Фітовіруси та методи їх моніторингу. Радіостійкість фітовірусів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство Аграрної політики України

Державний агроекологічний університет

Кафедра загальної екологіі

Курсова робота

з навчальної дисципліни: Загальна екологія та основи неоекології

на тему: Фітовіруси та методи їх моніторингу. Радіостійкість фітовірусів

Зміст

Вступ

1. Загальна характеристика царства Vira

1.1 Будова, розміри, ультраструктура вірусів

1.2 Хімічний склад

1.3 Розмноження

1.4 Принципи класифікації вірусів

2 Фітовіруси

2.1 Способи передачі фітовірусів

2.2 Розповсюдження

2.3 Вірусні хвороби рослин

3 Моніторинг вірусних хвороб рослин

4. Заходи боротьби з вірусними хворобами рослин

Список використаної літератури

Вступ

Представники царства Vira мають широке розповсюдження на нашій планеті. Вони відіграють велике значення не тільки в онтогенезі окремого організму, а й філогенезі планети в цілому, адже відомо, що еволюція проходила не в останню чергу завдяки вірусним хворобам. Предмет вивчення вірусології є чи не найактуальнішим на сьогодні, адже останнім часом значно збільшилась частота виникнення пандемій у зв'язку зі швидким пристосуванням збудників до засобів боротьби, отже потрібні нові розробки у галузях, що від них страждають: медицина, рослинництво, тваринництво.

Фітовірусологія як наука що вивчає вірусні захворювання рослин останнім часом набуває все більшого значення, адже за умов збільшення чисельності населення існує прагнення звести до мінімуму втрати в сільському господарстві, у той час як фітовіруси мають відчутну шкодочинність. Отже, метою даної роботи буде вивчення особливостей будови та функціонування вірусів в цілому (перший розділ роботи), фітовірусів та окремих іх представників (другий розділ), а також познайомитись з методами діагностики вірусних захворювань (третій розділ) та деякими методами боротьби (четвертий розділ).

1.Загальна характеристика царства Vira

Віруси -- це об'єкти, геномом яких є нуклеїнова кислота (ДНК або РНК). Ця нуклеїнова кислота репродукується в живих клітинах і, використовуючи їхній апарат синтезу, спонукає клітини синтезувати спеціалізовані частинки, або віріони, що містять геном вірусу і можуть передавати його в інші клітини ( за С. Лурія, Дж. Дарнелл). Це визначення наголошує на двох основних властивостях вірусів -- наявності у них власного генетичного матеріалу, що поводить себе в клітині хазяїна як частина цієї клітини, та наявності неклітинної інфекційної фази існування вірусів у вигляді спеціалізованих частинок, або віріонів, що репродукуються в клітині під генетичним контролем вірусу і є придатними для введення геному вірусу в інші клітини хазяїна.

За К. С. Суховим, віруси характеризуються такими основними ознаками: 1) дуже малими розмірами тіла; 2) відсутністю клітинної будови; 3) відносно простим хімічним складом (найпростіші віруси складаються з білка і нуклеїнової кислоти); 4) нездатністю до культивування на штучних синтетичих середовищах; 5) особливим циклом розвитку в організмі сприятливого хазяїна або частиною цього циклу в безклітинному середовищі, яке включає деякі органоїди клітини і речовини, необхідні для синтезу нуклеїнових кислот і білків; 6) здатністю деяких із них кристалізуватися за певних умов довкілля.

Аналізуючи сучасні досягнення вірусологічної науки, російські вчені доходять висновку, що віруси є автономними генетичними структурами, уламками життя, фрагментами живих систем, які нездатні до самостійного існування поза повноцінними організмами або клітинами, чи то, нарешті, субклітинними структурами. Як автономні генетичні структури віруси певною мірою мають або, вірніше, зберігають основні атрибути життя, включаючи такий кардинальний атрибут, як здатність до еволюції.

1.1 Будова, розміри, ультраструктура вірусів

На різних етапах розвитку вірус існує в різних формах, а тому складається враження що віруси є дуже лабільними. Проте дослідження показують, що кожен вид вірусів має певні, властиві тільки йому, ознаки. Найхарактерніші властивості для кожного виду мають зрілі форми вірусів, які називають віріонами .

Розміри різних вірусів коливаються від 8 до 750 нм (див табл. 1)

Табл.1. Розміри деяких вірусів(нм) (Векірчик К.М 2001 стор 262)

Вірус	Метод визначення І
	Ультрафільтрація	Ультрацентрифугування	Електронна мікроскопія
Тютюнової мозаїки (ВТМ)	15-25	--	15-3000
Мозаїки цукрових буряків, кавунів, Х-вірус картоплі	--	--	730-750
Коров'ячої віспи	125-175	170-180	227-305
Герпесу	100-150	180-220	133-233
Грипу А	80-120	70-116	123±11,18
Поліомієліту	8-12	28	8-27
Ящуру	8-12	17-20	20-32

До групи великих вірусів можна віднести віріони віспи, пситакозу, трахоми, мозаїки цукрових буряків, Х-вірус картоплі та ін. Середні розміри мають віруси грипу, сказу, герпесу тощо. Дуже малі розміри у віріонів енцефаліту, поліомієліту, ящуру та багатьох фітопатогенних вірусів. Цікаво, що найбільші за розмірами віруси наближаються до малих бактерій, наприклад мікоплазм, а найменші -- до макромолекул білка.

За формою віруси поділяються на такі групи:

Паличкоподібні-- віруси тютюнової мозаїки (ВТМ), штрихуватої мозаїки ячменю та багато інших

Ниткоподібні -- віруси жовтяниці цукрових буряків, мозаїки пшениці, квасолі сої, кавунів, Х-вірус картоплі.

Сферичні -- віруси грипу, курячої саркоми, японського енцефаліту, кору, паротиту, арбовіруси, віруси лейкозу курей і мишей.

Кубоїдальні -- віруси вісповакцини, натуральної віспи, аденовіруси, ентеровіруси, реовіруси, віруси папіломи людини і тварин тощо.

Булавовидні --бактеріофаги.

Форми віріонів визначаються будовою капсиду або нуклеокапсиду.

Капсиди вірусів утворені з білкових субодиниць, що стереотипно повторюються в структурі та хімічній будові віріона. Згідно з кристалографічними закономірностями, майже всі віруси за структурою капсиду (типом симетрії) поділяються на три великі групи: спіральні, поліедричні, що являють собою ікосаедри -- правильні багатогранники, і віруси з комбінованим типом симетрії.

Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) є типовим представником віусів зі спіральним типом симетрії. (мал. 1)

Рис.1 Модель будови вірусу тютюнової мозаїки: 1-- нуклеїнова кислота; 2 -- білкові субодиниці капсиду

За сучасними даними, ВТМ має форму порожнього циліндра діаметром 15 нм і завдовжки 300 нм.

