Генетические свойства и структура плазмид природных штаммов Bacillus subtilis

Присутствие плазмиды p19 в штамме-реципиенте B.subtilis 19 приводило к снижению частоты переноса крупной плазмиды в 20 раз по сравнению с опытами, в которых использовался утративший такую плазмиду реципиент (табл.5, скрещивания 2,6). Снижение эффективности конъюгативного переноса, если клетка-реципиент уже несет родственную плазмиду, описано для различных конъюгативных плазмид. Этот так называемый феномен поверхностного исключения (surface exclusion) хорошо изучен у E.coli и других бактерий кишечной группы (Garcillan-Barcia, de la Cruz, 2008). Однако частота мобилизации pUB110 в подобных опытах не изменялась; вероятно, на частоту переноса в случае p19 влияли скорее другие факторы, например, несовместимость плазмид, связанная с репликацией.

Было изучено влияние соотношения клеток донора и реципиента на частоту переноса p19cat в скрещиваниях B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) x B.subtilis 19 (pV) Str^R. Перенос происходил с одинаково большой частотой (10^-1) в широком диапазоне соотношений клеток донора и реципиента (от 10³ клеток донора на 1 клетку реципиента до 1 клетки донора на 10² клеток реципиента). Частота переноса снижалась, лишь если на клетку донора приходилось 10³ и более клеток реципиента.

Чтобы выяснить, через какое время после контакта клеток донора и реципиента начинается перенос p19, мы определяли число трансконъюгантов в скрещивании B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) x B.subtilis 19 (pV) Str^R в опытах с последовательным прерыванием конъюгации. Чтобы свести к минимуму конъюгацию на твердой среде, начальное соотношение числа клеток донора и реципиента было взято как 1: 10000. Для этого в момент времени "0"смешивали 0,8 мл среды LB, 0,1мл культуры реципиента (10⁷клеток) и 0,1мл культуры донора (10³ клеток). Результаты представлены на графике (рис.5). Передача p19cat начиналась непосредственно сразу после смешивания клеток штаммов- партнеров и достигала максимума через 3 часа. Перенос мелкой плазмиды начинался лишь через 60 минут после начала контакта клеток донора и реципиента.

Была изучена возможность конъюгативной передачи р19 из клеток B.subtilis в клетки других видов бацилл. Для определения частоты переноса р19 в качестве донора мы использовали штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110). Реципиентами служили штаммы 6 других видов рода Bacillus. Передача р19 шла с различной частотой (табл. 6). Наиболее эффективно р19 передавалась в клетки B.subtilis 19. Менее эффективно передача р19 происходила в клетки других видов (B.amiloliquefaciens, B.megaterium, B.pumilus, B.polymyxa); частота.

Рисунок 5. Динамика конъюгативной передачи плазмид р19cat и pUB110 в зависимости от продолжительности контакта клеток. В скрещиваниях использовали штамм B.subtilis 19 (p19cat pV pUB110) в качестве донора и штамм B.subtilis 19 (pV) Str^R в качестве реципиента

Таблица 6. Эффективность конъюгативного переноса р19cat в клетки других видов бацилл. В качестве донора был использован штамм B. subtilis 19 (p19cat pV pUB110) переноса в этих скрещиваниях была снижена на 1 - 4 порядка

В клетки B.subtilis (natto) и B.aterrimus p19cat не передавалась. Таким образом, плазмида р19 определяет способность к конъюгативному переносу как мелких плазмид, так и самой себя в клетки различных видов бацилл.

3.4 Клонирование, определение нуклеотидной последовательности и анализ секвенированных фрагментов ДНК плазмиды р19

Как было указано выше, конъюгативный перенос у грам-положительных микроорганизмов мало изучен; это полностью относится и к B.subtilis. Не известна и нуклеотидная последовательность ни одной из конъюгативных плазмид B.subtilis. На следующем этапе работы мы попытались клонировать фрагменты tra-района плазмиды р19 B.subtilis и определить их нуклеотидную последовательность. Секвенирование фрагментов плазмиды р19 было проведено в центре ДНК-диагностики ИОГен РАН.

