Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis

Таким образом, мелкие плазмиды штаммов B.subtilis из московской и белорусской коллеций частично гомологичны друг другу. Подавляющее большинство исследованных плазмид содержат высокогомологичные (>80%) модули mob и hsp.

2.4 Определение нуклеотидной последовательности EcoR1-HindIII фрагмента плазмиды р1516L

Как уже упоминалось выше, в штамме 1516 было обнаружено две плазмиды, р1516S и p1516L, отличавшиеся друг от друга лишь величиной одного EcoRI-HindIII-фрагмента (рис.2Б). Нам показалось интересным сравнить нуклеотидные последовательности этих фрагментов. EcoRI-HindIII-фрагмент р1516S был секвенирован в составе плазмиды р1516S. EcoRI-HindIII-фрагмент р1516L был получен с помощью ПЦР, а затем определена его нуклеотидная последовательность.

EcoRI-HindIII - фрагменты р1516L и р1516S отличались друг от друга наличием у плазмиды р1516L участка ДНК величиной 1383 пн. GC-состав этого участка ДНК - 38,7%, что незначительно отличается от GC-состава плазмиды р1516S (38,1%). Вставка располагалась внутри mob-гена, на расстоянии 18 пн от его 3'-конца (после нуклеотида 5932) (рис.2Б).На концах вставки были найдены: 1) прямые повторы, причем первый прямой повтор находился на последовательности вставки, а другой - на последовательности собственно плазмиды, непосредственно на границе ДНК плазмиды и вставки; 2) два совершенных инвертированных 10-членных повтора.

По данным на 2002г., нуклеотидная последовательность вставки имела большое сходство (70% гомологии) с фрагментами геномов Enterococcus faecalis (TIGR_1351/gef_11370) и Enteroroccus faecium (DOE_1352/Contig 7190). Аминокислотная последовательность, соответствующая нуклеотидной последовательности вставки, имела, по данным программы BlastX (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), значительное сходство с белками многих микроорганизмов; это были либо транспозазы, либо предполагаемые транспозазы. Размер этих белков - около 400 аминокислотных остатков. Однако участки гомологии располагались на различных рамках считывания и не совпадали с какой-либо одной из возможных ORF. Создавалось впечатление, что на последовательности вставки произошел сдвиг(и) рамки считывания, что нарушило нормальное строение гена.

Наличие прямых и инвертированных повторов по краям вставки и гомология центральной части вставки с транспозазами различных микроорганизмов позволила предположить, что вставка в p1516L является IS-элементом. Вероятно, ген описываемой нами транспозазы являлся дефектным, т.е. псевдогеном. Наличие в клетках штамма B.subtilis 1516 плазмид как с IS-элементом, так и без него, являлось косвенным свидетельством транслокации элемента. Возможно, функционально активные его копии находились на хромосоме. Мы назвали обнаруженную нами IS-последовательность ISBsu2. Cудя по характеру гомологии транспозазы ISBsu2 с транспозазами известных IS-элементов, ISBsu2 принадлежит к семейству IS256. Некоторые представители этого семейства имеют не одну пару инвертированных повторов, как подавляющее большинство IS-элементов, а две (Mahillon, Chandler, 1998). Эту же особенность мы отметили для ISBsu2. ISBsu2 была депонирована в 2003г. в GenBank (№ AY099458).

Возникал вопрос, присутствует ли мобильный элемент ISBsu2 в хромосоме штамма 1516, несущего соответствующую плазмиду, а также в хромосомах других штаммов B.subtilis и некоторых других бацилл. Для проверки этого предположения мы попытались обнаружить данную последовательность в хромосомной ДНК различных бацилл с помощью блот-гибридизации. Последовательность ISBsu2 была амплифицирована на плазмиде p1516L посредством ПЦР с использованием специфических праймеров, помечена ³²Р-дАТФ и использована в качестве зонда в блот-гибридизации по Саузерну с хромосомной ДНК бацилл. Хромосомная ДНК при этом обрабатывалась рестриктазой EcoRV. Мобильный элемент ISBsu2 имеет один сайт узнавания для EcoRV, расположенный приблизительно в его средней части; на ДНК собственно плазмиды р1516 сайтов узнавания для EcoRV нет.

