Методы исследования клетки

Существует большое количество моделей ультрамикротомов, среди которых хорошими качествами характеризуется наша отечественная модель УМТ-2. Недостаток ультратонких срезов -- это их малая контрастность. Для увеличения контраста изображения применяется обработка срезов специальными веществами, например уранилацетатом.

Окрашивание. Окрашивание постоянных препаратов -- необходимое условие для их последующего микроскопического изучения. Именно окрашивание позволяет различать разнообразные структуры клеток и тканей с такой четкостью, с какой они не могут быть выявлены никаким другим методом.

Красители, употребляющиеся для окраски препаратов клеток и тканей, относятся к веществам, которые по своим химическим свойствам разделяются на две группы: основные и кислотные. К первой группе принадлежат соли красящих оснований, чаще всего хлоргидраты, содержащие в своем составе аминогруппу. От аминогруппы и зависят их основные свойства. Основными красителями окрашиваются структуры клеток, обладающие кислотными свойствами. Эти структуры носят название базофильных.

Кислотные красители -- это свободные окрашенные кислоты или же их соли. Кислотные свойства красителей данной группы зависят от присутствия в них гидроксилов, а также групп SO2OH или СООН. Структуры клетки с основными свойствами окрашиваются кислотными красителями и носят название ацидофильных или оксифильных.

Существует также ряд нейтральных красителей, представляющих по своим химическим свойствам солеобразные соединения кислых и основных красителей. В таких солях и анион, и катион -- радикалы, имеющие хромофорную группу, и при окрашивании клеток базофильные структуры окрашиваются компонентом красителя с основными свойствами, а ацидофильные структуры -- кислотным компонентом.

Наконец, для окраски липоидов и особенно нейтрального жира, содержащегося во многих клетках, пользуются индифферентными красителями (например, судам красный). Окраска ими основана на чисто физическом явлении, которое заключается в очень хорошей растворимости этих красителей в жирах, и они применяются для целей окраски нейтрального жира, содержащегося в цитоплазме клеток.

Окраска мазков, тотальных препаратов и срезов производится как натуральными (гематоксилин, кармин и др.), так и синтетическими красителями (метиленовая зелень, фуксин и др.). Из большого количества разнообразных видов красителей, применяющихся в цитологии, мы рассмотрим лишь немногие, и именно те, которые наиболее часто используются для общих и специальных методов окрашивания.

Общие методы окраски. Эти методы применяются главным образом при изучении морфологии клетки. Из красителей, хорошо окрашивающих ядра и цитоплазматические структуры, особенно на тотальных препаратах, можно рекомендовать квасцовый кармин, уксуснокислый кармин, борный кармин. Широко используется также окраска мазков, тотальных препаратов и срезов гематоксилином. Гематоксилин не относится к числу красителей, но он легко окисляется, превращаясь при этом в гематеин -- сильно красящее вещество. Поэтому все способы приготовления растворов гематоксилина для окрашивания препаратов предусматривают превращение гематоксилина в гематеин. Однако оба эти соединения не способны окрашивать клетки и их структуры без протрав, т. е. солей аммония, железа, меди и др., с которыми они образуют лаки -- соединения типа солей.

Для окраски препаратов существует целый ряд рецептов приготовления гематоксилина: железный гематоксилин Гейден-гайна, Ясвоина, Вейгерта, квасцовый гематоксилин Бемера, Мейера, Эрлиха, Делафильда, фосфорно-вольфрамовый гематоксилин по Маллори и др. При окраске срезов железный гематоксилин часто комбинируется с различными кислыми красителями, например с эозином, придающим розовый цвет цитоплазме, с оранжевым Ж, светлым зеленым и др.

Из красителей, обладающих основными свойствами, часто употребляются метиловый зеленый, сафранин, метиленовый синий, тионин, толуидиновый синий, фуксин основной. Они дают особенно четкую окраску элементов клеточных ядер.

Широко распространены также сложные многокрасочные методы окрашивания срезов, мазков и тотальных препаратов клеток. Упомянутые выше комбинации гематоксилина с кислыми красителями -- один из простых примеров окраски такого типа, когда достигается большой контраст окраски ядерных и цитоплазматических структур.

