Влияние экологически значимых факторов на биокинетические показатели микроорганизмов

9

На правах рукописи

Калюжин Владимир Анатольевич

Влияние экологически значимых факторов на биокинетические показатели микроорганизмов

03.02.08 экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Томск 2010

Работа выполнена в лаборатории биокинетики и биотехнологии обособленного структурного подразделения "Научно-исследовательский институт биологии и биофизики" ГОУ ВПО "Томский государственный университет"

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Плеханов Геннадий Федорович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Печуркин Николай Савельевич

доктор технических наук, профессор Адам Александр Мартынович

доктор биологических наук Терещенко Наталья Николаевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО "Иркутский государственный университет"

Защита состоится 21 апреля 2010 г. в 10-00 часов на заседании диссертационного совета Д212.267.10 при ГОУ ВПО "Томский государственный университет" по адресу: 634050, г.Томск, пр.Ленина, 36.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета.

Автореферат разослан " _____ " марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Е.Ю. Просекина

Общая характеристика работы

Актуальность работы. В связи с тем, что развитие цивилизации сопровождается активным вмешательством человека в природные сообщества и этот процесс необратим, необходимо иметь возможность предсказывать последствия такого вмешательства (Одум, 1986; Яблоков, 1987; Акимова и др., 2006). Поскольку в ряде случаев необходимо прослеживать влияние факторов на изучаемые биосистемы на протяжении ряда поколений, то наиболее эффективным объектом исследования являются микроорганизмы. Высокая скорость их размножения позволяет отследить влияние факторов на протяжении нескольких поколений при продолжительности опытов в несколько часов.

Ответная реакция одноклеточных биосистем значительно зависит от свойств адаптивных систем клеток. В данном случае рассматривается наиболее широкое понятие адаптации, то есть такие границы интенсивности действующего фактора, в пределах которых возможны рост и размножение микроорганизмов. Наличие широкого поля адаптации позволяет ранжировать те или иные клеточные системы по их чувствительности к действующему фактору. В свою очередь, полученные закономерности при изучении ответной реакции позволяют, как показала практика, управлять морфофизиологическими показателями микроорганизмов. Очевидно, что проблема управления актуальна как для заводских биотехнологических, так и для антропогенно организованных систем.

Особое внимание необходимо обратить на изучение эффекта ответной реакции в "чистом виде", без дополнительных и сопутствующих эффектов. Так, адаптивные ответные реакции в условиях переменного режима культивирования хорошо изучены на хемостатных культурах. Однако спектр возможных ответных реакций у хемостатной культуры ограничен. Ограничения обусловлены фиксированной скоростью протока и тем, что ответная реакция развивается на фоне переменного состава среды. Очевидно, что однозначная интерпретация полученных результатов невозможна. По этой причине более надежные результаты по изучению переходных процессов при смене условий культивирования могут быть получены в опытах с нелимитированными культурами. Этому требованию удовлетворяет турбидостатный метод культивирования, где используется среда с многократной насыщающей концентрацией трофических компонентов, а скорость протока зависит от скорости размножения культуры. Тем самым, опыты с турбидостатной культурой позволяют изучать ответную реакцию в чистом виде, поскольку снимается влияние побочных и сопутствующих факторов. Однако число публикаций, посвященных этому вопросу, очень ограничено. Изучались, в основном, температурные переходы от оптимальной температуры к супраоптимальной (Работнова и др., 1979; Самойленко и др., 1981; Рихванов и др., 2001), то есть влияние физического фактора; влияние факторов химической природы почти не изучено. Были выделены и изучены следующие формы воздействия, определяющие условия обитания микроорганизмов: концентрация питательных веществ; концентрация растворенных осмотических факторов; ингибиторы различных процессов; смена концентрации ионов водорода; суточный и сезонный ход температуры; концентрация кислорода в среде; смена источников питания. Актуальным моментом также является изучение возможности переноса закономерностей, обнаруженных в лабораторных условиях, на природные популяции микроорганизмов. По этой причине изучалось влияние на рост и размножение микроорганизмов продуктов техногенной природы. Изучалась возможность утилизации микроорганизмами в качестве единственного источника углерода и энергии органических веществ алифатического, карбоциклического, гетероциклического рядов и их смесей произвольного состава. Также была изучена толерантность микроорганизмов к щелочным, щелочно-земельным и тяжелым металлам. Данные исследования необходимы для разработки способов восстановления природных сред, загрязненных техногенными выбросами, что актуально в настоящее время ((Позмогова и др., 1980, 1983; Тенси и др., 1981; Печуркин и др., 1984; Тулемисова и др., 1984; Берри, 1985; Панников, 1991; Бабьева и др., 1992).

Вместе с тем к числу малоизученных процессов относится также ответная реакция на одновременное воздействие нескольких стимулов. В природных условиях микроорганизмы часто подвергаются воздействию многих факторов одновременно. Наиболее вероятно в летнее время влияние стимулов химической природы на фоне суточного хода температуры. Исследования в данных направлениях позволяют прогнозировать динамику ответной реакции микроорганизмов на естественные и техногенные раздражители, что может представлять интерес для теоретической и прикладной экологии, так как человеческая деятельность прямо или косвенно оказывает влияние на интенсивность факторов, от которых зависят жизненные функции микроорганизмов.

Цели и задачи диссертационной работы. Целью диссертационной работы было изучение закономерности ответной реакции проточной культуры дрожжей на действие физического и химических факторов и исследование возможности переноса результатов лабораторных опытов в природные среды для решения прикладных экологических задач.