Как уже упоминалось, мы получили 31 клон B.subtilis 19 (p19::p3) Cm^R Tra^-, в которых плазмида р19 была помечена геном cat; эти клоны были не способны служить донорами при конъюгации. Мы использовали эти производные р19 для клонирования и последующего секвенирования фрагментов tra-района плазмиды (рис.4). Для этого плазмидная ДНК клонов обрабатывалась рестриктазой ClaI с последующим лигированием и трансформацией клеток E.coli DH5(?). Селекция велась по маркерам Cm^R и Ap^R. На плазмиде р3 нет сайтов узнавания для рестриктазы ClaI; на р19 их около 20. Мы ожидали получить гибридные плазмиды р3-19, состоящие из вектора р3 и двух EcoRI-ClaI фрагментов ДНК р19; в исходной плазмиде р19 эти два фрагмента, скорее всего, не граничили друг с другом. Предполагалось, что клонированные фрагменты р19 должны содержать ген(ы), повреждение которых приводит к неспособности плазмид р19::р3 осуществлять конъюгацию.

Для 11 плазмид серии р3-19 были построены рестриктные карты и определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК, непосредственно прилегающих к р3, с помощью стандартного праймера pUC/M13F и праймера cat, синтезированного по известной нуклеотидной последовательности гена cat. Это позволило определить, что четыре плазмиды идентичны; для дальнейшей работы была использована одна из них. Остальные плазмиды отличались друг от друга, хотя некоторые из них несли как разные, так и одинаковые фрагменты ДНК р19. Эти 8 плазмид были использованы для определения нуклеотидных последовательностей клонированных на них фрагментов ДНК р19. Кроме того, для определения нуклеотидной последовательности была использована плазмида pBluescript-6 из библиотеки фрагментов ДНК р19, клонированных по EcoRI сайту в клетках E.coli XL1 Blue. Она была обнаружена при гибридизации библиотеки клонов с зондом - фрагментом ДНК одной из плазмид серии р3-19.

Для определения нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК р19 мы, во-первых, секвенировали плазмиды серии р3-19 со стандартных праймеров (pUC/M13F и cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков плазмид р3-19. Во-вторых, проводили субклонирование плазмид серии р3-19. Всего было получено 22 плазмидных субклона, строение которых подтверждено рестриктным анализом. Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров (pUC/M13F, pUC/M13R, cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков. Затем на основе полученных нуклеотидных последовательностей создавали специфические праймеры. Всего их было синтезировано 87. Определение нуклеотидной последовательности ДНК со специфическими праймерами проводили на матрицах плазмид р3-19 и плазмидных субклонах.

Клонированные на данных плазмидах фрагменты ДНК р19 соответствовали пяти контигам (рис.6). Эти контиги депонированы в GenBank : 2021 пн (№ FJ434455), 4518 пн (EF506609), 22728 пн (№ FJ434456), 739 пн (№ FJ434457), 2932 пн (EF506610). Идентификация ORF на секвенированных фрагментах, поиск в базах данных гомологов белковых продуктов, соответствующих этим ORF, и сравнение с белками tra-районов других плазмид грам-положительных бактерий (см.далее) позволили предположить, что фрагменты ДНК р19 величиной 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн находятся в исходной плазмиде именно в таком порядке, как они изображены на рис.6, и близко друг от друга.

Рисунок 6. Расположение секвенированных контигов на плазмиде р19. Цифрами указаны величины фрагментов в пн. Буквами обозначены сайты рестрикции ферментов ClaI (C) и EcoRI (Е). Положение фрагментов 739 пн и 2932 пн относительно других контигов неизвестно

Используя праймеры, синтезированные по конечному участку ДНК фрагмента 4518 пн и начальному - фрагмента 22728 пн, мы получили посредством реакции ПЦР фрагмент ДНК. После определения нуклеотидной последовательности его размер оказался равен 568 пн. Таким образом, нам удалось соединить контиги 4518 пн и 22728 пн. Это позволило уточнить величины ORF5 и ORF10 по сравнению с определенными ранее (GenBank № EF506609 и № JF434456). В конечном счете, мы определили нуклеотидную последовательность четырех контигов р19: 2021 пн; 27814 пн; 739 пн; 2932 пн; их суммарный размер - 33506 пн (рис.6).