К многокрасочным методам относятся также: трехцветный метод Маллори, применяемый для дифференциальной окраски различных тканевых элементов; окраска срезов эозин-азуром; окраска мазков и особенно мазков крови по Романовскому -- Гимза. Метиловый синий -- эозин по Манну дает очень четкую окраску ядерных структур. Метиловый зеленый -- пиронин по Унна -- чрезвычайно важная окраска для выявления ядерных и цитоплазматических структур, в которых дифференциально окрашиваются нуклеиновые кислоты: ДНК -- в зелёный (метиловый зеленый) и РНК -- в розовый цвет (пиронин).

Способы окраски препаратов обязательно должны сочетаться со способом фиксации объекта; каждый вид и качество окраски препарата теснейшим образом связаны с выбором того или иного фиксатора. Например, фиксация препаратов смесями, содержащими четырехокись осмия, не годится для последующего применения окраски эозин-азуром и трехцветным методом Маллори, окраска же гематоксилином возможна после различных способов фиксации, а для окраски метиловым зеленым -- пиронином наилучшими фиксаторами служат смеси Карнуа, Гелли, Буэна.

Некоторые красители окрашивают структуры клеток и тканей в иной цвет, чем цвет самого красителя. Так, толуидиновый синий может давать синевато-красное, а синий тионин -- фиолетово-красное окрашивание. Такое явление носит название метахромазии и играет большую роль для выявления в клетках мукополисахаридов, хондриотин-серной кислоты в хряще и ряда других веществ, окрашивающихся метахроматически.

Наряду с разнообразными окрасками в цитологии довольно широко используются методы импрегнации клеточных структур металлами: серебром, золотом, осмием. Особенно часто импрегнируются серебром клетки нервной системы, соединительной ткани, клетки простейших.

7. Цитохимические или гистохимические методы

Совершенно четкой и определенной границы между общими методами окрашивания и цитохимическими реакциями провести нельзя. Однако если задачу большинства общих методов окрашивания составляет выявление разнообразных клеточных структур и они неспецифичны для каких-либо определенных химических веществ, то цель цитохимических реакций заключается в определении именно химических веществ и их локализации в клетке. Поэтому для цитохимических реакций пригодны лишь те методы фиксации, которые позволяют фиксировать и осаждать химические вещества в тех местах, где они располагаются в живых клетках. После фиксации химические вещества должны быть в таком состоянии, чтобы они не растворялись при дальнейшей обработке, не выходили бы из клетки и не меняли бы своего положения в пределах клетки.

Для цитохимических исследований пригодны препараты клеток, фиксированных всеми указанными выше фиксаторами, причем каждый раз фиксатор выбирается в соответствии с тем, какое вещество должно быть выявлено. Пригодны также срезы свежезамороженных тканей, мазки, пленки эпителия, а также материал, подвергнутый лиофилизации.

С помощью цитохимических реакций можно прежде всего выявить все основные неорганические компоненты клетки: К, Na, Fe, Са, Си, Р, Hg, S, N и др. Выявление неорганических компонентов осуществляется широко известными из неорганической химии, но несколько видоизмененными в применении к биологическим объектам реакциями.

Белки. Белковые компоненты клеток можно определить, применяя многочисленные методы, большинство которых основано на определении отдельных аминокислот и реактивных групп, входящих в состав белковой молекулы. К числу таких методов относятся: ксантопротеиновая реакция, указывающая на присутствие в белке тирозина, феннлаланина, триптофана; реакция Мил-лона на присутствие тирозина; реакция Серра на аргинин; реакция тетразоииевого сочетания на тирозин, триптофан и гистидин и реакции на выявление сульфгидрильных (-SH), дисульфидных (S-S), аминогрупп (NH2) и других реактивных групп белковых молекул. Окрашивание белков кислотными и основными красителями при разных значениях рН позволяет определить кислые и основные белки (например, гистоны).

Нуклеиновые кислоты. Цитохимические методы по выявлению нуклеиновых кислот основаны на реакциях трех основных компонентов; фосфорной кислоты, углеводов и оснований. Один из методов окраски, который вместе с тем представляет и пример цитохимической реакции, уже был упомянут выше,-- это окраска метиловым зеленым -- пиронином по Браше. Основу этой реакции составляет способность метилового зеленого и пиронина давать солеобразные соединения с фосфорной кислотой, входящей в состав молекул нуклеиновых кислот. К такому же типу реакций относится окраска нуклеиновых кислот галлоцианином, который окрашивает и ДИК и РНК в серовато-синий цвет. Обе реакции не обладают достаточной степенью специфичности и требуют обязательного применения контроля, т. е. обработки препаратов ферментами; дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой. После действия первого фермента на препаратах не выявляется ДНК, а рибонуклеаза удаляет из клеток РНК, которая после обработки также не выявляется на контрольных препаратах.