Віріон ВТМ містить одноланцюгову РНК, його капсид складається з однакових, розміщених спірально, білкових субодиниць. У кожній спіралі на три витки припадає 29 субодиниць, кожна з яких є білковою молекулою з молекулярною масою-17 530. Загалом віріон містить 2130 (±2 %) ідентичних білкових субодиниць. Спіральний тип симетрії характерний не тільки для фітопатогенних вірусів, його знайдено і у вірусів, що вражають тварин і бактерії.

Віруси з кубічною симетрією (ізометричні віруси). Застосування рентгеноструктурного аналізу у вірусологічних дослідженнях показало, що у багатьох видів вірусів віріони мають правильний багатогранний капсид (оболонку) у вигляді ікосаедра, всередині якого міститься нуклеїнова кислота. Рентгенограми віріонів кущистої карликовості томатів, жовтої мозаїки турнепсу, поліомієліту з великою точністю показали, що вони мають кубічну симетрію. Відомо, що існують три типи фігур з кубічною симетрією: тетраедр (осі симетрії 2:3, найменша кількість структурних одиниць 12), октаедр (осі симетрії 4:3:2, число структурних одиниць 24) та ікосаедр, або двадцятигранник (осі симетрії 5:3:2, кількість субодиниць 60).

рис. 2 Схематичне зображення ікосаедричних вірусів

А--аденовірус (тетраедр)

Б--вірус герпесу (октаедр)

В--вірус саркоми Рауса (ікосаедр)

Електронно-мікроскопічне вивчення будови ікосаедричних вірусів виявило на їхній поверхні структурні елементи, які є комплексами білкових субодиниць. Ці структурні елементи дістали назву капсомерів,або морфологічних субодиниць. Виявляється, що ікосаедрична форма є «вигідною» природною структурою тому, що при цьому великою мірою заощаджується білковий матеріал для будови капсиду віріона, а також ще й тому, що для утворення ікосаедра потрібна мінімальна кількість енергії.

Представники групи вірусів зі складним типом симетрії є складніше організованими. Вони мають нуклеокапсид, який характеризується кубічною симетрією, а розміщений усередині його нуклеопротеід укладений спірально. Добре вивченим представником складніше побудованих вірусів є вірус мозаїки люцерни (ВМЛ). Морфологічні субодиниці ВМЛ, на відміну від інших вірусів, характерно укладені у вигляді пента- і гексамерів: частково за вимогами гвинтової і частково -- кубічної симетрії. Комбінований тип симетрії мають віруси вісповакцини, лейкозів, сарком тощо.

До цієї групи складніше організованих вірусів належать і деякі види фагів, що мають два різних типи симетрії (головка й відросток). У великих, зокрема Т-парних, фагів головка має ікосаедричну форму, а відростки -- гвинтову симетрію і є органами прикріплення до клітин бактерій.

1.2 Хімічний склад

Для успішного вивчення хімічного складу різних вірусів насамперед потрібно мати чисті препарати. Більшість методів очистки вірусів включає ультрацентрифугування, хроматографію тощо. Кінцева мета очистки -- одержати препарати, що містять тільки інфекційні вірусні частинки, які можна використати для вивчення як структури, так і хімічного складу вірусів. Очищені препарати багатьох вірусів можуть кристалізуватися..

Д. Й. Івановський першим спостерігав у листках тютюну, ураженого мозаїчною хворобою, включення, які тепер називають кристалами Івановського.

Елементарний склад вірусних частинок такий (%): вуглець -- 50; кисень -- 20; водень -- 7; азот -- 16; фосфор -- 0,4-0,5; сірка -- 0,1-0,6; зольні елементи -- 2,5, за вмістом цих елементів штами вірусів практично не розрізняються, варіює (як правило, для фітовірусів) вміст сірки.

Незважаючи на значні відмінності в будові та хімічному складі різних вірусів, усі вони мають два основні компоненти: нуклеїнову кислоту і білковий капсид (оболонку). Слід зазначити, що білки фітопатогенних вірусів належать до кислих білків, тобто мають у складі від 5% до15% гліцину. У деяких вірусів нуклеокапсид може бути оточеним другою зовнішньою оболонкою, яка має ліпідну, ліпопротеїдну або гліколіпопротеїдну природу. Таку оболонку прийнято позначати терміном «суперкапсид». У складніше організованих вірусів окрім суперкапсида є ще одна проміжна оболонка -- білкова мембрана, що оточує розміщений в центрі нуклеокапсид, який утворює структуру так званого нуклеоїда. Крім названих компонентів, до складу всіх вірусів входять катіони металів.

Як уже зазначалось, у найпростіших вірусів, наприклад у ВТМ, капсид складається з ідентичних субодиниць білка, які містять 158 амінокислот (переважно Ь-амінокислоти) ВТМ. 2130+100 пептидних ланцюжків субодиниць капсиду укладені по спіралі так, що виникає порожній циліндр завдовжки 300 нм і діаметром 15 нм.

У складніше організованих вірусів білкова оболонка складається з кількох білків, наприклад в аденовірусів виявлено близько 10 різних структурних білків, які беруть участь у формуванні капсида і серцевини віріону. Крім структурних білків, у складі вірусних частинок виявлено також ферментні білки. Це, зокрема, РНК-залежна РНК полімераза (транскриптаза), РНК-залежна ДНК полімераза (ревертаза), АТФ-аза бактеріофагів зі скоротливими чохлами відростків та багато інших. Є дані, що ці ферменти кодуються вірусним геномом.

Цікаво, що вірусний білок, зокрема багатьох паличкоподібних вірусів, має здатність до самозбирання (упорядкованої агрегації), тобто, зруйнований до субодиниць за певних умов, він може знову відновлюватися до вихідного стану. Пояснити це можна тим, що впорядкований агрегат білка (капсид) має найменшу вільну енергію порівняно з мономерними пептидними ланцюгами. Тому самозбирання капсидів, як і будь-який процес, що веде до зменшення вільної енергії системи, може відбуватися спонтанно.

Якщо не брати до уваги індивідуальні функції, властиві тим чи іншим білкам у конкретних видів вірусів, то взагалі вірусні білки як компонент віріону виконують захисну, адресну і регуляторну функції. Серед білків, що утворюються під час вірусної інфекції, розрізняють три групи: 1) білки, які можуть каталізувати реплікацію нуклеїнової кислоти вірусу; 2) білки структурні, що входять до складу нових віріонів; 3) білки, які можуть змінювати деякі функції або структури клітин хазяїна.