На секвенированных фрагментах ДНК плазмиды р19 идентифицировано 39 ORF. Из них 33 соответствуют целым ORF, четыре (ORF1, ORF 9, ORF35, ORF38) - 3'-концу генов, две (ORF34, ORF39) - 5'-концу генов. Подавляющее большинство ORF транскрибировалось в одном направлении, кроме двух ORF из контига 2932 пн. Это может быть косвенным свидетельством однонаправленной репликации плазмидной ДНК. 89,6% нуклеотидной последовательности было занято собственно ORF, таким образом некодирующие участки занимают малую часть секвенированной последовательности. Расстояния между концом одной ORF и началом следующей ORF в основном были невелики (0-50 пн); в некоторых случаях начало одной ORF и конец другой накладывались друг на друга. Вероятно, гены плазмиды организованы в опероны. В нескольких случаях межгенное расстояние составляло несколько сот пн. В таких участках были идентифицированы промоторы и ориджины - как репликации, так и конъюгативного переноса. Величина гипотетических белков, соответствующих ORF, колебалась от 50 аа (меньшие белки не идентифицировали) до 843 аа. ГЦ состав фрагментов ДНК составлял 30-34%; для отдельных ORF он колебался от 29% до 39%. Перед всеми ORF, имеющими 5'-конец, идентифицированы сайты связывания с рибосомами. Перед ORF2, ORF7, ORF8, ORF11, ORF22, ORF31, ORF34 идентифицированы -35 и -10 районы промоторов. Белковые продукты, соответствующие 26 ORF, имеют гомологи в базах данных. Продуктам десяти ORF на основании этой гомологии можно приписать определенные функции (рис.7).

Чтобы подтвердить конъюгативные функции обнаруженных ORF, мы проводили их инактивацию посредством инсерционного мутагенеза. Для этого клонировали фрагменты генов (расположенные не на концах, а в середине генов) величиной от 0,23 до 0,9 тпн на векторных плазмидах pMTL21C и р3. Эти плазмиды не способны реплицироваться в клетках B. subtilis, но несут экспрессирующийся в них селективный маркер, ген cat (обусловливающий Cm^R фенотип). Чтобы удостовериться в том, что клонированные фрагменты действительно соответствуют нужным ORF, определяли их нуклеотидные последовательности в соответствующей гибридной плазмиде со стандартных праймеров pUC/M13F, pUC/M13R и cat. Полученными гибридными плазмидами проводили трансформацию клеток штамма B.subtilis 19 (р19). Отбор трансформантов осуществляли по Cm^R-фенотипу. Гибридные плазмиды, вероятно, встраивались в участки тех ORF, фрагменты которых были на них клонированы, посредством гомологичной рекомбинации, тем самым нарушая функциональную целостность соответствующих ORF. Полученные трансформанты B. subtilis 19 (p19::pMTL21C)Cm^R и B. subtilis 19 (p19::p3)Cm^R были проверены на способность к конъюгативной передаче р19 в скрещиваниях с реципиентами B. subtilis 19 (pV)Str^R и B. subtilis19 (pV)Tet^R.

Рисунок 7. Генетическая карта четырех секвенированных контигов плазмиды р19. Горизонтальные стрелки обозначают ORF, направление стрелок - направление транскрипции ORF, цифры над стрелками соответствуют номерам ORF. Вертикальные стрелки обозначают ориджины конъюгационного переноса (oriT) и вегетативной репликации (oriV). Вертикальными линиями с утолщениями обозначены идентифицированные промоторы. + и - отмечают ORF, инактивация которых, соответственно, приводит к снижению способности р19 к конъюгативному переносу или не влияет на него. Заштрихованный участок ДНК принадлежит tra-району р19

В качестве положительного контроля использовался штамм-донор B. subtilis 19 (p19cat) Cm^RTra⁺, частота конъюгации которого составляла до 1 на клетку реципиента. Таким образом нами было проверено 10 ORF. Как оказалось, инактивация ORF1, 4, 10, 12, 17 и 35 приводит к снижению частоты передачи р19 на 3-5 порядков в сравнении с контролем, что указывает на участие продуктов данных ORF в конъюгативном переносе плазмиды. Нарушение структуры ORF 6, 24, 25 и 32 не влияло на конъюгативные свойства плазмиды, и частота конъюгации не отличалась от контроля (рис.7). Вероятно, продукты данных ORF не участвуют в процессе конъюгативного переноса р19. Мы не выясняли, почему повреждение ORF вызывает значительное снижение, но не полное подавление конъюгации. Скорее всего, это связано с тем, что число копий плазмиды р19 может быть больше 1 на клетку, и наряду с мутантными, в клетках могла присутствовать нормальная плазмида.

Большая часть контига 2932 пн оказалась полностью гомологичной rep-району плазмиды pBS72. Эта крупная плазмида, как и р19, выделена в Белоруссии из природного штамма B.subtilis (Titok et al., 2003). Район гомологии содержит две целые ORF р19 (ORF8, соответствующую repA гену, и ORF7), конец ORF9, а также ориджин репликации (oriV) (рис.8). Для того, чтобы подтвердить наличие на данном фрагменте функционально активных генов, необходимых для репликации, мы сконструировали гибридную клонированного на pBluescript-6, и гомологичного ему BglII-фрагмента pBS72 (3081 пн), клонированного на pMTLBS72.

