Эффекты кластеризации глобулярных белков в растворах

Изучение закономерностей кластеризации белков при их взаимодействии с водой, осмолитами, между собой в связи с проблемой растворяющей способности воды и регуляции физико-химического состояния биологических растворов. Управление поведением подобных систем.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 05.09.2010
Размер файла 743,5 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

±1/ = (4-X2z2)/(2X2z2-4Xz2/ -8) (24)

±1/ = (X2z2-4X+4)/(8X-8) (25)

На рис.7 показана взаимосвязь критического параметра (m2/m3)cr и эффективной температуры: |1/| ~ (T)3/2. При заданной концентрации белка m2 кривые 1 и 2 на рис. 7 характеризуют температурное поведение критической точки при вариациях концентрации соли и соответствуют низким ( < 0) и высоким ( > 0) концентрациям соли, соответственно. Из рис.7 следует, что температура критической точки (и спинодали) возрастает с ростом концентрации соли при < 0, в то время как при > 0 температура критической точки уменьшается. Максимальной температуры спинодаль достигает при = 0 и составе: (m2/m3)кр = (1/)[1+(1+42/z2)0,5].

При условии > 0 поведение кривых 2 (для спинодали) и 3 (для нод бинодали) на рис.7 показывает, что с ростом m3 температура критической точки и температура нод понижается и достигает температуры минимальной (тройной точки), соответствующей значению |1/| = N = (z2-2)/ 22. Здесь состав системы удовлетворяет условию (m2/m3) = 2/. При этой температуре и составе все фазы находятся в равновесии.

Существование точки пересечения кривых 1 и 3 на рис.7 свидетельствует о температурной инверсии бинодали и спинодали. При составах m2/m3 справа от точки пересечения Q (очень малые концентрации соли или большие белка) температура фазового квазиравновесия расположена выше, чем критическая точка. Это система с нижней критической температурой растворения (НКТР). При составах m2/m3 слева от точки пересечения Q, но еще при < 0, температура фазового квазиравновесия ниже, чем у критической точки, т.е это система с ВКТР. Таким образом, есть основания предположить, что постепенное увеличение концентрации соли может приводить к постепенному переходу от системы с НКТР к системе с ВКТР и это может быть зарегистрировано экспериментально как фазовый переход.

Используя температурные зависимости критического состава на рис.7 и диаграмму рис 5, качественно можно представить фазовую диаграмму (ФД) растворимости системы в широко используемых координатах: температура - концентрация белка, где концентрация соли является варьируемым параметром (рис.8). Эта ФД аналогична общему (generic) типу диаграмм для глобулярных белков, (Muschol and Rozenberger, 1997). Повышение температуры критической точки (максимума спинодали) с увеличением концентрации соли при < 0 показано сплошной стрелкой, а при > 0 пунктирной стрелкой показано уменьшение температуры критической точки и стремление к тройной точке. «Низкосолевые» кластеры существуют на бинодали 5 на рис 8, а «высокосолевые» кластеры существуют на бинодали S - m2* на рис 8.

На рис.8 для системы с ВКТР верхняя точка спинодали и бинодали является критической. При изменении температуры или состава системы вода-белок-соль здесь имеет место критический ФП флуктуационного типа, когда обе фазы, сосуществующие при более низких температурах, становятся тождественными при ее повышении. При этом, в соответствии с теорией непрерывных фазовых переходов (Базаров,1983), у системы сначала появляются свойства однородной системы, а потом, будучи в целом однородной, у нее пропадают свойства двухфазной системы. Этот переход может занимать значительный участок фазовой диаграммы и представлять собой область закритических ФП (область между бинодалью и кривой растворимости).Здесь могут существовать динамические кластеры белка с ограниченным временем жизни, метастабильные по отношению к обеим граничным фазам белка. Аналогичные процессы и динамические кластеры могут существовать и в системе с НКТР. Поскольку механизмы образования систем с НКТР и ВКТР различны, различны должны быть и динамические кластеры. Согласно существующим данным, в растворах лизоцима обнаруживаются два типа динамических кластеров размерами ~ 10 нм и 100 нм. Первые из них характерны для низкосолевых растворов и являются динамическими компактными олигомерами белка (Stradner et.al. 2006).

В Главе 5 представлены результаты исследования влияния неорганических солей на структурную гетерогенность растворов САЧ-СМ. Растворы белка (50-200 мг/мл), модифицированного меткой на основе малеимида, содержали соли (NaCl, KSCN, MgCl2, CaCl2) разной концентрации в диапазоне 10-3 - 4 М/л.Выбор солей обусловлен тем, что они (за исключением KSCN) имеют параболического типа зависимость коэффициента активности от концентрации. Для них последовательно реализуются условия > 0, = 0 и > 0 с ростом концентрации соли. Если для MgCl2, CaCl2 экстремум коэффициента активности имеет место при 0,3 - 0,5 М, то для NaCl пологий минимум существует около 1,5 М концентрации.

Регистрировали индуцированные солями изменения в спектрах ЭПР модифицированных белков и сравнивали со спектрами белков в буферных растворах без соли. При этом анализировались параметры спектров (ширина линий, расстояния между экстремумами линий и соотношение амплитуд) в диапазоне температур от 77К до 318 К, позволяющие получить информацию о диполь-дипольных взаимодействиях спин-меток и средних расстояниях между молекулами белка (рис.9), их диффузионных характеристиках (рис.1) и термодинамических функциях состояния водно-белковой матрицы (рис 10,11).

