Эффекты кластеризации глобулярных белков в растворах

Изучение закономерностей кластеризации белков при их взаимодействии с водой, осмолитами, между собой в связи с проблемой растворяющей способности воды и регуляции физико-химического состояния биологических растворов. Управление поведением подобных систем.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 05.09.2010
Размер файла 743,5 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РОЖКОВ Сергей Павлович

ЭФФЕКТЫ КЛАСТЕРИЗАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В

РАСТВОРАХ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург-2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН

Официальные оппоненты:

Засл. деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Воробьев Владимир Иосифович

доктор физико-математических наук, профессор Трусов Анатолий Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Розенфельд Марк Александрович

Ведущая организация: Учреждение РАН Институт высокомолекулярных соединений РАН

Защита состоится «_21_»_октября 2010 года в_16_ часов на заседании Совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «______» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент Курилова Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Взаимодействие молекул биополимеров с водой, ионами солей и между собой непосредственным образом связано с проблемой растворяющей способности воды и эволюции биологических растворов (Хочачка и Сомеро, 1988). Взаимодействие белок- белок и белок- растворитель присутствует во всех аспектах метаболической регуляции и установления надмолекулярной организации, а также определяет механизм агрегации, кристаллизации, денатурации и коагуляции белков при их выделении и очистке. Поэтому изучение самих явлений и механизмов, лежащих в их основе, остается одной из самых актуальных проблем молекулярной биофизики.

Золь гель фазовые превращения, сопровождающие большинство биохимических реакций в цитоплазме, являются сложными и многоступенчатыми процессами, первые этапы которых можно обнаружить лишь с помощью прецизионных физических методов. Несомненно, что важную роль на этих этапах играют динамические, т.е. обратимые ассоциаты макромолекул (Измайлова, Ребиндер, 1974; Frieden and Nichol, 1981, Веденов, 1984). Динамическая ассоциация глобулярных белков обеспечивает переходный уровень к надмолекулярной организации раствора макромолекул, осуществляя возможность более тонкой и сложной регуляции биохимических процессов, чем та, которая происходит при участии только растворенных молекул. Посредством взаимодействия белок- белок и белок- растворитель решается проблема мгновенной, на уровне микроокружения макромолекул, регуляции осмотического гомеостаза (Наточин и др., 1991). Патогенез ряда заболеваний связан с нарушением кооперативных взаимодействий между молекулами белков, их неконтролируемой ассоциацией и агрегацией и обусловлен потерей устойчивости состояния (гомеостаза) под действием внешних факторов (Хорст, 1982). В рамках современных представлений гомеостаз и стресс (который предшествует патологии) на разных уровнях структурной организации биосистем предлагается рассматривать как два устойчивых состояния (или фазы), переход между которыми (фазовый переход) сопровождается кооперативным изменением структурно-динамических и морфологических свойств биосистемы. На молекулярном уровне на это указывает существование неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем (НАСКС), определяющим звеном белковой теории которого в настоящее время есть основания считать реакции полимеризации глобулярного актина (Браун, Моженок, 1987). Список сокращений: НАСКС - неспецифический адаптационный синдром клеточных систем;

САЧ, САЧ-СМ - сывороточный альбумин человека и его спин-меченый аналог;

L-L, L-S -фазовые переходы (ФП) типа жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело.

ДЛФО - теория устойчивости коллоидов Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека;

ЭПР-электронный парамагнитный резонанс,

ВБМ - водно-белковая матрица, ПЭГ - полиэтиленгликоль; ФД - фазовая диаграмма;

НКТР, ВКТР - нижняя и верхняя критические температуры растворения;

С60FWS - водорастворимый фуллерен, ShC - шунгитовый углерод; ND- наноалмаз;

HbS, HbA, HbС - формы гемоглобина

В решении задач биотехнологии важную роль играют методы выделения и очистки белков, наиболее известными из которых являются «высаливание» и кристаллизация. Для оптимизации этих процессов требуется глубокие знания роли температуры, величины рН, концентрации и физико-химических свойств агентов, влияющих на растворимость биополимеров. Вместе с тем эти данные разрозненны и трудно достижимы, поскольку около 20 факторов приходится учитывать для получения кристаллов белков. Фазовые диаграммы, полезные в таких случаях, существуют лишь для десятка белков и то весьма ограниченные (Grouazel et.al., 2006). Более чем за полтора века практических достижений в кристаллизации белков не разработана общая теория этого процесса, поэтому до сих пор метод проб и ошибок является доминирующим. В настоящее время особый интерес к обратимым ассоциатам (кластерам) в растворах биополимеров возникает в связи с тем, что они предшествуют возникновению зародышей новой фазы и могут определять механизм кристаллизации или преципитации (высаливания) белка в насыщенных растворах, являясь зародышами «скрытой» фазы.

В качестве объекта экспериментального исследования взят сывороточный альбумин человека (САЧ) и лизоцим. Они являются одними из наиболее доступных и изученных белков и широко применяются в медицине, биотехнологии и в пищевой промышленности. СА один из первых белков, в растворах которого были идентифицированы белковые кластеры (Giordano et.al., 1991). Вместе с тем СА гетерогенный белок как по существованию множества изоформ, так и по загрузке лигандами, поэтому существуют значительные трудности в изучении и построении фазовых диаграмм этого белка современными методами малоуглового нейтронного и рентгеновского рассеяния (Zhang et.al., 2007). Это требует внедрения новых экспериментальных и теоретических подходов в исследовании его фазовых диаграмм.

Разрабатываемые в работе вопросы непосредственно связаны с проблемой существования даже в умеренно концентрированных растворах глобулярных белков концентрационной гетерогенности - белковых кластеров. Подобные явления предполагают наличие потенциала притяжения между одноименно заряженными частицами, что не вписывается в рамки традиционных теорий. Однако появившиеся в последнее время теоретические разработки допускают возникновение в некоторых условиях дальнодействующих сил притяжения в растворах одноименно заряженных частиц (Chu and Wasan, 1996). По своей природе это силы кулоновские и их происхождение связано с определенной периодичностью расположения заряженных частиц и противоионов.