Рисунок 8. Сопоставление EcoRI-фрагмента р19 (2932 пн), клонированного на pBluescript-6, и гомологичного ему BglII-фрагмента pBS72 (3081 пн), клонированного на pMTLBS72

Она состояла из фрагмента ДНК р19 величиной 2932 пн, вектора E.coli pBluescript и кассеты с геном cat. Полученная плазмида p6cat была способна трансформировать клетки B.subtilis и реплицироваться в них. Вероятно, фрагмент ДНК р19 величиной 2932 пн действительно несет функционально активный rep-район р19. На контиге 2932 пн слева от rep-района на участке ДНК, который не был секвенирован у pBS72, располагалась еще одна ORF - ORF 6. Она соответствует небольшому белку (129 аа), содержащему HTH (helix-turn-helix) мотив, свойственный ДНК-связывающим белкам. Инактивация этой ORF не влияла на способность р19 к конъюгативному переносу. Таким образом, ORF 6 не является необходимым геном конъюгации, однако нельзя исключить какого-то (необязательного) участия продукта этого гена в конъюгативном процессе.

Контиги 2021 пн и 27814 пн содержали ORF, белковые продукты которых были гомологичны белкам конъюгации различных грам-положительных микроорганизмов. Характеризуя предполагаемые функции белковых продуктов ORF р19, которые могут быть вовлечены в процесс конъюгации, мы старались сравнивать их с компонентами VirB-VirD системы A. tumefaciens, являющейся модельной для описания системы секреции 4 типа (T4SS) и ее частного случая - mating pair formation (mpf) комплекса конъюгации (Christie, 2001; Schroder, Lanka, 2005). Ниже приведен перечень белковых продуктов идентифицированных ORF контигов 2021 пн и 27814 пн, для которых можно предположить определенные функции.

1. Продукты ORF4, ORF10, ORF15 - гомологи VirD4-, VirB11-, VirB4-подобных белков. Это крупные белки, имеющие АТФ-связывающий и АТФ-азный домены. Они функционируют в виде гомомультимеров и являются «энергетическими моторами» конъюгации (Atmakiri et al., 2004). Эти белки являются универсальными для различных систем конъюгации - они обнаружены и у грам-отрицательных, и у грам-положительных микроорганизмов, хотя в некоторых системах конъюгации у грам-положительных бактерий VirB11-подобные белки могут отсутствовать (Grohman et al., 2003). Инактивация ORF4 и ORF10 подавляет способность р19 к конъюгации, что подтверждает необходимость соответствующих белков для этого процесса.

2.Продукт ORF26 также имеет гомологию с VirD4-подобными белками. Однако его величина (200 аа вместо обычных для гомологов этого белка 700-800 аа), отсутствие свойственных VirD4-подобным белкам консервативных доменов и гомология с VirD4-подобными белками не только продукта самой ORF26, но и аминокислотной последовательности, которая может быть транслирована с ДНК межгенного района ORF26 - ORF27, позволяют предположить, что ORF26 является псевдогеном. Возможно, ORF26 является продуктом дупликации ORF4 и последующих делеций и других перестроек гена.

3. По нашим данным, ORF1 необходима для процесса конъюгации. Продукт ORF1 имеет небольшую гомологию (около 30% идентичных аминокислот) с несколькими белками грам-положительных микроорганизмов, содержащими TOPRIM-домен, характерный, в том числе, для DnaG-праймаз и топоизомераз. Однако сам белок, соответствующий ORF1, такого домена не имеет - возможно потому, что мы определили лишь часть нуклеотидной последовательность гена, без его начала. Нельзя исключить возможности того, что данный белок имеет топоизомеразную активность.

4. Продукт ORF12 - крупный белок, также необходимый для конъюгации р19; на N-конце он имеет множественные трансмембранные домены (5 по данным программы TMHMM2.0 и 7 - по данным программы InterProScan). Эта особенность белка позволяет предполагать, что он, возможно, является функциональным аналогом конъюгативного белка TcpH плазмиды pCW3 C.perfringens, который, в свою очередь, содержит VirB6-подобный домен (Teng et al., 2008). Белок VirB6 является образующим белком конъюгативного канала и взаимодействует как с передаваемой нитью ДНК, так и с другими VirB-белками (Schroder, Lanka, 2005).

5. Продукт ORF17 - лизоцим-подобный белок, имеющий трансгликозилазный и NLP/P60 домены. Вероятно, он является функциональным аналогом VirВ1-подобных белков и вызывает частичное разрушение клеточной стенки.