На бинодали фазовой диаграммы, при температурах ниже критической, для многих белковых систем имеет место фазовый переход типа жидкость-жидкость, приводящий к фазовому разделению и образованию метастабильных концентрированных кластеров белка. Макроскопическое проявление этого явления в солевых растворах сопряжено с высаливанием. Для многих белков эффект наблюдается в области субнулевых температур. Согласно выводов Главы 4, увеличение концентрации соли будет приводить к смещению бинодали из области низких в область комнатных (физиологических) температур. При этом в эксперименте при комнатной температуре, согласно выводов Главы 4, может наблюдаться фазовый переход, связанный с «плавлением» низкосолевых динамических кластеров -олигомеров и появлением высокосолевых динамических кластеров и даже концентрированных микрофаз белка при высаливающих концентрациях солей.

По данным литературы (Zhang et.al, 2007) в водно-солевых растворах сывороточного альбумина быка при комнатных температурах не было обнаружено явных признаков ФП типа L-L. Наши же результаты свидетельствуют о наличии фазовых переходов типа «плавления» в растворах САЧ при более низких температурах (рис.10 и рис.11). Возможно, это обусловлено большей склонностью САЧ к взаимодействию и агрегации, чем САБ и более низким диапазоном температур исследования. Повышенные значения параметра d1/d в диапазоне низких концентраций соли наиболее вероятно указывают на наличие компактных кластеров-олигомеров. При умеренном повышении концентрации соли эти кластеры «плавятся» и исчезают, о чем говорит уменьшение d1/d и скачок термодинамических функций состояния .

В диапазоне больших концентраций солей (близких к высаливающим) появляются динамические «высокосолевые» кластеры и новые концентрированные фазы белка субмикронных размеров с несколько большим расстоянием между молекулами белка, чем в «низкосолевых» олигомерах (рис.9). В растворах САЧ с CaCl2 и MgCl2 они становятся визуально заметны по увеличению мутности. Однако при дальнейшем увеличении концентрации соли раствор становится вновь прозрачным. Вероятно, здесь имеет место критический фазовый переход. Для этих солей на рис.10 изотерма ТS в верхней точке сливается с изотермой G, т.е. G ТS. Таким образом, энтропия начинает управлять поведением системы, что характерно для критического фазового перехода (Юркин, 1991). Кроме того, зависимость параметра 2Tr в области плато (рис.3) соответствует нулевым значениям высших производных удельной свободной энергии вплоть до четвертой, что также является термодинамическим признаком критического ФП (Моравец, 1967). Вероятно, возможность наблюдать критический переход обусловлена снижением температуры критической точки в условиях высоких концентраций двухвалентных солей, т.е. при условии 0 и попаданием ее в область температур эксперимента. В этом случае раствор белка представляет собой смесь флуктуационных зародышей обеих граничных фаз при сохранении макроскопической прозрачности (рис.5, кривая 2).

В растворах САЧ с NaCl критического фазового перехода визуально наблюдать не удается, как и кластеров новой фазы, но по мере уменьшения концентрации белка и соли амплитуда скачка (при постоянном значении m2/m3, что согласуется с уравнением (13)) убывает (см. рис.11). Это может свидетельствовать о приближении к критическому фазовому переходу, причем со стороны высоких концентраций белка (рис.8).

Солью индуцируемый структурный фазовый переход (ФП) можно интерпретировать как фазовый переход воды, участвующей в гидратации низкосолевых и и высокосолевых динамических кластеров белка. В таком представлении спиновая метка является индикатором термодинамических изменений гидратации в процессе ФП. Отрицательные значения термодинамических функций H, ТS, G свидетельствуют, что закрытое (А) - состояние полости в структуре белка, где локализована спин-метка, термодинамически более стабильно, чем открытое для растворителя В- состояние. В «низкосолевой» зоне эта стабилизация сильнее.

Поскольку фазовый переход на рис.10 и рис.11 сопровождается увеличением среднего расстояния взаимодействия между молекулами белка (рис.9), есть основания считать, что под действием соли плотные динамические кластеры белка - олигомеры разрушаются и образуются более «рыхлые», но большего размера динамические кластеры второго типа, постепенно формируя метастабильные микрофазы, обогащенные белком.

При относительно плавном поведении G(m3). на рис.10 и рис.11, следует отметить существование пологого экстремума при определенной концентрации соли. С ростом концентрации белка экстремум сдвигается в область больших концентраций соли (Рожков, Борисова 1993). Для более точного анализа G(m3). использован подход с влиянием вязкости раствора на соотношение амплитуд спектра ЭПР САЧ-СМ (Глава 3). Рассчитанные таким образом данные представлены на рис.12. В таком виде они представляют собой зависимость безразмерной энергии Гиббса А-состояния водно-белковой матрицы от состава. По краям солевого интервала структура белка более жесткая (стабилизация А-состояния полости), чем в середине, где происходит перестройка структуры раствора из «низкосолевой» (кластеры первого типа) в «высокосолевую» (кластеры второго типа). При температуре 45 0С фазовый переход не регистрируется.

Фазовый переход в середине солевого интервала сопряжен с ростом частоты вращения метки (рис.1), с ростом растворимости белка (рис.3), и с ростом расклинивающего давления воды в ВБМ, характеризующего увеличение гибкости белка.

На рис.13 показано поведение удельной поверхностной энергии в области локализации спиновой метки на поверхности белка в зависимости от состава раствора. Увеличение концентрации белка ведет к росту энергии, однако с появлением кластеров рост компенсируется. Плавление белковых кластеров 1 типа и их превращения во 2 тип с ростом концентрации соли существенным образом в значениях не проявляется.