Основним компонентом вірусів є також нуклеїнові кислоти (РНК або ДНК). Раніше вважали, що віруси рослин містять РНК. Однак у 1968 р. було виявлено, що вірус мозаїки цвітної капусти містить дволанцюгову молекулу ДНК. Більшість вірусів рослин містять одноланцюгову лінійну РНК.

На відміну від клітинних організмів, у вірусів, на додаток до двох основних типів нуклеїнових кислот, є також одноланцюгові ДНК і дволанцюгові РНК.

Одноланцюгова ДНК фагів має кільцеву форму, а вірусів, які уражають еукаріотні клітини, -- лінійну. Вторинна структура одноланцюгової ДНК вірусного походження нічим не відрізняється від макромолекулярної організації одноланцюгових РНК.

Дволанцюгова РНК, вперше відкрита у реовірусів, виявилась досить поширеною в царстві вірусів. Вторинна структура РНК являє собою досконалу подвійну спіраль, що містить два комплементарні полірибонуклеотидні ланцюги.

Слід зазначити, що дволанцюгова ДНК Т-парних фагів відрізняється від ДНК інших вірусів тим, що замість цитозину містить 5-оксиметилцитозин і глюкозу, приєднану до деяких оксиметильних груп оксиметилцитозину.

Крім білків і нуклеїнових кислот, до складу вірусних частинок можуть входити ліпіди, вуглеводи та інші речовини. Ліпіди виявлені у складноорганізованих вірусів. Вони містяться переважно в складі ліпопротеїдної оболонки (суперкапсида) і формують її ліпідний бімолекулярний шар, в якому містяться суперкапсидні білки.

Вважають, що ліпідний компонент стабілізує структуру віріону. Характерним для вірусів, які містять ліпіди, є те, що без винятку всі ліпіди у них не кодуються геномом, а мають клітинне походження. Вуглеводи у вірусів входять до складу глікопротеїдів. Кількість їх може становити понад 10 % у перерахунку на масу віріону. Вуглеводний компонент глікопротеїнів вірусу відіграє істотну роль у структурі та функції білка. Він є каркасом для локальних ділянок глікопротеїду, забезпечуючи збереження конформації білкової молекули, і зумовлює її захист від ферментів протеаз.

1.3 Розмноження

Взаємодія вірусу з хазяїном починається з моменту його проникнення +(загальну схему розмноженн див. рис.3). Віріони можуть деякий час пересуватися між клітинами, а після цього вступають в тісні взаємовідносини з якоюсь з них. З цього починається розвиток інфекційного процесу.

У життєвому циклі вірусів чергуються дві фази -- позаклітинна, під час якої вірус перебуває у вигляді інертної інфекційної частинки -- віріону, і внутрішньоклітинна фаза, протягом якої проявляються властивості вірусів, закодовані в їхньому геномі, тобто здійснюється їх розмноження.

Рис. 3 Схема розмноження вірусу (СНІД) (1. стор 271)

Зважаючи на складність цього процесу та його кардинальну відмінність від розмноження прокаріотів, вчені розробили низку методів для вивчення проникнення віріонів у живу клітину хазяїна. Часто використовують метод змішування певної кількості вірусів із суспензією клітин з наступним відокремленням клітин центрифугуванням і визначенням вмісту вірусів у надосадовій рідині. При використанні хімічних методів застосовують так званий мічений вірус, в якого один з компонентів (білок або нуклеїнова кислота) має радіоактивну мітку. З морфологічних методів найчастіше використовують електронну мікроскопію.

Завдяки сучасним методам дослідження вченим вдалося встановити складний характер взаємодії вірусу з клітиною хазяїна. Залежно від властивостей вірусу і сприйнятливої клітини, а також умов зовнішнього середовища, розрізняють такі основні типи взаємодії вірусу з клітиною:

а) розмноження вірусу призводить до руйнування і загибелі клітини (такий тип взаємодії дістав назву продуктивної інфекції, а віруси -- вірулентних);

б) взаємодія, при якій клітини залишаються живими, а дозрілі віріони не утворюються, називається абортивною інфекцією;

в) геном вірусу інтегрується (об'єднується) з генетичним апаратом клітини і під час поділу клітини може тривалий час передаватися в дочірні клітини. Однак через деякий час, за певних умов, у клітині може початися розмноження вірусу, яке призводить клітину до загибелі. Такий тип взаємодії дістав назву вірогені.

При першому типі взаємодії розмноження вірусу відбувається шляхом послідовного перебігу таких стадій:

1) адсорбція вірусу на клітинах;

2) проникнення вірусу в клітину;

3) роздягання (депротеїнізація оболонки) вірусу в клітині;

4) транскрипція нуклеїнової кислоти;

5) трансляція інформаційних РНК;

6) реплікація генома;

7) складання вірусних компонентів і вихід дозрілих віріонів з клітини хазяїна

Вірус може потрапити у рослинну клітину через комах-перенощиків, повитиці, через грунт, під час щеплення хворої рослини на здорову та під час механічної інокуляції.

Перша стадія проникнення вірусів у клітину -- прикріплення їх до клітинної стінки, можливе через електростатичну взаємодію позитивно і негативно заряджених угруповань на поверхні вірусу і клітини, --називають адсорбцією. Це високоспецифічний процес. Структури віріону, що уможливлюють його адсорбцію клітиною, називаються вірусними рецепторами або прикріплюючи ми білками, оскільки вони «впізнають» специфічні угруповання на мембрані клітини і зумовлюють прикріплення до них вірусу.

Кількість специфічних рецепторів на поверхні клітини може складати до 105 на одну клітину. Наявність відповідних рецепторів -- один із важливих факторів, що визначають можливість чи неможливість для даного вірусу спричиняти інфекційний процес у клітині. Саме відсутністю специфічних рецепторів пояснюють стійкість деяких клітин і організмів до зараження певними вірусами.

Після того, як віріон адсорбувався на поверхні клітини, починається друга стадія -- проникнення його в клітину. Перехід цілого віріону крізь цитоплазматичну мембрану може відбуватися шляхом віропексису (піноцитозу) або внаслідок злиття цитоплазматичної мембрани з оболонкою віріону. Вважається, що ці механізми доповнюють один одного. Фітопатогенні віруси можуть проникати в рослинну клітину за допомогою комах-переносників при вегетативному розмноженні, під час догляду за рослинами тощо, а деякі бактеріофаги проникають крізь клітинну стінку шляхом ін'єкції.

