже была в полной мере осознана. Уже были созданы биохимические методы секвенирования (то есть, определения аминокислотной последовательности) белковых молекул, уже принесли первые плоды эксперименты по рентгеновской дифракции на белковых кристаллах, в результате которых стало известно пространственное строение первых белков -- миоглобина и гемоглобина.

Биофизиков, занимавшихся в то время теоретическими вопросами биологической термодинамики и теории информации и изучавших действие радиации на живую материю, а в более молекулярной области -- искусственные однослойные и бислойные мембраны, стало живо интересовать строения белковых молекул и возможность их моделирования с использованием статистических подходов теории полимеров. Однако очень быстро стало ясно, что белки, хотя и представляют собой линейные (то есть неветвящиеся) полимеры, в корне отличаются от гомополимеров полиэтилена или, скажем, каучука, со строением которых уже более или менее разобралась полимерная химия того времени. Белки являются гетерополимерами, то есть цепочками из звеньев-мономеров двадцати основных разновидностей, и именно это определяет богатейший арсенал функций, которыми наделила их природа и перечень ролей, которые возложила на них жизнь.

Белки, несомненно, устроены принципиально более сложно и «умно», чем каучук или другие похожие полимеры, и это исключительно благодаря тому, что образующие их «звенья» -- аминокислоты -- несут боковые радикалы с сильно различающимися свойствами. Ровно в силу этой же причины структура белков намного сложнее и разнообразнее, нежели структура гомополимеров, и здесь-то и выяснилось, что все существующие полимерные теории не описывают многообразия форм, которые могут принимать белковые молекулы.

Проблему самопроизвольного сворачивания белковой цепи в уникальную пространственную структуру в настоящее время называют фолдингом (от англ. to fold -- складывать, сворачивать), и она считается крупнейшей неразрешённой задачей биофизики современности. Структура белковых молекул интересует учёных не напрасно: согласно максиме, называемой также «основной догмой молекулярной биофизики», структура белка, его динамическая подвижность и выполняемые им функции неразрывно связаны между собой. А это обозначает, что ключом к изучению всего белкового «царства» является проблема структуры и динамики полипептидных молекул.

Однако в чём же здесь проблема и при чём же тут, наконец, компьютеры, упомянутые в названии этой статьи?

Дело в том, что далеко не всегда возможностей экспериментальных методик, которые используются для установления пространственной организации белковых молекул, достаточно для практического решения задачи. В отличие от технологий секвенирования последовательности ДНК геномов живых организмов [1-3], определение пространственной структуры ещё не стало настолько автоматизированным, чтобы структуру любого интересующего белка можно было бы установить с фиксированными временными и материальными затратами. Например, в случае техники рентгеноструктурного анализа наиболее сложным моментом является получение белкового кристалла, образующего при облучении чёткую и качественную дифракционную картину, пригодную для «расшифровки» трёхмерной структуры. Условия, в которых белки образуют упорядоченную фазу, называемую белковым кристаллом, зачастую подобрать очень сложно, и во многих случаях уходят годы упорных экспериментов, прежде чем появляются первые результаты. Другой популярный метод изучения пространственной структуры биологических молекул -- спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) -- также имеет ряд ограничений, связанных с размером исследуемых молекул, получением достаточных количеств изотопно-меченных образцов белков и расшифровкой получающихся ЯМР-спектров.

Особенно остро проблемы обоих упомянутых методов встают в случае работы со сложными белковыми комплексами или интегральными белками клеточных мембран, -- для последних дело усугубляется гетерогенностью и сложной организацией молекулярного окружения, в котором существуют эти молекулы. В изучении мембранных белков, например, один из самых крупных «камней преткновения» -- добиться корректного встраивания очищенной или синтезированной белковой молекулы в липидные агрегаты, «изображающие» мембрану в эксперименте, -- например, мицеллы или липосомы [4].

Разумной альтернативой в случае, если экспериментальных данных об организации интересующего белка нет, становится область теоретической молекулярной биофизики, которую в общем виде именуют компьютерным экспериментом, или экспериментом in silico.

In vivo, in vitro, in silico