Несмотря на то, что представленные здесь данные характеризуют взаимодействие белок- растворитель, качественное объяснение результатов можно провести на основе взаимодействия белков. В этой главе на основе коллоидного подхода (теория ДЛФО) обсуждается возможная структурно-динамическая модель раствора белка. Она оперирует белковыми кластерами-олигомерами, располагающимися на расстоянии второго энергетического минимума потенциальной энергии взаимодействия. При этом мономеры белка окружают кластеры на расстоянии первичного энергетического минимума и обеспечивают стабилизацию как коллоидного состояния раствора, так и стабилизацию структуры белка (закрытое А-состояние полости белка, где локализована спин-метка). На основании этой модели удается качественно объяснить «плавление» кластеров-олигомеров действием электролита на величину и положение потенциальных барьеров энергии взаимодействия кластеров и молекул белка.

Глава 6 посвящена изучению влияния молекулярно-коллоидной системы гидратированных фуллеренов С60 на структурно-динамические характеристики молекул сывороточного альбумина. Другая задача работы заключалась в регистрации отклика белков (в т.ч. актин-спектринового цитоскелета) эритроцитарных мембран (теней), приготовленных по известным методикам, на присутствие в их суспензии наночастиц углерода различного происхождения, включая шунгитовый углерод и наноалмазы. В качестве рабочей гипотезы было предположение, что в основе неспецифических проявлений биологической активности коллоидной дисперсии фуллеренов (С60FWS, Andrievsky et.al., 1995) может лежать их способность влиять на фазовое состояние раствора, т.е. на изменение критического состава (Рожков, Горюнов, 2002; Rozhkov et.al., 2003), как это характерно для многих осмолитов. Вместе с тем можно ожидать и адсорбцию белков на нанокластерах углерода.

Характерной особенностью С60FWS является их коллоидный характер, что означает присутствие в растворе агрегатов (кластеров) различного размера. Коллоидными являются также растворы водорастворимых производных фуллеренов, фуллеренов и их производных в органических растворителях. Это делает их в структурном плане во многом похожими на растворы биополимеров, для которых определяющим условием стабильности является состояние гидратации.

Рис 14 а,б

Исследовали изменения динамики спиновых зондов при плавном замораживании воды, участвующей в гидратации наночастиц и белков (рис.14 а,б). Показано, что реакция гидратной оболочки на замораживание как в дисперсиях наноуглерода, так и в белках содержит общие закономерности, связанные с существованием незамерзающей воды в диапазоне (-15 - - 300С) в устойчивых дисперсиях наночастиц и ее отсутствием в неустойчивых дисперсиях.

Чрезвычайно важно знать состояние гидратации нанокластеров углерода, места возможного взаимодействия нанокластеров с биологическими структурами, поскольку нанокластеры могут служить сильными катализаторами окислительно-восстановительных реакций, создавая в своем окружении повышенную концентрацию кислорода и ионов металлов. Следствием этих взаимодействий может оказаться токсический эффект наноуглерода. В работе исследовано влияние гидратированных фуллеренов (С60FWS) и наночастиц шунгитового углерода (ShC) на изменение скорости запускаемых ионами железа потери и последующего зависимого от кислорода восстановления парамагнитных свойств водо и мембранорастворимых стабильных спиновых зондов 4-оксо-ТЕМПО (1) и 5-Доксилстеариновой кислоты (2). Зонды служили в качестве индикаторов модулирующего действия наночастиц углерода на свободнорадикальные процессы. В опытах с (1) в коллоидные растворы, содержащие либо С60FWS, либо ShC в разных концентрациях от 0,1 до 1 мг/мл и 0,1 мМ зонда, добавляли разные концентрации FeSO4 (от 0,1 до 1 мМ). Первые 20-30 минут шла относительно быстрая известная реакция восстановления (реакция -I) зонда ионами железа c потерей парамагнетизма зонда, которая затем сменялась медленной реакцией окисления (реакция-II) зонда с восстановлением сигнала ЭПР. При этом скорости обеих реакций росли пропорционально концентрации как сульфата железа, так и наночастиц ShC . Без наночастиц углерода реакция окисления (II) не шла.

Добавлением аскорбиновой кислоты (200 мкМ и 40 мкМ FeSO4) можно замедлять скорость реакции (I), при этом фуллерены на скорость реакции (I) практически не влияют. В этой же системе реакция (II) запускалась добавлением свежей порции воды или следовых количеств перекиси водорода. Это свидетельствует о важной роли молекул кислорода в реакциях окисления зонда, при этом в присутствии фуллеренов скорость реакции (II) возрастала.

В опытах с (2) зонд вводили в мембрану теней эритроцитов и наблюдали динамику изменения парамагнетизма зонда добавлением FeSO4 в концентрации от 0,04 до 0,8 мМ в суспензию теней, не содержащую и содержащую 20 мкМ фуллеренов (рис.15). В этой системе после мгновенного восстановления зонда, индуцируемого Fe+2 , сразу (< 3 мин) начинался рост сигнала ЭПР, причем скорость роста изменялась пропорционально росту концентрации FeSO4. и увеличивалась в присутствии фуллеренов, если концентрация FeSO4 была больше 0,04 мМ. При меньшей концентрации FeSO4 эффект фуллеренов не обнаруживается, что может свидетельствовать об отсутствии у фуллеренов собственных прооксидантных свойств, выражающихся в способности генерировать активные формы кислорода.

Таким образом, обнаруженный прямой каталитический эффект углеродных наночастиц на радикальные реакции в водной среде и в тенях мембран эритроцитов в присутствии O2 указывает на необходимость тщательного контроля содержания ионов железа в дисперсиях углеродных наночастиц при их медико-биологическом применении.