6. Продукт ORF21 - гомолог продукта ORF34 плазмиды pHTbeta E.faecium, который, вероятно, является релаксазой (Tomita, Ike, 2005). Релаксаза - важнейший и универсальный компонент различных систем конъюгации; этот фермент осуществляет одноцепочечный разрыв в передаваемой нити ДНК в специфическом участке, т.н. nic-сайте oriT, и ковалетно связывается с 5'-концом ДНК. Это событие инициирует процесс конъюгативного переноса ДНК. Как и продукт ORF34 pHTbeta, белок, соответствующий ORF21 р19, имеет свойственные релаксазам-никазам четыре аминокислотных мотива. Он может рассматриваться как функциональный аналог VirD2 белка плазмиды Ti. Белки, гомологичные продукту ORF21 р19, встречаются у различных грам-положительных микроорганизмов, в том числе у плазмид pAW63 и pFR55 B.thuringiensis, pXO2 B.anthracis, и, вероятно, составляет новую группу релаксаз, отличную от описанных (Francia et al., 2005; Garcillan-Barcia et al., 2009).

7. Продукт ORF32 является ДНК-топоизомеразой I/III типа. Активность этого гена не является необходимой для осуществления конъюгативного переноса. Однако, ДНК-топоизомеразы являются компонентами многих конъюгативных систем (Zehner et al., 2000).

Белковые продукты ORF13, ORF14, ORF18, ORF20 имеют много гомологов в базах данных среди грам-положительных микроорганизмов, хотя их функции неизвестны

Вблизи от гена релаксазы (ORF 21), между ORF18 и ORF19, расположен протяженный некодирующий район (271 пн), содержащий прямые и инвертированные повторы; в одном из плечей инвертированного повтора можно выделить последовательность нуклеотидов, характерную для nic-сайта oriT мобилизуемых плазмид суперсемейства pMV158 (ANNNTG) (Francia et al., 2005). Мы полагаем, что в данном районе находится oriT плазмиды р19.

Исходя из результатов инактивации различных ORF р19 и сведений о гомологии белковых продуктов этих ORF с белками баз данных, мы полагаем, что к tra-району плазмиды р19 могут быть отнесены контиг 2021пн и часть (17893 пн; ORF1 - ORF21) контига 27814пн. Это составляет 19914 пн и соответствует 20 ORF (рис.7). Правомерность такого разделения контига 27814 пн на две части подтверждает тот факт, что между ORF21 и ORF22 находится промотор. Особенностью белков tra-района является то, что они часто имеют трансмембранные районы: 12 из 18 белков tra-района р19 имеют сигнальные последовательности или трансмембранные участки; подобные участки имеют только 4 из 17 белков, не отнесенных нами к tra-району (здесь учтены белки, для которых известен N-конец).

По данным анализа нуклеотидных последовательностей конъюгативных плазмид, tra-район составляет несколько меньше половины величины плазмиды (Grohmann et el., 2003; Van der Auwera et al., 2005). Так как величина р19 составляет около 97 тпн, то можно предположить, что tra-район р19 имеет величину около 45 тпн. Следовательно, мы определили нуклеотидную последовательность ДНК примерно половины tra-района р19. Таким образом, использованный нами метод (маркирование плазмиды р19 с помощью гена cat, отбор Cm^RTra^- вариантов штамма B.subtilis 19 и клонирование прилежащих к гену cat фрагментов ДНК р19) позволил определить нуклеотидную последовательность значительной части tra-района р19.

3.5 Поиск у других микроорганизмов систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации р19

Представляло интерес выяcнить, существуют ли гомологи не только отдельных генов конъюгации р19, а всей их совокупности, т.е. существует ли какая-либо система конъюгации, родственная таковой р19. Результаты поиска в GenBank представлены в табл. 7. По числу гомологичных белковых продуктов, соответствующих ORF tra-района р19 (16 из 20), наиболее близка р19 система конъюгации штамма B.thuringiensis IBL200. Однако порядок расположения генов в tra-районах р19 и штамма IBL200 различен. Возможно, отчасти это связано с тем, что определение нуклеотидной последовательности ДНК штамма IBL200 не закончено и находится в стадии draft assembly. Кроме того, еще 10 организмов - все они грам-положительные имеют каждый от 9 до 12 белков, гомологичных гипотетическим белкам tra-района р19.

Таблица 30. Результаты поиска в GenBank систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации плазмиды р19.

