Методы исследования клетки

Размещено на http://www.allbest.ru/

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТКИ

1. Световая микроскопия

микроскопия цитология клетка авторадиография

Современная цитология располагает многочисленными и разнообразными методами исследования, без которых было бы невозможно накопление и совершенствование знаний о строении и функциях клеток. В настоящей главе мы познакомимся лишь с основными, наиболее важными методами исследования.

Современный световой микроскоп представляет весьма совершенный прибор, который до сих пор имеет первостепенное значение в изучении клеток и их органоидов. С помощью светового микроскопа достигается увеличение в 2000-2500 раз. Увеличение микроскопа зависит от его разрешающей способности, т. е. наименьшего расстояния между двумя точками, которые видны раздельно.

Чем меньше частица, видимая в микроскоп, тем больше его разрешающая способность. Последняя, в свою очередь, определяется апертурой объектива (апертура - действующее отверстие оптической системы, определяемое размерами линз или диафрагмами) и длиной волны света.

Определение разрешающей способности микроскопа производится по формуле: а = 0,6 ,где а -- минимальное расстояние между двумя точками; -- длина волны света; п -- показатель преломления среды, находящейся между препаратом и первой, т. е. фронтальной, линзой объектива; a -- угол между оптической осью объектива и наиболее сильно отклоняющимся лучом, попадающим в объектив, или угол дифракции лучей.

Величина, указанная в знаменателе дроби (n sin a), постоянна для каждого объектива и называется его численной апертурой. Численная апертура, а также увеличение гравируются на оправе объектива. Соотношение между численной апертурой и минимальным разрешаемым расстоянием таково: чем больше численная апертура, тем меньше это расстояние, т. е. тем выше разрешение микроскопа.

Повышение разрешающей способности микроскопа, совершенно необходимое для исследования деталей строения клетки, достигается двумя путями:

1) увеличением численной апертуры объектива;

2) уменьшением длины волны света, которым освещается препарат.

С целью увеличения численной апертуры применяются иммерсионные объективы. В качестве жидкостей служат: вода (я=1,33), глицерин (я=1,45), кедровое масло (/1=1,51) по сравнению с п воздуха, равным 1.

Поскольку показатель преломления иммерсионных жидкостей больше 1, то численная апертура объектива повышается и в него могут попадать лучи, составляющие с оптической осью объектива больший угол, чем в том случае, когда между фронтальной линзой объектива и препаратом находится воздух.

Второй путь увеличения разрешающей способности микроскопа заключается в применении ультрафиолетовых лучей, длина волны которых меньше длины волны лучей видимого света.

Однако разрешающая способность микроскопа может быть повышена только до определенного предела, ограниченного длиной световых волн. Наименьшие частицы, которые хорошо видны в современный световой микроскоп, должны иметь величину больше '/з длины волны света. Это значит, что при использовании видимой части дневного света с длиной волны от 0,004 до 0,0007 мм в микроскоп будут видны частицы не меньше 0,0002-0,0003 мм. Следовательно, с помощью современных микроскопов удается рассмотреть те детали строения клетки, которые имеют величину не меньше 0,2-0,3 мк.

В настоящее время создано много разнообразных моделей световых микроскопов. Они обеспечивают возможность многостороннего исследования клеточных структур и их функции.

Биологический микроскоп. Биологический микроскоп (МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБР и др.) предназначен для изучения препаратов, освещаемых проходящим светом. Именно этот тип микроскопа наиболее широко распространен для изучения строения клеток и других объектов.

Однако с помощью биологического микроскопа удается детально изучить главным образом фиксированные и окрашенные препараты клеток. Большинство живых неокрашенных клеток в проходящем свете бесцветны и прозрачны (они не поглощают света), п их не удается рассмотреть подробно.

Фазовоконтрастная микроскопия. Контрастное изображение препаратов живых клеток, почти невидимых при наблюдении их в биологическом микроскопе, дает фазовоконтрастное устройство).

Метод фазового контраста основан на том, что отдельные участки прозрачного препарата отличаются от окружающей среды по показателю преломления. Поэтому проходящий через них свет распространяется с различной скоростью, т. е. испытывает смещение фаз, что выражается в изменении яркости. Фазовые изменения световых волн превращаются в световые колебания разной амплитуды, и получается воспринимаемое глазом контрастное изображение препарата, в котором распределение освещённостей соответствует распределяет широкие возможности в изучении живых клеток, их органоидов и включений в неповрежденном состоянии. Это обстоятельство играет важную роль, так как фиксация и окраска клеток, как правило, повреждает клеточные структуры.

Фазовоконтрастное устройство к биологическому микроскопу состоит из набора фазовых объективов, отличающихся от обычных наличием кольцеобразной фазовой пластинки, конденсора с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа, который увеличивает изображение кольцевой диафрагмы н фазовой пластинки при их совмещении.

Интерференционная микроскопия. Метод интерференционного контраста близок к методу фазовоконтрастной микроскопии и дает возможность получать контрастные изображения неокрашенных прозрачных живых клеток, а также вычислить сухой вес клеток. Специальный интерференционный микроскоп, применяемый для этих целей, устроен так, что пучок параллельных световых лучей, идущих от источника света, разделяется на две параллельные ветви -- верхнюю и нижнюю.

Нижняя ветвь проходит через препарат, и фаза ее светового колебания изменяется, а верхняя волна остается неизменной. За препаратом, т.е. в призмах объектива, обе ветви вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции участки препарата, обладающие различной толщиной или неодинаковыми показателями преломления, окрашиваются в разные цвета и становятся контрастными и хорошо видимыми.

Флуоресцентная микроскопия. Подобно методу фазового контраста флуоресцентная (или люминесцентная) микроскопия дает возможность изучать живую клетку. Флуоресценцией называется свечение объекта, возбуждаемое поглощенной им световой энергией. Возбуждать флуоресценцию можно ультрафиолетовыми, а также синими н фиолетовыми лучами.