В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние экологически значимых факторов на проточную культуру дрожжей в стационарном режиме культивирования и оценить их управляемость.

2. Выявить основные закономерности при переходных процессах у проточной культуры дрожжей и проверить возможность управления культурой.

3. Оценить характер ответной реакции в переходных условиях при адаптации дрожжей к одновременному воздействию двух факторов.

4. Изучить возможность применения для решения прикладных задач данных, полученных при изучении адаптивных возможностей дрожжей и природных популяций микроорганизмов.

5. На базе полученных результатов разработать и внедрить в практику микробиологические технологии, предназначенные для решения экологических задач.

Положения, выносимые на защиту:

1. При культивировании дрожжей в стационарных условиях такие стимулы, как температурный фактор, лимитирующий фактор, рН фактор, 2,4-динитрофенол (ДНФ), осмотическое давление, дыхание и гипоксия, смена источника азота и углерода оказывают влияние: одни - на все три изучаемых показателя, другие - на один или два. Объектом сравнения является культура, растущая при оптимальных условиях.

2. В условиях переходного процесса при изменении интенсивности действующих факторов, в зависимости от природы стимула и его интенсивности, адаптивный процесс дрожжей завершается в первом-втором поколении в одном случае и растягивается на пять-шесть поколений в другом случае.

3. Существует последовательность в ответной реакции на два одновременно представленных стимула. Так, при адаптации дрожжей к одновременному воздействию двух факторов сначала происходит адаптация к позитивному фактору, а потом к негативному.

4. Наиболее продолжительная адаптация - у дрожжей при температурных переходах от субоптимальной-оптимальной температуры к супраоптимальной, и продолжительность процесса находится в прямой зависимости от эффективности работы хемиосмотической энергетической системы клетки.

5. В природных сообществах микроорганизмов присутствуют виды, способные утилизировать все разновидности техногенных органических соединений. Успешность этого процесса находится в той же зависимости, что и у дрожжей при усвоении субстрата.

Методы исследования. Исследования проводились с использованием проточных систем, работающих в режиме турбидостата и хемостата. Были изучены периодические культуры. В полевых исследованиях моделировались условия периодического культивирования.

Достоверность результатов диссертации. Все опыты проводились с 5-6 кратным повтором. Основные принципы проверялись в полевых условиях на протяжении 21 года. Выявляемые на дрожжах закономерности успешно подтверждаются на прочих микроорганизмах.

Научная новизна. В результате исследований:

1. Прослежена динамика ответной реакции дрожжей на действие нескольких факторов. Определены возможности управления изучаемыми показателями у культуры дрожжей.

2. Изучена устойчивость микроорганизмов к действию тяжелых металлов. Разработан способ ликвидации нефтяных разливов (ПатентРФ).

3. Разработан способ очистки воды и грунта от всех видов органических загрязнителей (Патент РФ).

Практическая значимость. На основе исследований дрожжевой культуры удалось разработать способ очистки воды и грунта от нефти и нефтепродуктов при помощи микроорганизмов. Способ защищен Патентом РФ. При помощи данного способа очищено более 300 гектаров земель и водоемов в различных регионах России и СНГ. Дальнейшие исследования позволили разработать способ биологической очистки воды и грунта от органических веществ алифатического, карбоциклического, гетероциклического рядов и их смесей произвольного состава. Тем самым способ позволяет очищать любые твердые и жидкие среды от любого органического загрязнителя и тяжелых металлов при помощи микроорганизмов. В настоящее время разработана универсальная технология, позволяющая трансформировать любые виды загрязнений в полезные биотехнологические продукты.

Внедрение результатов. Результаты внедрены в практику при проведении экологических работ по рекультивации замазученных земель с применением микроорганизмов. Работы проводились: в Республике Коми (г.Усинск); на территории Сибири (города Нефтеюганск, Нижневартовск, Стрежевой, Пионерный, Томск, Новосибирск, Иркутская область); в Казахстане (г.Павлодар). За период с 1986 по 2007 гг. было очищено от нефтяных загрязнений около 300 га земель и водоёмов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов" (Пущино, 1986), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино,1989), Международном симпозиуме "Контроль и реабилитация окружающей среды" (Томск, 1998), V Международной конференции "Химия нефти и газа" (Томск, 2003) и др.

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано 68 работ, из них 14 в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК, 2 патента РФ.

Вклад автора. При получении результатов настоящей работы вклад автора являлся определяющим. Все материалы, вошедшие в диссертацию, были получены лично автором.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, списка литературы. Общий объем диссертации составляет 303страницы, содержит 129 рисунков и 46 таблиц. Список использованных литературных источников составляет 303 наименования, из них 73 иностранных.

Краткое содержание работы

1. Литературный обзор

Показано влияние физических и химических факторов на рост и развитие микроорганизмов, включая дрожжи, изучали большое количество исследователей. Исследования проводились как в природных, так и в лабораторных условиях. Прослежена роль факторов в экологии многих видов микроорганизмов.

Вместе с тем, полевые исследования, в основном, носят описательный характер. Влияние иных, кроме температуры, факторов не учитывается. Более значимые результаты можно получить в лабораторных условиях. Опыты проводятся с применением как периодических, так и проточных систем культивирования. Однако при периодическом и хемостатном культивировании оценка динамики адаптации культуры к фактору затруднена или невозможна. При периодическом культивировании приспособление к новому температурному режиму осуществляется на сроке изменяющейся концентрации субстрата, а при хемостатном - верхний порог скорости размножения ограничен экспериментатором. По этой причине предпочтительны нелимитированные культуры, растущие в турбидостате. В данном случае работа установки контролируется в режиме обратной связи самой популяцией микроорганизмов. Это позволяет изучать влияние факторов в чистом виде, поскольку влияние прочих факторов исключено.