Більшість оболонкових і безоболонкових вірусів тварин проникають у клітину шляхом рецепторного ендоцитозу, який відбувається в певних ділянках цитоплазматичної мембрани, в спеціальних заглибленнях, на дні яких містяться специфічні рецептори. Заглиблення забезпечують швидку інвагінацію і утворення вкритих особливим білком, клатрином, внутрішньоклітинних вакуолей. Ендоцитоз уможливлює внутрішньоклітинний транспорт вірусу в складі ендоцитарної вакуолі. Остання може рухатися в будь-якому напрямі і зливатися з клітинними мембранами, і при цьому звільнювати вірусну частинку у відповідних ділянках всередині клітини.

Наступною стадією є «роздягання», тобто звільнення нуклеїнової кислоти вірусу від захисної оболонки, яка перешкоджає експресії вірусного геному. Депротеїнізація оболонки низки вірусів відбувається за допомогою ферментів у спеціалізованих органелах клітини (лізосомах, диктіосомах), перинуклеарному просторі, ядерних порах, на ядерній мембрані тощо. Цей поступовий процес є результатом серії послідовних реакцій.

У наступній стадії здійснюється процес транскрипції звільненої від оболонок нуклеїнової кислоти вірусу, тобто переписування інформації, яка міститься в ДНК, на РНК за законами генетичного коду і за допомогою РНК-полімерази. Продуктами транскрипції в клітині є іРНК. У ДНК-вмісних вірусів іРНК синтезується на матриці однієї із ниток ДНК. Схема перенесення генетичної інформації у цих вірусів така ж, як і в клітини:

ДНК >транскрипція>РНК --трансляція > білок.

РНК-вмісні віруси, у яких генетична інформація зберігається не в ДНК, а в РНК, зокрема у РНК-вмісних «плюс-ниткових» вірусів, що в них функції іРНК виконує сам геном, генетична інформація передається за такою схемою; РНК > білок (пікорнавіруси, тогавіруси, коронавіруси). У вірусів, геном яких не може виконувати функцію іРНК, у клітині синтезується комплементарна геному іРНК. У цьому випадку передача генетичної інформації здійснюється у такий спосіб: РНК > іРНК> білок. Сюди належать ортоміксовіруси, пара-міксовіруси та ті віруси, у яких геном представлений одноланцюговою РНК, а також реовіруси та деякі інші, геном яких складається з дволанцюгової РНК.

Деякі віруси тварин -- так звані ретровіруси -- мають унікальний шлях передачі генетичної інформації. У них РНК переписується на ДНК, а ДНК інтегрує з геномом клітини і в його складі переписується на РНК, яка володіє функціями іРНК. Такі віруси мають вірусоспецифічний фермент, який переписує РНК на ДНК. Цей процес одержав назву зворотної транскрипції, а фермент -- зворотної транскриптази (ревертаза). Вона також може синтезувати нитку ДНК на матриці ДНК.

Процес переведення генетичної інформації, яка міститься в іРНК, у специфічну послідовність амінокислот у молекулі білка називається трансляцією. Саме в результаті трансляції іРНК відбувається синтез білка в клітині. Він здійснюється на рибосомі, яка складається з двох субодиниць -- великої і малої. Субодиниці містять рибосомальні РНК і білки.

Трансляція перебігає у три фази: ініціація, елонгація і термінація, які перебігають за допомогою тРНК

Ініціація-- найважливіший етап в процесі трансляції. Він ґрунтується на впізнанні рибосомою іРНК і зв'язуванні з її особливими ділянками. Рибосома «упізнає» іРНК завдяки «шапочці» на 5'-кінці і зсковзує до З'-кодону, доки не досягне ініціаторного кодону, з якого починається трансляція. В еукаріотній клітині ініціаторним кодоном є кодон АУГ або ГУГ, що кодують амінокислоту метіонін. З цієї ініціаторної амінокислоти починається синтез поліпептидного ланцюга. Він відбувається внаслідок приєднання залишків амінокислот через утворення між ними пептидних зв'язків і називається елонгацією. При цьому ланцюг іРНК протягується через рибосому і закодована у ній генетична інформація «декодується». іРНК функціонує на декількох рибосомах, кожна з яких синтезує той самий поліпептидний ланцюг, який кодується даною іРНК.

Термінація трансляції .здійснюється тоді, коли рибосома доходить до термінуючого кодону в складі іРНК. У цей момент синтез поліпептидного ланцюга закінчується і він звільняється від полірибосоми. Після цього полірибосоми розпадаються на субодиниці. Останні можуть входити до складу нових полірибосом.

Реплікація (від лат. rерlісаtіо -- подвоєння) -- синтез молекул нуклеїнової кислоти, які гомологічні геному. Реплікація геному ДНК-вмісних вірусів каталізується переважно клітинними ферментами; її механізм подібний до реплікації клітинної ДНК. Кожна синтезована молекула ДНК складається з однієї батьківської і однієї заново синтезованої дочірньої нитки. Це так званий напівконсервативний механізм реплікації.

Реплікація вірусних РНК відбувається в клітині за допомогою вірусоспецифічних ферментів. Реплікацію каталізує той самий фермент, що й транскрипцію (репліказа). При реплікації одноланцюгових РНК спочатку синтезуються комплементарні геному ланцюги, які, в свою чергу, стають матрицями для синтезу копій генома. Механізм реплікації дволанцюгової РНК добре вивчено у реовірусів, віріони яких також містять вірусоспецифічну РНК-полімеразу. Після проникнення віріону в клітину, РНК-полімераза частково звільняється від білків, активується і здійснює синтез іРНК, причому зчитування відбувається тільки з одного ланцюга батьківських молекул РНК, тобто за консервативним механізмом.

Синтез дволанцюгових дочірніх молекул РНК здійснюється асинхронно -- на матриці батьківської РНК синтезуються комплементарні її ланцюги, які є матрицями для синтезу другого ланцюга РНК.

Синтез компонентів вірусних частинок може відбуватися в різних структурах ядра і цитоплазми. У деяких вірусів синтез вірусних нуклеїнових кислот проходить в ядрі, а синтез вірусних білків -- в цитоплазмі. Отже, на відміну від бактерій та інших клітинних організмів, вірусам властивий диз'юнктивний (роз'єднаний) спосіб розмноження, який полягає в тому, що їхні компоненти синтезуються в клітині хазяїна відокремлено, неодночасно в різних місцях.

Завершальним етапом внутрішньоклітинного існування вірусів є формування з новосинтезованих компонентів (НК і білків) нових віріонів з властивою їм структурою та вихід дозрілих вірусних частинок з клітини.

Упродовж еволюції у вірусів виникли два способи перебігу цього завершального етапу. В аденовірусів, пікорнавірусів, реовірусів та деяких інших складання та дозрівання віріонів йде усередині клітини. У вірусів, які мають оболонку (РНК-вмісні віруси з негативним геномом, ретровіруси та інші), складання віріону і вихід його з клітини відбувається шляхом відбрунькування в зовнішнє середовище. Вважається, що це найбільш ефективний механізм виходу вірусу.