Целый ряд структур и веществ, содержащихся в клетках, обладает собственной (или первичной) флуоресценцией. Например, зеленый пигмент хлорофилл, содержащийся в хлоропластах растительных клеток, обладает характерной ярко-красной флуоресценцией. Довольно яркое свечение дают витамины А и B, некоторые пигменты бактериальных клеток; это позволяет распознавать отдельные виды бактерий.

Однако большинство веществ, содержащихся в клетках, не обладает собственной флуоресценцией. Такие вещества начинают светиться, обнаруживая разнообразную окраску, только после предварительной обработки люминесцентными красителями (вторичная флуоресценция). Эти красители носят название флуорохромов, К ним относятся флуоресцеин, акридин оранжевый, берберин-сульфат, флоксин и др. Флуорохромы обычно применяются в очень слабых концентрациях (например, 1:10000, 1:100000) и не повреждают живую клетку. Многие из флуорохромов избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры и вещества в определенный свет. Так, акридин оранжевый при определенных условиях окрашивает дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в зеленый, а рибонуклеиновую кислоту (РНК) в оранжевый цвета. Поэтому вторичная флуоресценция с акридином оранжевым сейчас один из важных методов изучения локализации нуклеиновых кислот в клетках различных организмов.

Кроме того, применение флуорохромов дает возможность получить контрастные, удобные для наблюдения препараты, на которых легко можно найти нужные структуры, распознать клетки бактерий и сосчитать их. Метод флуоресцентной микроскопии позволяет также изучить изменения клеток и отдельных внутриклеточных структур при разных функциональных состояниях, дает возможность различать живые и мертвые клетки.

При использовании в качестве источника флуоресценции синих и фиолетовых лучей света аппаратура состоит из обычного биологического микроскопа, низковольтной лампы (для микроскопа) е синим светофильтром, который пропускает лучи, возбуждающие флуоресценцию, и желтого светофильтра, убирающего излишние синие лучи. Применение же ультрафиолетовых лучей как источника флуоресценции требует специального флуоресцентного микроскопа с оптикой из кварца, пропускающего ультрафиолетовые лучи.

Поляризационная микроскопия. В основе метода поляризационной микроскопии лежит способность различных компонентов клеток и тканей к преломлению поляризованного света. Некоторые клеточные структуры, например нити веретена деления, миофибриллы, реснички мерцательного эпителия и др., характеризуются определенной ориентацией молекул и обладают свойством двойного лучепреломления. Это так называемые анизотропные структуры.

Исследование анизотропных структур производится с помощью поляризационного микроскопа. От обычного биологического микроскопа он отличается тем, что перед конденсором помещается поляризатор, а за препаратом и объективом помещены компенсатор и анализатор, позволяющие детально исследовать двойное лучепреломление в рассматриваемом объекте. При этом в клетках обычно наблюдаются светлые или окрашенные структуры, вид которых зависит от положения препарата по отношению к плоскости поляризации и от величины двойного лучепреломления.

Поляризационный микроскоп дает возможность определить ориентировку частиц в клетках и других структурах, четко видеть структуры с двойным лучепреломлением, а при соответствующей обработке препаратов можно сделать наблюдения над молекулярной организацией той или иной части клетки.

Микроскопия в темном поле. Изучение препаратов в темном ноле осуществляется с помощью особого конденсора. От обычного конденсора светлого поля темнопольный конденсор отличается тем, что пропускает только очень косые краевые лучи источника света. Поскольку краевые лучи имеют сильный наклон, они не попадают в объектив, и поле зрения микроскопа оказывается темным, а объект, освещенный рассеянным светом, кажется светлым.

На препаратах клеток обычно содержатся структуры разной оптической плотности. На общем темном фоне эти структуры четко видны благодаря их различному свечению, а светятся Они потому, что рассеивают попадающие на них лучи света (эффект Тиндаля).

В темном поле можно наблюдать разнообразные живые клетки.

Ультрафиолетовая микроскопия. Ультрафиолетовые (УФ) лучи глазом человека не воспринимаются, в силу чего непосредственное изучение клеток и их структур в них невозможно. Для целей исследования препаратов клеток в УФ лучах Е.М. Брумберг (1939) сконструировал оригинальный ультрафиолетовый микроскоп МУФ-1, и в настоящее время имеется несколько моделей этого микроскопа. Метод Е.М. Брумберга основан на том, что многие вещества, входящие в состав клеток, имеют характерные спектры поглощения УФ лучей.

При исследовании различных веществ в живых или фиксированных неокрашенных клетках и тканях в таком микроскопе препарат фотографируется трижды (на одной и той же пластинке) в лучах трех различных зон УФ спектра.

Для фотографирования длины УФ волн подбираются так, чтобы в каждой зоне находилась полоса поглощения какого-либо одного вещества, не поглощающего лучи в двух других зонах. Поэтому вещества, которые видны на фотографиях, оказываются разными на всех снимках.

Затем полученные снимки помещают в особый прибор, называемый хромоскопом. Один снимок рассматривают в синих, второй - в зеленых, а третий - в красных лучах.

Получаются три цветных изображения, которые в хромоскопе сводятся в одно, и на этом конечном изображении объекта различные вещества клетки оказываются окрашенными в разные цвета.

Но ультрафиолетовый микроскоп позволяет, не только фотографировать, а и производить визуальные наблюдения над тканями и клетками, для чего в нем имеется специальный флуоресцирующий экран.

С помощью этого микроскопа удаётся рассмотреть частички несколько меньших размеров, чем в обычный биологический микроскоп, благодаря тому что УФ лучи обладают значительно более короткой длиной волны, чем обычные световые лучи.

Поэтому разрешающая способность УФ микроскопа равна 0,11 мк, в то время как разрешающая способность биологического микроскопа при использовании обычного освещения равна 0,2-0,3 мк.

При помощи ультрафиолетового микроскопа проводится количественное определение поглощения УФ лучей нуклеиновыми кислотами и другими веществами, содержащимися в клетках, т. е. определяется количество этих веществ в одной клетке.