2. Методика проведения исследований

Объектом исследования были выбраны дрожжи S.cerevisiae - 14, широко распространенные в природе и применяемые в пищевой промышленности (Семихатова, 1980; Бабьева и др., 1992). Изучаемый вид микроорганизмов обитает на поверхности поврежденных плодов и ягод и постоянно в течение суток подвергается воздействию переменной температуры в соответствии с ее суточным ходом. Очевидно, что в процессе эволюции должна была сформироваться система адаптации к переменному режиму температур. В опытах применялась синтетическая среда с многократно насыщающей концентрацией всех компонентов. Среда была "оптически пустой", что обеспечивало беспрепятственное прохождение света от источника к фотосопротивлению. Экспериментальная установка была сконструирована на основе литературных данных (Печуркин, 1975; Печуркин, 1978). Приводится блок-схема установки. Ферментер имел рабочий объем 75 мл. Осуществлялась глубинная аэрация. Воздух подавался в количестве 400-600 л в час на 1л культуральной жидкости. Температурный режим поддерживался за счет водяной рубашки, окружающей рабочий объем ферментера. Особая конструкция донной части ферментера препятствовала проскакиванию пузырьков воздуха через световой пучок. Концентрация биомассы в ферментере поддерживалась с точностью ±0,5%, температура - с точностью ±0,1?С. Специальная инерционная система отфильтровывала случайные изменения оптической плотности. Была выявлена область концентрации биомассы, при которой регистрирующая система работала с наибольшей чувствительностью. Эта концентрация составляет 200-350 мг/л. Тем самым в ферментере присутствовало около 5·10⁸ клеток. В полевых исследованиях изучались консорциумы аборигенных микроорганизмов. Видовой состав не определялся. Однако конечный результат был стабилен, так как использовались селектированные микробиологические комплексы.

3. Результаты экспериментальных исследований

3.1 Переход популяции дрожжей от состояния покоя к активному росту

Для природных популяций дрожжей характерны переходы от состояния покоя к активному росту. Данные переходы возможны при смене неблагоприятных условий на условия, приемлемые для роста и размножения. Вданном разделе рассматриваются переходы популяции дрожжей от состояния покоя к росту под влиянием следующих факторов: обогащение среды обитания питательными веществами, повышение температуры, удаление из клеток ингибитора с учетом предыстории культуры.

3.1.1 Активация роста трофическим фактором

Изучались три группы популяций дрожжей, находящихся в состоянии покоя за счет исчерпания источников азота, фосфора, глюкозы. Активация роста достигалась добавлением в среду недостающих элементов питания в количествах: источника азота (NH₄)₂SO₄ до 150мг/л, источника фосфора NaH₂PO₄ до 100мг/л, глюкозы до 4,5г/л. При данных концентрациях достигаются максимальные скорости роста и размножения дрожжей. Опыты проводились при 30°С. Дрожжи находились в состоянии покоя 24 часа. Кинетика переходного процесса прослеживалась на проточной турбидостатной культуре в условиях интенсивной аэрации. Данные по длительности первого генеративного цикла после активации роста представлены в таблице 1.

Таблица 1. Длительность первой генерации после активации роста

Отмечается большая длительность первого генеративного цикла после переноса дрожжей в условия, оптимальные для роста и размножения. Однако уже во втором поколении длительность генеративного цикла во всех опытах стабилизируется на уровне, типичном для турбидостатной культуры при оптимальной температуре 30°С и при насыщающей концентрации питательных веществ, где D = 0,3ч^-1, а длительность удвоения числа клеток составляет 2,3 часа.

Вместе с тем обращает на себя внимание влияние на длительность первого генеративного цикла предыстории культуры до перехода ее в состояние покоя. Наиболее существенно это влияние на культуру, активируемую источником азота. Так, при низких скоростях протока у хемостатной культуры при D=0,05ч^-1 и D=0,15ч^-1 отмечается наибольшая продолжительность первого генеративного цикла. В свою очередь для культур, активированных источником азота и глюкозой, влияние предыстории незначительно.

Изучение кинетики изучаемых явлений показало, что после введения в среду фактора активатора следует стадия задержки роста. Так, для культур, активируемых источником азота, рост начинается через 5,5 часа после введения активатора, если культура выращивалась в хемостате при D=0,05ч^-1. Для культур, выросших при скорости протока D=0,15ч^-1, длительность задержки роста составляет 3,2 часа, а при D=0,26ч^-1 - 2 часа. Культуры, активируемые источником фосфора и глюкозой, имеют сходный по продолжительности период задержки роста. Во всех опытах длительность этого периода составляет 1,5-2 часа.