Процессы формирования кластеров сопряжены с фазовыми переходами типа жидкость- жидкость (De Young et.al., 1993), результатом которых является образование субмикронных размеров обогащенных белком капель жидкости, метастабильных по отношению к кристаллической фазе. Их возникновение описывается на основе короткодействующего парного потенциала взаимодействия между макромолекулами, которые представляются в виде жестких сфер, и дальнего потенциала отталкивания. Такой потенциал средней силы может включать несколько видов энергии взаимодействия. Иногда его строят на основе элементов классической теории ДЛФО, с привлечением сил отталкивания за счет структурированных слоев растворителя (Brandon et.al., 2006). С использованием такого подхода, а также с учетом энтропийных эффектов исключенного объема и/или деплеций удается достаточно точно объяснить некоторые экспериментальные данные различных структурно-динамических методов в растворах глобулярных белков, построить их фазовые диаграммы (Tavares et.al., 2004; Bonnete et.al., 1999), оценить силу белок-белкового взаимодействия по величине и знаку второго вириального коэффициента осмотического давления (George and Wilson, 1994; Neal et.al., 1998; Bonette et.al., 1999). С другой стороны, этот коэффициент в большей степени характеризует взаимодействие белка с солью (Edsall et.al., 1950).

Однако силовой подход не способен объяснить эффекты лиотропных рядов электролита в механизме взаимодействия белков (Tardieu et.al., 1999) и существенно анизотропный характер белок-белкового взаимодействия (Lomakin et.al., 1999). Поэтому в последнее время энергичные попытки были предприняты в изучении специфических эффектов распределения ионов на границах фаз (Luo et.al., 2006), взаимодействия ионов электролита с белками с учетом поляризуемости анионов (Bostrom et.al., 2005), их гидратации (Collins, 2006) и влияния на структурированность воды (Grigsby et.al., 2002). Все же этих усилий пока явно недостаточно, чтобы понять возможную определяющую роль воды в формировании надмолекулярной организации растворов белков.

В выяснении механизма образования белковых кластеров существенный прогресс могла бы внести равновесная термодинамика, однако по ряду причин он мал (Haas and Drenth, 2000). Как известно, поверхностное натяжение вносит значительный вклад в работу образования критического зародыша новой фазы при нуклеации. Поскольку молекула белка имеет развитую поверхность с выраженной кривизной, одной из важнейших задач для понимания функциональной активности белка, в частности, стабилизации той или иной конформации белка, является изучение связи удельной поверхностной энергии водно- белковой матрицы с межмолекулярной энергией взаимодействия белок-белок, ответственной за образование белковых кластеров. На существование такой связи могут указывать явления капиллярных эффектов первого и второго рода (Щукин и др., 1982), обусловленные кривизной гидратируемой поверхности и расклинивающим давлением между взаимодействующими макромолекулами. Кроме того, индуцируемые в присутствии различных осмотически активных молекул (осмолитов) изменения конформационного равновесия белковых структур часто рассматриваются на основе энтропийных эффектов исключенного объема или деплеций, приводящих к изменению взаимодействия между молекулами белка (Saunders et.al., 2000). Это сопряжено с наличием потенциала отталкивания в таких системах между молекулами осмолитов и белков.

С другой стороны, (де)стабилизация структуры белка в присутствии осмолитов, влияющих на поверхностное натяжение растворителя, в биохимии интерпретируется в терминах равновесного связывания молекул осмолитов и растворителя, а также конкуренции между ними (Kita et.al., 1998) - то есть эффектами предпочтительной гидратации. К категории взаимодействия белок - растворитель относится также гидрофобное, изменяющееся пропорционально неполярной поверхности макромолекулы. «Гидрофобные силы» дают большой вклад в функциональную динамику белка, структурный фолдинг и в механизм агрегации.

Таким образом, взаимодействие белок- белок и белок- растворитель есть два подхода к одному явлению, связующим звеном между которыми могла бы стать концепция микроскопического поверхностного натяжения растворителя. К сожалению, имеющиеся теории поверхностного натяжения и способы его измерения пока весьма далеки от совершенства, так что их изучение также остается актуальной задачей.

Целью работы является исследование фундаментальной проблемы природы и механизмов дальних взаимодействий и поверхностных явлений, приводящих к возникновению надмолекулярной организации в многокомпонентных растворах глобулярных белков. При этом особое внимание уделяется теоретическому подходу к построению различного вида фазовых диаграмм и способов их взаимной трансформации. Теоретический анализ системы вода-белок-соль проводится на основе равновесной термодинамики с элементами теории устойчивости по отношению к процессам диффузии (Пригожин, Дефей, 1968), критических и закритических явлений (Базаров, 1983), термодинамики многокомпонентных систем (Edsall et.al., 1950).

Непосредственная задача исследования - изучение закономерностей кластеризации белков при их взаимодействии с водой, осмолитами и между собой в связи с проблемой растворяющей способности воды и регуляции физико-химического состояния биологических растворов. Анализируются возможности управления структурными свойствами и динамическим поведением подобных систем, а также выясняется роль этих явлений в функционировании биосистем (осморегуляция, механизмы срочных реакций белковых систем на изменения температуры и солености) и в технологических процессах (стабилизация структуры белка осмолитами, «высаливание», нуклеация). Экспериментально проблема решается на базе метода ЭПР спиновых меток и зондов.

Для достижения цели решаются следующие задачи:

1. Разрабатывается комплекс методических приемов на базе метода ЭПР спиновой метки для анализа изменений динамических и термодинамических свойств водно-белковой матрицы макромолекул, в том числе расклинивающего давления и удельной поверхностной энергии, в процессе соль-индуцируемых структурных фазовых переходов. Для проверки работоспособности метода полученные результаты по эффективности различных осмолитов в стабилизации структурной динамики молекул белка сопоставляются с данными независимых методов.