Микрофотографирование. Микрофотографирование разнообразных микроскопических препаратов проводят для того, чтобы получить их увеличенное изображение -- микрофотографию. На микрофотографиях удобно изучать отдельные структуры клеток и других объектов; микрофотографии представляют документы, очень точно отражающие все детали строения микроскопического препарата.

Фотографирование микроскопических препаратов производится с помощью специальных микрофотоустановок или микрофотонасадочных камер. Последние получили широкое распространение и пригодны для микрофотографирования с биологическим и любым другим микроскопом. Микрофотонасадочная камера -- это фотоаппарат, у которого объектив удален и заменен микроскопом.

Оптическая система микроскопа выполняет роль объектива этого фотоаппарата. Имеется несколько типов микрофотонасадок. Очень удобны из них микрофотонасадки типа МФН-8.

Существует также и специальный биологический микроскоп МБИ-6 с постоянной фотокамерой. МБИ-6 позволяет производить обычное визуальное исследование препаратов и их фотографирование в проходящем и отраженном свете, в светлом и темном полях зрения, с фазовым контрастом и в поляризованном свете.

Большую роль в изучении процессов жизнедеятельности клетки играет микрокиносъемка. Для исследования деталей важнейших процессов, протекающих в клетке, таких, как деление, фагоцитоз, течения цитоплазмы и др., применяют цейтраферное устройство.

С помощью этого устройства можно производить либо ускоренную съемку, применяемую обычно при быстро протекающих процессах, либо замедленную съемку тех изменений в клетке, для которых характерно медленное течение.

Микрокиносъемка представляет собой не только метод, позволяющий детально исследовать разнообразные структуры и процессы в живой клетке, но и метод документации этих процессов и всех тех изменений, которые с ними связаны.

2. Электронная микроскопия

С изобретением электронного микроскопа (1933) началась новая эпоха в изучении строения клетки. Современный электронный микроскоп имеет разрешающую способность до 4 А, и с его помощью удалось рассмотреть много новых важных органоидов клетки, которые при изучении в световом микроскопе казались просто бесструктурными участками.

Основное отличие электронного микроскопа от светового заключается в том, что в нем вместо света используется быстрый поток электронов, а стеклянные линзы заменены электромагнитными полями.

Схема движения электронов в электронном микроскопе изображена на рисунке. Источником электронов, т. е. катодом, служит вольфрамовая нить, нагреваемая электрическим током до раскаленного состояния. Пучок электронов, вылетающих из раскаленной вольфрамовой нити, направляется к аноду. Движение электронов от катода к аноду осуществляется под ускоряющим воздействием разности потенциалов.

В центре анода имеется небольшое отверстие. Сквозь него проходят электроны, и пучок их фокусируется магнитной катушкой, играющей роль конденсорной линзы, которая направляет его на объект.

Когда пучок электронов уже прошел через объект, изображение его увеличивается с помощью второй магнитной катушки, которая действует, как линза объектива; затем пучок электронов проходит через третью магнитную катушку, действующую в качестве окуляра или проекционной линзы и увеличивающую уже полученное изображение объекта.

Окончательное изображение объекта можно наблюдать глазом на специальном флуоресцирующем экране или же фотографировать.

Для электронномикроскопического исследования пригодны только препараты фиксированных клеток, подвергнутых очень сложной предварительной обработке. Живые клетки с помощью электронного микроскопа пока еще не исследуются. Причина этого заключается в том, что свободное движение электронов в микроскопе достигается только в достаточно высоком вакууме, а живые клетки, содержащие значительное количество воды, сильно повреждаются при помещении их в вакуум. Кроме того, живые клетки повреждаются и при облучении интенсивным потоком электронов.

Электронный микроскоп особенно широко стал применяться для биологических исследований в последние 10-15 лет и неизмеримо расширил возможности изучения тончайших деталей строения клетки.

3. Методы исследования живых клеток

Микроскопическое исследование живых клеток и тканей широко применяется в цитологии для самых различных целей, например: для изучения изменений, происходящих в клетках при разнообразных внешних воздействиях, для выяснения закономерностей обмена веществ в клетках, для изучения клеточных структур, токов цитоплазмы, клеточной проницаемости.

Приготовление препаратов живых клеток. Наблюдения над живыми клетками требуют прежде всего приготовления специальных препаратов. Мелкие организмы, такие, как одноклеточные водоросли, простейшие, бактерии переносятся вместе с каплей среды, в которой они культивируются, на предметное стекло.

Препарат покрывается покровным стеклом, и его можно исследовать под микроскопом. Живые клетки из тканей многоклеточных организмов исследовать труднее, так как для приготовления препаратов эти клетки нужно отделить от ткани, что связано с нанесением им каких-то повреждений. Выделение клеток, а также наблюдения над ними необходимо производить в средах, пригодных для более или менее продолжительного переживания их и разных для различных организмов. Так, клетки растений обычно исследуются в воде, а клетки разнообразных холоднокровных и теплокровных животных исследуются в физиологическом растворе, в растворе Рингера соответствующего состава и в других солевых эквилибрированных растворах.

Рассматривать под микроскопом можно неокрашенные препараты причем, как уже указывалось выше, структуры неокрашенных живых клеток наиболее четко удается видеть с применением темного поля, флуоресцентного микроскопа и т. д.

Методы прижизненной окраски. Прижизненные красители -- это органические соединения ароматического ряда, обладающие относительно небольшой токсичностью для живых клеток. Различаются основные и кислые красители. Проникая в клетку, они соединяются главным образом с белками, и вначале вся цитоплазма приобретает диффузную окраску, после чего некоторые красители откладываются в цитоплазме в форме гранул.

Из кислых красителей наиболее часто используется трипановый синий (0,5-процентный раствор) и литиевый кармин в виде 20-процентного раствора, который к исследуемым препаратам добавляется по капле. Из основных красителей чаще всего употребляется нейтральный красный в разведении 1 : 200000 или более крепкий раствор -- 1 : 50 000; метиленовый синий в растворах 1 : 1.000 или 1: 10000.

