Эффекты кластеризации глобулярных белков в растворах

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РОЖКОВ Сергей Павлович

ЭФФЕКТЫ КЛАСТЕРИЗАЦИИ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В

РАСТВОРАХ

Специальность 03.01.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург-2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН

Официальные оппоненты:

Засл. деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Воробьев Владимир Иосифович

доктор физико-математических наук, профессор Трусов Анатолий Анатольевич

доктор биологических наук, профессор Розенфельд Марк Александрович

Ведущая организация: Учреждение РАН Институт высокомолекулярных соединений РАН

Защита состоится «_21_»_октября 2010 года в_16_ часов на заседании Совета Д.212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд.90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им.А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «______» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент Курилова Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Взаимодействие молекул биополимеров с водой, ионами солей и между собой непосредственным образом связано с проблемой растворяющей способности воды и эволюции биологических растворов (Хочачка и Сомеро, 1988). Взаимодействие белок- белок и белок- растворитель присутствует во всех аспектах метаболической регуляции и установления надмолекулярной организации, а также определяет механизм агрегации, кристаллизации, денатурации и коагуляции белков при их выделении и очистке. Поэтому изучение самих явлений и механизмов, лежащих в их основе, остается одной из самых актуальных проблем молекулярной биофизики.

Золь гель фазовые превращения, сопровождающие большинство биохимических реакций в цитоплазме, являются сложными и многоступенчатыми процессами, первые этапы которых можно обнаружить лишь с помощью прецизионных физических методов. Несомненно, что важную роль на этих этапах играют динамические, т.е. обратимые ассоциаты макромолекул (Измайлова, Ребиндер, 1974; Frieden and Nichol, 1981, Веденов, 1984). Динамическая ассоциация глобулярных белков обеспечивает переходный уровень к надмолекулярной организации раствора макромолекул, осуществляя возможность более тонкой и сложной регуляции биохимических процессов, чем та, которая происходит при участии только растворенных молекул. Посредством взаимодействия белок- белок и белок- растворитель решается проблема мгновенной, на уровне микроокружения макромолекул, регуляции осмотического гомеостаза (Наточин и др., 1991). Патогенез ряда заболеваний связан с нарушением кооперативных взаимодействий между молекулами белков, их неконтролируемой ассоциацией и агрегацией и обусловлен потерей устойчивости состояния (гомеостаза) под действием внешних факторов (Хорст, 1982). В рамках современных представлений гомеостаз и стресс (который предшествует патологии) на разных уровнях структурной организации биосистем предлагается рассматривать как два устойчивых состояния (или фазы), переход между которыми (фазовый переход) сопровождается кооперативным изменением структурно-динамических и морфологических свойств биосистемы. На молекулярном уровне на это указывает существование неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем (НАСКС), определяющим звеном белковой теории которого в настоящее время есть основания считать реакции полимеризации глобулярного актина (Браун, Моженок, 1987). Список сокращений: НАСКС - неспецифический адаптационный синдром клеточных систем;

САЧ, САЧ-СМ - сывороточный альбумин человека и его спин-меченый аналог;

L-L, L-S -фазовые переходы (ФП) типа жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело.

ДЛФО - теория устойчивости коллоидов Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека;

ЭПР-электронный парамагнитный резонанс,

ВБМ - водно-белковая матрица, ПЭГ - полиэтиленгликоль; ФД - фазовая диаграмма;

НКТР, ВКТР - нижняя и верхняя критические температуры растворения;

С60FWS - водорастворимый фуллерен, ShC - шунгитовый углерод; ND- наноалмаз;

HbS, HbA, HbС - формы гемоглобина

В решении задач биотехнологии важную роль играют методы выделения и очистки белков, наиболее известными из которых являются «высаливание» и кристаллизация. Для оптимизации этих процессов требуется глубокие знания роли температуры, величины рН, концентрации и физико-химических свойств агентов, влияющих на растворимость биополимеров. Вместе с тем эти данные разрозненны и трудно достижимы, поскольку около 20 факторов приходится учитывать для получения кристаллов белков. Фазовые диаграммы, полезные в таких случаях, существуют лишь для десятка белков и то весьма ограниченные (Grouazel et.al., 2006). Более чем за полтора века практических достижений в кристаллизации белков не разработана общая теория этого процесса, поэтому до сих пор метод проб и ошибок является доминирующим. В настоящее время особый интерес к обратимым ассоциатам (кластерам) в растворах биополимеров возникает в связи с тем, что они предшествуют возникновению зародышей новой фазы и могут определять механизм кристаллизации или преципитации (высаливания) белка в насыщенных растворах, являясь зародышами «скрытой» фазы.

В качестве объекта экспериментального исследования взят сывороточный альбумин человека (САЧ) и лизоцим. Они являются одними из наиболее доступных и изученных белков и широко применяются в медицине, биотехнологии и в пищевой промышленности. СА один из первых белков, в растворах которого были идентифицированы белковые кластеры (Giordano et.al., 1991). Вместе с тем СА гетерогенный белок как по существованию множества изоформ, так и по загрузке лигандами, поэтому существуют значительные трудности в изучении и построении фазовых диаграмм этого белка современными методами малоуглового нейтронного и рентгеновского рассеяния (Zhang et.al., 2007). Это требует внедрения новых экспериментальных и теоретических подходов в исследовании его фазовых диаграмм.

Разрабатываемые в работе вопросы непосредственно связаны с проблемой существования даже в умеренно концентрированных растворах глобулярных белков концентрационной гетерогенности - белковых кластеров. Подобные явления предполагают наличие потенциала притяжения между одноименно заряженными частицами, что не вписывается в рамки традиционных теорий. Однако появившиеся в последнее время теоретические разработки допускают возникновение в некоторых условиях дальнодействующих сил притяжения в растворах одноименно заряженных частиц (Chu and Wasan, 1996). По своей природе это силы кулоновские и их происхождение связано с определенной периодичностью расположения заряженных частиц и противоионов.