2. Исследуются процессы формирования кластерной организации водно- солевых растворов молекул САЧ в условиях изменения концентрации компонентов и температуры.

3. Строятся теоретические фазовые диаграммы модельной системы вода-белок-соль и определяются условия возможных фазовых переходов ней в зависимости от концентрации компонентов, температуры, заряда белка, связывания с ионами электролита и активности электролита.

4. Проводится анализ существующих литературных данных по кластерной природе растворов лизоцима как наиболее изученного модельного белка для верификации разработанной модели и установленных на основе модели закономерностей.

5. Исследуется влияние на водно - белковые системы нового типа осмолитов - гидратированных наночастиц и нанокластеров углерода, представленных фуллеренами, фуллереноподобными структурами шунгитового углерода и наноалмазами.

Научная новизна результатов.

1. Предложена модель возникновения кластеров в растворах глобулярных белков, в основу которой положена определяющая роль компенсации удельной поверхностной энергии воды в результате анизотропного взаимодействия между молекулами белков в кластере. При этом теория допускает существование кластеров двух типов, различающихся размерами, один из которых может быть охарактеризован как «фаза».

2. Предложен способ анализа детерминанта устойчивости модельной системы вода-белок-соль, построена фазовая диаграмма состояния раствора и показана возможность ее представления в разных системах координат. Установлено, что положение фазового перехода и критической точки на фазовой диаграмме определяется отношением молярных концентраций белка и соли. Величина этого отношения зависит от индивидуальных характеристик белка (заряд, число адсорбируемых ионов) и активности электролита.

3. Впервые в аналитическом виде получены коэффициенты, характеризующие уравнение «высаливания» белка электролитом и показывающие роль адсорбированных ионов в этом процессе.

4. Фазовый переход типа жидкость-жидкость рассматривается как фазовый переход воды, участвующей в гидратации мономеров и кластеров белка. Это позволяет именно к воде применить основные термодинамические следствия существования критических фазовых переходов. При этом представления об универсальной растворимости всех компонент раствора в критической точке, неравномерное и селективное перераспределение компонент системы по пути к критической точке по разным типам гидратных оболочек позволяют предположить существование механизма регуляции активности белка с участием ненативных форм белковых глобул.

5. Зарегистрированы эффекты неспецифического влияния гидратированных наночастиц углерода на стабилизацию САЧ и мембранных белков, в основе которого может лежать способность наночастиц регулировать фазовое состояние водно-солевого раствора белка и адсорбировать компоненты раствора.

6. Предлагается механизм срочной регуляции осмотического равновесия и неспецифических физико-химических регуляторных реакций на уровне микроокружения макромолекул в ответ на изменение состава или температуры, основанный на существовании кластерной организации белка.

7. Апробированы новые экспериментальные подходы на базе метода ЭПР спиновой метки, позволяющие с использованием изотерм изменения вязкости раствора сахарозой регистрировать изменения удельной поверхностной энергии белка, а также эффективных термодинамических функций состояния водно- белковой матрицы как результата изменения взаимодействия между компонентами раствора в процессе фазовых переходов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Разработка комплекса методических приемов на базе метода ЭПР спиновой метки для анализа свойств водно-белковой матрицы молекул белка, их изменений под действием осмолитов и в процессе соль-индуцируемых структурных фазовых переходов.

2. Теоретический подход к построению фазовых диаграмм модельной системы вода-белок соль, поиск условий и механизмов образования кластеров белка и сопряженных с ними фазовых переходов в зависимости от концентрации компонентов, температуры, заряда белка, связывания с ионами электролита и активности электролита.

3. Экспериментальное обнаружение фазовых переходов и кластерной организации водно- солевых растворов молекул САЧ и лизоцима в условиях изменения концентрации компонентов и температуры.

4. Эффекты влияния на водно - белковые системы и их кластерную организацию нового типа осмолитов - гидратированных наночастиц и нанокластеров углерода, представленных фуллеренами, фуллереноподобными структурами шунгитового углерода и наноалмазами.

5.Оценка перспектив использования результатов исследования в решении ряда биомедицинских и технологических задач (осморегуляция, стабилизация белка осмолитами, регуляция активности белка, поиск оптимальных условий кристаллизации, механизмы стресс-индуцированных денатурационных изменений белков).

Практическая значимость работы заключается в разработанной методологии изучения явления кластеризации глобулярных белков, объединяющей экспериментальное наблюдение эффектов взаимодействия белков в разных областях фазовой диаграммы и ее теоретический анализ на основе взаимодействия белок-растворитель.

Установленные закономерности возникновения белковых кластеров двух типов в системе вода-белок-соль и фазовых переходов позволяют получить научно-методический подход к выбору условий, наиболее оптимальных для целей кристаллизации, очистки и стабилизации структуры белка.

Предлагаемая концепция связи межмолекулярного расклинивающего давления и давления в водно-белковой матрице дает возможность теоретически и экспериментально связать изменения межмолекулярного взаимодействия с изменениями конформационной динамики молекул и стабилизации структуры белка. Показано, что метод ЭПР спиновых меток и зондов при условии адекватной интерпретации формы спектра можно использовать для построения фазовых диаграмм растворов глобулярных белков, при этом становится доступной информация как о взаимодействии белок-белок, так и об изменении внутримолекулярной динамики, которая сопряжена с межмолекулярным взаимодействием.

Предложен способ измерения удельной поверхностной энергии в области локализации спиновой метки и ее изменений в присутствии различных осмолитов, позволяющий оценивать эффективность осмолитов в стабилизации структуры белка.

На молекулярном уровне образованием кластеров обоснован механизм срочной регуляции ионно-осмотического равновесия и рассмотрен кооперативный фазовый переход системы под действием неспецифических факторов (изменении температуры, концентрации соли) из состояния осмотического гомеостаза к состоянию стресса и патоологии. Найдены возможности управления этим процессом на уровне микроокружения макромолекул. Обнаруженные закономерности дают основание для построения физико-химической модели, которая позволила бы понять эволюционные механизмы возникновения конформационных белковых патологий и неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем.