При диз'юнктивному розмноженні утворення віріону можливе лише в тому випадку, якщо вірусні НК і білки володіють здатністю при достатній концентрації «упізнавати» один одного серед різноманітних клітинних білків і НК та спонтанно з'єднуватися. Білково-нуклеїнове «упізнавання» обмежено невеликою ділянкою нуклеїнової кислоти і визначається унікальною послідовністю нуклеотидів у некодуючій частині вірусного генома.

У простих вірусів спочатку формуються провіріони, які далі, в результаті модифікації білків, перетворюються на віріони. Найпростіший механізм складання віріонів спостерігається у вірусів зі спіральною симетрією. Так, у класичного представника таких вірусів -- ВТМ -- віріони формуються самоскладанням, тобто спонтанною агрегацією за типом кристалізації.

У складних вірусів складання віріонів здійснюється у кілька етапів з участю ядерних і цитоплазматичних мембран. Взаємодія нуклеїнової кислоти з внутрішніми білками приводить до формування нуклеокапсидів, які є проміжними структурами при складанні. У деяких вірусів є низка гідрофобних білків, які виконують функції посередників між сформованими нуклеокапсидами і вірусними оболонками. Механізм складання віріонів РНК- і ДНК-вмісних вірусів досить складний і досі ще недостатньо вивчений.

Останньою стадією репродукції вірусів є вихід повністю сформованих віріонів з клітини назовні. Це відбувається шляхом «вибуху» або брунькування. При першому способі спостерігається лізис (руйнування) і загибель клітини і вихід з неї дозрілих віріонів. Це характерно для вірусів, які не мають ліпопротеїдної оболонки (адено-, пікорна-, рео-, парвовіруси та ін.).

Вихід із клітини шляхом брунькування властивий вірусам, які мають ліпопротеїдну мембрану, що є похідною клітинних мембран. При цьому способі клітина хазяїна може тривалий час зберігати життєздатність і продукувати вірус до повного виснаження своїх ресурсів.

Розглянутий нами процес розмноження властивий переважній більшості вірулентних вірусів, основною рисою яких є здатність автономно розмножуватися в інфікованій клітині, що, як правило, призводить до загибелі клітин хазяїна. Однак існує велика група так званих помірних вірусів, характерною рисою яких є здатність до інтеграції (об'єднання) вірусного генома з геномом клітини хазяїна. В цьому разі вірус у клітині нічим не виявляє своєї присутності і тривалий час існує «приховано» (екліпс), стаючи нібито складовою частиною генетичного матеріалу клітини.

1.4. Принципи класифікації вірусів

Розробити природну класифікацію вірусів, визначити їхнє місце в системі живої природи намагалися ще після їх відкриття. Вперше спробу об'єднати усі віруси в царстві Vіга зробив Ф. Холмс у 1939 р. Він поділив царство вірусів на дві групи: Phytophagi (віруси рослин) і Zoophagi (віруси тварин). Над розробкою перших систем класифікації вірусів також успішно працювали С. Д. Мошковський, В. М. Рижков, В. М. Жданов та ін.

У 1962 р. відомий французький вірусолог А. Львов сформулював основні критерії і запропонував проект універсальної ієрархічної класифікації вірусів. З 1966 р. питаннями класифікації і номенклатури вірусів займається Міжнародний комітет з таксономії вірусів (МКТВ). За основу класифікації МКТВ прийняв фізичні і хімічні критерії, запропоновані А. Львовим, але вирішив тимчасово відмовитися від всеохоплюючої класифікації, вважаючи за доцільне створювати її поступово, до міри нагромадження інформації.

Нині МКТВ затверджена універсальна таксономічна система вірусів, яка складається з трьох порядків, 64 родин і 233 родів, у т. ч. 24 «плаваючих» родів вірусів тварин, рослин і мікроорганізмів. Порядок (Оrder) є зібранням родин вірусів із загальними характеристиками. Порядок Сaudovirales включає три родини -- Myoviridae Styloviridae, Pedoviridae. Порядок Mononegaviridales об'єднує чотири родини: Podoviridae, Rhabdoviridae, Bornaviridae, Filoviridae. До порядку Nidovirales віднесено родини Coronaviridae i Alteriviridae.

Род вірусів позначають назвою з суфіксом -virus. Вид вірусу має позначення латиною Species. Цей таксон є найважливішою ієрархічною одиницею. Нині прийнято визначати вид вірусів як політипічну категорію (клас), яка складає реплікуючу лінію і займає особливу екологічну нішу.

Щодо системи вірусів рослин, то, за найновішими даними, серед 9 родин і 24 родів вірусів рослин, затверджених виконавчим комітетом МКТВ, тільки одна родина Geminiviridae і один рід Nanovirus включають віруси з одноланцюговим ДНК-геномом і одна родина Caulimoviridae -- з дволанцюговим ДНК-геномом. Решта вірусів належать до РНК-геномних. Однак і досі класифікація вірусів рослин є ще слабо вивченою.

Віруси бактерій і грибів. Нині виявлено віруси, які уражають понад сто видів бактерій. Більшість з них це ДНК-геномні фаги, але є й РНК-геномні. Г. В. Акерман та співавт. (1978) за формою поділяють їх на чотири групи: фаги, які мають кубічну головку і відросток; кубічні фаги; ниткоподібні фаги; плеоморфні фаги.

Тепер виділено 10 родин вірусів бактерій, які охоплюють більшість нині відомих

2. Фітовіруси

2.1 Способи передачі фітовірусів

Віруси рослин мають здатність досить швидко розповсюджуватися в біоценозах. Вони можуть поширюватися завдяки переносникам (кліщі, попелиці, нематоди, гриби ), передаватися при вегетативному розмноженні через бульби, живці, цибулини. Більшість фітовірусів передаються щепленим. Близько 90 різних видів вірусів рослин передаються насінням, деякі фітовіруси можуть викликати інфекцію без участі переносників, коли збудник знаходиться в грунті. Знання екології збудника необхідне для використання необхідних засобів боротьбі проти нього (рис.4).

Рис. 4 Основні шляхи передачі фітовірусів. - передача за допомогою пилку; 2- передача за допомогою насіння; З - за допомогою еекторіе-комах; 4- при прямому контакті з рослинами {механічному пошкодженні); 5- за допомогою векіпорів-нематод; 6- за допомогою векторів-грибів

При ураженні рослин -- господарів фітовірусами найчастіше розвивається системна реакція. При цьому інфекція часто протікає з яскраво вираженими симптомами у вигляді мозаїки, скручування, хлорозу, появи енацій та ін. Така інфекція може закінчуватись навіть загибеллю інфікованих частин рослин або і всієї рослини. Разом з тим, інколи перебіг інфекційного процесу проходить без чітких ознак хвороби, які помітні за габітусом рослин. Часто уражений організм може бути прихованим носієм інфекції. Продуктивність таких рослин знижується в незначній мірі. Так реагують на вірусну інфекцію рослини-резерватори, переважна більшість яких відноситься до бур'янів .