Процессы формирования кластеров сопряжены с фазовыми переходами типа жидкость- жидкость (De Young et.al., 1993), результатом которых является образование субмикронных размеров обогащенных белком капель жидкости, метастабильных по отношению к кристаллической фазе. Их возникновение описывается на основе короткодействующего парного потенциала взаимодействия между макромолекулами, которые представляются в виде жестких сфер, и дальнего потенциала отталкивания. Такой потенциал средней силы может включать несколько видов энергии взаимодействия. Иногда его строят на основе элементов классической теории ДЛФО, с привлечением сил отталкивания за счет структурированных слоев растворителя (Brandon et.al., 2006). С использованием такого подхода, а также с учетом энтропийных эффектов исключенного объема и/или деплеций удается достаточно точно объяснить некоторые экспериментальные данные различных структурно-динамических методов в растворах глобулярных белков, построить их фазовые диаграммы (Tavares et.al., 2004; Bonnete et.al., 1999), оценить силу белок-белкового взаимодействия по величине и знаку второго вириального коэффициента осмотического давления (George and Wilson, 1994; Neal et.al., 1998; Bonette et.al., 1999). С другой стороны, этот коэффициент в большей степени характеризует взаимодействие белка с солью (Edsall et.al., 1950).

Однако силовой подход не способен объяснить эффекты лиотропных рядов электролита в механизме взаимодействия белков (Tardieu et.al., 1999) и существенно анизотропный характер белок-белкового взаимодействия (Lomakin et.al., 1999). Поэтому в последнее время энергичные попытки были предприняты в изучении специфических эффектов распределения ионов на границах фаз (Luo et.al., 2006), взаимодействия ионов электролита с белками с учетом поляризуемости анионов (Bostrom et.al., 2005), их гидратации (Collins, 2006) и влияния на структурированность воды (Grigsby et.al., 2002). Все же этих усилий пока явно недостаточно, чтобы понять возможную определяющую роль воды в формировании надмолекулярной организации растворов белков.

В выяснении механизма образования белковых кластеров существенный прогресс могла бы внести равновесная термодинамика, однако по ряду причин он мал (Haas and Drenth, 2000). Как известно, поверхностное натяжение вносит значительный вклад в работу образования критического зародыша новой фазы при нуклеации. Поскольку молекула белка имеет развитую поверхность с выраженной кривизной, одной из важнейших задач для понимания функциональной активности белка, в частности, стабилизации той или иной конформации белка, является изучение связи удельной поверхностной энергии водно- белковой матрицы с межмолекулярной энергией взаимодействия белок-белок, ответственной за образование белковых кластеров. На существование такой связи могут указывать явления капиллярных эффектов первого и второго рода (Щукин и др., 1982), обусловленные кривизной гидратируемой поверхности и расклинивающим давлением между взаимодействующими макромолекулами. Кроме того, индуцируемые в присутствии различных осмотически активных молекул (осмолитов) изменения конформационного равновесия белковых структур часто рассматриваются на основе энтропийных эффектов исключенного объема или деплеций, приводящих к изменению взаимодействия между молекулами белка (Saunders et.al., 2000). Это сопряжено с наличием потенциала отталкивания в таких системах между молекулами осмолитов и белков.

С другой стороны, (де)стабилизация структуры белка в присутствии осмолитов, влияющих на поверхностное натяжение растворителя, в биохимии интерпретируется в терминах равновесного связывания молекул осмолитов и растворителя, а также конкуренции между ними (Kita et.al., 1998) - то есть эффектами предпочтительной гидратации. К категории взаимодействия белок - растворитель относится также гидрофобное, изменяющееся пропорционально неполярной поверхности макромолекулы. «Гидрофобные силы» дают большой вклад в функциональную динамику белка, структурный фолдинг и в механизм агрегации.

Таким образом, взаимодействие белок- белок и белок- растворитель есть два подхода к одному явлению, связующим звеном между которыми могла бы стать концепция микроскопического поверхностного натяжения растворителя. К сожалению, имеющиеся теории поверхностного натяжения и способы его измерения пока весьма далеки от совершенства, так что их изучение также остается актуальной задачей.

Целью работы является исследование фундаментальной проблемы природы и механизмов дальних взаимодействий и поверхностных явлений, приводящих к возникновению надмолекулярной организации в многокомпонентных растворах глобулярных белков. При этом особое внимание уделяется теоретическому подходу к построению различного вида фазовых диаграмм и способов их взаимной трансформации. Теоретический анализ системы вода-белок-соль проводится на основе равновесной термодинамики с элементами теории устойчивости по отношению к процессам диффузии (Пригожин, Дефей, 1968), критических и закритических явлений (Базаров, 1983), термодинамики многокомпонентных систем (Edsall et.al., 1950).

Непосредственная задача исследования - изучение закономерностей кластеризации белков при их взаимодействии с водой, осмолитами и между собой в связи с проблемой растворяющей способности воды и регуляции физико-химического состояния биологических растворов. Анализируются возможности управления структурными свойствами и динамическим поведением подобных систем, а также выясняется роль этих явлений в функционировании биосистем (осморегуляция, механизмы срочных реакций белковых систем на изменения температуры и солености) и в технологических процессах (стабилизация структуры белка осмолитами, «высаливание», нуклеация). Экспериментально проблема решается на базе метода ЭПР спиновых меток и зондов.

Для достижения цели решаются следующие задачи:

1. Разрабатывается комплекс методических приемов на базе метода ЭПР спиновой метки для анализа изменений динамических и термодинамических свойств водно-белковой матрицы макромолекул, в том числе расклинивающего давления и удельной поверхностной энергии, в процессе соль-индуцируемых структурных фазовых переходов. Для проверки работоспособности метода полученные результаты по эффективности различных осмолитов в стабилизации структурной динамики молекул белка сопоставляются с данными независимых методов.