В солевых растворах в присутствии фуллеренов отмечено уменьшение в водно-белковой матрице микроскопического поверхностного натяжения, которое также является интегральной характеристикой гидратации. Было также обнаружено, что индуцируемый солью фазовый переход, сопряженный с разрушением «низкосолевых» динамических белковых кластеров, в присутствии фуллеренов происходил при больших концентрациях электролита (Таблица 1). Как следует из таблицы, при концентрации соли 0,15 М в присутствии фуллерена H/W и ТS/W белка соответствуют «низкосолевому» типу гидратной оболочки, в то время как при этой концентрации они должны бы соответствовать «высокосолевому» типу. Таким образом, присутствие фуллерена влияет на положение фазового перехода на фазовой диаграмме, сдвигая критический состав в сторону больших концентраций соли. Они способствуют сохранению «низкосолевых» динамических белковых кластеров (олигомеров) в том диапазоне концентраций электролита (физиологически значимом), где в отсутствие фуллеренов они начинали «плавиться». Если следовать логике фазовой диаграммы рис.9, то в присутствии фуллеренов температура спинодали должна понижаться, как это происходит в присутствии глицерола и полиэтиленгликолей (Galkin and Vekilov, 2000). Вероятно, нанокластеры фуллеренов, являясь коллоидными частицами, стабилизируют коллоидное состояние белкового раствора за счет дальнодействующих сил.

Таблица 1 Изменение термодинамических функций состояния водно- белковой матрицы, рассчитанные из температурной зависимости свободной энергии перехода спин-метки из А в В состояние полости белка в диапазоне 15-36 0С и приведенные к 15 0С , в зависимости от концентрации NaCl и в присутствии фуллеренов

NaCl (M)

1,0

0,1

0,01

0,001

0,15+ 5мкM C60

TS/W

(отн.ед)

28,83,5

29,94,0

15,51,5

15,91,3

17,31,5

H/W (отн.ед)

30,23,5

31,14,0

16,61,5

16,91,3

18,41,5

Обнаружен универсальный стабилизирующий эффект наночастиц на мембранные белки теней эритроцитов при температурах больше 310 К. На рис.16 представлены зависимости отношения параметров спектра ЭПР W/S спиновой метки, модифицирующей белки актин-спектринового каркаса теней эритроцитов, от температуры. В присутствии наноалмазов (ND) и шунгита (ShC) белки ведут себя практически одинаково с контролем вплоть до температур 310 К, однако далее в актин-спектриновом комплексе начинается денатурационный процесс и проявляется стабилизирующий эффект наночастиц углерода: уменьшение отношения W/S свидетельствует об усилении внутри и межмолекулярного взаимодействия белков цитоскелета (Butterfield,1982). Стабилизирующий эффект (ND) сохраняется после «отжига» - нагреве суспензии теней до 600С, последующем охлаждении до 250С и повторном нагревании до 600С, что может говорить о защитном действии наночастиц против необратимых процессов термоиндуцированной агрегации.

В опытах со спин-зондом 5-Доксилстеариновой кислотой было показано, что наночастицы углерода вызывают перераспределение спин-зонда из одного микроокружения (предположительно, в аннулярном слое липидов), в другое. Это может быть связано с изменением взаимодействия белков в мембране в связи с их ассоциацией, индуцированной наночастицами.

В Главе 7 обсуждаются возможные следствия, вытекающие из существования кластерной организации раствора белка и фазовых переходов, сопровождающих ее трансформацию. Эти следствия можно использовать для лучшего понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе некоторых конкретных биотехнологических процессов, а также биопроцессов, находящихся в стадии интенсивного изучения на более высоких уровнях биологической организации.

В первой части Главы 7 обсуждаются результаты исследования механизма кристаллизации лизоцима, т.е. изменений структурно-динамического состояния раствора лизоцима при увеличении концентрации NaCl. Молекулы лизоцима модифицировали спиновой меткой на основе йодацетамида в условиях посадки метки в одном центре на Гис-15. Снимали спектры ЭПР образцов белка концентрации 35 мг/мл при разных концентрациях NaCl от 0,003 до 3 М в 0,01 М фосфатном буфере, рН 6,4 при температурах 293 К и 77 К. Определяли время корреляции молекул лизоцима и при разных мощностях СВЧ измеряли степень насыщения и параметр d1/d, обратно пропорциональный среднему расстоянию между белками. На рис.17 показано его изменение в зависимости от концентрации NaCl. Можно выделить три диапазона концентраций NaCl, в которых поведение d1/d кардинально изменялось. Эти изменения достаточно легко интерпретировать с использованием фазовой диаграммы (рис.8), которая адекватно описывает раствор лизоцима. Так, в диапазоне до 0,15 М NaCl происходит постепенное разрушение структурной организации, вероятно представленной «низкосолевыми» кластерами (олигомерами) белка. Здесь много общего с раствором САЧ (рис.10). От 0,3 М до 1,5 М NaCl напротив, видна существенная разница с раствором САЧ.

Дело в том, что лизоцим, в отличие от альбумина, легко кристаллизуется, поэтому в этой области образовывались зародыши и микрокристаллы белка, визуально заметные на 4 сутки. Расстояние между молекулами белка при этом сокращается (рост d1/d). Высокая скорость зародышеобразования объясняется близким расположением спинодали на фазовой диаграмме белка. Поскольку спинодаль с ростом концентрации соли поднимается по оси температур и приближается к температуре эксперимента, усиливается рост флуктуаций концентрации молекул белка. В этом случае возрастает вероятность флуктуаций, достаточных для образования зародыша кристалла.