При работе с любым из витальных красителей следует учесть, что краситель нужно растворять только в той среде, в которой могут переживать клетки исследуемого организма. Время для окрашивания препаратов сильно варьирует, но для большинства витальных красителей оно равно от 15 до 60 мин.

Прижизненная окраска позволяет выявлять многие структуры клеток. Особенно хорошие результаты в этом отношении дает применение витальных красителей в качестве флуорохромов. Окраска живых клеток дает возможность выявлять изменения, происходящие в клетках и тканях при разных внешних воздействиях. В последнем случае чрезвычайно важно то, что количество красителя, поглощенного неповрежденными и поврежденными путем какого-либо воздействия клетками (например, высокой температурой), можно точно определить и выразить количественно. Разница в количестве красителя, поглощенного неповрежденными и поврежденными клетками, свидетельствует о характере и степени изменений, возникающих под влиянием различных внешних воздействий.

Следует указать и еще один вид окраски клеток -- 1-процентным водным раствором эозина. Этот метод окраски дает возможность отличать живые клетки от мертвых. Эозин быстро окрашивает в розовый цвет только мертвые клетки, и сама окраска их получается диффузной; живые клетки такой раствор эозина не окрашивает.

Методы микрургии (микрохирургия). Экспериментальные методы, и в первую очередь разнообразные операции на клетках (микрооперации), стали применяться цитологами уже во второй половине прошлого столетия. Первые микрооперации проводились на сравнительно крупных объектах, например на развивающихся клетках различных животных, без использования каких-либо специальных приспособлений и при небольших увеличениях лупы или препаровального микроскопа. Микрооперации на крупных клетках и до сих пор проводятся вручную без каких-либо сложных приборов.

Примерами таких микроопераций могут служить разрушение и отделение бластомеров в процессе развития зародыша, разнообразные операции на одноклеточной водоросли Acetabularia и инфузории Stentor, у которых благодаря крупным размерам клеток проводится вручную даже пересадка ядер.



Рисунок 1 - Эпителиальные клетки роговицы, окрашенные нейтральным красным: а - граиулообразование; б - повреждение клетки (протоплазма прокрашена; отчетливо видно структурированное ядро).

Микрооперации на отдельных клетках мелких размеров стали проводить только в начале нашего столетия, когда был сконструирован прибор, называемый микроманипулятором.

В настоящее время имеется несколько моделей микроманипуляторов. Одна из них изображена на рисунке. Микроманипуляторы позволяют проводить очень тонкие операции над клеткой и ее органоидами.

Для этих операций требуются большие увеличения микроскопа и специальные микроинструменты, которые чаще всего изготовляются самим экспериментатором из тонких стеклянных нитей или палочек.

Примерами основных микроопераций на клетке могут служить следующие: разрезание клеток простейших и многоклеточных организмов на части с целью изучения роли этих частей в процессе жизнедеятельности клетки; уколы, разрушение, а также удаление отдельных частей клетки для выяснения вопроса об их физиологической роли; извлечение частей клетки для последующего ультрахимического анализа; введение в клетку витальных красителей с целью детального исследования процесса окраски, а также для определения клеточного рН; введение в клетку мельчайших кусочков никеля или железа для определения вязкости цитоплазмы по скорости движения этих кусочков при центрифугировании клеток; введение в клетки различных фармакологических препаратов.

Методы микрургии широко применяются и для выделения тканевых клеток или одноклеточных организмов при переносе их в новую культуральную среду или в организм животного, что особенно важно для получения клонов. Наконец, к числу сложных микрургических операций, которые начали применяться сравнительно недавно, относится извлечение и трансплантация ядер, ядрышек и других органоидов клетки. Для этих операций пригодны главным образом крупные клетки простейших и других одноклеточных организмов, а также и крупные клетки некоторых многоклеточных животных, например амфибий. Так осуществляется перемещение ядра из одной амебы в другую, перемещение макронуклеуса инфузорий (Stentor, Euplotes) из одной особи в другую.

Операции по пересадке ядер дают возможность изучить роль ядра и цитоплазмы в жизни клеток, изучить изменения, происходящие в безъядерных клетках, выяснить участие ядра и цитоплазмы в передаче по наследству тех или иных признаков.

Методы культивирования клеток и тканей. В условиях лаборатории можно культивировать самые разнообразные клетки одноклеточных и многоклеточных организмов, что совершенно необходимо для решения целого ряда цитологических проблем.

Культивирование клеток и тканей вне организма (in vitro) связано с соблюдением определенных условий, необходимых для роста и развития этих культур. Прежде всего требуется подходящая для каждого вида культур посуда. Так, культуры бактерий и простейших обычно содержатся в пробирках, чашках Петри и Коха, в стеклянных флаконах, микроаквариумах. Предметные стекла с углублениями (лунками), чашки и флаконы Карреля используются Для культур тканей многоклеточных организмов. Выращивание культур производится на минеральных и питательных средах, состав которых различен для отдельных видов бактерий, простейших, а также для клеток и тканей многоклеточных животных и растений. Культуры бактерий успешно растут в жидких, в полужидких и на плотных питательных средах. Большое разнообразие культуральных сред известно и для простейших. Например, инфузория-туфелька -- обычный объект для многих цитологических работ -- хорошо культивируется на сенном настое, настое салата, на минеральной среде Л.К. Лозина-Лозинского с постоянной подкормкой бактериями и дрожжами. Культуры амеб (Amoeba proteus) выращиваются на минеральной среде Прескотта с кормлением их мелкими инфузориями тетрахименами, а для культур разнообразных паразитических простейших существует много видов специальных сред, часто имеющих сложный состав.

Сложность состава характеризуется и большинство сред, используемых для выращивания тканевых культур. Например, синтетическая среда 199, наиболее широко применяемая сейчас для культивирования самых различных тканей, содержит свыше 60 компонентой (аминокислоты, витамины, источники липидов, компоненты нуклеиновых кислот и прочие вещества).