2. Исследуются процессы формирования кластерной организации водно- солевых растворов молекул САЧ в условиях изменения концентрации компонентов и температуры.

3. Строятся теоретические фазовые диаграммы модельной системы вода-белок-соль и определяются условия возможных фазовых переходов ней в зависимости от концентрации компонентов, температуры, заряда белка, связывания с ионами электролита и активности электролита.

4. Проводится анализ существующих литературных данных по кластерной природе растворов лизоцима как наиболее изученного модельного белка для верификации разработанной модели и установленных на основе модели закономерностей.

5. Исследуется влияние на водно - белковые системы нового типа осмолитов - гидратированных наночастиц и нанокластеров углерода, представленных фуллеренами, фуллереноподобными структурами шунгитового углерода и наноалмазами.

Научная новизна результатов.

1. Предложена модель возникновения кластеров в растворах глобулярных белков, в основу которой положена определяющая роль компенсации удельной поверхностной энергии воды в результате анизотропного взаимодействия между молекулами белков в кластере. При этом теория допускает существование кластеров двух типов, различающихся размерами, один из которых может быть охарактеризован как «фаза».

2. Предложен способ анализа детерминанта устойчивости модельной системы вода-белок-соль, построена фазовая диаграмма состояния раствора и показана возможность ее представления в разных системах координат. Установлено, что положение фазового перехода и критической точки на фазовой диаграмме определяется отношением молярных концентраций белка и соли. Величина этого отношения зависит от индивидуальных характеристик белка (заряд, число адсорбируемых ионов) и активности электролита.

3. Впервые в аналитическом виде получены коэффициенты, характеризующие уравнение «высаливания» белка электролитом и показывающие роль адсорбированных ионов в этом процессе.

4. Фазовый переход типа жидкость-жидкость рассматривается как фазовый переход воды, участвующей в гидратации мономеров и кластеров белка. Это позволяет именно к воде применить основные термодинамические следствия существования критических фазовых переходов. При этом представления об универсальной растворимости всех компонент раствора в критической точке, неравномерное и селективное перераспределение компонент системы по пути к критической точке по разным типам гидратных оболочек позволяют предположить существование механизма регуляции активности белка с участием ненативных форм белковых глобул.

5. Зарегистрированы эффекты неспецифического влияния гидратированных наночастиц углерода на стабилизацию САЧ и мембранных белков, в основе которого может лежать способность наночастиц регулировать фазовое состояние водно-солевого раствора белка и адсорбировать компоненты раствора.

6. Предлагается механизм срочной регуляции осмотического равновесия и неспецифических физико-химических регуляторных реакций на уровне микроокружения макромолекул в ответ на изменение состава или температуры, основанный на существовании кластерной организации белка.

7. Апробированы новые экспериментальные подходы на базе метода ЭПР спиновой метки, позволяющие с использованием изотерм изменения вязкости раствора сахарозой регистрировать изменения удельной поверхностной энергии белка, а также эффективных термодинамических функций состояния водно- белковой матрицы как результата изменения взаимодействия между компонентами раствора в процессе фазовых переходов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Разработка комплекса методических приемов на базе метода ЭПР спиновой метки для анализа свойств водно-белковой матрицы молекул белка, их изменений под действием осмолитов и в процессе соль-индуцируемых структурных фазовых переходов.

2. Теоретический подход к построению фазовых диаграмм модельной системы вода-белок соль, поиск условий и механизмов образования кластеров белка и сопряженных с ними фазовых переходов в зависимости от концентрации компонентов, температуры, заряда белка, связывания с ионами электролита и активности электролита.

3. Экспериментальное обнаружение фазовых переходов и кластерной организации водно- солевых растворов молекул САЧ и лизоцима в условиях изменения концентрации компонентов и температуры.

4. Эффекты влияния на водно - белковые системы и их кластерную организацию нового типа осмолитов - гидратированных наночастиц и нанокластеров углерода, представленных фуллеренами, фуллереноподобными структурами шунгитового углерода и наноалмазами.

5.Оценка перспектив использования результатов исследования в решении ряда биомедицинских и технологических задач (осморегуляция, стабилизация белка осмолитами, регуляция активности белка, поиск оптимальных условий кристаллизации, механизмы стресс-индуцированных денатурационных изменений белков).

Практическая значимость работы заключается в разработанной методологии изучения явления кластеризации глобулярных белков, объединяющей экспериментальное наблюдение эффектов взаимодействия белков в разных областях фазовой диаграммы и ее теоретический анализ на основе взаимодействия белок-растворитель.

Установленные закономерности возникновения белковых кластеров двух типов в системе вода-белок-соль и фазовых переходов позволяют получить научно-методический подход к выбору условий, наиболее оптимальных для целей кристаллизации, очистки и стабилизации структуры белка.

Предлагаемая концепция связи межмолекулярного расклинивающего давления и давления в водно-белковой матрице дает возможность теоретически и экспериментально связать изменения межмолекулярного взаимодействия с изменениями конформационной динамики молекул и стабилизации структуры белка. Показано, что метод ЭПР спиновых меток и зондов при условии адекватной интерпретации формы спектра можно использовать для построения фазовых диаграмм растворов глобулярных белков, при этом становится доступной информация как о взаимодействии белок-белок, так и об изменении внутримолекулярной динамики, которая сопряжена с межмолекулярным взаимодействием.

Предложен способ измерения удельной поверхностной энергии в области локализации спиновой метки и ее изменений в присутствии различных осмолитов, позволяющий оценивать эффективность осмолитов в стабилизации структуры белка.