Меньшее число белков-гомологов tra-района р19 есть и у других грам-положительных микроорганизмов, в том числе у плазмиды рХО2 B.anthracis. При этом и расположение генов, кодирующих гомологичные tra-белки, очень сходно с таковыми у р19; особенно это относится к расположению соответствующих генов у плазмид pFR55 B.thuringiensis, pCP13 C.perfringens, pCLL C.botulinum B и штамма JGS 1495 C.perfringens C. Это позволило расположить фрагменты 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн на карте р19 в определенном порядке (рис. 6). Для некоторых микроорганизмов, фигурирующих в табл.7, показано, что гены tra-района расположены на плазмидах (pRF55, pCLL, pCP13, pEspВ, pLM80); в остальных случаях они, возможно, расположены на хромосомах и являются частью либо интегрированных в хромосомы плазмид, либо конъюгативных элементов (ICE). Гомологи комплекса белков tra-района р19 встречаются среди грам-положительных микроорганизмов различных видов и родов, это несомненно свидетельствует о наличии межвидового и межродового горизонтального переноса подобных генов. Однако ни один из указанных микроорганизмов не имеет гомологов всех белков tra-района р19; идентичность аминокислотных остатков в сравниваемых белках максимально составляет 61%, а для подавляющего большинства белков не превышает 40%. Различная степень гомологии белков позволяет предположить мозаичное строение tra-района р19. Следовательно, система конъюгации, определяемая плазмидой р19 имеет существенные отличия от уже описанных систем, хотя и сходна с некоторыми из них. Нужно отметить, что для белков ни одного микроорганизма из табл 7 не обнаружена гомология с белками, кодируемыми rep-районом р19. Видимо, tra- и rep-районы р19 имеют различное происхождение, что еще раз подтверждает модульное строение плазмид.

Мы проверили, способны ли к мобилизационному переносу другие крупные плазмиды из белорусской коллекции. Для этого в клетки семи штаммов из белорусской коллекции, содержащих крупные плазмиды, была введена путем трансформации мелкая неконъюгативная плазмида pUB110, несущая маркер устойчивости к канамицину. Эти штаммы были использованы в качестве доноров; реципиентом служил штамм 19 (pV) Str^R. Все проверенные штаммы из белорусской коллекции были способны к мобилизационному переносу pUB110. Частота переноса была довольно высока и колебалась от 10^-3 (что равно частоте переноса pUB110, осуществляемого плазмидой р19) до 10^-5.

Мы хотели также проверить наличие на других крупных плазмидах из природных штаммов B.subtilis генов, гомологичных генам конъюгации плазмиды р19. Для этого использовали реакцию ПЦР с праймерами, созданными для генов конъюгации р19 ORF15 (гомолог virB4) и ORF10 (гомолог virB11). Были проверены девять штаммов B.subtilis из московской коллекции, несущие крупные плазмиды, и один такой штамм из белорусской коллекции. Только один из проверенных штаммов - BS15 из белорусской коллекции - дал результаты ПЦР, идентичные таковым для штамма B.subtilis 19. Таким образом, судя по нашим данным, из проверенных крупных плазмид только pBS15 несет гены virB4 и virB11, гомологичные генам плазмиды р19. Эти данные подтверждают предположение о том, что крупные плазмиды, выделенные из почвенных штаммов B.subtilis в разных местах Белоруссии, несут гомологичные системы конъюгации, существенно отличающиеся от таковых у других крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов. Кроме того, уникальны и rep-районы этих плазмид. Таким образом, крупные плазмиды из белорусской коллекции, выделенные из разных штаммов в разных местах Белоруссии, очень сходны друг с другом. Это весьма необычный факт. Возможно, он может быть объяснен именно способностью плазмид к эффективному конъюгативному самопереносу.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ плазмид из природных штаммов B.subtilis, выделенных в Москве и Московской области (московская коллекция) и различных районах Белоруссии (белорусская коллекция). В 24 из 42 штаммов московской коллекции обнаружены плазмиды. Охарактеризованы 32 мелкие плазмиды из 29 штаммов обеих коллекций. Определена нуклеотидная последовательность двух плазмид: р1414 (7949 пн) и p1516S (9881 пн). По величине, характеру рестрикции и гомологии ДНК исследованные мелкие плазмиды составляют однородную группу.

2. На основании данных сиквенса и гибридизации установлено, что у изученных мелких плазмид имеются следующие модули и входящие в них гены: mob (гомологичные гены, присутствуют у всех проверенных плазмид, кроме одной); hsp (гомологичные гены, встречаются у большинства плазмид), rap (имеются у некоторых плазмид и обладают не столь выраженной гомологией). Гены модуля par не обнаружены ни у одной плазмиды. Ген hsp, кодирующий белок - гомолог белков теплового шока, обнаружен нами в составе мелких плазмид впервые.