Апробация работы Основные результаты исследований были представлены на международных и отечественных съездах, конференциях, семинарах:

2nd International Symposium “Molecular order and mobility in polymer systems”, (Saint Petersburg, 1996); и XIII международного совещания по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург, 1996; 2006); Юбилейная научная Конференция «50 лет Карельскому Научному Центру РАН (Петрозаводск, 1996); International Symposium “Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical Aspects”, (Moscow, 1998); 2 и 3 съезда биофизиков России (Москва, 1999, Воронеж, 2004); V - X Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, 1997-2003); 4, 5, 6, 7 Biennal International Workshop “Fullerenes and atomic clusters” (St. Petersburg, 1999; 2001; 2003; 2005); 3 Международного Семинара «Минералогия и жизнь: биоминеральные гомологии» (Сыктывкар, 2000); Международного Минералогического Семинара (Сыктывкар, 2001); III Съезда Биохимического Общества (С-Петербург, 2002); Международной Конференции “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем” (Минск, 2004); IX International Conference “Hydrogen material science and chemistry of carbon nanomaterials” (ICHMS`2005) (Sevastopol, 2005); Российской Конференции “Современные проблемы молекулярной биофизики” (СпбГУ , 2006); XVI International Conference “Chemical Thermodynamic in Russia” ( Suzdal, 2007).

Публикации Всего по материалам диссертации опубликовано 34 работы (без учета тезисов докладов).

Личный вклад автора Автором осуществлен выбор направления исследований и постановка задач. Эксперименты, анализ и интерпретация данных проведены лично автором. Им же предложен аналитический подход для построения фазовых диаграмм и проведен их теоретический анализ. Часть исследований, результаты которых представлены в диссертации, были поддержаны грантами РФФИ, № 99-03-32388 и № 03-03-32347, при этом автор являлся руководителем проектов.

Структура работы Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка литературы, содержащего 402 источника. Работа изложена на 270 страницах , содержит 11 таблиц и иллюстрирована 69 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении изложены проблемы, связанные с обнаружением в растворах глобулярных белков концентрационной неоднородности - кластеров, обосновывается актуальность их изучения, формулируются цели и задачи исследования, приводится общая характеристика работы.

Первая глава носит обзорный характер. Первая треть главы 1 посвящена вопросам изучения взаимодействия белок-белок и физической природы сил взаимодействия, начиная от диполь-дипольных, затем коллоидных, включающих молекулярные, ион-электростатические и гидратационные и заканчивая энтропийными эффектами исключенного объема и деплеций. Кратко представлены силы, обуславливающие возникновение потенциала взаимодействия одинаково заряженных частиц и учитывающие конечный радиус ионов и неравномерность их распределения в растворах коллоидных частиц. Как экспериментальная характеристика сил взаимодействия более подробно рассмотрено осмотическое давление и его вириальные коэффициенты. Приведены примеры экспериментального обнаружения кластеров в растворах различными физическими методами, в основном в связи с их предполагаемой ролью в процессах кристаллизации белков. Анализируются существующие гипотезы о механизмах фазовых переходов в растворах биополимеров, сопряженных с возникновением кластеров и возможные способы представления фазовых диаграмм растворов белков.

Во второй трети главы 1 обсуждаются некоторые аспекты взаимодействия молекул с растворителем, основанные на структурных особенностях воды и ее способности располагать в своей структуре различные по строению молекулы. Затем вопросы структурирования воды рассмотрены применительно к проблеме гидратации биомакромолекул и роли когезионной прочности воды в механизме взаимодействия белок-растворитель. Эта концепция позволяет использовать модель предпочтительной гидратации в изучении стабилизации структуры белка в растворе. Далее приводится взгляд на состояние воды с позиции макроскопических представлений, где активность воды и осмотическое давление являются интегральными термодинамическими характеристиками раствора. Исходя из этих представлений, рассмотрена концепция осмотических сил и расклинивающего давления как сил, ответственных за опосредованное растворителем взаимодействие белок-белок. Здесь же расклинивающее давление сопоставляется с капиллярными эффектами, обусловленными кривизной поверхности и зависимостью удельной поверхностной энергии от кривизны.

Заключительная часть главы 1 посвящена вопросам взаимодействия ионов электролита с белковой глобулой и анализу существующих механизмов взаимодействия. Заканчивается глава обсуждением структурных и физико-химических особенностей молекул сывороточного альбумина и их растворов как основного объекта исследования.

Во второй главе описаны возможности применения метода ЭПР спиновых меток для изучения структурной динамики белков, обусловленной эффектами взаимодействия белок-растворитель. Сначала рассмотрены некоторые задачи, решаемые методом спиновых меток, обсуждаются его достоинства и недостатки применительно к поставленной проблеме. В качестве достоинств отмечается широкий выбор возможностей изучения структурной динамики белка в зависимости от легко варьируемых внешних условий и чувствительность к дальним, опосредованным растворителем, взаимодействиям спиновых меток на основе дипольного механизма, проявляющегося в уширении спектров ЭПР. Это позволяет при температурах жидкого азота регистрировать изменения локальной концентрации спин-меченых биополимеров в растворе как результата их взаимодействия.

К недостатку метода относится необходимость выбора соответствующей модели движения нитроксильного радикала и многократная вырожденность спектров ЭПР, зачастую не позволяющая точно оценить характер движения метки, дать спектрам однозначную интерпретацию и получать абсолютные значения динамических характеристик. Это вынуждает искать обходные пути извлечения нужной информации и данных об относительном изменении параметров спектра, что усложняет проведение эксперимента.

