Влияние экологически значимых факторов на биокинетические показатели микроорганизмов

В следующей серии опытов изучали переходные процессы у популяции дрожжей при быстрой смене концентрации веществ от оптимального уровня до ингибирующего и обратные переходы.

Опыты проводились в турбидостате при 30°С. Изучаемыми показателями были: удельная скорость роста, длительность генеративного цикла и возрастной состав популяции. Признаком завершения переходного процесса была стабилизация удельной скорости роста. Изучались переходные процессы с участием следующих веществ: NaH₂PO₄, MgСl₂, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄, KC1, NaCl. Концентрация действующего вещества изменялась от 0,01моль до 1моль и обратно. В опытах с MgSO₄, концентрация изменялась в варианте 0,01моль - 2моль. Повышение концентрации достигалось добавлением в ферментер и ёмкость со средой необходимого количества изучаемого вещества. Понижение обеспечивалось центрифугированием и отмывкой культуры с переносом в подготовленную среду. Результаты представлены в таблице 9. Уклонение от средней - менее 10%.

Таблица 9. Переходные процессы при смене концентрации веществ

Из представленных данных следует, что стабилизация изучаемого показателя наступает во втором-третьем поколении. Наиболее быстро завершаются переходные процессы при понижении концентрации. Переходные процессы 1 > 0,01моль с участием NaH₂PO₄ и (NH₄)₂SO₄ завершаются в первом поколении. При других переходных процессах стабильное состояние у популяции наступает в третьем поколении. Доля почкующихся клеток изменяется незначительно, что свидетельствует о слабом влиянии фактора концентрации на длительность элементов митотического цикла.

Изучение кинетики удельной скорости роста позволило выявить сходство в ответной реакции популяции дрожжей на повышение концентрации изучаемых веществ. Для всей группы таких переходных процессов характерно замедление скорости размножения в первые 2-4 часа от начала опыта. При этом отмечается полная остановка роста различной продолжительности от 0,5 часа до 1-2 часов. На второй стадии ответной реакции скорость размножения резко увеличивается. При этом в переходных процессах с участием MgSO₄, КС1, (NH₄)₂SO₄ удельная скорость роста достигает максимального значения, типичного для оптимальных условий, где µ=0,3 ч^-1. Продолжительность периода аномальной скорости роста сравнима с длительностью одной генерации. Затем следует снижение скорости размножения. Очевидно, первый этап замедления и остановки роста можно рассматривать как стадию предадаптации популяции, увеличение скорости отражает максимальную реализацию адаптивных функций, а следующее за этим замедление - истощение адаптивных проявлений. Вместе с тем эти явления наблюдаются не при всех переходных процессах. Так, при повышении концентрации NaCl после замедления скорости размножения на первой стадии следует период стационарного роста, где µ=0,15 ч^-1. При понижении концентрации на первом этапе отмечается увеличение скорости размножения в первые 2 часа. Затем в колебательном режиме скорость размножения переходит на стабильный режим. Сложный и длительный колебательный режим скорости размножения при переходных процессах с повышением и понижением концентрации, очевидно, свидетельствует об участии в этом процессе одновременно нескольких клеточных систем. В свою очередь, генерализованная ответная реакция является следствием баланса многокомпонентной системы. Вместе с тем быстрый переход на стационарный режим за период времени меньший, чем продолжительность одной генерации, свидетельствует о доминирующей роли одной системы, определяющей скорость размножения дрожжей. Это явление наблюдается при быстром повышении концентрации NaCl и быстром понижении концентрации NaH₂PO₄ и (NH₄)₂SO₄. По результатам проделанной работы можно сделать выводы: ингибирующая активность зависит от природы вещества, а не от осмотического эффекта. Изучаемые вещества оказывают одинаковое влияние на все стадии митоза без искажения возрастного состава популяции. Объем клеток изменяется незначительно, кроме опытов с NH₄Cl и MgSO₄. Внутриклеточное содержание ионов значительно меньше, чем в окружающей среде. Общий экономический коэффициент по глюкозе в концентрированных растворах понижен, но поддержание градиента концентрации не может быть объяснено активностью только биоэнергетических систем клеток. Длительность адаптации дрожжей к быстрой смене концентрации зависит от природы вещества.

3.1.5 Влияние быстрой смены pH на рост турбидостатной культуры дрожжей Saccaharomyces cerevisiae

Рост и развитие природных популяций дрожжей осуществляется, в ряде случаев, при непостоянном значении рН среды. Причины закисления среды обитания могут быть различными. Так, при активном брожении в застойных зонах происходит насыщение среды CO₂. Образующаяся угольная кислота в виде насыщенного раствора при 20-30°С имеет рН3,5-рН4,5. При усвоении источника азота в виде сульфатов или нитратов среда закисляется серной и азотной кислотой. Смещение рН достигает уровня рН2,5-рН2,2. Совместное проживание дрожжей с молочнокислыми и уксуснокислыми микроорганизмами также приводит к закислению среды соответствующими кислотами.

Переход от закисления к норме возможен при выходе СО₂ из раствора при восстановлении контакта среды обитания с атмосферным воздухом. Удаление минеральных и органических кислот происходит при вымывании их дождевой водой или утилизацией их другими видами представителей микрофлоры.

В предварительных опытах было установлено, что популяция дрожжей сохраняет постоянную скорость роста, объем клеток, возрастной состав в интервале рН7-рН3,5. Так, при температуре 32°С при рН7-рН3,5 дрожжи имеют удельную скорость роста µ=0,32 ч^-1, доля почкующихся клеток 6,2%. Двукратное замедление скорости размножения наступает при рН2,35. Полная остановка роста происходит при рН2,2. В условиях ингибирования роста происходит уменьшение доли почкующихся клеток, увеличение объема клеток, увеличение длительности генеративного цикла. Так, при рН2,35 при 32°С длительность генеративного цикла увеличивается в 2раза против нормы, то есть, с 2,2 часа до 4,4 часа. Объем клеток возрастает в 1,5 раза, доля почкующихся клеток понижается и составляет 2,9%.