Бур'яни (щириця біла, гірчиця біла, суріпиця звичайна, пирій повзучий та ін.) займають особливе місце серед факторів, що знижують врожай сільськогосподарських культур. Для цих рослин характерні велика енергія насіннєвого та вегетативного розмноження, тривале зберігання схожості насіння. Вони сильно виснажують та висушують грунти, часто являються джерелом розповсюдження хвороб та шкідників сільськогосподарських культур. Джерелом вірусів служить також насіння бур'янів. Завдяки його достиганню та обсипанню до збору сільськогосподарських культур, насіння накопичується на полях у великій кількості. Так, в одному шарі товщиною З0 см знаходиться в середньому від 100 млн. до 4 млрд. і більше насіння бур'янів на 1 га. При обробці грунтів значна їх частина переміщується в верхній горизонт, і їх кількість тут в сотні і тисячі разів перевищує кількість насіння, що висівається. Крім того, грунт може бути забруднений кореневищами бур'янів, що також можуть бути уражені вірусами. Так, вірус мозаїки цукрового буряку уражує також щирицю, осот, кормові боби. Віруси, що викликають жовтяницю буряка, можуть перезимовувати в багатьох розповсюджених бур'янах.

Багато вірусів швидко мігрують завдяки переносникам, якими можуть бути цикадки, кліщі, нематоди, гриби та ін. Напевно, перше місце по передачі вірусів серед комах займають попелиці. Попелиці і кліщі, як і інші летючі комахи, є одними з важливих факторів, що визначають дальність розповсюдження віруса від джерела. Так, за один день попелиці відносяться вітром на десятки і навіть сотні кілометрів.

Грунт є також одним із джерел інфікування рослин вірусами. Потрапляючи в грунт, віруси здатні інфікувати нові рослини. Існує три групи вірусів, що передаються через грунт:

віруси, що передаються грибами;

віруси, що передаються нематодами;

віруси, переносник яких невідомий.

Крім вірусів, що переносяться або нематодами, або зооспорами ґрунтових бактерій, існує група ґрунтових вірусів, представники якої "вільними" віріонами зустрічаються в грунті і воді та можуть переходити без допомоги переносників від хворих до здорових рослин, хоча деякі з них можуть переноситися нематодами або грибами.

Джерелами контамінації "вільних" від вірусів грунтів або інших субстратів може бути, ймовірно, невелика кількість рослин, що постійно виділяють через корені вірус в навколишнє середовище. Деякі віруси настільки призвичаїлися до цього способу розповсюдження, що інфікують тільки кореневу систему рослин-господарів або окремі частини їх надземних органів. Діагностика в такому випадку ускладнена, і можна припустити, що віруси цієї групи розповсюджені більш широко, ніж думали до останнього часу .

Численні віруси рослин містяться в грунті і в поверхневій воді, особливо в сільськогосподарських областях. Ступінь адсорбції і тривалість періоду, на протязі якого інфекційність зберігається і який може тривати тижні, а іноді і місяці, залежить від захисту вірусу і факторів зовнішнього середовища. Серед останніх це тип грунту, рівень вологості, рН, температура, вміст органічних субстанцій і звичайно пов'язана з цим біологічна активність середовища. Багато вірусів стабільні і здатні інфікувати рослини без допомоги векторів, а саме нематод та розповсюджених в грунті зооспор грибів. Передача вірусу з грунту та води ймовірно можлива і через непошкоджені корені рослин. Віруси, які є в струмках, можуть переноситись на великі відстані.

2.2 Розповсюдження

Вірус, що зберігає стабільність структури, знаходячись всередині рослини, так і зовні і досягає високих концентрацій в тканинах, має, зрозуміло, більшу ймовірність вижити та розповсюдитись, ніж той, що цими властивостями не володіє. Наприклад, ВТМ може на протязі довгого періоду зберігатись в мертвому рослинному матеріалі, що знаходиться в грунті, котрий в такому разі стає джерелом інфекції для наступних культур.

Віруси або штами вірусів, що переміщуються по рослині повільно від того місця, де пройшло ураження, мають меншу ймовірність вижити і потім ефективно розповсюджуватись, ніж ті з них, що транспортуються швидко. Швидкість руху вірусів відіграє певну роль, якщо її розглядати з точки зору тривалості життя окремих рослин-господарів. Так, віруси, що уражують довгоживучі дерева та кущі, можуть рухатись по своїм рослинам-господарям значно повільніше, ніж ті, що інфікують однорічні рослини. Віруси, що можуть проникати в насіння і зберігатись там, мають суттєві переваги порівняно з іншими, з точки зору розповсюдження, а також здатності до виживання. Розповсюдження вірусу некрозу тютюну у більшості рослин-господарів обмежене кореневою системою, і існування цього вірусу в природі залежить від здатності грибів-переносників передавати його через грунт і уражувати таким чином інші рослини Ймовірність виживання вірусу, що викликає швидко-прогресуюче системне захворювання, яке призводить до загибелі рослини, значно менша, ніж у тому випадку, коли вірус викликає у рослин слабкі або середньої тяжкості захворювання, при яких вони продовжують вегетувати та розмножуватись.

Основні фактори, що впливають на виживання штаму, такі:

· Ефективна передача комахами або іншими засобами (попелиці, кліщі, грунтові гриби та ін.)

· Більш швидке розмноження та більший урожай, ніж у конкурентів

· Розвиток слабкої або не надто сильної форми захворювання (в іншому випадку рослина може померти ще до завершення розмноження вірусу)

Цікаво зазначити, що в природі існують фітовіруси як з вузьким, так і з широким колом господарів. Це пояснюється тим фактом, що віруси, що мають високу специфічність, вражають, як правило, багаторічні насадження, у той час як інші спеціалізуються на однорічних рослинах.

Стосовно абіотичних факторів, що впливають на рослину вважають, що сезонні коливання частоти ураження є наслідком довготривалого впливу погодних умов на комах-переносників (за умови, що вірус переноситься перстстентно, неперсистентно, механічною інокуляцією).

Також варто зазначити, що грунтові умови також відіграють важливу роль у розповсюдженні вірусних хвороб: ступінь зараження значно корелює з родючістю грунту, його зволоженістю та ступенем аерації.