На молекулярном уровне образованием кластеров обоснован механизм срочной регуляции ионно-осмотического равновесия и рассмотрен кооперативный фазовый переход системы под действием неспецифических факторов (изменении температуры, концентрации соли) из состояния осмотического гомеостаза к состоянию стресса и патоологии. Найдены возможности управления этим процессом на уровне микроокружения макромолекул. Обнаруженные закономерности дают основание для построения физико-химической модели, которая позволила бы понять эволюционные механизмы возникновения конформационных белковых патологий и неспецифического адаптационного синдрома клеточных систем.

Апробация работы Основные результаты исследований были представлены на международных и отечественных съездах, конференциях, семинарах:

2^nd International Symposium “Molecular order and mobility in polymer systems”, (Saint Petersburg, 1996); и XIII международного совещания по эволюционной физиологии, Санкт-Петербург, 1996; 2006); Юбилейная научная Конференция «50 лет Карельскому Научному Центру РАН (Петрозаводск, 1996); International Symposium “Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical Aspects”, (Moscow, 1998); 2 и 3 съезда биофизиков России (Москва, 1999, Воронеж, 2004); V - X Всероссийских конференциях «Структура и динамика молекулярных систем (Яльчик, 1997-2003); 4, 5, 6, 7 Biennal International Workshop “Fullerenes and atomic clusters” (St. Petersburg, 1999; 2001; 2003; 2005); 3 Международного Семинара «Минералогия и жизнь: биоминеральные гомологии» (Сыктывкар, 2000); Международного Минералогического Семинара (Сыктывкар, 2001); III Съезда Биохимического Общества (С-Петербург, 2002); Международной Конференции “Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем” (Минск, 2004); IX International Conference “Hydrogen material science and chemistry of carbon nanomaterials” (ICHMS`2005) (Sevastopol, 2005); Российской Конференции “Современные проблемы молекулярной биофизики” (СпбГУ , 2006); XVI International Conference “Chemical Thermodynamic in Russia” ( Suzdal, 2007).

Публикации Всего по материалам диссертации опубликовано 34 работы (без учета тезисов докладов).

Личный вклад автора Автором осуществлен выбор направления исследований и постановка задач. Эксперименты, анализ и интерпретация данных проведены лично автором. Им же предложен аналитический подход для построения фазовых диаграмм и проведен их теоретический анализ. Часть исследований, результаты которых представлены в диссертации, были поддержаны грантами РФФИ, № 99-03-32388 и № 03-03-32347, при этом автор являлся руководителем проектов.

Структура работы Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка литературы, содержащего 402 источника. Работа изложена на 270 страницах , содержит 11 таблиц и иллюстрирована 69 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении изложены проблемы, связанные с обнаружением в растворах глобулярных белков концентрационной неоднородности - кластеров, обосновывается актуальность их изучения, формулируются цели и задачи исследования, приводится общая характеристика работы.

Первая глава носит обзорный характер. Первая треть главы 1 посвящена вопросам изучения взаимодействия белок-белок и физической природы сил взаимодействия, начиная от диполь-дипольных, затем коллоидных, включающих молекулярные, ион-электростатические и гидратационные и заканчивая энтропийными эффектами исключенного объема и деплеций. Кратко представлены силы, обуславливающие возникновение потенциала взаимодействия одинаково заряженных частиц и учитывающие конечный радиус ионов и неравномерность их распределения в растворах коллоидных частиц. Как экспериментальная характеристика сил взаимодействия более подробно рассмотрено осмотическое давление и его вириальные коэффициенты. Приведены примеры экспериментального обнаружения кластеров в растворах различными физическими методами, в основном в связи с их предполагаемой ролью в процессах кристаллизации белков. Анализируются существующие гипотезы о механизмах фазовых переходов в растворах биополимеров, сопряженных с возникновением кластеров и возможные способы представления фазовых диаграмм растворов белков.

Во второй трети главы 1 обсуждаются некоторые аспекты взаимодействия молекул с растворителем, основанные на структурных особенностях воды и ее способности располагать в своей структуре различные по строению молекулы. Затем вопросы структурирования воды рассмотрены применительно к проблеме гидратации биомакромолекул и роли когезионной прочности воды в механизме взаимодействия белок-растворитель. Эта концепция позволяет использовать модель предпочтительной гидратации в изучении стабилизации структуры белка в растворе. Далее приводится взгляд на состояние воды с позиции макроскопических представлений, где активность воды и осмотическое давление являются интегральными термодинамическими характеристиками раствора. Исходя из этих представлений, рассмотрена концепция осмотических сил и расклинивающего давления как сил, ответственных за опосредованное растворителем взаимодействие белок-белок. Здесь же расклинивающее давление сопоставляется с капиллярными эффектами, обусловленными кривизной поверхности и зависимостью удельной поверхностной энергии от кривизны.

Заключительная часть главы 1 посвящена вопросам взаимодействия ионов электролита с белковой глобулой и анализу существующих механизмов взаимодействия. Заканчивается глава обсуждением структурных и физико-химических особенностей молекул сывороточного альбумина и их растворов как основного объекта исследования.

Во второй главе описаны возможности применения метода ЭПР спиновых меток для изучения структурной динамики белков, обусловленной эффектами взаимодействия белок-растворитель. Сначала рассмотрены некоторые задачи, решаемые методом спиновых меток, обсуждаются его достоинства и недостатки применительно к поставленной проблеме. В качестве достоинств отмечается широкий выбор возможностей изучения структурной динамики белка в зависимости от легко варьируемых внешних условий и чувствительность к дальним, опосредованным растворителем, взаимодействиям спиновых меток на основе дипольного механизма, проявляющегося в уширении спектров ЭПР. Это позволяет при температурах жидкого азота регистрировать изменения локальной концентрации спин-меченых биополимеров в растворе как результата их взаимодействия.