3. В клетках B.subtilis впервые обнаружен и полностью секвенирован IS-элемент - ISBsu2 (1383 пн), находящийся на плазмиде. Установлено, что гомологи данного IS-элемента присутствуют в геноме различных штаммов B.subtilis.

4. Обнаружено, что плазмида р19 (97 тпн) из штамма B.subtilis 19 белорусской коллекции способна эффективно осуществлять конъюгативный перенос ДНК. Эффективность переноса значительно превосходит таковую для единственной известной конъюгативной плазмиды B.subtilis (natto) - pLS20. С помощью инсерционного мутагенеза плазмида р19 была маркирована геном устойчивости к хлорамфениколу, что позволило изучать различные виды и свойства конъюгативного переноса.

5. Изучены параметры самопереноса р19 и мобилизационного переноса pUB110. Перенос идет как на твердой, так и в жидкой средах и может осуществляться в клетки других видов бацилл. Частота самопереноса достигает 1, частота мобилизационного переноса на два порядка ниже. Перенос р19 начинается сразу после контакта клеток-партнеров; мобилизационный перенос начинается лишь через 60 минут. Частота самопереноса мало зависит от изменения количественного соотношения клеток донора и реципиента и существенно зависит от того, какие штаммы используются в качестве партнеров. Мобилизационный перенос происходит в широком диапазоне температур (21⁰-37⁰С). Мобилизация осуществляется, вероятно, по механизму донации.

6. Впервые для крупных плазмид B.subtilis определена нуклеотидная последовательность ДНК значительной части конъюгативной плазмиды р19 (33506 пн). На этой последовательности идентифицировано 39 открытых рамок считывания (ORF). Идентифицирован rep-район плазмиды р19, обусловливающий репликацию плазмиды и состоящий из гена rep (ORF8) и ориджина репликации. 20 ORF (19914 пн) могут быть отнесены к tra-району, обусловливающему конъюгативный перенос ДНК. Идентифицированы ORF, кодирующие белки-гомологи релаксазы, лизоцим-подобного белка, VirD4-, VirB4-, VirB11-подобных белков плазмиды pTi A. tumefaciens; идентифицирован ориджин конъюгативного переноса.

7. Судя по результатам компьютерного анализа предполагаемых продуктов ORF, принадлежащих к tra-району р19, конъюгативная система этой плазмиды имеет частичное сходство с конъюгативными системами ряда грам-положительных микроорганизмов (роды Bacillus, Clostridium, Exiguobacterium, Listeria), хотя и отличается от них.

8. Крупные плазмиды из штаммов белорусской коллекции составляют однородную группу, отличающуюся от других известных крупных плазмид грам-положительных микроорганизмов по строению rep- и tra-районов.

9. Конъюгативный перенос ДНК достаточно широко распространен у природных штаммов B.subtilis и может играть существенную роль в горизонтальном распространении генов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Полуэктова Е.У., Карандашова И.В., Сапогова Е.Ю., Прозоров А.А. Изучение гомологии природных криптических плазмид Bacillus subtilis. Генетика. 1996. Т.32. № 11. С.1498-1503.

2. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гагарина Е.Ю., Прозоров А.А. Одновременное присутствие трех криптических плазмид разной величины в почвенном штамме Bacillus subtilis. Генетика. 1999. Т.35. № 1. С.46-49.

3. Thorsted P.B., Thomas C.M., Poluektova E.U., Prozorov A.A. Complete sequence of Bacillus subtilis plasmid p1414 and comparison with seven other plasmid types found in Russian soil isolates of Bacillus subtilis. Plasmid. 1999. V.41. P.274-281.

4. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Прозоров А.А. Крупная конъюгативная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. 2000. Т.36. № 7. С.1000-1002.

5. Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Крупная плазмида из почвенного штамма Bacillus subtilis, осуществляющая конъюгативную мобилизацию с высокой частотой. ДАН. 2001. Т.379. № 1. С.130-131.

6. Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Конъюгативная мобилизация, осуществляемая с высокой частотой природным штаммом Bacillus subtilis, несущим крупную плазмиду. Генетика. 2002. Т.37. № 12. С.1598-1603.

7. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Гельфанд М.С., Брон С., Прозоров А.А. Наличие генетического мобильного элемента ISBsu2 из криптической плазмиды в хромосоме ряда штаммов Bacillus subtilis. ДАН. 2002. Т.386. № 4. С.552-554.