При 3 М NaCl мгновенно появился белый преципитат белка, который за 4 суток не изменился. Образец, соответствующий 3 М концентрации NaCl, уже попадает в область спинодали (рис.8), так как критическая концентрация NaCl для высаливания 35 мг/мл лизоцима соответствует 1,6 М соли. Однако при этом образуется не кристалл, а вязкий гель, о чем свидетельствует резкий рост времени корреляции вращения метки при относительно большом расстоянии между макромолекулами белка (рис.17). Образование геля в этой области фазовой диаграммы также отмечено в работе (Dumetz et.al.2008). Хотя это явление довольно слабо исследовано, можно предположить, что адсорбированные ионы электролита играют здесь немаловажную роль. Если молекулы белка с адсорбированными на поверхности ионами формируют кластер, то ионы оказываются в среде с пониженной диэлектрической проницаемостью. Из-за избыточного роста электростатической свободной энергии структура белка будет подвергаться денатурационным изменениям. Это может приводить как к их последующей агрегации, так и к полимеризации. Возможно, в этом заключен механизм возникновения геля лизоцима, поскольку ионы Cl- достаточно прочно связаны с белком (Retailleau et.al., 1997).

Таким образом, на примере водно-солевых растворов лизоцима с использованием метода ЭПР спиновой метки и соответствующих теоретических подходов показано существование ряда структурно-динамических состояний раствора белка, связанных с взаимодействием белок-растворитель и сопряженных с возникновением сложных надмолекулярных, в том числе и кристаллических структур.

Для белковых кристаллографов важно, что значения второго вириального коэффициента взаимодействия можно использовать в качестве критерия для облегчения поиска условий кристаллизации белка. Развиваемый в работе подход обнаруживает взаимосвязь этого коэффициента с параметрами системы z и и позволяет установить пределы его изменения. Существует аналитическое выражение для коэффициента взаимодействия В в виде (Edsall et.al., 1950).

В = (26)

Здесь первое слагаемое - Доннановский член, 22 - коэффициент активности белка, зависящий от его концентрации и формы. Он имеет положительное значение в случае асимметричных молекул, но в случае сильно заряженных молекул и взаимодействия белка с солью им можно пренебречь. Третье слагаемое характеризует взаимодействие белка с электролитом и имеет отрицательное значение. Здесь 23=(-/2m3)(2+33m3), а 33m3 =. Учтем, что в суперкритической (тройной) точке , где спинодаль и бинодаль вырождаются в одну линию, пересекающую границу твердой фазы, выполняется условие (m2/m3) = 2/. Подставив это значение в уравнение (13), получим: = 22/(z2-2). Тогда уравнение (26) вблизи этой точки, в пренебрежении 22 и с учетом соответствующих выражений, будет выглядеть как:

В =. (27)

Отсюда следует, что приближение к фазовому переходу жидкость-твердое тело характеризуется отрицательными значениями коэффициента взаимодействия и может происходить в узком диапазоне изменения его величины, определяемом вариациями параметров:

2 <z2< 22. (28)

В таблице 2 представлены рассчитанные по уравнению (27) значения В для лизоцима, M2 =14000, для концентраций NaCl 2% и 7%, и ряда значений рН. Значения (как правило, это анионы для 1:1 электролита) брались с учетом условия (28), но при этом предполагалось, что с ростом концентрации NaCl значение может возрастать. Как видно из таблицы, рассчитанные величины располагаются в относительно узком диапазоне значений и близки к экспериментальным (Guo et.al., 1999) (В табл.2 они приведены в скобках). Однако из ур.(27) следует, что не потенциал взаимодействия белок-белок определяет знак и величину этого коэффициента, а взаимодействие с ионами электролита.

Таблица 2. Расчет значений коэффициента взаимодействия для лизоцима

Заряд белка z

2% NaCl

7% NaCl

, число Cl-

B104, mol мл/г2

, число Cl-

B104, mol мл/г2

9 (рН 5.4)

7

-1.9 (-2.8)

8

-2.4

10 (рН 5.0)

8

-3.0 (-2.9)

9

-3.5

11 (рН 4.6)

8

-0.6 (-1.7)

10

-4.9

13 (рН 4.0)

10

-2.9 (0.1)

12

-5.0 (-7.4)

Далее в Главе 7 на основе особенностей фазовой диаграммы модельной системы вода-белок-соль (рис.5) обсуждаются механизмы мгновенной регуляции ионно-осмотического гомеостаза висцеральных жидкостей, а на основе обобщенной ФД (рис.8) механизмы возможного эволюционного происхождения регуляторных явлений в цитоплазме в ответ на изменение физико-химических условий среды, известных как неспецифический адаптационный синдром клеточной системы (НАСКС).

Наличие в модельной системе вода-белок-соль фазового перехода 1 рода, заканчивающегося критическим переходом, предполагает существование петли Ван-дер-Ваальса (рис.5). При этом в качестве метастабильных состояний в квазиравновесии со старой фазой возникают кластеры новой фазы, которые последовательно трансформируются по мере изменения состава вплоть до макроскопического фазового превращения. При этом, согласно правилу Максвелла, химический потенциал воды системы остается постоянным, пока поддерживается квазиравновесие мономеркластер. В то же время динамическое состояние макромолекул в кластере и в растворе могут различаться, хотя в среднем баланс стабилизирующих и дестабилизирующих структуру белка сил будет поддерживаться на некотором стационарном уровне. Это обеспечивает одновременно и быструю регуляцию и относительную стабильность функции в целом. Квазиравновесие мономеркластер предлагается рассматривать как квазиравновесие двух псевдофаз воды, участвующей в гидратации мономеров белка и кластеров белка. Эти псевдофазы находятся в равновесии с объемной водой раствора как с третьей фазой, не участвующей в критическом переходе. В критической точке в водной части системы наблюдается критический фазовый переход двух типов гидратации, соответствующих мономерам и динамическим кластерам. Таким образом, получает подтверждение гипотеза (Дудоладов, Тинчер, 1971) о существовании структурно-температурного оптимума гомеостаза системы (норма), сопряженного с непрерывным фазовым переходом в поверхностном слое воды молекул белка, в наибольшей степени приспособленного к регуляции. В данном случае регуляция возникает как термодинамические следствия близости критического фазового перехода (Юркин, 1991). Основные проявления этих следствий заключаются в неравномерном и селективном распределении компонент системы на пути к критической точке (например, распределение Na+ и К+ между фазами) и универсальная растворимость компонент раствора в области критической точки.