В данном разделе рассматриваются кинетические изменения таких показателей, как длительность генеративного цикла, возрастной состав, объем клеток при изменении рН 2,35 - рН4.

При переходе рН4 > рН2,35 в течение первых трех часов объем клеток уменьшается, затем возрастает и стабилизируется на новом уровне. Доля почкующихся клеток уменьшается в течение первых 1,5 часов. Затем их доля возрастает с максимумом через 2,5-3,5 часа от начала опыта. Их доля в максимуме составляет 15-17%, что в 2,5-3 раза больше нормы в оптимальных условиях. Длительность первой генерации увеличивается с 2,2 часа до 5,1часа. Стабилизация показателя достигается во втором поколении.

Переход рН2,35 > рН4 протекает более гладко. Объем клеток быстро уменьшается, достигая стабильного значения через 1 час от начала опыта. Доля почкующихся клеток плавно возрастает, достигая нормы через 5-6 часов. Длительность генеративного цикла изменяется с 4,4 часа до нормы - 2,2часа в первом поколении.

Для переходов рН4 > рН2,35 характерно значительное замедление ювенильной фазы развития клетки в интервале 2,5-3,5 часа от начала опыта. Данное замедление нарушает баланс скоростей прохождения клеткой ранних и поздних стадий митоза. При переходном процессе в течение значительного времени длительность ювенильной фазы при рН2,35 увеличена, в то время как при этом же рН для стационарной культуры данный период сокращен, и доля ювенильных клеток снижена до 2,9%. Вместе с тем обращает на себя внимание высокая стойкость дрожжей к рН фактору. Так, большинство представителей микрофлоры прекращает рост при рН4 > рН5. В свою очередь дрожжи проявляют свойство ацидофилов, сохраняя способность к росту при рН до 2,2. Механизм быстрой реадаптации дрожжей при переходах рН2,35 > рН4 осуществляется, очевидно, по принципу "узкого звена". Так, быстрые переходы свидетельствуют об изменении активности небольшого числа ферментативных реакций. Обычно это одна реакция или одна система регуляции. Механизм действия рН фактора сводится к его влиянию на биоэнергетическую систему клетки. Так, хемиосмотическая биоэнергетическая система клетки функционирует за счет поддержания градиента концентрации ионов водорода. Внутри клетки поддерживается рН, близкая к рН7. На внешней мембране накапливаются ионы Н⁺. Тем самым, клетка в активном состоянии представляет конденсатор, где в роли изолятора выступает клеточная оболочка. Синтез АТФ, как было показано в классических работах Митчела, осуществляется за счет управляемого потока зарядов в направлении среда > клетка, вынос ионов Н⁺ из клетки сопряжен со значительными энергозатратами. Наконец, при достижении нулевого энергетического баланса рост и размножение клетки прекращаются. Тем самым, представленные в данном разделе результаты свидетельствуют о влиянии энергетических потоков на динамику изучаемых показателей.

3.1.6 Переходные процессы при изменении содержания кислорода в среде обитания дрожжей

Моделировалась ситуация, при которой поток кислорода в клетку снижался, а затем вновь восстанавливался. Это происходит, например, при погружении клеток на большую глубину в воду с последующим всплытием. При переходах от дыхания к гипоксии переходный процесс длится 8-9 часов и заканчивается во втором поколении. Доля ювенильных клеток летом снижается более чем в два раза, объем клеток увеличивается в 1,5 раза. При восстановлении аэрации переходный процесс завершается в первом поколении через 4-5 часов. Поскольку при данном переходном процессе изменяются все изучаемые показатели, то данное воздействие может быть использовано как средство управление ими.

3.1.7 Адаптация турбидостатной культуры дрожжей к быстрой смене источников азота, углерода и энергии

Изучаемый вид дрожжей для поддержания жизни и роста нуждается в источнике углерода и энергии, фосфора, азота, калия, магния, ?-аланина, биотина. Действующей частью источника фосфора является анион РО₄^-3, магния и калия - катионы Mg⁺² и К⁺¹. Данные ионы не имеют аналогов, то же можно сказать о биотине и ?-аланине. В свою очередь, дрожжи способны усваивать разнообразные источники азота и различные углеводы. Природные популяции дрожжей по мере истощения в субстрате какого-либо источника азота или углевода вынуждены переключаться на новый источник.

В данном разделе рассматриваются источники азота: сульфат аммония, карбамид, аспарагин, и углеводы: глюкоза, сахароза, мальтоза. В опытах дрожжи выращивались в течение 12 поколений на том или ином источнике при 30°С. Содержимое ферментера турбидостата сливалось, центрифугировалось, биомасса отмывалась дистиллятом. Затем отмытая биомасса возвращалась в ферментер, в котором среда была изменена по изучаемому источнику, и велось наблюдение за динамикой адаптации. Изучались следующие переходные процессы по источникам азота: сульфат аммония > карбамид; карбамид > сульфат аммония; сульфат аммония > аспарагин; аспарагин > сульфат аммония; аспарагин > карбамид; карбамид > аспарагин. По источникам углеводов: глюкоза > сахароза; сахароза > глюкоза; сахароза > мальтоза; глюкоза > мальтоза; мальтоза > сахароза; мальтоза > глюкоза. Концентрация изучаемых веществ составляла 1 г/л.