При гибридизации с хромосомной ДНК штамма, несущего плазмиду p1516S, обнаружилось 18-20 полос гибридизации разной интенсивности (рис.3). Плазмида p1516S не содержит ISBsu2, поэтому возможная примесь плазмидной ДНК не могла повлиять на результат гибридизации. Поскольку рестриктаза EcoRV разрезает ISBsu2 на две части, любая нуклеотидная последовательность на хромосоме, гомологичная ей, также разрезается при соответствующей обработке и должна дать две полосы гибридизации. Таким образом, число участков гомологии с ISBsu2 на хромосоме (т.е.копий ISBsu2) должно быть в два раза меньше числа полос гибридизации - в данном случае 9-10. При гибридизации с хромосомной ДНК штаммов B.subtilis, содержавших плазмиды

Рисунок 3. Результаты блот-гибридизации хромосомной ДНК из различных штаммов B.subtilis с меченной ³²Р-дАТФ ДНК ISBsu2

а - электрофореграмма EcoRV фрагментов хромосомной и плазмидной ДНК и EcoRI-HindIII фрагментов ДНК фага ?; б - результаты блотгибридизации этих фрагментов с радиоактивным зондом. 1 - p1516L; 5 - ?, EcoRI-HindIII; остальные пробы - хромосомная ДНК из штаммов B.subtilis , рестрицированная EcoRV: 2 - 1516 (p1516S); 3 - 1516 (p1516L); 4 - 1414 (p1414); 6 - 168; 7 - IFO3022 (pTA1060); 8 - 1315 (p1315); 9 - 1385 (p1385); 10 1513. Цифры слева - величина EcoRI-HindIII фрагментов ДНК фага ? в тпн. p1414, p1315, p1385 и pTA1060, для которых была определена полная нуклеотидная последовательность и было известно, что ни одна из них не содержит IS-элементов (Mejer et al., 1998; Bron, личное сообщение), также обнаружились полосы гибридизации, от двух до шестнадцати. Много полос гибридизации обнаруживалось и при гибридизации с хромосомной ДНК штамма р1516L (возможно, что одна из полос соответствовала примеси ДНК плазмиды р1516L). Мы провели также гибридизацию с хромосомной ДНК штамма B.subtilis 19, несущего крупную конъюгативную плазмиду р19 и мелкую криптическую плазмиду рV; с ДНК типового лабораторного бесплазмидного штамма B.subtilis 168; с ДНК почвенных штаммов B.subtilis

604, 1356, 1431, 1513, не несущих плазмид, и с ДНК других бацилл, близких к B.subtilis 168 (B.subtilis W23, B.aterrimus ВКМВ-922, B.licheniformis В-993, B.pumilus ВКМВ-508). Была взята также ДНК Е.coli DH5

Ни в одном случае, кроме ДНК штамма 1513, мы не обнаружили полос гибридизации. На рисунке не приведены многочисленные «пустые» дорожки с ДНК штаммов, не давших полос гибридизации (кроме ДНК B.subtilis 168).

У B.subtilis известно крайне мало IS-элементов. ISBsu2 была вторым IS-элементом, обнаруженным у B.subtilis [первый IS-элемент, обнаруженный у B.subtilis (natto), - IS4Bsu1 - негомологичен ISBsu2 и принадлежит семейству IS4 - Nagai et al., 2000] и первым, локализованным на плазмиде. В 2007г. была опубликована в GenBank нуклеотидная последовательность еще одного, третьего, IS-элемента, IS256Bsu1 из штамма B.subtilis (natto); величина последовательности составляла 1369 пн. IS256Bsu1 содержала ген транспозазы (1248 пн), окруженный парой инвертированных 26-членных повторов. IS256Bsu1 и ее ген транспозазы на 97% оказались идентичными ISBsu2 и ее предполагаемому гену транспозазы (Kimura, Itoh, 2007). Таким образом, гомологи ISBsu2 присутствуют в различном количестве копий в хромосомной и плазмидной ДНК ряда почвенных и промышленных штаммов B.subtilis.