2.3 Вірусні хвороби рослин

Таблиця 2 (див. додаток 1) містить відомості про способи передачі, симптоматику, шкодочинність дванадцяти найпоширеніших в Україні вірусів (за даними на весну 2005р.). Нижче наведена детальна характеристика деяких з цих вірусів.

Вірус жовтої карликовості ячменю (ВЖКЯ)

Вірус жовтої карликовості ячменю належить до роду Luteoviridae. РНК лінійна (+ ланцюг). Віріони ізометричні, діаметром 25-30 нм, ліпідів та вуглеводів немає. Молекулярна маса віріону 6,5х106. Білок оболонки один. Плавуча щільність в СsСl -- 1,40г/см3. ТТІ -65-70 °С, витримує замороження в соці та відтавання. Оптимальні умови для розвитку: ї -- 1 2 °С, інтенсивність освітлення 32400^3200 люкс. Стійкий до хлороформу та бутанолу. ВЖКЯ,є сильним імуногеном.

На сьогодні відомі 6 штамів ВЖКЯ, що належать до двох підгруп, в зв'язку з різницею в будові РНК. Вірус передається попелицями персистентно, циркулює, але не розмножується в організмі комахи. Локалізується у флоемі. В комаху вірус потрапляє з соком з клітин флоеми. Після проходження заднього відділу кишечника вірус потрапляє в гемоціль, а після циркуляції в гемолімфі концентрується в слинних залозах. Після живлення комахи на рослині вірус з слиною потрапляє у флоему. ВЖКЯ передається такими попелицями, як велика злакова, черемхова, соргова або кукурудзяна, звичайна злакова, зелена персикова. Різні штами вірусу передаються різними видами попелиць.

Симптоми, що викликає ВЖКЯ, залежать від рослини-господаря, умов вирощування та штаму вірусу.

На природних господарях проявляються персистентні симптоми, що можуть варіювати в залежності від умов. На ячмені звичайному -- хлороз листків, на овесі посівному -- поява хлоротичних та червоних листків, пшениці літній, -- хлороз листків, на рисі посівному -- поява жовто-оранжевих листків, на кукурудзі звичайній -- часто симптомів дуже мало, але іноді з'являється пурпурова або малинова смугастість листків.

До експериментальних господарів відносяться рослини з багатьох родин, що при експериментальному ураженні дають симптоми хлорозу, почервоніння, призупинки росту.

До рослин-індикаторів ВЖКЯ належать: овес звичайний, ячмінь звичайний, на яких вірус викликає хлороз листків.

До безсимптомних господарів відносять: мітлицю повзучу, грястицю звичайну, пирій повзучий, кострище лучну та ін.

На ячмені перший повільний симптом жовтої карликовості ячменю -- золотисто-жовтий колір листя, уповільнення росту. Якщо були уражені сходи, листя починає жовтіти через 10-15 діб. Пожовтіння поширюється вниз, спочатку по краю листка, поступово охоплюючи усю його площу. Листки уражених рослин розташовані більш вертикально, вони товстіші та жорсткіші, ніж у здорових рослин. Хворі рослини часто не утворюють колосся, мають нерозвинену кореневу систему.

На пшениці перші ознаки хвороби -- більш темний у порівнянні з нормальним колір листя, хлороз нових листків, пригнічення росту. Коли ріст припиняється, спостерігається тільки загальний хлороз; пшениця дуже кущиться і досягає лише 1/3 -- 1/4 нормальної висоти колосся майже не має. Якщо рослини уражуються після фази кущіння, па них сильно жовтіють молоді листки, починаючи з верхівки; вони дещо відстають у рості, але мозаїчна крапчастість відсутня. Пшениця найчастіше уражується ВЖКЯ в період появи сходів. У хворих рослин озимої пшениці спостерігається плескатість зерна і пустоколосиця. Хвороба може приводити до зниження морозостійкості, підвищення сприйнятливості до хвороб, що викликаються факультативними і сапрофітними грибами. Хворі рослини сильніше заселяються злаковими попелицями.

На вівсі ознаки захворювання майже такі самі, як і на ячменю, але листя має червоний, а не жовтий колір. Крім того, суцвіття, як правило, недорозвинені повністю, або частково стерильні, білого кольору. При ураженні в більш пізні строки спостерігається лише почервоніння пізно утворених листків.

У інфікованої кукурудзи листки темно-червоні, навіть пурпурові, часто спостерігається карликовість. Деякі сорти і гібриди кукурудзи являються безсимптомними носіями вірусу. Інкубаційний період вірусу в уражених рослинах кукурудзи 8-25 діб. Жито найбільш стійке до ВЖКЯ.

Хворі рослини грястиці збірної, тонконога лучного) не мають більш-менш чітких симптомів, хоч і несуть у собі вірус. Основний резервартор -- багаторічні трави, особливо костриця лучна.

Проріджені посіви ячменю, вівса та пшениці, які висівають пізно весною або влітку, сильно уражуються ВЖКЯ, Перезимівлі вірусу, крім озимих, сприяють дикоростучі злаки. З них попелиці весною переносять збудника захворювання на ярі культури, а потім на озимі та бур'яни -- і коло замикається.

Інтенсивність дихання у хворих рослин під час ранньої інфекції вища, ніж у здорових. Через 35-69 днів після інокуляції фотосинтез і випаровування зменшуються. У хворому листі нагромаджується крохмаль і розчинні вуглеводи, зменшується вміст цукру. Вірусна інфекція впливає на обмін азоту, його кількість в листках зменшується і зростає в корінні. Шкідливість ВЖКЯ залежить від культури, її сорту та строків сівби. Експериментальне встановлено, що ВЖКЯ може знижувати урожай вівса на 19-96%, пшениці на 63-99%, ячменю на 67-80%

Вірус некротичного пожовтіння жилок буряку (ВНПЖБ)

Вірус некротичного пожовтіння жилок буряку належить до роду Benyvirus. За морфологією подовжені жорсткі палички з діаметром 20 нм, і довжиною біля 70, 100, 265, та 390 нм. ТТІ: 65-70 °С. Нуклеїнова кислота представлена чотирма молекулами плюс лінійних РНК. Білок: один поліпептид оболонки. Ліпідів і вуглеводів немає.

На буряках викликає "різоманію" -- бородоподібне розростання бічних коренів. Хворі рослини характеризуються пожовтінням листків, некротичним хлорозом жилок, обгортанням, поникненням і зупинкою росту, пов'язаними з пошкодженням коріння .

Вірус порушує обмін речовин, уповільнює ріст і розвиток рослин, а також процес цукроутворення, в результаті чого знижується

врожайність коренеплодів на 30-80% і цукристість більш ніж на 3-5%. В коренеплодах збільшується кількість калію в 2, натрію -- в 3-4 рази.