Дрожжи способны усваивать каждый из перечисленных источников. Удельная скорость роста при 30°С составляет на каждом из источников µ=0,3ч^-1, а длительность генерации 2-3 часа.

Выбор изучаемых веществ был обусловлен особенностью их биохимической трансформации дрожжевыми клетками.

Так, источник азота превращается в основном в аминокислоты. В аминокислотах азот содержится в виде аминогруппе NH₂. В виде аминогруппы органические вещества содержатся в карбамиде (NH₂)₂СО. Тем самым, если осуществляется переход (NH₂)₂СО > (NH₄)₂SO₄, то дрожжам необходим синтез группы ферментов для обеспечения трансформации NH₄ > NH₂. При обратном переходе (NH₄)₂SO₄ > (NH₂)₂СО группа ферментов, обеспечивающая превращение NH₄ > NH₂, исчезает. Тем самым в одном переходном процессе должна осуществляться индукция синтеза ферментов, в другом - деградация этих ферментов. В свою очередь, аспарагин (Asn) является одним из базовых соединений, из которого дрожжи за счет незначительного числа ферментативных реакций синтезируют весь аминокислотный компонент клетки. Тем самым при поступлении аспарагина исчезает необходимость в ферментах, обеспечивающих все предшествующие пути трансформации азота. При обратном переходе Asn > NH₄ или Asn > NH₂ синтезируется весь комплекс ферментов, необходимых для утилизации азота.

С индукцией синтеза ферментов связано также усвоение изучаемых углеводов. Так, моносахара глюкоза и фруктоза с участием переносчиков проникают в клетку. В свою очередь дисахара сахароза и мальтоза не проникают. Для обеспечения их доступности для дрожжей необходимо участие ферментов, локализованных на внешней оболочке клетки. Дальше гидролитические ферменты превращают молекулу сахарозы в два моносахара: глюкозу и фруктозу. Мальтоза расщепляется в две молекулы глюкозы. Тем самым подготовка сахарозы и мальтозы требует участия двух различных ферментных систем. В дальнейшем для усвоения продуктов гидролиза сахарозы - глюкозы и фруктозы - требуется группа ферментов, отличная от тех, которые необходимы для усвоения одной глюкозы - продукта гидролиза мальтозы.

Тем самым смена изучаемых источников азота и углеводов сопровождается индукцией синтеза ферментов с участием ядра клетки.

Результаты экспериментов по адаптации дрожжей к источнику азота представлены в таблице 10.

Таблица 10. Переходные процессы при смене источника азота

Из представленных данных следует, что длительность генеративного цикла 2,3 часа, типичная для популяций, растущих в стационарных условиях, устанавливается в основном в третьем поколении. Наиболее быстро происходит адаптация к аспарагину и сульфату аммония. Адаптация к карбамиду наиболее длительна. Для таких переходных процессов характерна стадия медленного роста в течение первого поколения.

Результаты экспериментов по изучению адаптации дрожжей к углеводам представлены в таблице 11.

Таблица 11. Переходные процессы при смене сахаров

Длительность адаптивного процесса при смене углеводов наибольшая при участии дисахаров. Однако во втором поколении переходный процесс завершается. Сравнение длительности переходных процессов при смене источника азота и при смене источника углерода и энергии показывает, что адаптация к углеводам осуществляется с большей скоростью. Возможно, это объясняется тем, что дрожжи в природных условиях чаще меняют источник углеводов, чем азота. По этой причине более развита адаптивная функция по отношению к углеводам. Изучение кинетики процесса адаптации показало отсутствие периодов остановки роста при смене изучаемых веществ. Очевидно, это свидетельствует о высокой лабильности индуцируемых систем. Уже через 10-15 минут после смены источника отмечается размножение клеток со скоростью, равной половине максимальной или больше половины.

3.1.8 Управление морфофизиологическими показателями у хемостатной культуры дрожжей

Изучение хемостатной культуры показало, что наиболее эффективное культивирование по показателю выхода биомассы протекает при больших скоростях протока при лимитировании глюкозой. Наибольший выход биомассы, очевидно, обеспечивается тем, что при лимитировании глюкозой исключается эффект катаболитной репрессии, и источник углерода и энергии используется более полно, в то время как при лимитировании источниками фосфора и азота глюкоза расходуется нерационально. При этом использование лимитирующего фактора является хорошим средством регуляции возрастного состава популяции. Концентрация ювенильных клеток прямо зависит от скорости протока. Наблюдается рост за счет резервного запаса веществ. Наиболее значимы запасы магния и биотина. При отсутствии внешнего источника этих веществ дрожжи увеличивают биомассу в 5-10 раз. При отсутствии глюкозы рост дрожжей отсутствует. Очевидно, глюкоза не накапливается в клетках.

3.2 Влияние на проточную культуру дрожжей физического фактора - температуры культивирования