3.Анализ крупных плазмид

3.1 Поиск крупных плазмид в штаммах B. subtilis и определение их способности к конъюгации

Имевшаяся в нашем распоряжении коллекция природных штаммов B.subtilis, выделенных из почв Москвы и Московской области, была использована также для поиска крупных плазмид. Было проверено 42 штамма коллекции, в 9 из них были обнаружены плазмиды размером более 36 тпн. Пять штаммов содержали только крупную плазмиду, другие, кроме крупной, несли также мелкие плазмиды. Еще одна крупная плазмида, р1387-3, была обнаружена ранее (см.выше). По сумме длин рестриктных фрагментов был определен размер крупных плазмид из штаммов 1899 (данные В.З.Незаметдиновой), 544 и 1387. Он составил 60 тпн, 65,1 тпн и 36 тпн соответственно.

Изучение генетики крупных плазмид бацилл мы решили начать с поиска у них способности к конъюгативному переносу. Как было сказано выше, гены mob, необходимые для переноса мелких плазмид с помощью конъюгативного аппарата крупных плазмид, широко распространены среди RCR-плазмид B.subtilis. Однако способность к конъюгации была показана до сих пор только для одной плазмиды B.subtilis (natto) - pLS20 (Koehler, Torne, 1987). При этом ни особенности самого процесса конъюгации, ни участвующие в нем гены описаны не были.

Ни один из штаммов B.subtilis московской коллекции не проявлял какой-либо устойчивости к антибиотикам. Плазмиды не имели заметных фенотипических проявлений, т.е. были криптическими. Следовательно, мы не могли наблюдать непосредственно перенос крупных плазмид. Мы ввели посредством трансформации протопластов в четыре штамма B.subtilis, имевших крупные плазмиды (1387, 1420, 1440, 1899), мелкую плазмиду pUB110, несущую маркер устойчивости к канамицину и определяющую Km^R фенотип клеток. Тот факт, что данные штаммы получили pUB110, был подтвержден результатами электрофореза. В наших опытах к мобилизации pUB110 оказалась способной лишь плазмида р1387-3 из штамма B.subtilis 1387. Мобилизация шла только на поверхности фильтров и при условии, что реципиентом был штамм B.subtilis RM125 c нарушенной системой рестрикции-модификации. Частота конъюгативного переноса для р1387-3 была низкой (10^-7). Конъюгация с р1387-3 шла нерегулярно. Были опыты, в которых на чашках вырастало лишь несколько колоний конъюгантов или их не было вовсе.

Таким образом, проверенные крупные плазмиды из московской коллекции были неспособны к мобилизации, или она шла у них с предельно низкой частотой. В поисках удобной модели конъюгативного переноса для B.subtilis мы обратились к белорусской коллекции природных штаммов B.subtilis. Наши коллеги из Белорусского Государственного Университета обнаружили в этой коллекции штаммы с крупными плазмидами (Titok et al., 2003). Мы использовали для поиска конъюгативного переноса штамм B.subtilis 19, несущий крупную плазмиду р19. Плазмида р19 оказалась способной к мобилизации мелких плазмид и к самопереносу с высокой частотой. Как оказалось позже, другие крупные плазмиды этой коллекции очень схожи друг с другом по способности к конъюгации. Изучению закономерности этих процессов посвящен следующий раздел работы.

Штамм B.subtilis 19 был выделен из лесной почвы Белоруссии. Он содержит две плазмиды: крупную р19 с тета-типом репликации (Titok et al., 2003) и мелкую, pV, реплицирующуюся по сигма- (RC-) типу. Размер р19 был определен В.З.Незаметдиновой по сумме фрагментов рестрикции EcoRI и KpnI и составил более 97 тпн. Размер pV был определен нами также по сумме фрагментов рестрикции и составил 8,5 тпн (табл.1). Обе плазмиды были криптическими. В клетки штамма B.subtilis 19 посредством трансформации лизоцимных протопластов была введена плазмида pUB110. Были получены производные штамма B.subtilis 19, лишенные pV (они возникали спонтанно) или р19 [при выращивании штамма 19 (р19 pV pUB110) на средах, содержащих высокие концентрации канамицина] (Лотарева и др., 2002). Получить производные штамма 19, полностью лишенные плазмид, нам не удалось.