Для всех опытов по активации роста любым из трех источников питания характерно скачкообразное увеличение скорости роста после стадии задержки. При этом в первые 0,5-1 часа после начала роста его скорость уже равна или близка к максимальному значению. Изучение динамики изменения возрастного состава изучаемых популяций показало также наличие стадии задержки. Однако продолжительность этого периода почти не зависит от предыстории культуры и природы фактора активатора. Во всех опытах почкование начинается через 1-2 часа после активации. При этом в первые 2-6 часов доля ювенильных почек достигает значения 15-30%, в то время как у стационарных культур величина этого показателя не превышает 7%. Для культур, активированных источником азота, максимальные концентрации ювенильных почек отмечаются в период задержки размножения клеток. Высокая концентрация почкующихся клеток свидетельствует об увеличении продолжительности данного периода, то есть увеличивается время, необходимое для прохождения клеткой ранних стадий митоза, профазы и метафазы, в сравнении с нормой. Тем самым в данных опытах скорость прохождения клеткой ранних стадий митоза является определяющим моментом, влияющим на динамику перехода дрожжей от состояния покоя к активному росту.

В следующей серии опытов культура активировалась температурным фактором. Для этого активировалась популяция дрожжей, хранившихся в течение 20 суток при температуре 0-2°С. Активация достигалась переносом охлажденной культуры в ферментер турбидостата на полную среду с температурой 30°С. До перехода в состояние покоя дрожжи имели максимальную скорость роста.

Оценка динамики изменения скорости размножения и возрастного состава показала следующее. Максимальная скорость размножения была достигнута через 1 час после активации. Доля ювенильных клеток у исходной культуры соответствовала норме. Через 1 час доля снизилась с 6,5% до 3,2%, далее возросла до 9% и сохранилась на этом уровне в течение 5-6 часов. Количественная оценка изучаемых показателей выявила полное совпадение с динамикой переходного процесса у активно растущей культуры при повышении температуры в интервале 14°С ± 30°С. Тем самым продолжительное хранение при температуре 0-2°С не привело к изменению свойств дрожжей. Их исходные свойства были зафиксированы охлаждением и безынерционно реализованы после активации.

Проводилась активация культуры дрожжей, ингибированной 2,4-динитрофенолом и находившейся в состоянии покоя в течение 24 часов. Активация обеспечивалась созданием условий, повышающих диссоциацию динитрофенола, и одновременным снижением градиента концентрации ионов Н⁺ в направлении среда > клетка. Это достигалось изменением рН среды, содержащей 10 мг/л динитрофенола. Изменялась рН: рН 4 > рН 6 добавлением в среду щелочи - NaOH. При этом степень диссоциации динитрофенола повышалась. Заряженные ионы уже не проникали в дрожжевую клетку, а имеющиеся в клетке выходили в среду. Через 0,5 часа клетки освобождались от ингибитора. Предварительно было установлено, что скорость размножения дрожжей постоянна в интервале рН 3,5 - рН 6,5. Изменение рН в этом интервале не оказывает влияния на скорость размножения дрожжей. Через 1,5 часа после активации была достигнута максимальная скорость размножения дрожжей. Доля изменения почкующихся клеток изменялась незначительно. Тем самым присутствие в клетке в течение 24часов ингибитора 2,4-динитрофенола, очевидно, не привело к необратимым изменениям, и активность клеток полностью восстанавливалась после выхода ингибитора из них.

3.1.2 Популяция дрожжей в лимитированных условиях и при повышении лимитирующей концентрации среды до насыщения

Реальные природные популяции микроорганизмов, в том числе дрожжи, осуществляют свой жизненный цикл в большинстве случаев в лимитированных условиях. Только при определенном стечении обстоятельств состав питательного субстрата становится сбалансированным, и рост дрожжей в течение некоторого интервала времени осуществляется беспрепятственно. Рост дрожжей в условиях лимитирования и переход от лимитирования к насыщению может быть прослежен на примере популяции, обитающей на поврежденных плодах и ягодах. Так, в большинстве случаев период времени, в течение которого имеются созревшие плоды и ягоды, ограничен. До периода плодоношения дрожжи вынуждены развиваться в местах истечения древесных и растительных соков. В свою очередь, состав растительных соков несбалансирован с потребностью дрожжей. В состав соков, как правило, входит значительное количество сахаров и ограниченное количество источников азота, фосфора, факторов роста. Тем самым, до периода плодоношения дрожжи живут в лимитированных условиях. В свою очередь, плоды, ягоды, корнеплоды более обогащены недостающими питательными веществами. В период плодоношения дрожжевые клетки, переносимые ветром, водой, фиксируются на плодах и ягодах. По мере их созревания возникают поврежденные участки вследствие активности литических ферментов или за счет механических повреждений. У дрожжей, попавших на поврежденные участки, начинается переходный процесс от состояния лимитирования к насыщению. В течение некоторого периода времени при низкой плотности популяции дрожжи растут в нелимитированных условиях. По мере увеличения плотности популяции, а также при прекращении периода плодоношения дрожжи вновь возвращаются в лимитированные условия или в условия покоя.

В данном разделе рассматриваются особенности роста и размножения дрожжей в условиях лимитирования и в условиях перехода от лимитирования к насыщению.

Изучалась лимитированная турбидостатная культура дрожжей, растущая при температуре 30°С, рН4 в условиях интенсивной аэрации.

Предварительно было установлено, что рост изучаемого вида дрожжей возможен только при наличии в среде одновременно следующих источников: азота, фосфора, калия, магния, глюкозы, ?-аланина, биотина. При отсутствии любого из перечисленных факторов дрожжи не растут. Тем самым каждый из источников может выступать в роли лимитирующего фактора. Лимитирование достигалось снижением трофических веществ в среде, поступающей в ферментер на фоне постоянной концентрации биомассы. При достижении определенного соотношения концентрации субстрата и концентрации биомассы наступает состояние лимитированного роста. Изучалась популяция, лимитированная следующими компонентами: источники азота (NH₄)₂SO₄, фосфора NaH₂PO₄, калия К₂SO₄, магния MgSO₄, глюкоза, ?-аланин, биотин. Концентрация биомассы была постоянной и составляла 500 мг/л. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Рост дрожжей в условиях лимитирования

Из представленных в таблице 2 данных следует, что лимитирование роста дрожжей наступает при относительно низких концентрациях веществ. Данные концентрации в 2-3 раза ниже содержания перечисленных веществ в растительных соках. Тем самым, на начальных стадиях развития колонии дрожжей на свежих природных средах возможен их рост в нелимитированных условиях.