Один из высокоспецифичных методов определения ДНК на мазках, тотальных препаратах и срезах представляет нуклеальная реакция Фельгена. Эта реакция включает два этапа: 1) гидролиз в 1 /V растворе HCI, цель которого -- превращение дезоксирибозы -- составной части молекулы ДНК в альдегид и 2) окрашивание в реактиве Шиффа (фуксин-сернистая кислота), обладающем высокой степенью чувствительности к альдегидам. Соединяясь с бесцветной фуксин-сернистой кислотой, альдегиды переводят ее в соединение, окрашенное в яркий красно-фиолетовый цвет.

Углеводы. Из углеводов, содержащихся в растительных и животных клетках, с помощью цитохимических методов можно выявить как моносахариды, например глюкозу, так и разнообразные полисахариды.

Цитохимический анализ полисахаридов основан на окислении их следующими окислителями: йодной кислотой, периодатом калия и натрия, хромовой кислотой.

Цель окисления -- получение высокомолекулярных альдегидных соединений, которые затем выявляются реактивом Шиффа, подобно тому как это было только что указано для реакции Фельгена. Сама же реакция на полисахариды носит название реакции ШИК (Шифф-йодная кислота). Реактив Шиффа окрашивает разнообразные полисахариды, например гликоген, в яркий красно-фиолетовый цвет. Одновременно с гликогеном реактив Шиффа окрашивает в такой же яркий цвет другие полисахариды, и особенно кислые, типа мукополисахаридов, мукопротеидов и др. Для раздельного определения этих веществ используется приготовление контрольных препаратов, на которых гликоген удаляется из клеток обработкой птиалином слюны. Вещества же типа мукополисахаридов, мукопротеидов и кислые полисахариды типа гиалуроновой кислоты требуют применения специальных методов определения. Одна из реакций на такие соединения уже была названа выше: это явление метахромазии.

Гликоген на мазках, тотальных препаратах и срезах можно определить также путем окрашивания йодом или раствором Люголя (йод - 1 г, К! - 2 г, дистиллированная вода - 300 мл). Под действием йода гликоген окрашивается в красно-бурый или коричневый цвет.

Липоиды. Нейтральный жир, находящийся в, цитоплазме клеток, избирательно окрашивается красным Суданом III в оранжево-красный цвет и черным Суданом -- в черный цвет. Судан черный окрашивает и другие структуры "клеток, в которых содержатся липоиды. Имеется также ряд методов для определения в клетке веществ, содержащих в своем составе липоиды, например холестерин.

Ферменты. В настоящее время методы цитохимии позволяют выявить около 50 различных ферментов, находящихся в клетках и тканях. Если при цитохимическом определении белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов выявляются какие-то структурные части их молекул, то при определении ферментов выявляется их активность.

Для того чтобы обнаружить активность какого-либо фермента, клетки помещаются в среду, содержащую субстрат для данного фермента. Фермент расщепляет субстрат, а последний выбирается с таким расчетом, чтобы один из продуктов расщепления можно было выявить при помощи цветной реакции. Очень важно, чтобы субстрат, участвующий в реакции, был хорошо растворим и легко проникал бы в клетку. Напротив, окрашенные конечные или промежуточные продукты реакции, не должны быть растворимыми и должны располагаться именно в тех частях клетки, где они находятся в прижизненном состоянии, а не диффундировать в соседние клетки или в другие части одной и той же клетки.

Примером реакций определения ферментативной активности в клетках может служить реакция на сукцинатдегидрогеназу -- важнейший фермент, участвующий в окислительно-восстановительных процессах.

Основу этой реакции составляет восстановление с помощью этого фермента бесцветной и хорошо растворимой соли тетразолия (биосубстрат) в почти нерастворимый формазан (конечный продукт реакции), окрашенный в синий или сине-фиолетовый цвет.

При цитохимическом определении активности гидролитических ферментов (фосфатазы, липазы и др.) в растворимые субстраты, которыми могут служить альфа и бетта-глицерофосфат, адено-зинтрифосфат и некоторые другие органические соединения, содержащие фосфор, добавляются ионы металлов.