Выход системы под действием физико-химических факторов среды из состояния «нормы» (фазовый переход) является «стрессом». Как следует из диаграммы на рис.8, при повышении температуры, но прежнем составе системы, может нарушаться квазиравновесие белок кластер и устанавливается однофазная мономерная форма структурной организации раствора белка. При этом теряется способность к осмотической регуляции (зона выше кривой растворимости). При понижении температуры ниже некоторого предела и том же составе система также теряет способность к осмотической регуляции, поскольку оказывается в неустойчивой области фазовой диаграммы внутри спинодали. При этом в ней идут процессы спинодального распада, завершающиеся образованием новых фаз, обогащенных белком, либо кинетически стабилизированных, но термодинамически неравновесных состояний - геля (Dumetz et.al. 2008).

Таким образом, структурно-температурный оптимум гомеостаза является особенностью макромолекулярной системы, находящейся вблизи термодинамического равновесия, элементы которой обладают фазообразующими свойствами по отношению к растворителю, а структурированность возникает вследствие специфического проявления метастабильности (кластеризации) в многокомпонентных системах. Реализация этого состояния не требует затрат метаболической энергии, так как соответствует относительному минимуму химического потенциала воды. Такие системы могли оказаться объектом эволюционного отбора. Так, механизм аллостерической регуляции ферментативной активности олигомерных белков изначально мог иметь в основе динамическое равновесие мономер-кластер, а существование расклинивающего давления между элементами надмолекулярных структур могло реализоваться в способность сократительных белков генерировать силу при изменении степени полимеризации.

Из термодинамической теории критических и закритических фазовых переходов известно (Семенченко, 1962), что сильное развитие флуктуаций в системе позволяет ей в течение некоторого времени сохранять свой состав и частично структуру при относительно резком изменении внешних воздействий, при этом слабая реакция обусловлена малостью кинетических коэффициентов. Такие мезофазы слабо проводят тепло, вязкие, самодиффузия в них замедляется. Можно предположить, что в процессе добиологической эволюции одним из критериев отбора была способность растворов полипептидов и полинуклеотидов переходить в закритическое состояние или в состояние спинодального распада. В этом состоянии гигантских флуктуаций концентрации можно было «пережидать» действие неблагоприятных факторов, таких, как резкие скачки температуры, давления, солености без потери состава, а потом возвращаться в исходное или близкое к нему структурное состояние с оптимизированным значением химического потенциала воды. При этом давление отбора могло быть направлено на подбор полипептидов и нуклеотидов (и катализаторов), способных к быстрым процессам де(полимеризации), поскольку при этом и вся система при изменении внешних условий быстро возвращается к квазиравновесному состоянию мономеркластер.

На современном этапе биологического развития могла сохраниться эта реликтовая способность химического этапа эволюции, естественно, усовершенствованная в процессе биологической эволюции. Возможно, что “память” об этом естественном процессе проявляется в современных условиях в форме НАСКС (Браун, Моженок, 1987). Можно предположить, что основная задача НАСКС состоит в том, чтобы в стрессовой ситуации за счет частичной потери клеточного содержимого перевести межклеточную среду в новое изотоническое состояние, подобное квазиравновесию мономер-кластер, которое в силу своих термодинамических особенностей не позволит клеткам допустить избыточных потерь внутриклеточного материала.

С другой стороны, в основе явлений НАСКС лежит способность цитоплазматических белков к обратимым денатурационным изменениям (Александров, 1985) и/или полимеризации. Однако механизм денатурационных изменений до сих пор остается неизвестен. В свете излагаемых нами представлений (уравнение 22), под денатурационными можно представлять изменения структуры белков в кластере - микрофазе, вызванные присутствием на поверхности белков, образующих кластер, адсорбированных ионов электролита, которые по каким-либо причинам оказались не способными к десорбции при образовании кластера. Уменьшение диэлектрической проницаемости среды будет приводить к росту свободной энергии системы из-за усиления электростатических взаимодействий, которые могут «взрывать» белок (Финкельштейн, Птицын, 2002). В свою очередь, денатурированные белки в кластере могут обладать способностью к полимеризации, а полимеры - к последующей нуклеации.

В настоящее время установлено, что гомогенная нуклеация полимеров HbS является двухступенчатым процессом (Galkin et.al., 2007). Первым шагом является обратимый L-L фазовый переход, создающий высококонцентрированного аморфного предшественника для полимеризации, а разбавленная фаза сильно влияет на последующую кинетику нуклеации полимеров. Термодинамические и кинетические характеристики L-L перехода сильно зависят от наличия специфических контактов молекул гемоглобина разных форм (HbS, HbC, HbA) и их конформаций (Chen et.al., 2004; Pan et.al., 2007). Подобный механизм сейчас интенсивно обсуждается в связи с проблемой формирования амилоидных фибрилл, лежащей в основе многих конформационных заболеваний (Киселев, 2005). В связи с этим можно высказать гипотезу, что загрузка белков ионами, к примеру, тяжелых металлов, не способных к десорбции при формировании кластеров, может провоцировать кластерную денатурацию белков по прионному типу, их последующие полимеризацию и нуклеацию фибрилл.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1. Разработан термодинамический подход, позволяющий строить фазовые диаграммы системы вода-белок-соль. При этом установлено соотношение между критическим составом системы, соответствующим индуцируемому солью фазовому переходу между двумя типами белковых кластеров, температурой и физико-химическими характеристиками белка и соли, включающими заряд белка, число адсорбированных ионов и их активность. Тем самым открывается возможность целенаправленно регулировать фазовое состояние этой системы и предсказывать структурно-динамическое поведение ее компонент в заданных точках фазовой диаграммы.