3.2 Изучение мобилизационного переноса, осуществляемого плазмидой р19 из почвенного штамма B.subtilis

Изучение особенностей конъюгативной мобилизации проводилось с использованием в качестве донора штамма 19 (p19 pV pUB110). В качестве реципиента был взят хорошо изученный лабораторный штамм B.subtilis 168 с хромосомным геном устойчивости к хлорамфениколу (ВD170 Cm^R). В скрещиваниях B.subtilis 19 (p19 pV pUB110) x ВD170 Cm^R трансконъюганты, устойчивые к канамицину, стабильно появлялись с частотой около 10-³ на клетку реципиента (в отдельных опытах частота достигала 10^-2) (табл.3). Конъюгация шла с одинаковой частотой на твердой и в жидкой средах. При электрофорезе плазмидной ДНК, выделенной из клонов трансконъюгантов, были видны полосы, соответствующие ДНК pUB110. Однако необходимо было исключить возможность получения реципиентом мелкой плазмиды за счет спонтанной трансформации ДНК, к которой способны клетки B.subtilis. Для этого в среду со смешанной культурой клеток штаммов-партнеров добавлялась ДНКаза I до конечной концентрации 100 мкг/мл. На количество возникающих трансконъюгантов обработка ДНКазой I не влияла. Чтобы исключить возможность переноса pUB110 за счет трансдукции, вместо культуры донора в скрещиваниях использовался ее фильтрат (фильтр Millipor 0,22m). Трансконъюгантов и в этом случае обнаружено не было. Конъюгативный перенос, осуществляемый некоторыми крупными плазмидами, чувствителен к действию протеиназы (Andrup et al.,1993). Мы проверили, влияет ли обработка протеиназой К на частоту мобилизационного переноса, осуществляемого p19. Результаты опытов показали, что частота мобилизации pUB110 при обработке клеток штаммов-партнеров протеиназой К (1 мг/мл; 30 мин.) снижалась не более чем в 2 раза.

Выше упоминалось, что при выращивании на средах с высокой концентрацией канамицина бактерии теряли плазмидцу р19; при этом они утрачивали способность к мобилизационному переносу. Чтобы окончательно доказать, что способность к мобилизации pUB110 связана с наличием в клетке крупной конъюгативной плазмиды, была проведена блот-гибридизация плазмидной ДНК, выделенной из разных производных штамма 19, полученных в ходе работы, как способных, так и неспособных к конъюгации. В качестве зонда был использован минирепликон р19 из плазмиды pMTLBS19. И в этих опытах способность к конъюгативному переносу pUB110 коррелировала с наличием в клонах крупной плазмиды р19. Потеря плазмиды pV не влияла на способность к мобилизационному переносу мелких плазмид (табл.3, скрещивания 2, 3). Таким образом, для конъюгативного переноса мелкой плазмиды из штамма-донора B.subtilis 19 требуется наличие в штамме именно крупной плазмиды р19.

Способность p19 осуществлять мобилизацию в жидкой среде позволила определить такие параметры мобилизации, как кинетика переноса плазмид и ее зависимость от температуры. Было показано, что нарастание числа трансконюгантов в зависимости от времени контакта клеток было одинаковым

Таблица 3. Конъюгативный (мобилизационный) перенос мелких плазмид из клеток штаммов, несущих крупную плазмиду р19 при температуре 30 и 37С; через 80 мин. оно замедлялось, и кривые выходили на плато

Конъюгация была возможна и при комнатной температуре (21С). Трансконъюганты в этом случае обнаруживались значительно позже; к 180 мин. количество их было максимальным, но все же примерно в 50 раз меньшим, чем при 30 и 37С.

Мы использовали в качестве доноров и реципиентов производные штаммов B.subtilis 19 и 168, в том числе штамм 168 RM125 R^- M ^-, лишенный системы рестрикции-модификации RI (см.далее табл.5, скрещивания 2-6). Во всех случаях частота мобилизационной передачи pUB110 оставалась постоянной и составляла 10^-3. Исключением является скрещивание 5, где и донором, и реципиентом были штаммы B.subtilis 168. В этом случае частота передачи pUB110 падала более чем на два порядка и составляла 6,8х10^-6.