В процессе расщепления таких субстратов ферментами окрашенные продукты реакции осаждаются в местах ферментативной активности в виде малорастворимых солей кальция, свинца, меди, кобальта и других металлов.

8. Метод меченых атомов (авторадиография)

Меченые атомы широко применяются в цитологии для изучения разнообразных химических процессов, протекающих в клетке, например: для изучения синтеза белков и нуклеиновых кислот, проницаемости клеточной оболочки, локализации веществ в клетке и т. д.

Для этих целей применяются соединения, в которые введена радиоактивная метка.

В молекуле меченого вещества, например аминокислоты или углевода, один из атомов замещен атомом того же вещества, но обладающим радиоактивностью, т. е. радиоактивным изотопом. Известно, что изотопы одного и того же элемента не отличаются друг от друга по своим химическим свойствам, и, попав в организм животного или растения, они ведут себя во всех процессах так же, как и обычные вещества. Однако благодаря тому, что эти изотопы обладают радиоактивным излучением, их можно легко обнаружить, применяя фотографический метод.

В цитологических исследованиях наиболее широкое распространение получили искусственные радиоактивные изотопы, обладающие мягким излучением, в процессе распада которых образуются электроны с небольшой энергией. К числу таких изотопов относятся: изотоп водорода -- тритий 3Н, изотоп углерода 14С, фосфора 32Р, серы 35S, йода 1311 и других элементов, входящих в состав органических соединений.

Меченые соединения вводятся непосредственно в организм животного или растения, в изолированные из организма клетки, находящиеся в культуре тканей, в клетки простейших и бактерий. Пути введения их в организм различны: многоклеточным животным они вводятся путем инъекции или с пищей, в случае культур клеток и тканей, простейших и бактерии, а также очень мелких многоклеточных организмов меченые соединения вводятся в культуральную среду.

Введенные в организм радиоактивные изотопы активно включаются в обмен веществ. Доза вводимого в организм меченого соединения устанавливается опытным путем и не должна быть слишком большой, чтобы не нарушить нормального обмена веществ вследствие значительного радиоактивного излучения.

Через различные промежутки времени после введения меченых соединений фиксируются кусочки тканей и органов, клетки простейших и бактерий. Наилучшие результаты дает фиксация смесью Карнуа или спиртово-уксусной смесью (3:1). Из фиксированного материала приготовляются обычные парафиновые срезы, на поверхность которых (после удаления парафина) наносится тонкий слой чувствительной фотографической эмульсии. Эта так называемая ядерная эмульсия характеризуется очень мелким размером зерен (0,2-0,3 ж/с), их однородностью и значительно большим насыщением желатины AgBr, чем обычная фотографическая эмульсия.

Препараты с нанесенной на них фотоэмульсией экспонируются в темноте, при относительно низкой температуре (около 4°С), а затем проявляются и закрепляются так же, как при получении обычных фотографий. За время экспонирования препаратов излучение радиоактивных изотопов, включившихся в те или иные структуры клетки, оставляет след от пробега р-частиц в слое фотоэмульсии.

В процессе проявления зерна AgBr, оказавшиеся в местах пробега бетта-частиц, восстанавливаются проявителем до металлического серебра. Последние обладают черным цветом и обнаруживаются после проявления препаратов в виде зерен, находящихся в слое фотоэмульсии над теми клетками и их структурами, в которые оказался включенным радиоактивный изотоп. Такие препараты носят название радиоавтографов.

После процессов проявления и закрепления радиоавтографы тщательно промываются в воде, а затем окрашиваются одним из красителей, выявляющих то вещество в клетке, в которое должен включиться радиоактивный изотоп. Только некоторые виды окраски, например реакция Фельгена, производятся до нанесения эмульсии на радиоавтографы, так как гидролиз в кислоте и при высокой температуре обязательно повредит слой эмульсии. Готовые радиоавтографы заключаются в канадский бальзам и изучаются под микроскопом.

Включение радиоактивных изотопов осуществляется лишь в те участки клеток и их структуры, где происходят активные процессы, например процессы синтеза белков, углеводов, нуклеиновых кислот.