2. Впервые в аналитическом виде получены коэффициенты, характеризующие уравнение высаливания белка электролитом и показывающие роль адсорбированных ионов в этом процессе. При этом, зная концентрацию белка в разбавленной и концентрированной фазах, на основе уравнения высаливания можно определить число адсорбированных ионов соли.

3. Показано, что методом ЭПР спиновых меток и зондов можно регистрировать индуцируемые температурой и солью фазовые переходы в растворах глобулярных белков, получая информацию как о взаимодействии белок-белок по изменению среднего расстояния между белками, так и о внутримолекулярной конформационной динамике, которая сопряжена с межмолекулярным взаимодействием. В этом заключается преимущество данного метода по сравнению с другими.

4. Обнаружено неспецифическое стабилизирующее влияние гидратированных наночастиц углерода на белки, в основе которого может быть как механизм их взаимной адсорбции, так и коллоидная природа и структурированность дисперсий углерода, обусловленная дальнодействующими силами. Это влияет на характеристики фазовых переходов на фазовой диаграмме раствора белка. Кроме того, биологическая активность наночастиц может проявляться в их способности катализировать окислительно-восстановительные реакции в модельных и живых системах, во многом благодаря общим особенностям гидратации наночастиц и белков.

5. Фазовый переход типа жидкость-жидкость, сопряженный с образованием микронных капель концентрированных белковых растворов и кластеров белка, предложено рассматривать как фазовый переход воды, участвующей в гидратации мономеров и кластеров белка. Это позволяет именно к воде применить основные термодинамические следствия, обусловленные существованием критических фазовых переходов и связанные с универсальной растворяющей способностью воды в критической точке, (что способствует образованию ненативных белковых конформаций), неравномерным и селективным перераспределением компонент (ионов соли) между фазами по пути к критической точке, пониженной термодинамической устойчивостью околокритических фаз.

6. Предлагается механизм срочной регуляции осмотического равновесия и неспецифических физико-химических регуляторных реакций на уровне микроокружения макромолекул в ответ на изменение состава или температуры, основанный на существовании кластерной организации и фазовых переходов в растворе белка.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Kaivarainen A.I., Rozhkov S.P., Franek F., Olshovska Z. Intramolecular mobility in antiDNP antibodies and their Fab fragments. ESR spectra of the complexes with a spin-labelled hapten in H2O-D2O mixtures at various temperatures // Folia biologica.- 1983.- V.29.- P.209-220.

Рожков С.П., Кяйвяряйнен А.И. Изучение гибкости молекул сывороточного альбумина методом спиновой метки. //Биофизика.- 1985.- Т.30.- №5.- С.772-776.

Кяйвяряйнен А.И., Рожков С.П. Влияние температуры и связывания с ионами меди на подвижность субъединиц спин- меченых окси и метгемоглобина.// Биофизика.- 1987.- Т.32.- С.407-412.

Кяйвяряйнен А.И., Рожков С.П. Определение времен корреляции молекул лизоцима и лизоцима в комплексе с ингибитором методом спиновых меток.// Биофизика.- 1987.- Т.32.- №1.- С.22-25.

Рожков С.П. Спинодаль в концентрированных водно- солевых растворах молекул сывороточного альбумина // Журн. физической химии.- 1988.- Т.62.- С.1925-1928.

Рожков С.П. Стабилизация белка сахарозой по данным метода спиновой метки // Биофизика. -1991.- Т.36.- В.4.- С.571-576.

Рожков С.П. Изменение знака расклинивающего давления в гидратной оболочке молекул сывороточного альбумина в зависимости от концентрации соли по данным метода спиновой метки.// Коллоидный журнал.- 1992.- Т.54.- №6.- С.64-69.

Рожков С.П. Механизм взаимодействия молекул сывороточного альбумина с полиэтиленгликолями по данным метода спиновой метки // Журн. физической химии.- 1991.- Т.65.- №8.- С.2204-2209.

Рожков С.П., Борисова А.Г. Фазовый переход критического типа в водно- белковой матрице молекул сывороточного альбумина, индуцируемый солью.// Биофизика.- 1993.- Т.38.- В.4.- С.590-595.

Рожков С.П. Проблемы “нормы” в молекулярных модельных эколого- биохимических системах.// Теоретические аспекты экологической биохимии.Сб.статей./ Петрозаводск: BИзд-во Кар.НЦ РАН.- 1993.- С.195-203.

Рожков С.П. Критические явления в водно- солевых растворах биополимеров // Журн. физической химии. -1996.- Т.70.- №11.- С.1982-1986.

Рожков С.П. Стабилизация альбумина CaCl2 и MgCl2 регулируемым взаимодействием макромолекул: исследование методом спиновой метки. // Биофизика.- 1997.- Т.42.- В.5.- С.1020-1028.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Белок- белковые взаимодействия в водно- солевых растворах молекул сывороточного альбумина по данным метода спиновой метки.// Структура и динамика молекулярных систем (ред. Скирда и др.). Сб.статей /Йошкар- Ола, Казань, Москва:- 1997.- С.52-56.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Кластеры макромолекул в недонасыщенных растворах биополимеров.// Структура и динамика молекулярных систем. Ч.1.Сб.статей./ Йошкар- Ола, Казань, Москва:- 1998.- С.140-144.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Удельная поверхностная энергия и кластерная организация молекул сывороточного альбумина.// Структура и динамика молекулярных систем.- Вып.6 Сб.статей/ Казань: Изд-во УНИПРЕСС.- 1999.- С.197-200.

Rozhkov S.P., Goryunov A.S. Effects of inorganic salts on the structural heterogeneity of serum albumin solutions // Eur. Biophys. J.- 2000.- V.28.- N8.- P.639-647.