Культуры бактерий, простейших и тканевые культуры выращиваются при определенной температуре. Если кусочки тканей взяты от теплокровных животных, то тканевые культуры содержатся при 37° С. При этой же температуре культивируются многочисленные виды бактерий и паразитических простейших, живущих в организме человека и теплокровных животных. Свободноживущие простейшие, паразитические простейшие из холоднокровных животных, а также клетки растений можно успешно выращивать при комнатной температуре.

Вся посуда, инструменты, все минеральные и питательные среды, используемые для культур, должны быть стерильными. Загрязнение культур какими-либо посторонними частицами и бактериями из воды, воздуха и т. п. совершенно недопустимо В относительно нестерильных условиях содержатся только культуры свободноживущих простейших. Однако в последнее время получен ряд культур инфузорий и жгутиконосцев, которые носят название безбактериальных и требуют не меньших условий стерильности, чем тканевые культуры.

Еще одно необходимое условие для поддержания любой культуры -- это регулярные пересевы на свежую питательную среду. При условиях регулярных пересевов культуры бактерий, простейших и тканевые культуры могут существовать в течение многих лет.

Целый ряд цитологических исследований необходимо проводить на генетически однородном материале. С целью получения таких генетически однородных культур широко используется выведение клонов (клоновые культуры), представляющих потомство одной особи бактерий, простейших пли одной клетки какой-либо ткани.

Методы культивирования бактерий и простейших относительно просты; наибольшей сложностью характеризуются методы культивирования тканей. Среди них различаются культуры кусочков органов, кусочков тканей и отдельных клеток, выделенных из многоклеточного организма. Методика культивирования кусочков тканей разнообразна, но наиболее широко распространено культивирование в висячей капле и в чашке или флаконе Карреля.

В последнее время хорошо разработаны методы получения однослойных клеточных культур. Для таких культур небольшое количество клеток, полученных путем специальной обработки кусочков тканей, переносят в сосуды для культивирования и добавляют туда питательную среду. Клетки через небольшой промежуток времени прикрепляются к дну и стенкам сосуда, а затем начинают интенсивно размножаться, располагаясь в один слой. К настоящему времени получено несколько десятков клеточных штаммов, ведущих свое начало от разных тканей: соединительной, эпителиальной и др. Культуры таких клеток обладают определенными свойствами, сохраняющимися на протяжении многих клеточных поколений. Клетки из этих однослойных культур хорошо изучены, для них разработаны стандартные условия культивирования, и они представляют очень ценный материал при изучении клеточного обмена, потребностей клеток в тех или иных веществах, для исследований клеточных ядер, для прижизненных наблюдений и т. д.

Методы исследования биоэлектрических явлений в клетке. Биоэлектрические потенциалы или электрические напряжения в тканях и клетках животных и растений могут быть измерены и засняты на движущуюся фотопленку. Для отведения биоэлектрических потенциалов из клетки пользуются двумя методами:

1) внутриклеточное отведение с помощью микроэлектродов;

2) внеклеточное отведение с использованием наружных электродов. Рассмотрим кратко оба эти метода.

Микроэлектроды, которые используются для внутриклеточного отведения электрических потенциалов,-- это микропипетки из стекла, заполненные раствором соли -- электролитом (2,5-3 М КCI). Кончик микроэлектрода, вводящийся в клетку, очень тонкий; его диаметр меньше 1 мк. Микроэлектроды вводятся в клетку при помощи микроманипулятора. Противоположный конец микроэлектрода соединяется со стеклянной трубочкой, заполненной агар-агаром желеобразной консистенции (агар-агар приготовлен на растворе Рингера). Стеклянная трубочка, в свою очередь, соединяется с неполяризующимся хлорсеребряным или каломельным электродом, а последний -- с регистрирующим устройством. Второй электрод (наружный) помещается во внешнюю среду, которая окружает клетку. Это стеклянная трубочка, заполненная солевым раствором. Она соединяется одним концом с неполяризующимся электродом, а последний -- с регистрирующим устройством.

Для внеклеточного отведения биопотенциалов к наружной поверхности клеток прикладываются два электрода. Это либо стеклянные трубочки, наполненные раствором Рингера, либо металлические проволочки (серебряные или платиновые). Они соединяются с неполяризующимися хлорсеребряными или каломельными электродами, а они, в свою очередь, с регистрирующим устройством.

Измерение биоэлектрических потенциалов можно производить как на клетках различных тканей многоклеточных организмов, так и на клетках простейших. Метод внутриклеточного отведения с применением микроэлектродов используется главным образом для регистрации разницы потенциалов, которая существует между клеткой и окружающей средой (потенциалы покоя). Внеклеточное отведение позволяет также регистрировать потенциалы, возникающие при повреждении и возбуждении (потенциалы повреждения и возбуждения). В целом же регистрация электрических процессов в клетках, тканях и органах -- важный метод характеристики их функционального состояния.

Методы исследования физико-химических свойств клетки:

1. О вязкости клеточного содержимого, которое дает представление об агрегатном состоянии цитоплазмы и ядра, можно судить по скорости падения зерен крахмала в цитоплазме некоторых растительных клеток, по скорости перемещения ядрышка под влиянием силы тяжести, по скорости перемещения капельки масла, введенной в нервное или мышечное волокно, по скорости перемещения металлической частицы, введенной в клетку в магнитном поле, и по броуновскому движению, обычно наблюдаемому во многих растительных и животных клетках.

2. Измерение удельного веса клетки осуществляется путем подбора жидкости, не оказывающей токсического действия и с удельным весом, равным таковому клетки. Для этой цели пригодны, например, растворы гуммиарабика различной концентрации. Клетки помещаются в такую жидкость и центрифугируются. Удельный вес клеток и жидкости совпадает тогда, когда клетки не перемещаются при центрифугировании в этой жидкости. Таким же способом измеряется удельный вес изолированных ядер и органоидов клетки.

3. Определение показателя преломления клеток производится путем погружения клеток в индифферентные жидкости, обладающие разными показателями преломления. Когда показатели преломления клеток и среды совпадают, контуры клетки становятся невидимыми при наблюдении в фазово-контрастный микроскоп. Второй метод измерения показателя преломления основан на наблюдении клеток в интерференционном микроскопе. При этом по специальным формулам вычисляется отставание по фазе световой волны, прошедшей через клетку, по сравнению со световой волной, прошедшей вне клетки.