8. Полуэктова Е.У., Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Брон С., Прозоров А.А. Присутствие мобильного генетического элемента ISBsu2 в плазмиде почвенного штамма Bacillus subtilis и в хромосомах ряда штаммов этой бактерии. Генетика. 2002. Т.38. № 12. С.1719-1722.

9. Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Почвенный штамм Bacillus subtilis с крупной плазмидой, осуществляющей с высокой частотой конъюгативную мобилизацию. Микробиология. 2002. Т.71. № 2. С.254-257.

10. Лотарева О.В., Полуэктова Е.У., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Прозоров А.А. Межвидовой и внутривидовой конъюгативный перенос различных плазмид у бацилл. Генетика. 2003. Т.39. № 8. С.1141-1144.

11. Хольсаппель С., Гагарина Е.Ю., Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Гельфанд М.С., Прозоров А.А., Брон С. Структура мобильного генетического элемнта ISBsu2 из криптической плазмиды р1516 почвенного штамма Bacillus subtilis и наличие гомологов этого элемента в хромосомах различных штаммов Bacillus subtilis. Микробиология. 2003. Т.72. № 1. С.70-75.

12. Poluektova E.U., Fedorina E.A., Lotareva O.V., Prozorov A.A. Plasmid transfer in bacilli by a self-transmissible plasmid p19 from a Bacillus subtilis soil strain. Plasmid. 2004. V.52. 212-217.

13. Полуэктова Е.У., Федорина Е.А., Прозоров А.А. Конъюгативный перенос крупной плазмиды р19 у различных штаммов Bacillus subtilis. Генетика. 2005. Т.41. № 5. С.601-606.

14. Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Полуэктова Е.У., Титок М.А., Прозоров А.А. Способность к конъюгации и сравнительная характеристика крупных плазмид, содержащихся в природных штаммах Bacillus subtilis из разных регионов Восточно-Европейской равнины. Микробиология. 2007. Т.77. № 2. С.219-224.

15. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Шиловский И.П., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Родионова С.А., Прозоров А.А. Молекулярный анализ некоторых генов плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19, участвующих в процессе конъюгации. Генетика. 2008. Т.44. № 5. С.623-630.

16. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Родионова С.А., Прозоров А.А. Характеристика определяющего конъюгативный перенос tra-района плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Генетика. Т.45. 2010. № 1.

Тезисы

1. Nezametdinova V., Poluektova E., Kanapina A., Kanapin A., Sapogova E., Prozorov A. Properties of cryptic plasmids from the soil Bacillus subtilis strains. 12^th European meeting on bacterial gene transfer and expression. Siena, Italy, 1996. P.121.

2. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Gagarina E.J., Thomas C.M., Prozorov A.A. Bacillus subtilis cryptic plasmids, and their possible transfer in natural habitats. 13^th European meeting on bacterial transformation and 5^th European meeting on the molecular biology of the Pneumococcus. Kaiserslautern, Germany, 1999. B.3.

3. Poluektova E.U., Thorsted P.B., Nezametdinova V.Z., Lotareva O.V., Thomas C.M., Prozorov A.A. Cryptic plasmids found in the Bacillus subtilis strains from the Moscow region soils. International conference on bacilli. Senri-Chuo, Osaka, Japan, 1998. P.74.

4. Полуэктова Е.У., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Титок М.А., Прозоров А.А. Крупные плазмиды из почвенных штаммов Bacillus subtilis и осуществляемая ими конъюгативная мобилизация. Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Москва, 2001. С.132.

5. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Хольсаппель С., Тимакова Н.В., Прозоров А.А. Мелкие и крупные плазмиды в природных штаммах Bacillus subtilis. Тезисы III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва, 2004. С.344.

6. Шиловский И.П., Полуэктова Е.У. Идентификация генов конъюгации плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Тезисы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И.Алиханяна. Москва-Пущино, 2006. С.178-179.

7. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Лотарева О.В., Незаметдинова В.З., Федорина Е.А., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Различные классы плазмид, обнаруженные в штаммах Bacillus subtilis из почв некоторых регионов Восточно-Европейской равнины: свойства, молекулярная характеристика, возможная роль в биоценозах. Тезисы международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Москва, 2007г. С.102.

8. Полуэктова Е.У., Гагарина Е.Ю., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Характеристика tra-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. Тезисы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск, 2008г. С.26-27.

9. Полуэктова Е.У., Незаметдинова В.З., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Строение tra-района конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. Тезисы съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина, и V съезда ВОГиС. Москва, 2009г. С.42.