Собственные исследования позволили обнаружить следующие закономерности в ответной реакции турбидостатной культуры дрожжей в ответ на изменение температуры культивирования. Так, было установлено, что величина таких показателей, как удельная скорость роста, доля ювенильных клеток, объем клеток, непостоянна в течение нескольких поколений после смены температуры. При повышении температуры во всех экспериментах наблюдаются длительные периоды, при которых удельная скорость роста значительно превышает ее значение при исходной и конечной температуре, установленной у культуры, растущей при постоянном температурном режиме. При тех же температурных переходах отмечены периоды полной или почти полной остановки роста. Аналогичные явления имеют место и при понижении температуры, за исключением температурных переходов 39°С >14°С и 37,5°С >20°С, где значение удельной скорости роста в течение опыта не превышает величины этого показателя у стационарных культур. Значительные колебания величины удельной скорости роста можно объяснить тем, что дрожжи, находящиеся в различных стадиях развития, неодинаково реагируют на изменение температуры. Это, в свою очередь, приводит к значительному изменению возрастного состава культуры при температурных переходах. Обычно уменьшение доли ювенильных клеток в культуре предшествует периоду снижения удельной скорости роста, а возрастание числа таких клеток способствует увеличению скорости роста. Изменение объема клеток при температурных переходах отличается большим разнообразием. При переходах с повышением температуры в области 14°С ? 33°С, в области 36°С ? 39°С и при переходах (14°С ? 30°С) > (36°С ? 39°С) в течение первого поколения отмечаются периоды быстрого увеличения объема клеток. При температурных переходах с понижением температуры (36°С ? 39°С) > (14°С ? 30°С) и в области 36°С ? 39°С в первом поколении происходит быстрое уменьшение объема клеток. При аналогичных температурных переходах в области 14°С ? 30°С изменения объема незначительны. Анализ переходных процессов по значению такого показателя, как время удвоения числа клеток, позволяет выделить три типа ответной реакции у турбидостатной культуры дрожжей на смену температуры культивирования. К первому типу ответной реакции относятся те переходные процессы, при которых длительность первого удвоения числа клеток после температурного перехода t?₁ > t?₂ не более, чем на 20% отличается от длительности этого процесса при t?₁ в условиях стационарного температурного режима. Это температурные переходы в области 14°С ? 33°С как с повышением, так и с понижением температуры, переходы в области 36°С ? 39°С с понижением температуры, а также переходы 33°С > 36°С и 25°С > 36°С. При данных температурных переходах переходный процесс, по показателю времени удвоения числа клеток, завершается в первом поколении. Ко второму типу относятся те переходные процессы, при которых длительность удвоения числа клеток, отмеченная для t?₂ при постоянной температуре, устанавливается во втором-третьем поколении. Это явление установлено для температурных переходов (37,5°С ? 39°С) > (14°С ? 33°С) и при переходах в области 36°С ? 39°С при повышении температуры. К третьей группе были отнесены наиболее длительно протекающие переходные процессы со стабилизацией длительности удвоения числа клеток в пятом-шестом поколении. Это наблюдается при температурных переходах (14°С ? 33°С) > (37,5°С ? 39°С). Анализ полученных результатов позволяет утверждать, что, по показателю времени удвоения числа клеток, наиболее быстро переходные процессы завершаются при смене температуры при любых вариантах температурных переходов и в области супраоптимальной температуры с понижением температуры. Промежуточными по длительности, переходными процессами являются переходы, в области супраоптимальной температуры с повышением температуры и при переходах из супраоптимальной в субоптимальную-оптимальную область, а также температурные переходы 33°С > 36°С и 25°С > 36°С. Наиболее длительные переходные процессы отмечены для температурных переходов из области субоптимальной-оптимальной температуры в супраоптимальную область. Была установлена следующая закономерность: в интервале температур 12°С ? 39°С дрожжи находятся в двух физиологических состояниях. Одно присуще им при температуре 12°С ? 39°С, другое - при 36°С ? 39°С. В свою очередь, длительность переходного процесса минимальна (1-2 поколения) при температурных переходах в пределах каждого из физиологических состояний. Длительность же переходного процесса из одного состояния в другое максимальна и составляет 3-6 поколений. Температурные переходы в ряде случаев сопровождаются значительным увеличением скорости размножения клеток. Так, при переходах 14°С > 30°С; 14°С > 20°С; 14°С> 33°С; 14°С > 25°С - в 1,7-2,8 раза, 39°С > 36°С; 39°С > 37,5°С; 39°С > 33°С; 14°С > 39°С; 20°С > 37,5°С время удвоения числа клеток в течение одного поколения сокращается против исходного в 1,7-3,6 раза. Однако, длительность переходного процесса по данному показателю при таких температурных переходах неодинакова. При одних вариантах смены температуры переходный процесс завершается в первом поколении, при других - в пятом-шестом поколении. Особо следует отметить температурные переходы 14°С > 39°С и 20°С > 37,5°С, где длительность удвоения числа клеток в первом поколении в 2-3 раза меньше, чем при t?₁ и t?₂ в стационарном температурном режиме. Очевидно, в данных опытах супраоптимальная температура на протяжении первых поколений выступает в роли не ингибитора роста, а в роли активатора.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что дрожжи имеют высокую защищенность от перегрева. Так, при температурных переходах (14°С ? 33°С) > (37,5°С ? 39°С) культура на протяжении ряда поколений сохраняет скорость размножения большую, чем при супраоптимальной температуре при постоянном температурном режиме культивирования. Отличие дрожжей, растущих при постоянной температуре, в области субоптимальной-оптимальной температуры, от культуры, растущей при супраоптимальной температуре, наблюдается и на морфологическом уровне. Так, при температурах 14°С и 39°С, 20°С и 37,5°С, 25°С и 36°С удельная скорость роста в каждой паре температур одинакова. Однако по таким показателям, как объем клетки, возрастной состав, установлено различие. Различие между такими культурами особенно проявляется при переходных процессах. Как было установлено опытным путем, дрожжам требуется значительное время для изменения своего состояния. Так, для изменения своих свойств необходимо дрожжи, выросшие при 37,5°С, выдержать в течение 0,75-1 поколения при 20°С, а дрожжи, выросшие при 20°С, необходимо экспонировать при 37,5°С в течение трех поколений. Это хорошо согласуется с ходом суточной температуры. Так, свойство временной термотолерантности, позволяющее дрожжам размножаться с высокой скоростью при высоких температурах, полностью формируется при субоптимальной температуре в течение 8-9 часов. Это совпадает с длительностью ночного понижения температуры. А длительность проявления временной термотолерантности составляет 7-8 часов, что совпадает с продолжительностью периода максимума температур в течение суток.