Важным моментом, характеризующим лимитирование популяции, является пониженное содержание ювенильных клеток. Так, в нелимитированных условиях доля таких клеток составляет 6-7%, а в условиях глубокого лимитирования их доля 3-5%. Данное явление свидетельствует о сокращении длительности ранних стадий митоза на фоне увеличения продолжительности последующих стадий в сравнении с нормой.

Был также установлен повышенный расход источника энергии - глюкозы. Это явление можно объяснить тем, что при низких концентрациях питательных веществ в среде возникает градиент концентраций в направлении клетка > среда, то есть содержание веществ в клетке превышает их содержание в среде. По этой причине перенос трофических компонентов в клетку требует дополнительных энергетических расходов, так как осуществляется против градиента концентрации. В свою очередь, в оптимальных условиях концентрация питательных веществ равна или несколько больше их концентрации в клетках. Тем самым в оптимальных условиях перенос осуществляется с минимальным расходом энергии, в основном, за счет пассивного транспорта или просто диффузии. Отмечено также увеличение площади поверхности клеток в 1,3-1,7 раза у лимитированных культур в сравнении с нормой. Очевидно, это явление можно рассматривать как адекватную реакцию. Так, при низкой концентрации веществ в среде затрудняется обеспечение клетки необходимыми трофическими компонентами. В свою очередь, увеличение размеров клеток приводит к увеличению площади сорбирующей поверхности, что повышает вероятность захвата необходимых элементов питания для каждой отдельной клетки.

Следует также обратить внимание на существенное различие лимитированной турбидостатной культуры от хемостатной. Турбидостатная культура при любых условиях культивирования размножается с максимально возможной скоростью, в то время как скорость роста хемостатной культуры устанавливается экспериментатором, что препятствует реализации всех потенциальных адаптивных возможностей популяции. Скорость размножения лимитированной турбидостатной культуры в стационарных условиях ограничена, в основном, скоростью переноса субстрата из среды в клетку. Всвою очередь скорость переноса является важным адаптивным признаком, поскольку в реальных природных условиях на питательном субстрате растут и размножаются одновременно несколько видов микроорганизмов. Очевидно, что в данной конкурентной ситуации в условиях лимитирования выигрывают те виды, которые с наибольшей скоростью переносят субстрат в клетку, размножаясь при этом также с максимальной скоростью.

Данная ситуация в природных условиях отмечается при переносе дрожжевых клеток с истощенного субстрата на свежий субстрат, богатый питательными веществами. Наиболее типичен этот переходный процесс в сезон созревания плодов и ягод, когда ареал обитания дрожжей обогащается питательным субстратом. В данном разделе рассматриваются переходные процессы у дрожжей при повышении концентрации таких компонентов среды, как: источника азота (NH₄)₂SO₄, источника фосфора NaH₂РО₄, калия - К₂SO₄, магния - MgSO₄, глюкозы, ?-аланина, биотина - с лимитирующего уровня до насыщения. Опыты проводились при 30°С в условиях интенсивной аэрации. Переходный процесс активировался добавлением в ферментер и в емкость со средой необходимого количества соответствующего источника питания. Проводились опыты с популяциями, имеющими различные стартовые условия, то есть имеющие в исходном состоянии удельную скорость роста меньше половины максимального значения, равную половине и больше половины. За конечное состояние культуры принимался момент достижения максимальной скорости роста, типичной для нелимитированной культуры. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3. Рост популяции дрожжей при переходе от лимитирования к насыщению

Из представленных данных следует, что после повышения концентрации любого из исследуемых веществ с лимитирующего уровня до насыщения максимальная скорость размножения, типичная для 30°С, достигается во втором поколении. Большую длительность первой генерации можно объяснить наличием стадии задержки роста после повышения концентрации. Взависимости от исходного состояния культуры длительность задержки роста составляет 0,5-1,5 часа. Однако при всех переходных процессах рост с максимальной скоростью начинается через 2,5-4,5 часа. Задержку роста можно объяснить перестройкой биохимических систем клетки при переходе от низкой скорости роста к максимальной, связанной с синтезом дополнительных ферментов.

Тем самым популяция дрожжей в течение 2,5-4,5 часов способна увеличить скорость размножения до максимального уровня. Очевидно, это свидетельствует о высоких адаптивных возможностях дрожжей.

Изучение динамики возрастного состава популяции дрожжей показало быстрое, в течение 1,5-3 часов, увеличение доли ювенильных клеток до нормы, то есть до 6,5-7%. В дальнейшем число клеток, проходящих ранние стадии митоза, постоянно. Это свидетельствует о равнозначном ускорении всех фаз развития дрожжевых клеток.

3.1.3 Влияние быстрого повышения концентрации 2,4-динитрофенола на рост турбидостатной культуры дрожжей

Адаптация популяции дрожжей в условиях перехода от состояния покоя к активному росту, от активного роста к покою, переход от лимитирования к насыщению, влияние температурного, рН фактора, осмотического фактора сопровождаются изменением в активности биоэнергетической системы.