4. Определение внутриклеточного рН можно произвести путем прижизненного окрашивания клеток красителями, обладающими свойствами индикаторов (нейтральный красный, бромкрезиловый синий). В крупных клетках, например в гигантском нервном волокне, мышечном волокне, в крупных растительных клетках, рН определяется электрометрическим методом с применением микроэлектродов.

К этой же группе методов относится измерение электрического заряда поверхности клетки, измерение поверхностного натяжения и изоэлектрической точки клеток и др. Важно, чтобы определение всех перечисленных физико-химических свойств проводилось на живых, неповрежденных клетках.

4. Методы получения изолированных клеточных структур

Изучение биохимических свойств и химического состава клетки осуществляется разнообразными методами, среди которых за последние 10-15 лет широкое распространение получил метол изолированных клеточных структур.

Выделение из клеток ядер, ядрышек, митохондрий и других структурных образований производится путем последовательного (или дифференциального) центрифугирования.

Современные центрифуги -- это приборы, обладающие большой мощностью, способные развивать огромную скорость вращения (например, 60000 оборотов в минуту), необходимую для разделения клеток на отдельные фракции, в каждой из которых находятся определенные клеточные структуры.

Перед центрифугированием клетки подвергаются измельчению до такой степени, чтобы получилась однородная масса -- гомогенат. Получают гомогенат в специальном приборе -- гомогенизаторе. Наиболее распространенный гомогенизатор изображен на рисунке а. Ткани и клетки измельчаются в растворе сахарозы, чаще всего 0,25М, который не повреждает клеток. Процесс измельчения -- гомогенизация проводится при температуре 0-4° С.

Полученный гомогенат подвергается последовательному центрифугированию для того, чтобы разделить его на отдельные фракции.

В основе разделения клеточных структур на отдельные фракции лежит различие в удельном весе этих структур.

Каждая фракция состоит из более или менее однородных структур клеток (6). При относительно небольшой скорости центрифугирования осаждаются ядра, т. е. выделяется фракция ядер, обладающих среди клеточных структур наибольшим удельным весом. Над ядрами располагается более легкая по удельному весу фракция митохондрий, над ними -- еще более легкие по своему удельному весу фракции лизосом, микросом и т. д. В жидкости, которая находится над осадком, остаются только растворимые компоненты клетки, содержащиеся в клеточном соке.

Отдельные клеточные структуры, полученные путем центрифугирования, дальше подвергаются детальному исследованию. Определяются их биохимические свойства, изучаются белки, нуклеиновые кислоты, ферменты и другие вещества, входящие в состав ядер, цитоплазмы и различных органоидов клетки.

5. Методы микрохимического и ультрамикрохимического изучения клетки

К микрохимическим относятся те методы, с помощью которых производится определение от 10 до 0,01 мг вещества. Эти методы широко используются в цитологии для определения содержания в клетках белков, фосфора, аминокислот, нуклеиновых кислот, сахаров и т. д. По характеру своему, по аппаратуре, которая используется для определения веществ, микрохимические методы не отличаются от обычных биохимических методов.

Но для целого ряда цитологических исследований совершенно необходимо определение очень малых количеств веществ в отдельных клетках или в отдельных частях клетки. В таких случаях применяются ультрамикрохимические методы, позволяющие проводить определение химических веществ в очень маленьком количестве материала, например в кусочках ткани, весящих 100-500 мкг, или в очень малых объемах растворов. Применение ультрахимических методов связано с использованием специальной аппаратуры, например: весов для взвешивания исключительно малых количеств вещества, капиллярных пипеток, ультрамик-робюреток и т. д. С помощью ультрамикрохимических методов можно определить содержание в клетке веществ порядка 10-10 - Ю-12 г.

6. Метод рентгеноструктурного анализа

Метод рентгеноструктурного анализа основан на явлении дифракции рентгеновских лучей. Он применяется для изучения строения молекул белков, нуклеиновых кислот и других веществ, входящих в состав цитоплазмы и ядра клеток. Метод дает возможность определить пространственное расположение молекул, точно измерить расстояние между ними и изучить внутримолекулярную структуру.

Методы исследования фиксированных клеток. В решении многочисленных цитологических проблем исследование живых клеток имеет исключительно важное значение, но, к сожалению, те методы прижизненного изучения, которыми сейчас располагает цитология, не могут еще дать исчерпывающей картины строения клеток и тканей. Поэтому до сих пор фиксированные препараты чрезвычайно широко используются в цитологии.

Следует признать, что структура клетки выявляется особенно отчетливо только на фиксированных препаратах, и исследования по морфологии, цитохимии и авторадиографии клеток с помощью как светового, так и электронного микроскопа проводить без таких препаратов пока невозможно.

Фиксация. Фиксация представляет собой начальный и чрезвычайно важный этап в изготовлении любого фиксированного препарата. Фиксаторы, быстро проникая в клетку, должны убить ее, не вызывая грубых изменений в клеточных структурах. Фиксаторы по возможности должны переводить все вещества, входящие в состав клетки, в нерастворимую форму, что очень важно для последующей обработки препарата (промывка в воде, проводка через спирты и т. д.).

Однако фиксация и последующая обработка вызывают в клетках и тканях целый ряд нежелательных изменений. Чаще всего наблюдается сморщивание и уменьшение объема, но иногда может происходить и набухание, сопровождающееся некоторым увеличением объема клеток. Нередко под влиянием фиксатора в цитоплазме и ядре образуются мелкие и крупные вакуоли, иногда фиксаторы вызывают появление новых, необычных структур, которые отсутствуют в живой клетке. Такие изменения носят название атерфактов, и к ним необходимо относиться критически, сравнивая фиксированные препараты с живыми объектами.