К недостатку метода относится необходимость выбора соответствующей модели движения нитроксильного радикала и многократная вырожденность спектров ЭПР, зачастую не позволяющая точно оценить характер движения метки, дать спектрам однозначную интерпретацию и получать абсолютные значения динамических характеристик. Это вынуждает искать обходные пути извлечения нужной информации и данных об относительном изменении параметров спектра, что усложняет проведение эксперимента.

В этой главе проведен анализ экспериментальных результатов, полученных в рамках существующих модельных подходов, для интерпретации спектров ЭПР молекул САЧ и расчета эффективных значений времен корреляции _c вращательной диффузии спиновых меток в водно-белковой матрице. На рис.1 представлены экспериментальные данные по изменению частоты вращения 1/_c спиновой метки, модифицирующей молекулы САЧ, от температуры и концентрации NaCl. Существенно нелинейный характер зависимости частоты вращения от варьируемых параметров (аналогия с расслаивающимися полимерными системами (Вассерман, Коварский, 1986)), свидетельствует в пользу гипотезы о фазовом переходе в водно-белковой системе, хотя и не раскрывает его природу.

Третья глава посвящена разработке новых экспериментальных подходов для изучения взаимодействия белок-растворитель методом спиновой метки. На рис.2. представлены спектры ЭПР сывороточного альбумина человека (САЧ), модифицированного спиновой меткой на основе малеимида (САЧ-СМ) по SH -группе Цис-34 (Hull et.al.1975). Показано, что В- компонента спектра не обусловлена посадкой метки на других центрах, например, аминогруппах (Benga, Strach, 1975). Совокупность экспериментальных наблюдений позволяет предложить модель (Wetzel et.al., 1980), согласно которой полость в структуре белка, где локализована метка, находится в двух конформациях, с большей (А) и меньшей (В) микровязкостью. В (А)- состоянии метка находится в «закрытой» полости белка и характеризует глубинные слои водно- белковой матрицы (ВБМ), а в (В)- состоянии - поверхностные.

Благодаря хорошему разрешению А и В компонент спектра ЭПР молекул САЧ-СМ можно измерять эффективные значения коэффициента распределения радикалов К_р^эф, не применяя процедур разделения и интегрирования спектров:

K_р^эф I₀^A(H₀)²_A / I₀^B(H₀)²_{B .} (1)

Амплитуда и эффективная ширина линии I₀ и H₀ показаны на рис.2. Использование K_р^эф позволяет регистрировать термодинамические отличия А и В состояний ВБМ и их изменения, индуцируемые присутствием гостевых молекул в растворе.

-lnK_р^эф=(G_A - G_B)^эф = (H_A - H_B)^эф -Т(S_A - S_B)^эф (2)

где G^эф = (G_A - G_B)^эф - разность эффективных значений свободной энергии Гиббса; H^эф = (H_A - H_B)^эф - энтальпии и S^эф = (S_A - S_B)^эф - энтропии А и В состояний ВБМ. С помощью уравнения Вант-Гоффа рассчитывали H = -RdlnK/d(T^-1) и S = -(G/T)_P = R(TdlnK/dT + lnK).

В работе предлагается новый высокочувствительный способ регистрации величины, пропорциональной изменению G^эф, с использованием сахарозных зависимостей. В координатах ln[A]/[B] = f{ln(T/)} строятся линейные изотермы изменения вязкости и определяется угол их наклона . Так как T/ ~ (₀)^-1exp(-W/RT), где W - энергия активации вязкого течения, а - вязкость раствора, то:

tg ~ RTln([A]/[B])/W = -G^AB/W, (3)

где -G^AB характеризует разность свободных энергий Гиббса А и В состояний водно- белковой матрицы, куда экспонирована спиновая метка. Таким образом, -G^AB/W является безразмерным параметром, позволяющим регистрировать изменения свободной энергии состояния ВБМ (см.рис.12), вносимые возмущениями различной природы.

Знание функции изменения свободной энергии ВБМ в присутствии осмолитов (сахароза, глицерин, мочевина, полиэтиленгликоли (ПЭГ), электролиты) позволяет представлять результаты действия осмолитов на ВБМ в терминах изменения силового параметра П - поверхностного расклинивающего давления (Рожков, 1991; 1992), либо химического потенциала белка ₂^Tr (энергетический параметр):

₂^Tr ~(G_A-G_B)^эф_{осмолит}-( G_А-G_В)^эф_вода. = G_S - G_W , (4)

Изменение ₂^Tr ~ G_S - G_W характеризует удельную свободную энергию переноса спин-метки из А в В состояние полости белка, когда белок переходит из водного (w) в водно-солевое (s) окружение. Здесь ₂^Tr определяет растворимость белка S_2(m3) в солевом растворе (Arakawa et.al., 1991): ₂^Tr = (₂/m₃)dm₃ = - RTln(S_2(m3)/S_2(W)), где m₂ и m₃ - молярные концентрации белка и соли.

На рис. 3 показано, что ₂^Tr принимает отрицательные значения при умеренных концентрациях NaCl и положительные - при больших концентрациях. Это можно интерпретировать так, что в первом случае взаимодействие белок-соль термодинамически более выгодное (доступное состояние полости белка, где локализована метка, для воды, растворимость выше), а во втором случае наблюдается стабилизация закрытой полости белка, сопряженная с уменьшением растворимости.

Приводимые в этой главе данные метода ЭПР спин-метки о действии осмолитов на состояние водно-белковой матрицы находятся в полном соответствии с имеющимися в литературе данными других методов о (де)стабилизирующем влиянии того или иного осмолита на структуру белка (Arakawa et.al., 1991).