Анализ полученных результатов показывает, что длительность переходного процесса при быстрой смене температуры культивирования минимальна в границах каждого из физиологических состояний дрожжей. Так, перестройка на новый режим скорости размножения при температурных переходах в области температур 14°С ? 33°С и 36°С ? 39°С завершается в первом-втором поколениях. При температурных переходах из одной области в другую (14°С ? 33°С) - (36°С ? 39°С) процесс перестройки скорости размножения длится три-шесть поколений. Наиболее длителен процесс при повышении температуры. Очевидно, что смена одного состояния на другое требует очень глубоких структурных и функциональных изменений в дрожжевой клетке.

В представленной работе выявлены некоторые закономерности поведения дрожжей в условиях быстрой смены температур культивирования в диапазоне 14°С - 40°С. Полученные данные позволяют предсказать динамику параметров генеративной активности и процента почкующихся клеток при различных температурных переходах. Это, в свою очередь, позволяет использовать тепловой фактор как средство управления ростом и развитием дрожжевой культуры.

Полученные результаты позволяют утверждать следующее. При температурном ходе в направлении 14°С > 30°С скорость размножения дрожжей перестраивается на новый режим в течение одного поколения. Тем самым, при повышении температуры в период с ночного времени к полуденному скорость размножения дрожжей безынерционно увеличивается. При дальнейшем повышении температуры отмечается инерционность в скорости размножения дрожжей. Так, в переходных условиях при смене температуры на супраоптимальную (14°С ? 33°С)> (36°С ? 40°С) дрожжи в течение нескольких поколений размножаются со скоростью, близкой к той, которая отмечена для оптимальной температуры. Время, в течение которого сохраняется это свойство, совпадает с длительностью периода послеполуденного повышения температуры. Тем самым такая инерционность позволяет дрожжам переживать период максимума температуры без потери в скорости размножения. Очевидно, такой способ защиты от перегрева дает значительные преимущества природным популяциям дрожжей. Вместе с тем, данное свойство постоянно восстанавливается в периоды ночного понижения температуры или в дневное время при похолодании. Возможно, что свойство временной термотолерантности позволяет дрожжам значительно расширить географический ареал обитания и адаптироваться к климатическим условиям, типичным для субтропических и тропических широт. В опытах было установлено, что фактор, обеспечивающий устойчивость дрожжей к перегреву, синтезируется при понижении температуры от 33°С и ниже. Следовательно, устойчивость к перегреву формируется в период дневного или ночного понижения температуры.

3.2.1 Лимитированная турбидостатная культура дрожжей в условиях теплового стресса

Изучаемый вид дрожжей имеет температурный оптимум в интервале 30°С - 33°С. В свою очередь, природные популяции дрожжей в летнее время, в полуденное и послеполуденное время, прогреваются до супраоптимальной температуры. Наиболее часто это отмечается в средних и низких географических широтах.

В опытах с нелимитированной культурой было установлено, что наибольшая удельная скорость роста (µ=0,3ч^-1) достигается при температуре 30°С - 33°С. При температуре 37,5°С скорость роста снижается при стационарном культивировании в 2 раза и составляет µ=0,15 ч^-1. При быстром повышении температуры 30°С > 37,5°С дрожжи проявляют свойство временной термотолерантности. Данное свойство позволяет дрожжам в течение 2-3 поколений при 37,5°С сохранять максимальную скорость роста. Очевидно, это явление имеет адаптивную значимость и позволяет популяции дрожжей переживать периоды дневного повышения температуры без потери скорости роста. Время, в течение которого свойство временной термотолерантности сохраняется, составляет 5-8 часов, что совпадает с длительностью дневного минимума температуры. В свою очередь, синтез системы термотолерантности осуществляется при субоптимальной-оптимальной температуре. Длительность периода синтеза составляет 4-8 часов, что совпадает с длительностью ночного понижения температуры. Тем самым, в период ночного минимума температуры дрожжи формируют термозащитную систему, которая реализуется в период дневного максимума температур.

В свою очередь, природные популяции дрожжей часто осуществляют жизненный цикл в условиях лимитирования их роста тем или иным компонентом среды. Было предположено, что недостаток в среде обитания жизненно важных элементов питания должен оказать влияние на устойчивость дрожжей к перегреву.

Для проверки данного предположения проводились опыты с лимитированной культурой. Дрожжи в течение 12 поколений выращивались при 30°С в лимитированных условиях. Затем температура повышалась до 37,5°С, и велось наблюдение за динамикой таких показателей, как длительность генеративного цикла, удельная скорость роста, возрастной состав популяции, площадь поверхности клеток. Длительность экспериментов составляла 24часа. Изучались культуры, лимитированные следующими источниками питания: источники азота (NH₄)₂SO₄, фосфора NаH₂PO₄, калия K₂SO₄, магния MgSO₄, глюкоза, ?-аланин, биотин. Изучались популяции, находящиеся при двух уровнях лимитирования. Температура повышалась за 4 минуты. Результаты экспериментов представлены в таблице 12.

Таблица 12. Зависимость термоустойчивости дрожжей от природы лимитирующего фактора

Из представленных данных следует, что термочувствительность популяции дрожжей зависит как от природы лимитирующего фактора, так и от глубины лимитирования.

Так, в условиях лимитирования источниками фосфора, глюкозы рост дрожжей прекращается при 37,5°С, если исходная скорость роста меньше или равна половине максимального значения. Культуры, лимитированные калием, прекращают рост, если исходная скорость роста меньше половины максимума. При недостатке в среде глюкозы и фосфора в условиях, где рост возможен при 37,5°С, длительность первого генеративного цикла увеличивается в 1,7-2,5 раза против исходного значения при 30°С. Данное явление усиливается во втором поколении.