Действие на рост и развитие клеток ингибиторов энергетических процессов изучено недостаточно. Вместе с тем исследование влияния ингибиторов на такую важную систему клетки, как система сопряжения дыхания и фосфорилирования, позволит выявить роль биоэнергетических процессов в регуляции роста и развития клеток.

Изучалось влияние 2,4-динитрофосфата (ДНФ) - ингибитора хемиосмотической биоэнергетической системы клетки. Достоинством данного ингибитора является его способность при определенных условиях проникать в клетку и разобщать дыхание и фосфорилирование как на уровне митохондрии, так и плазмолеммы. Содержание данного ингибитора в клетке можно регулировать при постоянстве его концентрации в среде. Регуляция концентрации ДНФ в клетке обусловлена его физико-химическими свойствами. Так, ДНФ является слабой кислотой. Для слабых кислот характерна относительно высокая степень диссоциации в нейтральных или близких к ним средах. При низком рН диссоциация снижается. Тем самым при рН7-рН6 доля ионов ДНФ, имеющих электрический заряд, значительно больше, чем при рН4-рН3. Вместе с тем, проницаемость клеточной оболочки для ионов значительно ниже, чем для нейтральных молекул. Следовательно, вероятность входа молекул ДНФ в клетку выше при низких значениях рН, чем при нейтральных. Проникая в клетку, имеющую нейтральную рН, молекулы ДНФ диссоциируют и нарушают градиент рН, обеспечивающий функцию системы фосфорилирования. Тем самым, изменяя рН среды в интервале рН4-рН6, можно регулировать степень ингибирования хемиосмотической биоэнергетической системы клетки и влиять на эффективность ее работы. В ранее проделанной работе было установлено, что динамика роста и развития дрожжей в интервале рН3,5-рН6 постоянна. Тем самым, в данном интервале рН среды является нейтральным фактором, и изменения в росте и развитии могут быть обусловлены, в основном, ДНФ. Опыты проводились с использованием турбидостата при 30°С и интенсивной аэрации.

В первой серии опытов изучали устойчивость дрожжей к быстрому повышению ДНФ. Концентрацию повышали за 0,5 минуты до уровней 2,5; 5; 7,5; 10 мг/л при рН4. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Влияние быстрого повышения концентрации 2,4-динитрофенола на рост дрожжей

Опыты показали, что длительность первой генерации увеличена. Во втором поколении наступает стабилизация скорости роста. Выявлены три типа ответной реакции. По первому типу популяция реагирует при повышении концентрации ДНФ до 5 мг/л с незначительным периодом задержки роста. По второму типу развивается ответная реакция при концентрациях 5,8-7,5 мг/л: отмечается длительный период задержки роста, превышающий период активного роста в первом поколении. При повышении концентрации до 10 мг/л рост прекращается и не возобновляется в течение 48 часов. Это третий тип ответной реакции. Во всех опытах не было отмечено изменение доли почкующихся клеток, что свидетельствует о сохранении отношения длительности различных стадий митоза. Обращает на себя внимание узкая область концентраций, 5-5,8 мг/л, в интервале которой резко возрастает время задержки роста в первом поколении. Данное явление свидетельствует о нелинейной зависимости эффекта от дозы при ингибировании биоэнергетической системы клетки и наличии узкой области качественного перехода.

Вместе с тем в длительных экспериментах было установлено, что при медленном, в течение 24 часов, повышении концентрации ДНФ рост дрожжей прекращается при содержании ингибитора 20-22 мг/л. Очевидно, у дрожжей при медленном повышении концентрации ДНФ формируется система защиты. Для выявления минимальной индуцирующей концентрации были проделаны опыты по следующей схеме. Дрожжи выращивались в течение 24 часов в присутствии ДНФ, затем концентрация доводилась до 10мг/л. Если в опыте отмечался рост, то данная концентрация считалась достаточной для индукции системы защиты. Ингибирующими были следующие концентрации ДНФ: 0,3; 0,6; 1,25; 2,5; 5; 7,5 мг/л. Установлено, что индукция отмечается в интервале концентраций 0,6-0,9 мг/л. Наиболее эффективной ингибирующей концентрацией является концентрация 2,5-5 мг/л. После предварительного культивирования при содержании ДНФ 2,5-5 мг/л рост дрожжей при 10 мг/л осуществляется без задержки, а длительность первой генерации составляет 3,5-3,8 часов. Тем самым, в данной серии экспериментов показано, что предварительное культивирование дрожжей в присутствии ДНФ позволяет затем проявлять устойчивость к той концентрации ДНФ, которая при одноразовом воздействии приводит к прекращению роста.

В следующей серии опытов было определено минимальное время, необходимое для индукции защитной системы. Дрожжи выращивались в течение 0,25-1 часа в присутствии ДНФ при концентрациях 0,9-7,5 мг/л. Затем концентрация повышалась до 10 мг/л. Установлено, что система защиты индуцируется наиболее быстро в течение 0,5 часа концентрациями ДНФ 1,25; 2,5; 5 мг/л. При экспозиции 0,25 часа индукция не отмечается. Концентрация ДНФ 7,5 мг/л индуцирует защитную систему через 2,5 часа. Особенностью последнего опыта является способность дрожжей формировать защитную систему при отсутствии роста и размножения.