Далее в главе 3 предлагается способ определения удельной поверхностной энергии водно-белковой матрицы методом изотерм вязкости (Рожков, Горюнов 2006). Он основан на данных метода ЭПР спин- метки, которые использовались для построения изотерм зависимости частоты вращения метки 1/_с от Т/, где - вязкость раствора, изменяемая сахарозой. Это позволяет в пределе линейной экстраполяции изотерм к бесконечной вязкости (Т/) 0 получить предельные значения частоты вращения 1/*:

1/_с = к (Т/)/v + 1/* , (5)

где к - постоянная Больцмана, v - эффективный объем метки и белка. Здесь 1/_с учитывает как диффузию метки в ВБМ с эффективной вязкостью *, так и диффузию белка в среде с вязкостью , изменяемую сахарозой. Граничное значение частоты диффузии метки 1/* соответствует такому движению, когда вязкость среды как таковая в спектрах ЭПР уже не проявляется, а дальнейшее уменьшение подвижности метки определяется ростом удельной поверхностной энергии в ВБМ из-за эффектов предпочтительной гидратации.

В соответствии с существующими моделями (Вассерман, Коварский, 1986), элементарный акт переориентации метки требует флуктуации свободного объема - объема активации v*. Средний квадрат радиуса такой флуктуации <r>² (kT)/, где - поверхностное натяжение растворителя. Частота флуктуаций метки 1/*, связанная с v*, определяется работой против поверхностных сил, стремящихся ее уничтожить:

1/* = А*ехр(-P v* /RТ) А*ехр(-2 v* /rRТ) (6)

где P - внутреннее давление, r - эффективный радиус , А* - константа, определяемая из температурной зависимости 1/*.

Тогда в пределе (Т/) 0 подвижность метки 1/* определяется лишь флуктуациями объема активации, зависящими от . Поэтому условие (Т/) 0 позволяет приводить давление к стандартному состоянию P v* = const. в уравнении (6). Присутствие в растворе белка других молекул (помимо сахарозы), влияющих на , будет приводить к изменению P. Тем самым создается возможность сравнения эффекта разных осмотически активных веществ на в стандартных условиях. Из уравнения (6) следует:

rRT(lnА*- ln(1/*))/2 v* ,(7)

где r 5 10^-10 м, v* 125 см³ (половина молярного объема метки).Значения _с вычисляли по формуле Фрида: _с = 2,55 10¹⁰(1 - А_zz/ А⁰_zz )^-0,615 , где А_zz и А⁰_zz - расстояния между крайними линиями спектра ЭПР исследуемого образца и образца при 77К.

На примере спин-меченых молекул САЧ, гемоглобина, антител проведена экспериментальная проверка методического подхода и исследован характер изменения поверхностного натяжения в зависимости от концентрации белка, строения спиновой метки, лигандного состояния белка, а также в присутствии разных концентраций солей (см.рис.13), декстранов и полиэтиленгликолей, Д₂О.

В теоретической части работы, которая представлена в Главе 4, обсуждается механизм образования белковых кластеров и анализируются условия их наиболее вероятного возникновения с использованием фазовых диаграмм. Это дает возможность целенаправленно регулировать фазовое состояние такой системы и предсказывать структурно-динамическое поведение ее компонент в заданных точках фазовой диаграммы.

Исходя из представлений (Фролов, 1987) о важной роли в агрегативной устойчивости дисперсных систем способности к компенсации поверхностной энергии частиц энтропийной составляющей свободной энергии Гиббса смешения, предложен возможный компенсационный механизм возникновения белковых кластеров. В кластере экранировка неполярной поверхности белка от взаимодействия с объемной водой раствора осуществляется заряженными и полярными группами соседних молекул белка и тем самым компенсируется избыточная поверхностная энергия. Это предполагает существенно анизотропный характер взаимодействия из-за мозаичного расположения полярных и неполярных групп на поверхности белка. В этом случае удельная поверхностная энергия молекулы белка в кластере уменьшается и ее среднее значение будет равно:

_с = ₀ (1 - r_кр S_э N_A/3V_м), (8)

где ₀ - поверхностное натяжение на границе неполярной поверхности белка с водой, S_э - экранируемая полярными группами площадь неполярной поверхности молекулы, N_А - число Авогадро, V_м - молярный объем белка, r_кр - радиус кластера.

Используя уравнение Гиббса-Томсона для критического зародыша RTln(m₂/m₂*)= 2V/r_кр, условие (8) и зависимость удельной поверхностной энергии от радиуса частиц, известную как уравнение Толмена, _{0 п} (1- 2l/r_кр ), где _п -поверхностное натяжение плоской поверхности, 2l - толщина поверхностного слоя, получаем, что в растворе, близком к насыщению, могут существовать критические квазичастицы размеров R₁ и R₂:

R_1,2 =(6V/S_э N_A){(1(-Y)^1/2)/(Y + 1)}, где Y= 3(RTlnm₂/m₂* )/(2_п S_э N_A). (9)

Из этого уравнения следует, что при концентрации белка m₂ m₂*ехр(-2_пS_эN_A/3RТ) в растворе создаются условия для формирования кластеров с размерами R₂ = 3V/S_эN_A. Также теоретически возможным оказывается существование в этих условиях квазичастиц с еще большим радиусом - R₁, однако активационный барьер их формирования может быть достаточно велик, чтобы они возникали спонтанно, и лишь в условиях насыщения, которое можно уменьшать добавлением соли, вероятность возникновения квазичастиц радиуса R₁ возрастает. Зависимость радиусов этих квазичастиц от концентрации биополимера m₂ показана на рис.4.