Тем самым недостаточная концентрация в среде обитания источников калия, фосфора, глюкозы является определяющим фактором, влияющим на термоустойчивость дрожжей.

В свою очередь, недостаток в среде магния, азота, биотина несущественно влияет на термотолерантность дрожжей. Скорость размножения в условиях лимитирования данными веществами при 37,5°С снижается не более, чем на 20%, а при лимитировании ?-аланином отмечено даже увеличение скорости размножения в первом поколении.

Детальное исследование кинетики ответной реакции лимитированных культур показало, что при повышении температуры скорость размножения безынерционно переключается на новый режим при недостатке в среде обитания источников азота, ?-аланина. При недостатке в среде глюкозы, калия, биотина безынерционное переключение установлено у популяций, где исходное значение удельной скорости больше половины максимальной. При меньших исходных скоростях размножения при 30°С отмечен период времени 2-4 часа, в течение которого происходит перестройка скорости роста. При недостатке в среде фосфора и магния период задержки отмечен во всех опытах. Для культур, лимитированных ?-аланином, магнием, биотином, отмечены длительные периоды продолжительностью 0,5-1 генерации, в течение которых наблюдается сверхскорость размножения. В данном случае скорость размножения при супраоптимальной температуре в 1,2-1,5 раза выше, чем при оптимальной 30°С. Культуры, глубоко лимитированные калием, фосфором, глюкозой, прекращают рост до завершения 0,5 генерации. При меньшем лимитировании глюкозой и фосфором рост прекращается через 20-24 часа по завершении 2,5-3 генерации.

Культуры, продолжающие расти при 37,5°С, стабилизируются, имея длительность генеративного цикла 10-12 часов. В природных условиях длительность дневного повышения температуры до супраоптимального уровня не превышает 8 часов. По этой причине остановка роста должна наблюдаться у популяций, глубоко лимитированных фосфором, калием, глюкозой.

Возрастной состав популяции при повышении температуры изменяется. Доля ювенильных клеток снижается в 0,5-2 раза. Это свидетельствует о сокращении длительности прохождения клеткой ранних стадий митоза.

Площадь поверхности клеток возрастает. Очевидно, за счет увеличения поверхности возрастает поступление питательных веществ в клетку.

3.2.2 Рост турбидостатной культуры дрожжей в условиях теплового стресса при различных pH среды

Было показано, что дрожжи сохраняют свойство термотолерантности в интервале рН6 - рН2,5, то есть в интервале, где рост дрожжей не ингибирован и при 30°С дрожжи имеют удельную скорость роста ?=0,25-0,3 ч^-1. При рН2,4 - 2,25 термотолерантность исчезает. Однако, после перехода рН2,35 > рН4 термотолерантность восстанавливается, то есть закисленная среда не препятствует формированию термотолерантности, но препятствует ее проявлению. Из полученных данных также следует, что рН фактор совместно с суточной температурой эффективно регулирует скорость размножения, в то время как на объем клеток и на состав влияет незначительно.

3.2.3 Влияние 2,4-динитрофенола на устойчивость турбидостатной культуры дрожжей к тепловому шоку

Изучение ответной реакции лимитированной культуры дрожжей на повышение температуры 30°С > 37,5°С показало, что термоустойчивость не проявляется при лимитировании источниками углерода и энергии, источником фосфора, источником калия. Поскольку перечисленные вещества участвуют, в том числе, и в биоэнергетических процессах и, в особенности, при работе хемиосмотической биоэнергетической системы, были проведены опыты по изучению влияния на термоустойчивость факторов, являющихся ингибиторами данной системы. Такими факторами были pH фактор и 2,4-ДНФ.

Было установлено, что данные факторы регулируют термоустойчивость в интервале от ее отсутствия до полного проявления. Наиболее важными моментами являются следующие: pH фактор и 2,4-ДНФ не препятствуют синтезу систем, обеспечивающих термоустойчивость, но препятствуют его проявлению. При снятии ингибирующего действия при супраоптимальной температуре свойство термоустойчивости восстанавливается. Очевидно, что термоустойчивость определяется, в основном, функцией хемиосмотической системы.

3.2.4 Ответная реакция турбидостатной культуры дрожжей на одновременное воздействие повышение температуры и повышение концентрации компонентов среды

В природных условиях микроорганизмы часто подвергаются одновременному воздействию нескольких факторов. Были проведены опыты по воздействию двух факторов на дрожжи. Изучалось влияние температурного перехода 30°С > 37,5°С и повышения концентрации лимитирующих рост веществ до насыщения. Опыты проводились с культурами, лимитированными азотом, глюкозой, источником фосфора, при различных стадиях лимитирования: µ=0,05ч^-1; µ=0,15ч^-1 и µ=0,25ч^-1 при 30°С. Было установлено, что дрожжи в течение первых двух поколений реагируют на повышение концентрации веществ, и только по истечении двух поколений следует ответная реакция на повышение температуры. Следовательно, при воздействии двух факторов возможна последовательность в ответной реакции. Причем, временная продолжительность предпочтения какому-либо фактору может продолжаться более одного поколения.

3.3 Применение микроорганизмов при решении экологических задач в природных условиях

Опыты, проделанные на дрожжах, показали:

1. Дрожжи быстро адаптируются к экологически значимым факторам, таким, как смена источников питания, температуры, pH фактору, осмотическому фактору, к повышению концентрации питательных веществ.

2. Наиболее устойчивыми являются дрожжи при насыщающей концентрации источников калия, фосфора, углерода и энергии при pH3 - pH7.