Нас интересовало, способны ли в данной конъюгационной системе передаваться другие мелкие плазмиды. С этой целью в штамм B.subtilis 19 вводились разные плазмиды с сигма-типом репликации: природная плазмида B.cereus рВС16 (4630 пн; Tc^R), ее вариант с инверсией крупного участка гена mob pBC16invEcoRI и плазмида S.aureus pC194 (2910 пн; Cm^R), у которой отсутствует ген mob. Все они способны реплицироваться в клетках B.subtilis.

Было показано, что рВС16 передавалась клеткам-реципиентам примерно с той же частотой, что и pUB110 - около 10^-3. В тех случаях, когда донор нес производную рВС16 с инверсией части гена mob, частота мобилизации падала на четыре порядка. Однако, если в клетках донора, помимо р19 и рВС16invEcoRI, содержалась мелкая природная плазмида pV, также имеющая ген mob, частота переноса плазмиды с поврежденным геном снижалась лишь на два порядка (табл.3, скрещивания 4,5). Плазмида рС194, лишенная и гена mob, и участка oriT, была абсолютна неспособна к мобилизационному переносу (табл.3, скрещивания 6, 7). Таким образом, для переноса необходимо наличие на мобилизуемой плазмиде oriT и неповрежденного гена mob. Мобилизация мелких плазмид у B.subtilis в описанной системе, вероятно, осуществляется по механизму донации. Изменений молекулярной массы плазмид, как мелких, так и крупных, выделенных из клеток трансконъюгантов (что характерно для процесса кондукции), никогда не наблюдалось.

Мы проверили, существует ли возможность конъюгативной мобилизации pUB110 из клеток B.subtilis 19 (p19 pV pUB110) в клетки реципиентов, принадлежащих к другим видам. При изучении межвидового конъюгативного переноса pUB110 (гетероконъюгации) в качестве реципиентов были использованы штаммы грам-положительных микроорганизмов: 12 разных видов рода Bacillus, а также штамм Staphylococcus aureus. Для всех штаммов-реципиентов предварительно были получены спонтанные мутанты, устойчивые к стрептомицину. Результаты представлены в табл. 4. Мобилизация шла с разной частотой. В опытах, где реципиентами были штаммы B.subtilis (natto), B. megaterium, B. polymixa, перенос мелкой плазмиды шел с достаточно большой эффективностью. В то же время клетки других видов бацилл при скрещиваниях получали pUB110 с заметно меньшей частотой: 10^-4 в случае реципиента B. licheniformis ; 10-⁶ в случае реципиентов B. sphaericus, B. pumilus, B. niger, B. globigii и B thuringiensis. В скрещиваниях B.subtilis 19 со штаммами B. mesentericus и S. aureus трансконъюгантов не возникало.

Таблица 4. Частота мобилизации pUB110 при скрещиваниях B. subtilis 19 (p19 pV pUB110) с другими видами бактерий

Возможность мобилизации плазмид при температуре 21°C , обычной для летних месяцев в средней полосе России, способность к межвидовому переносу, наличие у большинства изученных мелких бациллярных плазмид природных штаммов генов mob и ptr, необходимых для конъюгативной мобилизации, - все это позволяет предполагать, что конъюгативный перенос

плазмид с участием р19 активно происходит в природных условиях и может играть значительную роль в процессах генетического обмена между штаммами B.subtilis и даже между представителями разных видов бацилл.

3.3 Изучение конъюгативного переноса собственно крупной плазмиды p19

Все описанные выше эксперименты были поставлены с целью изучения мобилизации мелких плазмид. Между тем, очень важно было исследовать особенности переноса собственно крупной конъюгативной плазмиды. Плазмида p19 является криптической, что затрудняет исследование ее собственного переноса при конъюгации. Зафиксировать передачу р19 можно было, лишь проверяя на способность к мобилизации трансконъюганты, получившие мелкую плазмиду, а также по данным гибридизации, используя клонированный репликон р19 в качестве зонда. И то, и другое - процедура достаточно трудоемкая и дает возможность проверить лишь несколько десятков клонов.