Рожков С.П., Горюнов А.С., Суханова Г.А., Рожкова Н.Н., Андриевский Г.В. Молекулярные аспекты биологической активности водной молекулярно- коллоидной системы гидратированных фуллеренов в модельных растворах биополимеров.// Фуллерены и фуллереноподобные структуры. Сб. статей/ Минск: Изд-во БГУ.- 2000.- С.140-147.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Индуцируемое фуллеренами взаимодействие ионов электролита с молекулами белка по данным метода спиновой метки // Структура и динамика молекулярных систем. Вып.7. Сб. статей./ М.: Изд-во ИФХ РАН.- 2000.-С.286-289.

Рожков С.П. Трехкомпонентная система вода- биополимер-ионы как модель молекулярных механизмов осмотического гомеостаза // Биофизика.- 2001.- Т.46.- №1.- С.53-59.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Кластеры белков как кластеры “скрытой” фазы и влияние состава раствора на их размер // Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей.Вып.8,Ч.2/ Йошкар-Ола.- 2001.- С.124-127.

Горюнов А.С., Рожков С.П. Взаимодействие доменов сывороточного альбумина в присутствии декстрана и фуллерена по данным ДСК// Структура и динамика молекулярных систем. Сб. статей.Вып.8,Ч.2/ Йошкар-Ола.- 2001.- С.231-234.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Влияние гидратированных фуллеренов С60 на удельную поверхностную энергию водных растворов сывороточного альбумина // Журн. физ. химии.- 2002.- Т.76.- №7.- С.1303-1309.

Rozhkov S.P., Goryunov A.S., Sukhanova G.A., Borisova A.G. Rozhkova N.N. and Andrievsky G.V. Protein interaction with hydrated C60 fullerene in aqueous solutions // Biochem.Biophys. Res.Commun.-2003.-V.303.-P.562-566.

Рожков С.П. Фазовая диаграмма системы, моделирующей водно-солевой раствор биополимера. // Структура и динамика молекулярных систем. Вып.X Часть 2/ Казань.-2003.- С.197-201.

Рожков С.П. Критические фазовые переходы в системе вода-биополимер-электролит и проблемы кристаллизации белка //Журн.физ.химии.- 2004.-Т.78.- №11 -С.1962-1966.

Рожков С.П. Критические явления, фазовые равновесия и структурно-температурный оптимум гомеостаза в модельной системе вода-биополимер-электролит//Биофизика.- 2005 -Т.50.- в.2.- С.115-122.

Rozhkov S.P. Phase transition and precrystallization processes in a water-protein -electrolyte system //J.Cryst.Growth.- 2004.- V.273.- P.266-279.

Рожков С.П., Горюнов А.С. Определение удельной поверхностной энергии гидратной оболочки белка методом ЭПР с использованием спиновой метки // Биофизика.- 2006.- Т.51.- №2.- С. 236-241.

Рожков С.П. Растворимость и фазовые переходы в системе вода-белок-соль // Биофизика.- 2006.- Т.51.- С.822-826.

Рожков С.П., Суханова Г.А., Горюнов А.С., Борисова А.Г., Рожкова Н.Н. Стабилизация мембранных белков эритроцитов наночастицами углерода // Углеродные наночастицы в конденсированных средах( под ред. П.А.Витязя и др.)/ Минск: - 2006.- С.212-214.

Rozhkov S.P., Goryunov A.S., Rozhkova N.N. EPR spin-probe study of carbon nanoparticles hydration properties in aqueous dispersions // In: Hydrogen materials science and chemistry of carbon nanomaterials ( Vezirogly T.E. et.al, Eds.)/ Springer Science+Bisuness Media B.V.- 2007.- P.539-544.


Подобные документы

  • Структура биологических мембран и строение их основы - билипидного слоя. Молекулярная масса мембранных белков, их различие по прочности связывания с мембраной. Динамические свойства биологических мембран и значение организации для биологических систем.

    реферат [19,1 K], добавлен 20.12.2009

  • Физические, биологические и химические свойства белков. Синтез и анализ белков. Определение первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белков. Денатурация, выделение и очистка белков. Использование белков в промышленности и медицине.

    реферат [296,5 K], добавлен 10.06.2015

  • Белки (протеины) – высоко молекулярные, азотосодержащие природные органические вещества, молекулы которых построены из аминокислот. Строение белков. Классификация белков. Физико-химические свойства белков. Биологические функции белков. Фермент.

    реферат [4,0 M], добавлен 15.05.2007

  • Аминокислотный состав белков в организмах, роль генетического кода. Комбинации из 20 стандартных аминокислот. Выделение белков в отдельный класс биологических молекул. Гидрофильные и гидрофобные белки. Принцип построения белков, уровень их организации.

    творческая работа [765,3 K], добавлен 08.11.2009

  • Белки как класс биологических полимеров, присутствующих в каждом живом организме, оценка их роли и значения в процессе жизнедеятельности. Строение и основные элементы белков, их разновидности и функциональные особенности. Нарушение белкового обмена.

    презентация [980,5 K], добавлен 11.03.2013

  • Проблемы сборки мембранных белков, методы исследования и условия переноса белков через мембраны. Сигнальная и мембранная (триггерная) гипотеза встраивания белков в мембрану. Процесс сборки мультисубъединичных комплексов и обновление мембранных белков.

    курсовая работа [289,5 K], добавлен 13.04.2009

  • Понятие и структура белков, аминокислоты как их мономеры. Классификация и разновидности аминокислот, характер пептидной связи. Уровни организации белковой молекулы. Химические и физические свойства белков, методы их анализа и выполняемые функции.

    презентация [5,0 M], добавлен 14.04.2014

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.