Была проделана работа по изучению правомочности распространения закономерностей, обнаруженных у дрожжевой культуры, на другие виды микроорганизмов. Работы проводились с культурами, имеющими прикладное значение, в частности, для решения экологических вопросов.

К числу наиболее распространенных и опасных для биоты загрязнителей среды относятся нефть, продукты ее переработки, сеноманы, нефтешламы, буровые присадки 2-го - 3-го класса опасности, метанол. Загрязнение почв нефтью и продуктами ее переработки приводит к нарушению функционирования и изменению свойств биотических и абиотических компонентов почвенной природы, из-за чего процессы деградации нефти протекают длительное время - от 4 до 10 лет и более, в зависимости от степени загрязнения. Сроки естественного восстановления нефтезагрязненных почв значительно увеличиваются при сжигании нефти.

Применяемые "универсальные" микробиологические препараты по деструкции нефти и ее компонентов позволяют ускорить процесс восстановления почв, но практически каждый из них имеет свой изъян. Во-первых, препараты на основе монокультур способны разлагать только узкий спектр углеводородов нефти, как правило, с длинной цепью С₁₂-С₁₆, оставляя нетронутыми легкие и наиболее тяжелые фракции нефти, а также нафтены и ароматические соединения. Во-вторых, препараты на основе поликультур, в большинстве своем, получены путем селекции почвенной биоты, взятой с нефтезагрязненной территории, что ограничивает их применение только в пределах подобного почвенного района. В-третьих, в поликультурах наряду с микроорганизмами-биодеструкторами сосуществуют и микроорганизмы-паразиты, действие которых снижает производительность препарата. Исходя из этого, очевидно, что необходимо разрабатывать специализированный препарат, учитывая характер грунта, на котором будут проходить рекультивационные мероприятия (торф, суглинки, песок, водная среда); исключить возможность попадания в препарат паразитов; препарат должен сохранять биодеградационные свойства после воздействия низких температур в зимний период. В связи с этим мы предлагаем выделить и подготовить в рабочем объеме углеводородусваивающие и окисляющие микроорганизмы, направленные на биодеструкцию следующих техногенных загрязнителей:

1. Нефтяные разливы на технологических площадках (кустах) и прилегающих территориях с учетом типа почвогрунта. При этом рекультивация на технологических площадках происходит без прерывания процесса и вывоза грунтов, как было апробировано на кустовых площадках Стрежевого, Пионерного, Нефтеюганска, Усинска. На прилегающих территориях возможны подготовительные работы в зимний период с целью уменьшения концентрации нефти. В случае регулярных утечек нефти можно использовать технологию долгосрочного эффекта при одноразовом внесении микробиологического препарата и специальных добавок. Все мероприятия проходят без отрыва от технологического процесса.

2. Нефтепродукты (бензины, дизельное топливо, авиационное топливо, машинные масла, топливный мазут, твердые парафины). Разработанные технологии по деструкции нефтепродуктов применялись на площадях аварийных разливов территории Казахстана.

3. Нефтешламы (нефтезагрязненные грунты, осадки из резервуаров-накопителей и нефтешламовых карьеров, нефтешламы нефтеперерабатывающей промышленности). Нефтешламы различаются по вязкости углеводородов, засоленности, природе механических примесей, наличию тяжелых металлов. Поэтому на первой стадии рекультивационных работ проводится предварительная обработка (например, для удаления тяжелых металлов используются методы фиторекультивации, обеспечивающие перенос тяжелых металлов в биомассу растений). Следующая стадия сводится к активации аборигенных микроорганизмов и созданию для них оптимальных условий. Рекультивация возможна без вывоза грунта с промышленных площадок, без остановки производственного процесса. Очищенный грунт, на определенном этапе насыщенный нефтеусваивающими микроорганизмами, может использоваться для обработки нефтяных разливов. Этот способ используется с 1989г. и защищен патентами РФ.

4. Пластовые воды. Сопутствующие нефти содержат высокие концентрации ионов Na⁺, K⁺, Mg⁺, Сl^-, SO₄^-2, CO₃^-2. Попадая в почву, ионы могут накапливаться, достигая токсичных для растений концентраций. Внедрение натрия в почвенный поглощающий комплекс и вытеснение им катионов, определяющих почвенную кислотность, вызывает заметное подщелачивание кислых почв. Для восстановления биосферного баланса элементов необходимо выделение биогенных средств, которые позволят решить проблему накопления активных ионов в почве и прилегающих акваториях.

5. Токсичные компоненты буровых растворов, такие, как кальцинированная сода, карбоксиметилцеллюлоза, габроил НV, полиакриламид, РС-1, РС-2, РС-4, Дк-Дрил, гипан, К-4, сайпан, сульфонол и другие вещества 2-го - 3-го класса опасности. Для рекультивации подобных соединений также необходимо выделение специализированных микроорганизмов, способных в короткие сроки произвести очистку буровых амбаров с ликвидацией углеводородных загрязнителей и добавок буровых растворов.

6. Метанол, применяемый при газодобыче. Для некоторых микроорганизмов, таких, как облигатные метанотрофы, он является отличным субстратом. Использование узкоспециализированных микроорганизмов в утилизации метанола практически решит вопрос об экологическом воздействии загрязнителя на окружающую среду.

Конечным этапом рекультивации загрязненных территорий является восстановление растительного покрова (травянистого и древесного) за счет внесения в почву семян растений, устойчивых к низким концентрациям поллютантов. В акватории также вносятся водные формы растений. Дальнейшее восстановление биоценоза происходит в виде сукцессионных процессов.

Перечень органических веществ, доступных для микроорганизмов, удалось расширить. Был разработан способ утилизации веществ алифатического, карбоциклического, гетероциклических рядов и их смесей произвольного состава, то есть их удалось перевести в ранг доступных для утилизации всех видов органических веществ биогенного и техногенного происхождения. Поскольку органические загрязнения сосуществуют с другими веществами, то рассматривалась утилизация органических веществ совместно с тяжелыми металлами.