Чтобы по возможности избежать появления различных артефактов, для фиксации необходимо выбирать такую фиксирующую жидкость, которая подходит к данному объекту и дает возможность выявить структуры и вещества, подвергающиеся исследованию, нужно также правильно выбирать время фиксации, температуру фиксатора и другие условия. Фиксация любого объекта должна проходить быстро, чтобы в нем не успели произойти изменения, обычно наступающие сразу же после смерти клеток. Поэтому размер кусочков тканей и органов, предназначенных для фиксации, должен быть небольшим и, как правило, не превышать 5 мм.

Фиксаторы. Для цитологических исследований применяется множество разнообразных фиксирующих смесей, выбор которых в каждом отдельном случае зависит от целей и задач работы. Рассмотрим некоторые наиболее часто применяемые жидкости, обеспечивающие относительно хорошую фиксацию кусочков тканей и отдельных клеток.

Формалин. Формалин обычно употребляется в виде 4-10-процентного раствора. Формалин всегда содержит небольшую примесь муравьиной кислоты, которая вызывает образование осадков в клетках и нарушает тонкую структуру цитоплазмы и ядра. Поэтому для цитологических и тонких гистологических исследований лучше применять нейтральный формалин, полученный путем настаивания обычного формалина на СаС03. Нейтральный формалин хорошо сохраняет структуру клеток, вступая и соединение с белками, и пригоден как для изучения морфологии разнообразных клеток, так и для цитохимических реакций по выявлению белковых компонентов и особенно ферментов, полисахаридов и липидов, превращающихся после фиксации в нерастворимую форму. Время фиксации в формалине зависит от величины объекта: отдельные клетки можно фиксировать в течение 1 или нескольких часов, а небольшие кусочки тканей необходимо фиксировать 24 ч.

Этиловый спирт. Фиксация отдельных клеток, кусочков тканей и органов осуществляется 70-, 96- и 100-градусным (абсолютным) спиртом. Механизм действия спирта заключается в том, что он отнимает воду и вызывает необратимую денатурацию клеточных белков. Чистый спирт употребляется для фиксации, например, в тех случаях, когда нужно выявить полисахариды, легко растворяющиеся в воде. Полисахариды осаждаются спиртом, и последующая обработка препаратов должна производиться без воды. Этиловый спирт входит в состав ряда фиксирующих смесей, из которых наиболее часто применяется смесь Карнуа (1 мл уксусной кислоты, 6 мл 100-градусного этилового спирта и 3 мл хлороформа). Эта смесь удовлетворительно сохраняет структуры клетки и может быть использована для морфологических целей, хорошо сохраняет нуклеиновые кислоты, полисахариды, и фиксация ею пригодна для проведения цитохимических реакций. Время фиксации -- не больше 1-2 ч.

Фиксаторы, содержащие сулему. Обычно употребляется насыщенный водный раствор сулемы, который входит основной составной частью в целый ряд распространенных фиксирующих смесей, хорошо сохраняющих клеточные структуры. К числу таких смесей относятся: сулема с ледяной уксусной кислотой (100:5-6), смеси Ценкера, Гелли, Жильсона, Петрункевича, Максимова, Шаудинна и др. Растворы сулемы оказывают сильное осаждающее действие на белковые компоненты клетки и образуют осадки, нерастворимые в воде. При этом хорошо сохраняются ядерные и цитоплазматические структуры. Сулемовые фиксаторы применяются в основном для изучения морфологических особенностей разнообразных клеток. Но они также пригодны для цитохимического выявления белков и нуклеиновых кислот. Длительность фиксации объектов достигает 24 ч.

Фиксаторы, содержащие пикриновую кислоту. Пикриновая кислота употребляется в виде насыщенного водного раствора. Она входит в состав смеси Буэна (пикриновой кислоты -- 15 мл, формалина -- 5 мл, уксусной кислоты -- 1 мл) и различных ее модификаций. Пикриновая кислота в ткани проникает медленно, и фиксация длится не менее 2 ч. Фиксирующие смеси с пикриновой кислотой прекрасно сохраняют все основные структуры и компоненты клетки и применяются в основном для морфологических целей. Кроме того, пикриновая кислота переводит в нерастворимое в воде состояние полисахариды (гликоген), и после фиксации возможна постановка цитохимических реакций для определения как полисахаридов, так и белков, которые также хорошо сохраняются.

Уксусная кислота. Уксусная кислота в чистом виде в качестве фиксатора не применяется, но входит в состав ряда фиксирующих смесей, часть которых была упомянута выше. При фиксировании клеток смесями, содержащими уксусную кислоту, хорошо сохраняются ядра, а также форма хромосом в делящихся клетках, осаждаются нуклеиновые кислоты, что позволяет применить цитохимические реакции для их определения.

Фиксаторы, содержащие осмий. Фиксирующие смеси, в состав которых входит четырехокись осмия («осмиевая кислота»), дают наилучшие результаты при фиксировании клеток, так как вызывают весьма незначительные артефакты. Поэтому все осмиевые фиксаторы широко используются для изучения морфологии клеток. Кроме того, осмий прекрасно фиксирует липиды, и они при его действии чернеют (липиды обладают способностью восстанавливать осмий до низшей окиси, окрашенной в темный цвет). Из наиболее часто употребляемых осмиевых фиксаторов следует назвать смеси: Флемминга (15 мл 2-процентной осмиевой кислоты, 1 мл ледяной уксусной кислоты), Шампи, Бенда, Альтмана и др., в которых содержатся те же компоненты, что и в смеси Флемминга, но в других соотношениях. Осмий довольно медленно проникает в ткани, и потому длительность фиксации зависит от величины объекта: отдельные клетки фиксируются около 20 мин - 1 ч, кусочки тканей - до 24 ч.

Одноклеточные организмы и изолированные клетки многоклеточных можно фиксировать парами осмиевой кислоты.

Благодаря прекрасным фиксирующим качествам четырехокись осмия применяется в качестве фиксатора в электронной микроскопии. Для электронно-микроскопического изучения объекты фиксируются 1-2-процентной осмиевой кислотой в течение 20 мин -- 1 ч и после фиксации подвергаются довольно сложной обработке.