В этой главе проведен анализ экспериментальных результатов, полученных в рамках существующих модельных подходов, для интерпретации спектров ЭПР молекул САЧ и расчета эффективных значений времен корреляции c вращательной диффузии спиновых меток в водно-белковой матрице. На рис.1 представлены экспериментальные данные по изменению частоты вращения 1/c спиновой метки, модифицирующей молекулы САЧ, от температуры и концентрации NaCl. Существенно нелинейный характер зависимости частоты вращения от варьируемых параметров (аналогия с расслаивающимися полимерными системами (Вассерман, Коварский, 1986)), свидетельствует в пользу гипотезы о фазовом переходе в водно-белковой системе, хотя и не раскрывает его природу.

Третья глава посвящена разработке новых экспериментальных подходов для изучения взаимодействия белок-растворитель методом спиновой метки. На рис.2. представлены спектры ЭПР сывороточного альбумина человека (САЧ), модифицированного спиновой меткой на основе малеимида (САЧ-СМ) по SH -группе Цис-34 (Hull et.al.1975). Показано, что В- компонента спектра не обусловлена посадкой метки на других центрах, например, аминогруппах (Benga, Strach, 1975). Совокупность экспериментальных наблюдений позволяет предложить модель (Wetzel et.al., 1980), согласно которой полость в структуре белка, где локализована метка, находится в двух конформациях, с большей (А) и меньшей (В) микровязкостью. В (А)- состоянии метка находится в «закрытой» полости белка и характеризует глубинные слои водно- белковой матрицы (ВБМ), а в (В)- состоянии - поверхностные.

Благодаря хорошему разрешению А и В компонент спектра ЭПР молекул САЧ-СМ можно измерять эффективные значения коэффициента распределения радикалов Крэф, не применяя процедур разделения и интегрирования спектров:

Kрэф I0A(H0)2A / I0B(H0)2B . (1)

Амплитуда и эффективная ширина линии I0 и H0 показаны на рис.2. Использование Kрэф позволяет регистрировать термодинамические отличия А и В состояний ВБМ и их изменения, индуцируемые присутствием гостевых молекул в растворе.

-lnKрэф=(GA - GB)эф = (HA - HB)эф -Т(SA - SB)эф (2)

где Gэф = (GA - GB)эф - разность эффективных значений свободной энергии Гиббса; Hэф = (HA - HB)эф - энтальпии и Sэф = (SA - SB)эф - энтропии А и В состояний ВБМ. С помощью уравнения Вант-Гоффа рассчитывали H = -RdlnK/d(T-1) и S = -(G/T)P = R(TdlnK/dT + lnK).

В работе предлагается новый высокочувствительный способ регистрации величины, пропорциональной изменению Gэф, с использованием сахарозных зависимостей. В координатах ln[A]/[B] = f{ln(T/)} строятся линейные изотермы изменения вязкости и определяется угол их наклона . Так как T/ ~ (0)-1exp(-W/RT), где W - энергия активации вязкого течения, а - вязкость раствора, то:

tg ~ RTln([A]/[B])/W = -GAB/W, (3)

где -GAB характеризует разность свободных энергий Гиббса А и В состояний водно- белковой матрицы, куда экспонирована спиновая метка. Таким образом, -GAB/W является безразмерным параметром, позволяющим регистрировать изменения свободной энергии состояния ВБМ (см.рис.12), вносимые возмущениями различной природы.

Знание функции изменения свободной энергии ВБМ в присутствии осмолитов (сахароза, глицерин, мочевина, полиэтиленгликоли (ПЭГ), электролиты) позволяет представлять результаты действия осмолитов на ВБМ в терминах изменения силового параметра П - поверхностного расклинивающего давления (Рожков, 1991; 1992), либо химического потенциала белка 2Tr (энергетический параметр):

2Tr ~(GA-GB)эфосмолит-( GА-GВ)эфвода. = GS - GW , (4)

Изменение 2Tr ~ GS - GW характеризует удельную свободную энергию переноса спин-метки из А в В состояние полости белка, когда белок переходит из водного (w) в водно-солевое (s) окружение. Здесь 2Tr определяет растворимость белка S2(m3) в солевом растворе (Arakawa et.al., 1991): 2Tr = (2/m3)dm3 = - RTln(S2(m3)/S2(W)), где m2 и m3 - молярные концентрации белка и соли.

На рис. 3 показано, что 2Tr принимает отрицательные значения при умеренных концентрациях NaCl и положительные - при больших концентрациях. Это можно интерпретировать так, что в первом случае взаимодействие белок-соль термодинамически более выгодное (доступное состояние полости белка, где локализована метка, для воды, растворимость выше), а во втором случае наблюдается стабилизация закрытой полости белка, сопряженная с уменьшением растворимости.

Приводимые в этой главе данные метода ЭПР спин-метки о действии осмолитов на состояние водно-белковой матрицы находятся в полном соответствии с имеющимися в литературе данными других методов о (де)стабилизирующем влиянии того или иного осмолита на структуру белка (Arakawa et.al., 1991).

Далее в главе 3 предлагается способ определения удельной поверхностной энергии водно-белковой матрицы методом изотерм вязкости (Рожков, Горюнов 2006). Он основан на данных метода ЭПР спин- метки, которые использовались для построения изотерм зависимости частоты вращения метки 1/с от Т/, где - вязкость раствора, изменяемая сахарозой. Это позволяет в пределе линейной экстраполяции изотерм к бесконечной вязкости (Т/) 0 получить предельные значения частоты вращения 1/*:

1/с = к (Т/)/v + 1/* , (5)

где к - постоянная Больцмана, v - эффективный объем метки и белка. Здесь 1/с учитывает как диффузию метки в ВБМ с эффективной вязкостью *, так и диффузию белка в среде с вязкостью , изменяемую сахарозой. Граничное значение частоты диффузии метки 1/* соответствует такому движению, когда вязкость среды как таковая в спектрах ЭПР уже не проявляется, а дальнейшее уменьшение подвижности метки определяется ростом удельной поверхностной энергии в ВБМ из-за эффектов предпочтительной гидратации.