Была прослежена динамика накопления ДНФ в дрожжевых клетках при различных режимах воздействия. Установлено два типа ответной реакции:

1. Переходные процессы без задержки роста при повышении концентрации ДНФ до 5 мг/л или предварительная выдержка при тех же концентрациях с дальнейшим повышением до 10 мг/л. Концентрация ДНФ в течение одного часа увеличивается до уровня 0,2-0,5 мг на 1 г биомассы дрожжей и сохраняется в течение всего опыта.

2. Переходные процессы с временной задержкой роста с одноразовым повышением концентрации ДНФ от 5,8 мг/л до 10 мг/л. В течение первых двух часов содержание ДНФ в клетках возрастает до 1-1,5 мг на 1г биомассы. Затем следует спад концентрации ДНФ в клетках до уровня 0,4-0,5 мг на 1г биомассы. После достижения этого уровня через 7-8 часов начинается рост дрожжей. Тем самым содержание ДНФ в клетках в первые 2 часа опыта определяющим образом влияет на кинетику роста и размножения дрожжей. Разобщители фосфорилирования широко используются в мире микрофлоры как средство подавления роста конкурирующих видов. К числу ингибиторов этого класса относятся слабые органические кислоты: уксусная, молочная, яблочная; а также неорганические: угольная, сероводородная и другие. Тем самым скорость индукции защитной системы и сама способность к индукции определяют устойчивость конкретного вида в борьбе за существование при доминирующей роли данного фактора.

По таким показателям, как устойчивость дрожжей к ДНФ, скорость индукции защитной системы, изучаемый вид имеет высокую степень защищенности от факторов разобщителей фосфорилирования. Очевидно, это свойство сформировалось вследствие постоянного проживания дрожжей в средах с повышенным содержанием кислот, в основном, угольной кислоты.

В дополнительных опытах было установлено, что предварительное выдерживание дрожжей в течение 24 часов при рН2,3 дрожжи сохраняют способность к росту и размножению после перенесения их в среду с содержанием ДНФ до 12,5 мг/л. Тем самым рост дрожжей в закисленной среде индуцирует систему защиты и разобщителя фосфорилирования.

Показателем высокой защищенности биоэнергетической системы у дрожжей к воздействию ДНФ служит следующий опыт: рост дрожжей был остановлен при рН4 одноразовым добавлением ДНФ до концентрации 10мг/л. Через 24 часа рН среды был изменен рН4 > рН6. После такого перехода ДНФ быстро вышел из клеток, и через 0,5 часа турбидостатная культура дрожжей достигла максимальной скорости размножения. Очевидно, длительное, в течение 24 часов, присутствие ингибитора в дрожжевой клетке не привело к необратимым изменениям, и генеративная активность восстановилась без какой-либо существенной задержки.

3.1.4 Рост турбидостатной культуры дрожжей при высокой концентрации веществ в стационарном режиме и в условиях осмотического шока

Адаптация природных популяций дрожжей к концентрированным средам происходит при естественном высушивании субстрата: плодов, ягод, растительных соков. Степень обезвоживания может быть значительной. При этом концентрация веществ увеличивается, и дрожжи вынуждены адаптироваться к средам с высокой осмотической активностью. В предыдущих разделах рассматривались минимальные концентрации компонентов среды, при которых возможен рост дрожжей. В данном разделе изучалось влияние высоких концентраций растворенных веществ на рост дрожжей. Изучалось влияние веществ, входящих в состав питательной среды: (NH₄)₂SO₄, NaH₂PO₄, KCl, MgSO₄, глюкозы, биотина, ?-аланина, а также изучалось влияние дополнительных веществ: сахарозы, NaCl, (NH₄)₂SO₄, NH₄Cl, LiCl. Использовались вещества, имеющие класс чистоты "химически чистое", концентрации приводятся для безводных форм соединений. Опыты проводились с применением турбидостата при 30°С и интенсивной аэрации. Концентрацию измеряли в молярных единицах и повышали ступенчато на 0,25моль. Дрожжи выращивались в стационарных условиях в течение 12поколений. По истечении этого времени измеряли изучаемые параметры. Затем концентрация вновь повышалась на 0,25 моль. Изучаемыми показателями были: удельная скорость роста, длительность генеративного цикла, возрастной состав культуры, объем клеток, потребление глюкозы, содержание изучаемых веществ в клетке.

В другой серии опытов изучалась адаптация дрожжей к быстрому повышению концентрации в режиме осмотического шока. Изучались следующие вещества: NH₄CI, NaH₂PO₄, MgCL₂, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, KCI, NaCl. Концентрацию изменяли за 3-4 минуты от оптимального уровня до уровня, при котором скорость роста замедляется в два раза. После полной адаптации производился обратный переход. Слежение за изучаемыми показателями велось непрерывно.

В опытах со стационарными культурами было установлено, что замедление скорости размножения дрожжей отмечается при концентрации MgSO₄ 1,6 моль, глюкозы - 1,25 моль. Другие вещества начинали оказывать влияние на скорость размножения дрожжей при концентрации 0,3-0,6 моль. Биотин из-за слабой растворимости не оказывал влияния на рост дрожжей. Полученные результаты позволяют распределить изучаемые вещества в порядке возрастания их ингибирующей активности. Показатель ингибирующей активности определялся по формуле:

где:

J - ингибирующая активность

С - концентрация в молях, при которой происходит двукратное замедление скорости размножения.

Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние растворенных веществ на скорость размножения дрожжей

Из представленных данных следует, что ингибирующая активность не зависит от осмотического эффекта и определяется природой вещества. По устойчивости к глюкозе и MgSO₄ дрожжи могут быть классифицированы как экстремальные галофилы, по отношению к другим веществам - как умеренные галофилы. Витаминная добавка ?-аланин (предшественник в синтезе пантогеновой кислоты) оказывает то же влияние, что и минеральные добавки. Замедление скорости размножения в два раза для большинства изученных веществ отмечается в интервале концентраций 0,9-1,3 моль.

Особое внимание обращает на себя высокая ингибирующая активность ионов щелочного металла лития. Очевидно, этот эффект связан с токсическим действием. Ингибирующая активность другого иона - магния - существенно зависит от природы катиона. Так, в виде MgSO₄ ион магния в 2 раза менее активен, чем в виде MgCl₂.

Были проведены опыты для сравнения ингибирующей активности ионов лития с ионами тяжелых металлов. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Влияние тяжелых металлов на дрожжи

Из приведенных данных следует, что по уровню токсичности ионы лития сходны с ионами таких тяжелых металлов, как марганец, железо, цинк. По внешнему проявлению их сближает то, что отмечается адаптация у дрожжей к данным ионам с постепенным увеличением скорости размножения. Так, при содержании в среде LiCl 0,02моль удельная скорость роста µ=0,06 ч^-1, но через 72 часа этот показатель возрос с µ=0,06 до µ=0,13 ч^-1.

Аналогичные результаты были получены в опытах с ионами никеля, цинка, железа. Можно предположить, что, несмотря на большие различия в химических свойствах лития и тяжелых металлов, у них есть общие моменты по воздействию на дрожжи, в то время как у ионов калия, натрия, аммония, магния, глюкозы и сахарозы адаптивного эффекта с увеличением скорости размножения не было обнаружено.

В следующий серии опытов изучалось влияние концентрированных веществ на такие показатели, как объем клеток, общий экономический коэффициент по глюкозе, возрастной состав популяций. Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7. Объем клеток, потребление глюкозы, возрастной состав популяции дрожжей у ингибированной культуры при половинной скорости роста µ = 0,15ч^-1

Из приведенных данных следует, что возрастной состав популяций при высоких концентрациях веществ остался тем же, что и при культивировании в оптимальной среде. Если это явление наблюдается на фоне замедленной скорости размножения, то это свидетельствует о пропорциональном замедлении скорости прохождения клеткой всех стадий митоза. Расход глюкозы на поддержание жизни и роста в концентрированных средах возрастает, кроме культур, ингибированных NaH₂PO₄. Наиболее значительно повышение расхода при ингибировании КСl и NH₄Cl. Объем клеток уменьшен при культивировании в средах с MgSO₄, NH₄CI. Влияние других веществ на объем клеток незначительно. Очевидно, это явление не может быть объяснено одним только осмотическим эффектом. Согласно полученным результатам, дрожжи способны расти и размножаться в широком диапазоне концентрации растворенных веществ, от нескольких миллиграммов на 1 л до сотен граммов. В последнем случае дрожжи по своей устойчивости проявляют свойство галофилов. У галофилов устойчивость к высоким концентрациям сформировалась в процессе эволюции и достигается, в основном, за счет повышения устойчивости внутриклеточных компонентов к концентрированным растворам, так как у галофилов внутриклеточная концентрация ионов почти не отличается от внеклеточной. Внешние проявления этого свойства заключаются в том, что клетки галофилов тонут в концентрированных растворах. Дрожжевые же клетки в концентрированных растворах всплывают. Это свидетельствует о том, что внутриклеточное содержание веществ меньше, чем в среде. Дрожжи, очевидно, сохраняют удельный вес, равный 1,05-1,1, наблюдаемый в оптимальных условиях. По этой причине механизм адаптации дрожжей и галофилов к высоким концентрациям может отличаться. С целью более подробного изучения этого вопроса проводили прямое измерение содержания различных ионов в клетке дрожжей. Проводились опыты как с активно растущей культурой, так и культурой в состоянии покоя. Состояние покоя достигалось пересевом в среду без глюкозы. В данном случае выяснялась роль биоэнергетических систем в поддержании градиента концентрации в направлении среда > клетка. Продолжительность опыта составляла 24 часа. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8. Содержание ионов внутри клетки дрожжей у покоящихся и размножающихся культур

Из представленных данных следует, что во всех опытах отмечается значительный градиент концентрации в системе среда > клетка. Содержание изучаемых ионов в дрожжевой клетке значительно меньше, чем в среде.

При этом содержание ионов NH₄⁺ в клетке не зависит от активности биоэнергетических систем. Содержание ионов Mg²⁺ существенно зависит от содержания в среде обитания источника углерода и энергии - глюкозы. В опытах с К⁺ установлено более высокое содержание изучаемого иона у активно растущей клетки, чем у покоящейся. Очевидно, физиологические и биохимические механизмы адаптации дрожжей к каждому конкретному иону специфичны. Так, ионы Mg²⁺ активно удаляются из клетки при наличии источника энергии. Дрейф ионов NH₄⁺ не зависит от энергетического потенциала клетки. Ионы К⁺ в большем количестве содержатся в активных клетках. Очевидно, это необходимо для поддержания жизнедеятельности, так как поддержание трансмембранного потенциала клетки осуществляется в режиме антипорта К⁺ - Н²⁺. Общим моментом для всех изученных ионов является предел насыщения ими цитоплазмы. При достижении некоторой пороговой величины, различной для каждого иона, диффузия прекращается и устанавливается равновесное состояние. Наиболее значимо это явление для покоящихся клеток.