Однако применение осмиевых фиксаторов, так же как и всех остальных, названных выше, содержащих ядовитые химические вещества, дает хорошие результаты при изучении морфологии клеточных структур и выявлении химических компонентов клетки с помощью цитохимических реакций. Все эти фиксаторы, за исключением формалина, почти полностью подавляют активность ферментов, содержащихся в ядре и цитоплазме. Формалин оказывается наиболее пригодным для выявления локализации и активности ферментов, хотя и он несколько подавляет активность большинства ферментов.

Фиксация путем замораживания и замораживания-высушивания (лиофилизация). Чтобы избежать воздействия химических реактивов и в процессе фиксации сохранить в неповрежденной форме прижизненные структуры клеток, выявить в них ферментативную активность, и был предложен метод лиофилизации. Сущность этого метода заключается и том, что кусочки тканей и органов, а также отдельные клетки быстро замораживаются при температуре жидкого азота (-196°С), а затем высушиваются в вакууме в условиях отрицательной температуры (от 40 до 65°С). После высушивания объекты переносятся непосредственно в расплавленный парафин и из них изготовляются срезы.

В ряде случаев применяется не лиофилизация, а просто замораживание объектов при температуре жидкого азота или даже при температуре сухого льда -- углекислоты (-78°С) с целью последующего выявления ферментов.

Приготовление постоянных препаратов. Постоянные препараты -- это мазки, тотальные препараты и срезы. Мазки используются при изучении клеток крови, бактерий, простейших, изолированных тканевых клеток. Мазки наносятся на предметное или покровное стекло, фиксируются одним из указанных выше фиксаторов, затем, если нужно, промываются в воде и окрашиваются.

Тотальные препараты изготовляют из таких мелких объектов, как простейшие, органы маленького размера, кусочки тканей (например, пленки эпителия) и т. д. При изготовлении тотального препарата объект фиксируется одним из названных фиксаторов, промывается в воде, переносится на несколько минут в 70-градусный спирт, а затем окрашивается. Окрашенный препарат обезвоживается в этиловом спирте, проводится через просветляющую жидкость и заключается в канадский бальзам.

Процесс изготовления срезов более сложен, чем приготовление мазков и тотальных препаратов. Для целей получения срезов, так же как и для получения тотальных препаратов, сразу же после фиксации необходима тщательная промывка в воде, цель которой -- удаление фиксатора из объекта. Промывку в воде нельзя делать только в том случае, если вещество, которое нужно определить, легко в ней растворяется. Например, нельзя промывать в воде объекты, зафиксированные 96- и 100-градусным спиртом, а также смесью Карнуа, в которых нужно определить гликоген, так как эти фиксаторы не переводят гликоген в нерастворимую форму. Особенно длительная и тщательная промывка в воде требуется после фиксации формалином, сулемовыми смесями, а также смесями с пикриновой кислотой и осмием. Процесс промывки в проточной или многократно сменяемой воде длится в этих случаях до 24 ч.

Промытые в воде объекты переносятся дальше в растворы этилового спирта возрастающей крепости (от 40 до 100 градусов). Цель такой проводки через этиловый спирт -- обезвоживание и уплотнение объекта. После обезвоживания следуют среды, которые просветляют объект, т. е. ксилол, бензол, хлороформ, разнообразные масла.

При изготовлении тотальных препаратов объекты из ксилола переносятся в канадский бальзам, но можно также заключить их в глицерин или глицерин-желатину. При изготовлении срезов объект из ксилола или другой просветляющей среды заключается в такое пластическое вещество, которое способно пропитать клетки и все их структуры так, чтобы придать им консистенцию, позволяющую делать тонкие срезы. К числу таких пластических веществ относятся парафин, целлоидин и желатина. Для цитологических целей наиболее часто употребляется парафин, так как он дает возможность получить наиболее тонкие срезы. Заливка объектов в парафин производится в термостате при температуре 56-60° С, а заливка в целлоидин -- при комнатной температуре.

Залитые в парафин объекты пригодны для изготовления тонких срезов, толщина которых обычно не превышает 5-10 мк. Срезы изготовляются на специальном приборе -- микротоме, который снабжен очень острой бритвой. Дальше из готовых срезов удаляется парафин путем проводки их через этиловый спирт уменьшающейся крепости (100°, 96°, 70°), затем они промываются в воде и окрашиваются. Окрашенные срезы вновь промываются в воде (если это нужно), проводятся через этиловый спирт, ксилол и заключаются в канадский бальзам или его заменители.

Канадский бальзам -- это особый вид смолы, хорошо растворяющейся в ксилоле, бензоле и толуоле. Он применяется для заключения тотальных препаратов и срезов потому, что эти препараты сохраняются в нем в течение нескольких лет без особых изменений. Канадский бальзам хорошо просветляет срезы, быстро высыхает, тонкий слой его совершенно прозрачен, и его показатель преломления близок к показателю преломления воздуха.

В целом ряде случаев, например для изучения включений липидов в разнообразных клетках, для многих гистохимических исследований, применяется изготовление срезов на замораживающем микротоме. Замороженные срезы можно приготовить из нефиксированных кусочков тканей, а также после фиксации формалином и другими фиксаторами.

Таковы основные принципы изготовления постоянных препаратов клеток и тканей для изучения их с помощью светового микроскопа. Электронно-микроскопические исследования связаны с применением специальных методов обработки фиксированных объектов и изготовления срезов. Материал, зафиксированный четырехокисью осмия, после промывки обезвоживается в растворе этилового спирта возрастающей крепости (30, 40 и т. д. до 100С). Обезвоженные объекты заключаются в специальную среду, позволяющую делать ультратонкие срезы, толщина которых раина 100-500А. Средой для заливки очень мелких кусочков ткани (не больше 1-2 мм) или изолированных клеток служит пластическая масса: метакрилат, аралдит, среды типа желатины, эпоксидных смол и поливиниловых эфиров (ни парафин, ни другие среды, применяемые при изготовлении препаратов для световой микроскопии, для этой цели не подходят). Ультратонкие срезы получают на специальном приборе -- ультрамикротоме.