Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами

Актуальность проблемы. Важной и актуальной проблемой в селекции растений является задача создания селекционного материала с заданными свойствами. Создание такого материала до сих пор остается сложной и, в отдельных случаях, трудновыполнимой задачей. С одной стороны, с появлением технологий генной инженерии стало возможным создание таких растений. Однако, несовершенство этих технологий и возможность генетической модификации только единичных признаков не всегда позволяет применять их на практике. С другой стороны классическими методами селекции создано огромное количество ценного селекционного материала. Применение и интеграция новых технологий молекулярно-генетической оценки этого материала в селекционный процесс позволит значительно сократить время создания генотипов с заданными свойствами.

За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур (Collard and Mackil, 2007). Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие "молекулярно-генетический маркер". Внедрение ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому (Francia at al. 2005). В настоящее время разработано большое количество типов молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК. Они позволяют выявлять генетическое разнообразие на молекулярном уровне организации ДНК, что является базисом, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования.

При отборе нужных генотипов в расщепляющихся популяциях, селекционер сталкивается обычно со следующими проблемами:

1) Для отбора генотипа по заданному признаку необходима большая расщепляющаяся популяция;

2) Необходимо дождаться нужного поколения (F₅, F₆);

3) Становится достаточно сложно проводить отбор в популяции по нужному признаку, если его проявление зависит от условий окружающей среды;

4) Чаще всего приходится ждать до поздних этапов онтогенеза растений, чтобы провести отбор по признаку;

5) Трудно проводить накопление генов, например устойчивости, так как сложно провести отбор генов в присутствии уже существующих (Gupta and Varshney, 2000).

Помочь решить данные проблемы может использование близко сцепленных с признаком молекулярных маркеров, полученных различными методами.

До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур использовались только морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. При этом проявление тех или иных признаков в значительно степени зависит от условий внешней среды. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивается до 10, а для двулетних до 20 лет.

Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре последовательностей ДНК локусов (генов) у форм растений отличающихся по проявлению признака, например по устойчивости к фитопатогену.

Цель и задачи исследования. Цель исследований - разработка комплексной системы анализа геномов растений, основанной на использовании современных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических технологий для эффективной и ускоренной селекции растений

Задачи исследования

Разработать систему идентификации родительских геномов и мониторинга чужеродного генетического материала в селекционных программах с использованием межвидовой гибридизации.

Изучить особенности организации геномов растений, представителей различных семейств, для разработки эффективных ДНК-маркеров.

Разработать методологию использования молекулярных и молекулярно-цитогенетических маркеров на различных этапах селекционного процесса.

Разработать новые подходы изучения механизмов формирования 2n-гамет с целью преодоления межвидовой несовместимости при создании ценного селекционного материала.

Исследовать возможности использования ISSR-PCR-маркеров для оценки исходного селекционного материала и при создании эффективных ДНК-маркеров.

Клонировать и охарактеризовать последовательности генов устойчивости растений и их аналогов.

Создать ДНК-маркеры на хозяйственно-ценные гены томата, риса, огурца, малины и хмеля.

Научная новизна и практическая значимость. Адаптирована методика геномной in situ гибридизации на межвидовых гибридах лилий и изучен геномный состав этих гибридов, получаемых с использованием 2n-гамет. Вперые установлен механизм формирования 2n-гамет у межвидовых гибридов лилий, основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). На основе разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации на лилиях впервые подтверждена возможность создания трехгеномных гибридов (2n=36).

Разработана оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяющая проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.

Впервые продемонстрирована возможность использования высокоповторяющейся геномспецифичной последовательности ДНК GenBR-1 для визуализации генома B капустных в разном геномном окружении.

С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) впервые установлена геномная организация высокоповторяющихся последовательностей ДНК Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов томата. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением C-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.

Впервые клонирована высокоповторяющаяся субтеломерная последовательность ДНК хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на хромосомах. Выявлено, что эта последовательность может служить цитогенетическим маркером для идентификации хромосом хмеля. Впервые установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.

Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus, Cucumber и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри - и межвидовой гибридизации, а также форм растений томата с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.