Ставились следующие задачи:

1. Выяснить, способны ли микроорганизмы сохранять активность в присутствии концентрированных растворов тяжелых металлов.

2. Установить пределы устойчивости микроорганизмов к тяжелым металлам.

3. Выявить способность микроорганизмов усваивать органические вещества на фоне тяжелых металлов.

4. Проверить возможность использования микроорганизмов при очистке загрязненных сред не только от органических загрязнений, но и от тяжелых металлов.

Опыты проводились с истинными концентрированными растворами солей тяжелых металлов при отсутствии донных осадков. Было установлено:

А. Отмечены рост и размножение микроорганизмов, составляющих почвенную микрофлору, при концентрации тяжелых металлов более 1 моля (100-200 г/л) в пересчете на безводную форму.

Б. Микроорганизмы наиболее устойчивы к солям меди, никеля, хрома трехвалентного, бария, кобальта, ванадия, цинка, марганца двухатомного, вольфрама, циркония. Активный рост наблюдается при концентрации растворов свыше 200г/л. Наиболее токсичны серебро, хром шестивалентный, марганец семивалентный, кадмий, свинец. Рост прекращается при содержании их меньше 1г/л.

В. Микроорганизмы способны усваивать, например, альдегиды, спирты, углеводы и другие вещества в растворе солей тяжелых металлов.

В проделанной работе было установлено, что адаптивные возможности аборигенных микроорганизмов совпадают с возможностями дрожжей. Использование результатов, полученных при изучении дрожжей, и распространение их на другие виды позволяет решать крупномасштабные прикладные задачи. Разработанный способ позволил очистить от органических загрязнителей свыше 300 гектаров загрязненных территорий. Работы проводились в различных климатических регионах России и СНГ. Восстанавливались водоемы и земельные участки.

4. Основные результаты и выводы

4.1 Исследована возможность надежного измерения длительности генеративного цикла в переходных условиях

Было показано, что:

а) сложение долей генеративного цикла, осуществляющееся в интервале времени между замерами, обеспечивает надежное определение длительности генеративного цикла;

б) точность определения длительности генеративного цикла тем выше, чем меньше временной промежуток между измерениями;

в) графическое изображение динамики генеративной активности аппроксимируется прямой, что позволяет сравнивать результаты различных опытов по такому показателю, как тангенс угла наклона прямой.

4.2 При постоянной интенсивности действующих факторов в широком интервале условий было установлено, что

а) при воздействии таких факторов, как температура, лимитирование питательными веществами и кислородом, рН фактором, изменяется величина всех трех изучаемых показателей - длительность генеративного цикла, объем клеток, возрастной состав популяции, что позволяет использовать эти факторы как средство управления данными показателями;

б) такие факторы, как осмотическое давление, смена источников азота и энергии, введение в среду ДНК, оказывают влияние на генеративную активность и на объем клеток. При этом возрастной состав культур постоянен;

в) наиболее лабильные показатели - генеративная активность и объем клеток. Эти показатели изменяются при воздействии всех изучаемых стимулов;

г) при условиях, отличающихся от оптимальных по такому показателю, как генеративная активность, объем клеток увеличен, за исключением действия осмогенного фактора;

д) за счет увеличения объема клеток в дискомфортных условиях отмечается рассогласование скорости размножения клеток у дрожжей и скорости объемного роста.

4.3 Адаптация дрожжей к изменившейся интенсивности действующего фактора сопровождается следующими явлениями

а) при воздействии изучаемых химических факторов адаптивные процессы по указанным показателям завершаются в первом-втором поколении, и система переходит в стабильное состояние;

б) при воздействии на дрожжи физического фактора (температуры) адаптивные процессы завершаются в первом-втором поколении, за исключением температурных переходов в режиме (14 - 33^оС) > (37,5 - 40 ^оС), при которых адаптивный процесс продолжается более двух поколений;

в) обнаружено свойство термотолерантности у дрожжей, позволяющее им при выращивании в условиях субоптимальной-оптимальной температуры сохранять высокую скорость размножения в условиях перегрева при супраоптимальной температуре.

г) показано, что свойство терморезистенции формируется в период понижения температуры до субоптимального-оптимального уровня; очевидно, что это свойство формируется в естественных условиях в период ночного понижения температуры и позволяет дрожжам переносить полуденный-послеполуденный максимум температур без потери скорости размножения;

д) установлено, что свойство терморезистентности формируется как в условиях лимитирования, так и при ингибировании роста культуры дрожжей рН фактором и ДНФ. Проявляется терморезистентность в условиях высокой активности биоэнергетической системы клеток, локализованной в плазмолеме.

4.4 Проведены эксперименты по исследованию одновременного воздействия двух факторов на культуру дрожжей

Было установлено, что при одновременном воздействии двух факторов: негативного - повышение температуры до супраоптимального уровня и позитивных - снятие ингибирования рН фактором, ДНФ, повышение концентрации питательных компонентов среды от лимитирования до насыщения, дрожжи реагируют, в первую очередь, на позитивный стимул, а на негативный стимул реакция появляется в третьем-четвертом поколении.

4.5 Изучена возможность распространения закономерностей, полученных на дрожжах, на природные и лабораторные популяции других видов микроорганизмов

Было показано, что природная популяция микроорганизмов по динамике адаптации к таким факторам, как устойчивость к перегреву, устойчивость к осмогенным факторам, рН факторам, к лимитированию трофическими факторами, а также по порогам лимитирования и ингибирования происходит по схеме, аналогично дрожжам.