Таким образом, согласно рис.4, еще до достижения условия насыщения образуются кластеры первого типа с радиусом R₂, которые по мере приближения к насыщению могут трансформироваться в кластеры второго типа с радиусом R₁. Однако концентрацию белка, необходимую для насыщения раствора, можно уменьшать добавлением «осадителя», например, электролита. При этом кластеры с радиусом R₁ могут расти за счет уменьшения кластеров первого типа. В литературе есть сведения о существовании в растворах лизоцима субмикронного размера фрактальных кластеров и компактных кластеров-олигомеров с меньшими размерами (Muschol, Rozenberger, 1997).

Экспериментальные данные, подтверждающие гипотезу о компенсационном механизме, представлены на рис.13, где показано, что по мере роста концентрации белка поверхностное натяжение сначала растет, а затем резко падает, что совпадает с моментом образования белковых кластеров.

Далее стояла задача отнесения кластеров к определенному фазовому состоянию раствора. Для получения уравнений, характеризующих фазовые границы в растворе белка, проводится анализ термодинамической устойчивости модельной системы вода (1)- белок (2)- электролит (3) по отношению к росту флуктуаций, с которых начинается фазовое разделение, от концентрации компонент системы. Исходя из представлений равновесной термодинамики и основных неравенств, характеризующих устойчивость систем:

> 0, (10)

исследован детерминант устойчивости 0 ²G/m_im_j < в области его минимального (нулевого) значения. Здесь G/m_i=_i - химический потенциал компонентов раствора. При условии равенства нулю детерминанта и его главных миноров, а также с использованием элементов термодинамической теории многокомпонентных систем Скэтчарда (Edsall et.al. 1950), получено аналитическое выражение для коэффициента устойчивости системы (₁/m₂)_m3, где ₁ - химический потенциал воды, m₂ и m₃ - молярные концентрации биополимера и электролита:

. (11)

Здесь - число ионов электролита, адсорбированных белком, z - его заряд, - функция изменения коэффициента активности электролита от концентрации в приближении Дебая-Хюккеля, расширенного на большие концентрации соли введением экспериментальных поправок:

= .(12)

Здесь - ионная сила, r- Дебаевский радиус иона, d и Q - параметры, зависящие от температуры и диэлектрической проницаемости, _i - экспериментальные константы. Интегрирование выражения (11) позволяет получить уравнение линий, ограничивающих устойчивую (выше линии) и неустойчивую (ниже линии) по отношению к росту флуктуаций концентрации белка область фазовой диаграммы в координатах [₁ m₂]. Эти линии схематически изображены на рис.5. Их подробный анализ легко провести вследствие существования характеристических точек: экстремума и наибольшей крутизны, выражения для которых можно получить в аналитическом виде.

Если параметр < 0 (низкие и умеренные концентрации соли), то линия устойчивости имеет максимум, соответствующий критической точке С, а также одну точку максимальной крутизны В. При > 0 существует две точки максимальной крутизны, В и D. Совокупность точек С при различных значениях вариабельных параметров (температуры, концентрации соли и т.д.) образует линию спинодали на фазовой диаграмме, (т.е. линию, ограничивающую устойчивые и метастабильные состояния, от неустойчивых) а совокупность точек В и D соответствуют нодам бинодали и характеризуют метастабильное фазовое равновесие.

Химический потенциал воды ₁ с ростом m₂ изменяется вдоль изотермы (пунктир на рис.5), достигает границы устойчивости и образует петлю Ван-дер-Ваальса. При этом в точке (А) (на бинодали как на линии метастабильного равновесия фаз) начинают возникать метастабильные белковые кластеры концентрированной фазы с концентрацией белка D, а ₁ во всем диапазоне концентраций белка остается неизменным. Это фазовый переход типа жидкость-жидкость (L-L), близкий к ФП 1 рода. Важное условие метастабильности и существования квазиравновесных кластеров - равенство заштрихованных площадей на рис.5 (правило Максвелла).

Справа от линии устойчивости на рис.5 пунктиром показан рост изотермы в область больших концентраций белка, свидетельствующий о существовании энергетического барьера для кристаллизации F. Однако этот участок изотермы можно рассматривать как уменьшение ₁ в процессе разбавления водой набухшей твердой фазы. В этом случае изотерма также пересекается с линией устойчивости, но уже для набухшей твердой фазы. В этом случае правило Максвелла не выполняется (нет точки максимальной крутизны) и метастабильного состояния - кластера разбавленной «фазы» не образуется. Поэтому растворение не может происходить по механизму образования метастабильного кластера разбавленной фазы в набухшей твердой фазе.

С дальнейшим ростом m₃ ( > 0) форма линии устойчивости изменяется (рис.5, кривая 2). Появляется вторая точка перегиба (D) и вторая нода бинодали. При этом возможны два метастабильных состояния: (AD) и (EB). Это означает, что появляющиеся в этих условиях кластеры белка метастабильны как по отношению к кристаллической фазе, так и по отношению к раствору и время жизни таких динамических кластеров должно быть ограничено. В такой ситуации критический раствор в некотором диапазоне изменения состава представляет собой смесь флуктуационных кластеров от обеих граничных фаз и может при этом выглядеть макроскопически прозрачным. Такое состояние раствора наблюдалось нами в присутствии CaCl₂ и MgCl_2.

При еще большей концентрации электролита (кривая 3) раствор полностью теряет устойчивость и выделяется твердая фаза.

Согласно критерию Пригожина, из условия (₁/m₂) = 0 уравнения (11) можно получить уравнение спинодали фазовой диаграммы, которое связывает критический состав, при котором достигается критическая точка С, с характеристиками белка и соли:

.(13)

Выражение для состава, при котором достигаются точки максимальной крутизны линии устойчивости (ноды бинодали B и D на рис.5), получается из условия (₁²/m₂²) = 0:

.(14)

Из условия (₁/m₂) = получаем уравнение линии, ограничивающей максимально стабильную твердую фазу F от других состояний раствора:

.(15)

Уравнения (13)-(15) связывают критический состав системы (m₂/m₃)_кр со специфическими характеристиками биополимера: (m₂/m₃)_кр = f(, z, ). Все три линии сходятся в одной сверхкритической (тройной) точке с координатами (m₂/m₃) = 2/ при = 2²/(z²-²). В этой точке все фазы находятся в термодинамическом равновесии.