Коренева система рослин уражується переносником віруса -грибом Polymixa betae завдяки спорам, які підпливаючи до волосків корінців молодих рослин цукрового буряку, закріплюються на них і потрапляють в клітини, утворючи плазмодій. Основними резерваторами гриба являються рослини родини лободові, а також всі види буряку. Інфекційний потенціал зараженого грунту дуже великий. Вірус може зберігатися (до 18 років) в грунті з цистосорусом гриба.

Чутливими рослинами до ВНПЖБ є буряк звичайний, лобода біла, лобода мармурова, шпинат посівний.

Вирус тютюнової мозаїки (ВТМ)

Вирус тютюнової мозаїки належить до роду Tobamovirus. За морфологією жорсткі палички 300 нм довжиною та 18 нм діаметром. Мають спіральну симетрію з кроком біля 2,3 нм. Геном представлений однією одноланцюговою молекулою + РНК. Один поліпептид оболонки. Ефективні імуногени. Більшість членів групи мають помірне коло господарів. Легко передаються механічно, деякі - насінням.

Основним джерелом первинного ураження рослин ВТМ є післяжнивні рослини та їх залишки (стебла, листя, корені). В полі вірус передається соком хворих рослин під час культивації, пасинкуваня, вершкування, збирання листя та плодів. ВТМ може також переноситись різними комахами з гризучим апаратом: гусінню, кониками, слимаками тощо. Нагромаджується і зимує ВТМ в айстрах, капусті, конваліях, подорожнику, маку, хризантемах і багатьох інших багаторічних рослинах, звідки він може переноситись на однорічні рослини.

Крім мозаїки, ВТМ спричиняє на помідорах стрик, внутрішній некроз плодів, нитковидність, папоротевість листя. За деяких екологічних умов (недостатність освітлення, зниження температури, висока вологість) на помідорах з'являються більш тяжкі ураження, які призводять до відмирання ділянок тканин на стеблах та листі. Стрик поширений як в закритому, так і відкритому грунті. Втрати врожаю від хвороби досягають 40-60%. В умовах надмірного азотного живлення стрик проявляється у найбільш шкідливій формі. В останні роки у південних районах країни поширюється внутрішній некроз помідорів, що знижує врожайність до 8-20%. При ранньому ураженні рослини відстають у рості, втрати врожаю перевищують 30-40%. При більш пізньому ураженні мозаїка може бути різко вираженою, але рослини розвиваються, цвітуть і плодоносять. На стиглому листі тютюну ознаки хвороби можуть зникати, хоча рослина буде інфікована вірусом. Втрати врожаю в цих випадках становлять 10-15%..

Рослини - індикатори: тютюн звичайний, квасоля звичайна, сорт Пінто,

дурман звичайний--локальні некрози .

Циркуляція ВТМ: взимку -- зберігання в грунті, воді, багаторічних рослинах (подорожник, мак), рослинних залишках, однорічних бур'янах (лобода, дурман), незбираному гарбузинні, коренеплодах буряків, навесні -- механічна передача при обробці грунту, неспецифічна механічна передача комахами з гризучим апаратом передача між рослинами. Влітку -- період найбільшого розмноження, пов'язаний з температурою, вологістю та збільшенням біомаси рослин (картопля, томати, тютюн, перець), співіснування сільськогосподарських рослин та бур'янів, восени--розповсюдження переважно серед бур'янів

вірус фітовірус рослина хвороба

3. Моніторинг вірусних хвороб рослин

Моніторинг рівня інфекційних одиниць в першу чергу робиться шляхом оцінки титру патогенну в рослинах-господарях, або шляхом моніторингу популяцій відомих переносників та визначення частки популяцій переносника, що несе патоген рослин.

На сьогодні існують декілька способів ідентифікації збудників вірусної природи у зразках:

· імунохімічні методи--полягають у виявленні та візуалізації реакції антиген-анитіло, для чого використовують різноманітні імуноагрегати(радіоізотопи, флуоресцентні фарби, ферменти, які за умов реакції зберігають свою активність та специфічність). Найбільш вживаними з таких реакції є метод імунофлуоресценції за участю флюорохрому, ковалентно приєднаному до очищених противірусних антитіл (модифікація--DELIFIA, що вик. в медицині для аналізу білків, гормонів та ін.); „метод молекулярних бєконів” (на базі флуоресцентних антанідних ДНК-зондів)--для визначення вірусних антигенів; Використання як мітки колоїдного золота--для локалізації антигенів. ІФА(імуноферментний аналіз), чутливість якого на 2-3 порядки вище, ніж інших серологічних методів та ін.

· молекулярно-генетичні методи--використання клонованих ДНК-зондів для визначення нуклеїнової кислоти вірусу. Найуживаніші: полімеразна ланцюгова реакція(ПЛР), в основі якої лежить багатократне реплікування(амфіплікація) специфічної ділянки нуклеотидної послідовності, що приводить до збільшення чутливості системи до детекції (за рахунок реплікування реагентів); Лігазна ланцюгова реакція (ЛЛР), що значно швидша за ПЛР--у кожному циклі відбувається. подвоєння лігованих молекул, але цикли значно коротші і вик. дві пари нуклеотидів. Існує дві техніки амфіплікації: сигнальна (збільшення сигнал-генеруючої здатності систем) і цільова (збільшення кількості цілей--молекул вірусної нуклеїнової кислоти)

· візуалізація віріонів за допомогою атомно-силової мікроскопії--найкраще підходить для вивчення біології макромолекул та надмолекулярних структур: загострений до атомних розмірів осколок алмазу(зонд) переміщується над зразком, отже відтворюються контури сил відштовхування, що дозволяє малювати топографічні особливості поверхні на атомарному рівні. Застосування фазового зсуву дає можливість дізнатися про щільність об'єкту. АСМ дає зображення в об'ємі, що дає змогу більш точно будувати моделі віріонів.

· методи спектральної діагностики--дає змогу діагностувати Фітовіруси дистанційно, базовою ідеєю є те, що рослини поглинають і відбивають падаючу радіацію, і коефіцієнт поглинання здорових рослин відрізняється від того ж коефіцієнту у хворих (наприклад, область, у межах якої рослини інфіковані ВТМ можна діагностувати за зменшенням інтенсивності зеленого забарвлення листків у видимому діапазоні). Діагностику проводять здебільшого на трьох рівнях: на висоті 1.5--2 м.(звичайна фотографія), 75--100м.(повітряна фотографія з вертольоту), супутникова сенсорика (за допомогою супутника).Автори зазначають, що даний метод може бути використаний лише як метод попередньої діагностики і, як правило, потребує застосування інших, більш локальних, методів.