Поэтому для изучения закономерностей «самопереноса» p19 в данную плазмиду с помощью инсерционного мутагенеза был введен ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), определяющий устойчивость к хлорамфениколу. В качестве источника гена cat была использована плазмида р3 (рис.4). р3 представляет собой плазмиду E.coli pUC19 с встроенным в полилинкер геном cat из плазмиды pC194; р3 не способна реплицироваться в клетках B.subtilis. На плазмиде p19 имеется более 20 сайтов рестрикции EcoRI; р3 несет только один сайт узнавания этой рестриктазы. ДНК плазмид р3 и р19 была обработана рестриктазой EcoRI, а затем смесь фрагментов лигировали. Полученной лигированной смесью трансформировали клетки штамма B.subtilis 19 (p19). Отбирались клоны, устойчивые к хлорамфениколу, которые несли p19 со встроившимся за счет гомологичной рекомбинации геном cat. Интеграция р3 могла сопровождаться делецией части генов р19. Было получено несколько десятков клонов B.subtilis 19 (р19::р3) Cm^R, которые были проверены на способность к конъюгативному переносу р19::р3. Около половины из них (31 клон) оказалась неспособной к конъюгации (эти клоны были в дальнейшем использованы для клонирования учатков tra-района р19); другие клоны передавали р19::р3 с различной частотой. Был отобран клон, обозначенный как B.subtilis 19 (р19cat), способный передавать р19::р3 в ходе конъюгации с максимальной частотой и стабильно сохранявший Cm^R-фенотип при росте в

Рисунок 4. Маркирование плазмиды р19 с помощью плазмиды р3 и клонирование фрагментов ДНК р19, прилегающих к вставке р3. неселективных условиях. При скрещивании этого штамма с реципиентом B. subtilis 19 (pV pUB110), был получен штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) Cm^R Km^R, используя который в качестве донора при конъюгации, можно было проследить как передачу реципиенту крупной плазмиды p19cat, так и мобилизацию pUB110. Этот клон был использован в дальнейшей работе

Чтобы определить частоту и параметры конъюгативного переноса p19, был проведен ряд скрещиваний (табл.5). Как и при изучении мобилизационного переноса pUB110, для предотвращения возможной спонтанной трансформации в конъюгационные пробы добавлялась ДНКаза I до концентрации 100 мкг/мл. Чтобы исключить возможность переноса маркера за счет трансдукции, были проведены скрещивания с использованием вместо культуры донора ее фильтрата (фильтр Millipore 0,22m). Трансконъюгантов в этом случае обнаружено не было. Плазмидный состав клонов трансконъюгантов был подтвержден результатами электрофореза плазмидной ДНК, выделенной из клеток донорного штамма и трансконъюгантов.

Как показали результаты, крупная плазмида передавалась с очень высокой частотой при использовании в качестве партнеров штаммов B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) и 19 (pV) Str^R - около 70% клеток реципиента получали p19cat (в некоторых опытах частота конъюгации достигала 1). Когда же в качестве реципиента использовался лабораторный штамм B.subtilis 168 39-22 Str^R, частота переноса p19cat была более чем на два порядка ниже (табл.5, скрещивание 3). Возможно, у штаммов B.subtilis 19 и 168 имелись различные системы рестрикции-модификации. Чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты, где реципиентом был штамм 168 RM 125, лишенный системы рестрикции-модификации RI. Частота конъюгативного переноса p19cat в таких скрещиваниях достигала 2,5х10^-1 (табл.5, скрещивание 4). Штамм B.subtilis 168, получивший p19cat, также оказался способен быть донором (табл.5, скрещивание 5), хотя и со сниженной эффективностью. В скрещиваниях, где в качестве реципиента был взят вариант лабораторного штамма B.subtilis168 AMT Em^R, p19cat передавалась клеткам с частотой

Таблица 5. Конъюгативный перенос плазмид при использовании в качестве партнеров при конъюгации различных штаммов B.subtilis около 3х10^-2

Таким образом, кроме предполагаемого действия систем рестрикции-модификации, на частоту переноса, безусловно, влияют и другие, еще неизвестные факторы. Возможно, причинами снижения частоты конъюгации и, особенно, мобилизации (почти на 3 порядка) в случае, если и донором, и реципиентом являются производные лабораторного штамма B.subtilis 168, могут быть меньшая частота образования пар клеток донора и реципиента или недостаточно эффективный перенос плазмидной ДНК между конъюгирующими клетками из-за каких-то особенностей строения клеточной стенки.