Экспериментальные фазовые диаграммы часто представляются в координатах изменения растворимости белка logS от концентрации соли (или ионной силы). Если logS представить в форме уравнения Дебая-Хюккеля, эквивалентному выражению в скобках в уравнении (12) (Бланделл, Джонсон 1979), тогда из уравнения (12) следует, что:

logS . (16)

Уравнения (13) - (15), после их преобразования относительно параметра , с помощью уравнения (16) приводятся к виду, соответственно:

logS ~ + const (17)

logS ~ + const; (18)

logS ~ + const (19)

где уравнение (17) есть спинодаль, (18) - ноды бинодали, (19) - линия границы твердой фазы в координатах растворимости белка от концентрации соли.

Здесь наибольший интерес представляет уравнение (18), поскольку по смыслу рис.5 оно должно отражать существование двух фаз раствора с разными концентрациями белка, соответствующими длине ноды. Рассмотрим уравнение (18) вблизи критической точки. Так как m₃ = m₂/n (уравнение 13), где n > 2 - положительные рациональные числа и 2² <z², то уравнение (18), в пренебрежении малыми членами О(1/n²), будет иметь вид:

logS - ln(m₂²) - K_s() + b, (20)

Здесь уравнение (18) трансформируется в уравнение Сеченова и характеризует линию “высаливания”, где 1/n играет роль безразмерной концентрации соли, а

b (21)

- отрезок на оси ординат, полученный экстраполяцией прямолинейного участка на m₃ = 0, или гипотетическая растворимость в отсутствии электролита. K_s определяет угол наклона экстраполяционной прямой в области “высаливания”:

K_s - (22)

Этот коэффициент “высаливания” характеризует эффективность соли. Из уравнения (21) следует, что гипотетическая растворимость растет с ростом заряда белка и с числом адсорбированных ионов соли. Однако в области больших концентраций соли главным становится коэффициент высаливания и растворимость резко уменьшается с ростом . Механизм этого явления раскрывается в теории предпочтительной гидратации белков в присутствии солей (Arakawa, Timasheff 1984).

В таком представлении в уравнении (20) величина S является концентрацией белка в разбавленной фазе, а m₂ m₂^* - концентрацией белка в «фазе» кластера. Поэтому уравнение высаливания белка электролитом характеризует взаимосвязь между концентрациями белка в двух «фазах». Таким образом, зная заряд белка, число связанных анионов соли и ее концентрацию, а также концентрацию белка, при которой наступает высаливание, можно оценивать концентрацию белка в кластере. С другой стороны, если известна концентрация белка в разбавленной фазе и в кластере (иногда ее удается определить после центрифугирования раствора, в результате чего кластеры образуют макрофазу (Dumetz et.al., 2008 )), то можно оценивать число связанных с белком ионов.

Можно проверить адекватность уравнения (20) доступным экспериментальным данным для лизоцима. Чтобы установить соответствие безразмерного параметра 1/n и молярной концентрации соли NaCl (m₃), которая обычно используется для высаливания и кристаллизации лизоцима, необходимо решить трансцендентное уравнение:

2ln(m₃n/) - (23)

На рис.6 сопоставлены теоретически рассчитанные значения logS - 2ln(m₂^*) и экспериментальные значения logS при разных значениях рН (заряда белка z) и концентрациях NaCl. Растворимость лизоцима в работе (Retailleau et.al., 1997) определялась путем установления равновесия с кристаллом. Обычно с лизоцимом связано не менее 4-5 ионов Cl^- и с ростом концентрации соли их адсорбция может возрастать. Из рис.6 видно, что тенденции в поведении теоретических и экспериментальных зависимостей качественно совпадают, но отличаются на величину ln(m₂^*)², которая характеризует концентрацию белка в кластере. Расчетная концентрация оказывается несколько выше (около 700 мг/мл), чем реально наблюдаемая в кластере белка (около 500 мг/мл), получаемого в результате высаливания (Dumetz et.al., 2008 ).

На рис.6 также приведены данные по «растворимости» при концентрациях соли от 1 М NaCl и выше, полученные методом высаливания (Кривая 7). Концентрация белка, при которой в растворе появляется мутность, обусловленная возникновением кластеров, оказывается больше, чем в условиях равновесия (скачок на зависимостях в области 1М NaCl). Чтобы получить «скачок» на теоретических зависимостях, следует предположить, что часть ионов Cl^- десорбируется при образовании кластеров.

Реальные значения можно получить из данных по изменению концентрации белка в кластерах или в геле лизоцима в зависимости от концентрации NaCl (Dumetz et.al., 2008 ). В этом случае расчет по прямому уравнению (18) показывает, что при 1 М NaCl с белком связано 4,5 иона Cl^-, при 2 М NaCl - 6,5 иона Cl^- и при 3 М NaCl - 6,9 иона Cl^-, что согласуется с (Retailleau et.al., 1997). Таким образом можно определить число адсорбированных ионов электролита. При этом видна тенденция к насыщению в связывании анионов с ростом концентрации соли.

Температура является важнейшим фактором в механизме ФП и критической точки (КТ) можно достичь изменением температуры. Это предполагает существование взаимосвязи между температурой и критическим составом Х = (m₂/m₃)_кт,. Параметр ? связан с температурой через константы d и Q уравнения Дебая-Хюккеля, где Q ~ С/(T)^3/2. Здесь ? -диэлектрическая проницаемость, C - константа. Соотношение между Х = (m₂/m₃)_кр и температурой можно получить, используя уравнение (13) и (14):