В соответствии с существующими моделями (Вассерман, Коварский, 1986), элементарный акт переориентации метки требует флуктуации свободного объема - объема активации v*. Средний квадрат радиуса такой флуктуации <r>2 (kT)/, где - поверхностное натяжение растворителя. Частота флуктуаций метки 1/*, связанная с v*, определяется работой против поверхностных сил, стремящихся ее уничтожить:

1/* = А*ехр(-P v* /RТ) А*ехр(-2 v* /rRТ) (6)

где P - внутреннее давление, r - эффективный радиус , А* - константа, определяемая из температурной зависимости 1/*.

Тогда в пределе (Т/) 0 подвижность метки 1/* определяется лишь флуктуациями объема активации, зависящими от . Поэтому условие (Т/) 0 позволяет приводить давление к стандартному состоянию P v* = const. в уравнении (6). Присутствие в растворе белка других молекул (помимо сахарозы), влияющих на , будет приводить к изменению P. Тем самым создается возможность сравнения эффекта разных осмотически активных веществ на в стандартных условиях. Из уравнения (6) следует:

rRT(lnА*- ln(1/*))/2 v* ,(7)

где r 5 10-10 м, v* 125 см3 (половина молярного объема метки).Значения с вычисляли по формуле Фрида: с = 2,55 1010(1 - Аzz/ А0zz )-0,615 , где Аzz и А0zz - расстояния между крайними линиями спектра ЭПР исследуемого образца и образца при 77К.

На примере спин-меченых молекул САЧ, гемоглобина, антител проведена экспериментальная проверка методического подхода и исследован характер изменения поверхностного натяжения в зависимости от концентрации белка, строения спиновой метки, лигандного состояния белка, а также в присутствии разных концентраций солей (см.рис.13), декстранов и полиэтиленгликолей, Д2О.

В теоретической части работы, которая представлена в Главе 4, обсуждается механизм образования белковых кластеров и анализируются условия их наиболее вероятного возникновения с использованием фазовых диаграмм. Это дает возможность целенаправленно регулировать фазовое состояние такой системы и предсказывать структурно-динамическое поведение ее компонент в заданных точках фазовой диаграммы.

Исходя из представлений (Фролов, 1987) о важной роли в агрегативной устойчивости дисперсных систем способности к компенсации поверхностной энергии частиц энтропийной составляющей свободной энергии Гиббса смешения, предложен возможный компенсационный механизм возникновения белковых кластеров. В кластере экранировка неполярной поверхности белка от взаимодействия с объемной водой раствора осуществляется заряженными и полярными группами соседних молекул белка и тем самым компенсируется избыточная поверхностная энергия. Это предполагает существенно анизотропный характер взаимодействия из-за мозаичного расположения полярных и неполярных групп на поверхности белка. В этом случае удельная поверхностная энергия молекулы белка в кластере уменьшается и ее среднее значение будет равно:

с = 0 (1 - rкр Sэ NA/3Vм), (8)

где 0 - поверхностное натяжение на границе неполярной поверхности белка с водой, Sэ - экранируемая полярными группами площадь неполярной поверхности молекулы, NА - число Авогадро, Vм - молярный объем белка, rкр - радиус кластера.

Используя уравнение Гиббса-Томсона для критического зародыша RTln(m2/m2*)= 2V/rкр, условие (8) и зависимость удельной поверхностной энергии от радиуса частиц, известную как уравнение Толмена, 0 п (1- 2l/rкр ), где п -поверхностное натяжение плоской поверхности, 2l - толщина поверхностного слоя, получаем, что в растворе, близком к насыщению, могут существовать критические квазичастицы размеров R1 и R2:

R1,2 =(6V/Sэ NA){(1(-Y)1/2)/(Y + 1)}, где Y= 3(RTlnm2/m2* )/(2п Sэ NA). (9)

Из этого уравнения следует, что при концентрации белка m2 m2*ехр(-2пSэNA/3RТ) в растворе создаются условия для формирования кластеров с размерами R2 = 3V/SэNA. Также теоретически возможным оказывается существование в этих условиях квазичастиц с еще большим радиусом - R1, однако активационный барьер их формирования может быть достаточно велик, чтобы они возникали спонтанно, и лишь в условиях насыщения, которое можно уменьшать добавлением соли, вероятность возникновения квазичастиц радиуса R1 возрастает. Зависимость радиусов этих квазичастиц от концентрации биополимера m2 показана на рис.4.

Таким образом, согласно рис.4, еще до достижения условия насыщения образуются кластеры первого типа с радиусом R2, которые по мере приближения к насыщению могут трансформироваться в кластеры второго типа с радиусом R1. Однако концентрацию белка, необходимую для насыщения раствора, можно уменьшать добавлением «осадителя», например, электролита. При этом кластеры с радиусом R1 могут расти за счет уменьшения кластеров первого типа. В литературе есть сведения о существовании в растворах лизоцима субмикронного размера фрактальных кластеров и компактных кластеров-олигомеров с меньшими размерами (Muschol, Rozenberger, 1997).

Экспериментальные данные, подтверждающие гипотезу о компенсационном механизме, представлены на рис.13, где показано, что по мере роста концентрации белка поверхностное натяжение сначала растет, а затем резко падает, что совпадает с моментом образования белковых кластеров.

Далее стояла задача отнесения кластеров к определенному фазовому состоянию раствора. Для получения уравнений, характеризующих фазовые границы в растворе белка, проводится анализ термодинамической устойчивости модельной системы вода (1)- белок (2)- электролит (3) по отношению к росту флуктуаций, с которых начинается фазовое разделение, от концентрации компонент системы. Исходя из представлений равновесной термодинамики и основных неравенств, характеризующих устойчивость систем:

> 0, (10)

исследован детерминант устойчивости 0 2G/mimj < в области его минимального (нулевого) значения. Здесь G/mi=i - химический потенциал компонентов раствора. При условии равенства нулю детерминанта и его главных миноров, а также с использованием элементов термодинамической теории многокомпонентных систем Скэтчарда (Edsall et.al. 1950), получено аналитическое выражение для коэффициента устойчивости системы (1/m2)m3, где 1 - химический потенциал воды, m2 и m3 - молярные концентрации биополимера и электролита:

. (11)

Здесь - число ионов электролита, адсорбированных белком, z - его заряд, - функция изменения коэффициента активности электролита от концентрации в приближении Дебая-Хюккеля, расширенного на большие концентрации соли введением экспериментальных поправок:

= .(12)

Здесь - ионная сила, r- Дебаевский радиус иона, d и Q - параметры, зависящие от температуры и диэлектрической проницаемости, i - экспериментальные константы. Интегрирование выражения (11) позволяет получить уравнение линий, ограничивающих устойчивую (выше линии) и неустойчивую (ниже линии) по отношению к росту флуктуаций концентрации белка область фазовой диаграммы в координатах [1 m2]. Эти линии схематически изображены на рис.5. Их подробный анализ легко провести вследствие существования характеристических точек: экстремума и наибольшей крутизны, выражения для которых можно получить в аналитическом виде.

Если параметр < 0 (низкие и умеренные концентрации соли), то линия устойчивости имеет максимум, соответствующий критической точке С, а также одну точку максимальной крутизны В. При > 0 существует две точки максимальной крутизны, В и D. Совокупность точек С при различных значениях вариабельных параметров (температуры, концентрации соли и т.д.) образует линию спинодали на фазовой диаграмме, (т.е. линию, ограничивающую устойчивые и метастабильные состояния, от неустойчивых) а совокупность точек В и D соответствуют нодам бинодали и характеризуют метастабильное фазовое равновесие.

Химический потенциал воды 1 с ростом m2 изменяется вдоль изотермы (пунктир на рис.5), достигает границы устойчивости и образует петлю Ван-дер-Ваальса. При этом в точке (А) (на бинодали как на линии метастабильного равновесия фаз) начинают возникать метастабильные белковые кластеры концентрированной фазы с концентрацией белка D, а 1 во всем диапазоне концентраций белка остается неизменным. Это фазовый переход типа жидкость-жидкость (L-L), близкий к ФП 1 рода. Важное условие метастабильности и существования квазиравновесных кластеров - равенство заштрихованных площадей на рис.5 (правило Максвелла).

Справа от линии устойчивости на рис.5 пунктиром показан рост изотермы в область больших концентраций белка, свидетельствующий о существовании энергетического барьера для кристаллизации F. Однако этот участок изотермы можно рассматривать как уменьшение 1 в процессе разбавления водой набухшей твердой фазы. В этом случае изотерма также пересекается с линией устойчивости, но уже для набухшей твердой фазы. В этом случае правило Максвелла не выполняется (нет точки максимальной крутизны) и метастабильного состояния - кластера разбавленной «фазы» не образуется. Поэтому растворение не может происходить по механизму образования метастабильного кластера разбавленной фазы в набухшей твердой фазе.

С дальнейшим ростом m3 ( > 0) форма линии устойчивости изменяется (рис.5, кривая 2). Появляется вторая точка перегиба (D) и вторая нода бинодали. При этом возможны два метастабильных состояния: (AD) и (EB). Это означает, что появляющиеся в этих условиях кластеры белка метастабильны как по отношению к кристаллической фазе, так и по отношению к раствору и время жизни таких динамических кластеров должно быть ограничено. В такой ситуации критический раствор в некотором диапазоне изменения состава представляет собой смесь флуктуационных кластеров от обеих граничных фаз и может при этом выглядеть макроскопически прозрачным. Такое состояние раствора наблюдалось нами в присутствии CaCl2 и MgCl2.

При еще большей концентрации электролита (кривая 3) раствор полностью теряет устойчивость и выделяется твердая фаза.

Согласно критерию Пригожина, из условия (1/m2) = 0 уравнения (11) можно получить уравнение спинодали фазовой диаграммы, которое связывает критический состав, при котором достигается критическая точка С, с характеристиками белка и соли:

.(13)

Выражение для состава, при котором достигаются точки максимальной крутизны линии устойчивости (ноды бинодали B и D на рис.5), получается из условия (12/m22) = 0:

.(14)

Из условия (1/m2) = получаем уравнение линии, ограничивающей максимально стабильную твердую фазу F от других состояний раствора:

.(15)

Уравнения (13)-(15) связывают критический состав системы (m2/m3)кр со специфическими характеристиками биополимера: (m2/m3)кр = f(, z, ). Все три линии сходятся в одной сверхкритической (тройной) точке с координатами (m2/m3) = 2/ при = 22/(z2-2). В этой точке все фазы находятся в термодинамическом равновесии.

Экспериментальные фазовые диаграммы часто представляются в координатах изменения растворимости белка logS от концентрации соли (или ионной силы). Если logS представить в форме уравнения Дебая-Хюккеля, эквивалентному выражению в скобках в уравнении (12) (Бланделл, Джонсон 1979), тогда из уравнения (12) следует, что:

logS . (16)

Уравнения (13) - (15), после их преобразования относительно параметра , с помощью уравнения (16) приводятся к виду, соответственно:

logS ~ + const (17)

logS ~ + const; (18)

logS ~ + const (19)

где уравнение (17) есть спинодаль, (18) - ноды бинодали, (19) - линия границы твердой фазы в координатах растворимости белка от концентрации соли.

Здесь наибольший интерес представляет уравнение (18), поскольку по смыслу рис.5 оно должно отражать существование двух фаз раствора с разными концентрациями белка, соответствующими длине ноды. Рассмотрим уравнение (18) вблизи критической точки. Так как m3 = m2/n (уравнение 13), где n > 2 - положительные рациональные числа и 22 <z2, то уравнение (18), в пренебрежении малыми членами О(1/n2), будет иметь вид:

logS - ln(m22) - Ks() + b, (20)

Здесь уравнение (18) трансформируется в уравнение Сеченова и характеризует линию “высаливания”, где 1/n играет роль безразмерной концентрации соли, а

b (21)

- отрезок на оси ординат, полученный экстраполяцией прямолинейного участка на m3 = 0, или гипотетическая растворимость в отсутствии электролита. Ks определяет угол наклона экстраполяционной прямой в области “высаливания”:

Ks - (22)

Этот коэффициент “высаливания” характеризует эффективность соли. Из уравнения (21) следует, что гипотетическая растворимость растет с ростом заряда белка и с числом адсорбированных ионов соли. Однако в области больших концентраций соли главным становится коэффициент высаливания и растворимость резко уменьшается с ростом . Механизм этого явления раскрывается в теории предпочтительной гидратации белков в присутствии солей (Arakawa, Timasheff 1984).