Для исследования синтеза белков используются разнообразные меченые аминокислоты. О синтезе нуклеиновых кислот можно судить по включению в их молекулы меченых нуклеозидов: тимидина, цитидина, уридина. Тимидин, меченный по тритию, т.е. 3Н-тимидин включается исключительно в молекулы ДНК, и с помощью именно этого радиоактивного предшественника в последние годы было выяснено много важных закономерностей синтеза ДНК, удалось проследить редупликацию хромосом. 3Н-цитидин и 3Н-уридин (или эти же соединения, меченные по углероду) включаются как в молекулы ДНК, так и в молекулы РНК. О синтезе полисахаридов в клетке можно судить по включению в них меченых глюкозы и Na2so4.

В последние годы разработан метод получения радиоавтографов для исследования их с помощью электронного микроскопа (электронная авторадиография), что дает возможность изучать биохимические процессы в ультраструктурах клетки, т. е. получать точные данные о локализации химических веществ и их превращений в клетках разных органоидов.

9. Количественные методы в цитологии

К числу количественных методов относятся прежде всего многочисленные биохимические методы, с помощью которых можно определить количество содержащихся в клетке неорганических и органических веществ.

Ценность этих методов, широко используемых в цитологии, состоит в том, что они позволяют получить данные об изменениях в количестве разнообразных веществ в разные периоды жизнедеятельности клетки, в разные периоды ее развития, при воздействии факторов внешней среды, при патологических процессах и т. д.

Количественные методы дают также возможность получить цифровые данные о веществах, потребляемых и выделяемых клеткой в процессе ее жизнедеятельности. Так, используя специальную аппаратуру (респирометры Варбурга, Крога и др.). можно очень точно учесть количество потребляемого тканями или отдельными клетками кислорода, а также те изменения интенсивности, процессов дыхания, которые происходят при разном температурном режиме и других условиях.

Один из важных количественных методов, дающих возможность определить сухой вес клетки, основан на применении интерференционного микроскопа. Сущность этого метода заключается в том, что в интерференционном микроскопе свет, прошедший через объект, испытывает сдвиг фазы по сравнению с «контрольным лучом», не прошедшим через объект. Величина фазового сдвига выражается в изменении яркости и зависит от плотности объекта, а плотность, в свою очередь, зависит от количества сухого вещества, содержащегося в данном объекте. Сухой вес клеток или их отдельных структур выражается в граммах, и для вычисления его нужно измерить размер клетки (или отдельной её структуры), а также величину фазового сдвига.

Метод определения сухого веса с помощью интерференционного микроскопа применим не только для фиксированных, но и для живых клеток.

Еще один важный и широко используемый метод количественного анализа химического состава клетки -- это цитофотометрия. Основу метода цитофотометрии составляет определение количества химических веществ по поглощению ими ультрафиолетового, видимого или инфракрасного света определенной длины волны.

Количественный анализ можно проводить как на основе собственных спектров поглощения химических веществ (т. е. на неокрашенных препаратах), так и на основе спектров поглощения красителя, которым окрашены структуры клетки. Примером может служить определение количества ДНК на препаратах, окрашенных по Фельгену, и количества РНК после окраски пиронином.

Цитофотометр.

Поглощение света разнообразными клеточными структурами зависит от концентрации в них тех или иных химических веществ, и эта зависимость подчинена закону Ламберта-Бера: интенсивность поглощения лучей пропорциональна концентрации вещества при одной и той же толщине объекта. Различия в интенсивности поглощения света химическими веществами, локализованными в разнообразных клеточных структурах, выражаются количественными показателями, которыми часто служат относительные единицы, микрограммы и другие единицы измерения.

Приборы, служащие для целей спектрального анализа химического состава клеток, носят название цитофотометров. Цитофотометр включает источник света, фильтр, микроскоп и фотометр с фотоумножителем. На фотоумножитель проецируется изображение клетки.

При помощи цитофотометра определяется интенсивность прохождения света через клетку или же величина, обратная ей, т. е. оптическая плотность. Полученные величины сравниваются с такими же величинами, известными для других клеток, или же со стандартными образцами, Цитофотометры различных систем позволяют определять количество вещества до 10-12-14 г, т.е. характеризуются большой точностью измерений.

Метод цитофотометрии получил особенно широкое распространение в последние годы. Большое значение имеет то обстоятельство, что его можно сочетать с другими методами исследования, например с ультрафиолетовой микроскопией.

Размещено на Allbest.ru