В таком представлении в уравнении (20) величина S является концентрацией белка в разбавленной фазе, а m2 m2* - концентрацией белка в «фазе» кластера. Поэтому уравнение высаливания белка электролитом характеризует взаимосвязь между концентрациями белка в двух «фазах». Таким образом, зная заряд белка, число связанных анионов соли и ее концентрацию, а также концентрацию белка, при которой наступает высаливание, можно оценивать концентрацию белка в кластере. С другой стороны, если известна концентрация белка в разбавленной фазе и в кластере (иногда ее удается определить после центрифугирования раствора, в результате чего кластеры образуют макрофазу (Dumetz et.al., 2008 )), то можно оценивать число связанных с белком ионов.

Можно проверить адекватность уравнения (20) доступным экспериментальным данным для лизоцима. Чтобы установить соответствие безразмерного параметра 1/n и молярной концентрации соли NaCl (m3), которая обычно используется для высаливания и кристаллизации лизоцима, необходимо решить трансцендентное уравнение:

2ln(m3n/) - (23)

На рис.6 сопоставлены теоретически рассчитанные значения logS - 2ln(m2*) и экспериментальные значения logS при разных значениях рН (заряда белка z) и концентрациях NaCl. Растворимость лизоцима в работе (Retailleau et.al., 1997) определялась путем установления равновесия с кристаллом. Обычно с лизоцимом связано не менее 4-5 ионов Cl- и с ростом концентрации соли их адсорбция может возрастать. Из рис.6 видно, что тенденции в поведении теоретических и экспериментальных зависимостей качественно совпадают, но отличаются на величину ln(m2*)2, которая характеризует концентрацию белка в кластере. Расчетная концентрация оказывается несколько выше (около 700 мг/мл), чем реально наблюдаемая в кластере белка (около 500 мг/мл), получаемого в результате высаливания (Dumetz et.al., 2008 ).

На рис.6 также приведены данные по «растворимости» при концентрациях соли от 1 М NaCl и выше, полученные методом высаливания (Кривая 7). Концентрация белка, при которой в растворе появляется мутность, обусловленная возникновением кластеров, оказывается больше, чем в условиях равновесия (скачок на зависимостях в области 1М NaCl). Чтобы получить «скачок» на теоретических зависимостях, следует предположить, что часть ионов Cl- десорбируется при образовании кластеров.

Реальные значения можно получить из данных по изменению концентрации белка в кластерах или в геле лизоцима в зависимости от концентрации NaCl (Dumetz et.al., 2008 ). В этом случае расчет по прямому уравнению (18) показывает, что при 1 М NaCl с белком связано 4,5 иона Cl-, при 2 М NaCl - 6,5 иона Cl- и при 3 М NaCl - 6,9 иона Cl-, что согласуется с (Retailleau et.al., 1997). Таким образом можно определить число адсорбированных ионов электролита. При этом видна тенденция к насыщению в связывании анионов с ростом концентрации соли.

Температура является важнейшим фактором в механизме ФП и критической точки (КТ) можно достичь изменением температуры. Это предполагает существование взаимосвязи между температурой и критическим составом Х = (m2/m3)кт,. Параметр ? связан с температурой через константы d и Q уравнения Дебая-Хюккеля, где Q ~ С/(T)3/2. Здесь ? -диэлектрическая проницаемость, C - константа. Соотношение между Х = (m2/m3)кр и температурой можно получить, используя уравнение (13) и (14):


Подобные документы

  • Структура биологических мембран и строение их основы - билипидного слоя. Молекулярная масса мембранных белков, их различие по прочности связывания с мембраной. Динамические свойства биологических мембран и значение организации для биологических систем.

    реферат [19,1 K], добавлен 20.12.2009

  • Физические, биологические и химические свойства белков. Синтез и анализ белков. Определение первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белков. Денатурация, выделение и очистка белков. Использование белков в промышленности и медицине.

    реферат [296,5 K], добавлен 10.06.2015

  • Белки (протеины) – высоко молекулярные, азотосодержащие природные органические вещества, молекулы которых построены из аминокислот. Строение белков. Классификация белков. Физико-химические свойства белков. Биологические функции белков. Фермент.

    реферат [4,0 M], добавлен 15.05.2007

  • Аминокислотный состав белков в организмах, роль генетического кода. Комбинации из 20 стандартных аминокислот. Выделение белков в отдельный класс биологических молекул. Гидрофильные и гидрофобные белки. Принцип построения белков, уровень их организации.

    творческая работа [765,3 K], добавлен 08.11.2009

  • Белки как класс биологических полимеров, присутствующих в каждом живом организме, оценка их роли и значения в процессе жизнедеятельности. Строение и основные элементы белков, их разновидности и функциональные особенности. Нарушение белкового обмена.

    презентация [980,5 K], добавлен 11.03.2013

  • Проблемы сборки мембранных белков, методы исследования и условия переноса белков через мембраны. Сигнальная и мембранная (триггерная) гипотеза встраивания белков в мембрану. Процесс сборки мультисубъединичных комплексов и обновление мембранных белков.

    курсовая работа [289,5 K], добавлен 13.04.2009

  • Понятие и структура белков, аминокислоты как их мономеры. Классификация и разновидности аминокислот, характер пептидной связи. Уровни организации белковой молекулы. Химические и физические свойства белков, методы их анализа и выполняемые функции.

    презентация [5,0 M], добавлен 14.04.2014

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.