Впервые проведено клонирование двух последовательностей ДНК, специфичных для хромосомы Y мужских растений хмеля. На основе анализа клонированных последовательностей созданы эффективные ДНК маркеры для выявления пола растений хмеля, которые могут использоваться в селекционном процессе.

Впервые клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника остролистного. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.

Идентифицированы молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса. Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, расположенные на длинном плече 10-й хромосомы риса.

Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа ДНК локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Созданы кодоминантные CAPS-маркеры генов устойчивости к фузариозу (I2) и ветрициллезу (Ve) томата. Созданы ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля - на определение пола растений, риса - на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированы условия применения ДНК маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу. Предложены оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК для массового скрининга селекционного материала. Разработаны методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК технологий. Получены перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, и создан коммерческий гибрид F₁.

Успешная межвидовая гибридизация является базой для интрогрессии хозяйственно-ценных признаков в культурные растения. В зависимости от объекта, целей и задач, стоящих в процессе интрогрессии генетического материала, требуется разработка различных систем мониторинга чужеродного генетического материала. Они могут быть основаны на молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методах, как в отдельности, так и их комлексе.

1.1 Молекулярно-цитогенетические методы

1.1.1 Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий

В процессе межвидовой гибридизации в международном центре исследований растений PRI, Нидерланды, создан ряд форм и гибридов лилий разного уровня плоидности и геномного состава. Ранее было показано, что фертильные растения межвидовых гибридов лилий образуют 2n-гаметы (Van Tuyl, J. M. et al., 1989, Tuyl, J. M. et al., 1997). Однако механизм возникновения таких гамет и возможность их использования в селекционных программах по созданию новых форм лилий оставались неизвестными. В нашей работе была впервые использована геномная гибридизация in situ для идентификации родительских геномов в межвидовых гибридах лилий, а также выяснения механизмов возникновения 2n гамет.

Гибрид F₁: L. longiflorum 'Gelria' х азиатский гибрид 'Whilito' (LA). В результате геномной in situ гибридизации оказалось возможным четко различить оба родительских генома, L. longiflorum и азиатского гибрида, в LА-гибриде (рис.1а). Двенадцать хромосом с зеленой флуоресценцией принадлежат L. longiflorum.

Проба равномерно гибридизовалась по всей длине этих хромосом. Остальные двенадцать хромосом с синей флуоресценцией принадлежат азиатскому гибриду 'Whilito' и визуализованы методом контрокрашивания красителем DAPI. Нами наблюдался очень низкий уровень перекрестной гибридизации меченой ДНК L. longiflorum на хромосомы, имеющие происхождение от азиатского гибрида 'Whilito'. Сайты гибридизации генов рибосомной ДНК были детектированы на трех хромосомах, имеющих происхождение от L. longiflorum и на трех - от азиатского гибрида.

Гибриды F₁: Азиатский гибрид х (L. longif1orum х азиатский гибрид) (ALA). На рисунке 1b показан результат геномной in situ гибридизации на растении ALA-2.

В качестве пробы были использованы ДНК L. longiflorum (зеленая флуоресценция) и ДНК плазмиды рТА 71 (красная флуоресценция), контрокрашивали DAPI (синяя флуоресценция).

Это растение является триплоидом (2n=36) вследствие образования нередуцированных 2n-гамет LА-гибридом, который использовался в качестве отцовской формы для получения ALA растений.

В растении ALA-l обнаружено пять рекомбинантных хромосом, восемь нерекомбинантных хромосом от L. longifloruт и двадцать три хромосомы азиатского гибрида. Одна из рекомбинантных хромосом содержала четыре сегмента, полученных от геномов L. longifloruт и Азиатского гибрида, что указывает на три сайта рекомбинации (рис 1b).

Три хромосомы имели два сайта кроссинговера и одна хромосома имела один сайт, который был близко расположен к рДНК региону хромосомы азиатского гибрида.

В общей сложности в ALA-l было обнаружено десять точек рекомбинации и было обнаружено два и семь рДНК-сайтов, принадлежащих L. longifloruт и азиатскому гибриду соответственно.

Рис 1. Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий. a. F₁: (L. longiflorum х азиатский гибрид (синие хромосомы) (LA) b. F₁ (азиатский гибрид х [L. longif1orum х азиатский гибрид (ALA)] c. F₁ восточный гибрид (красные хромосомы) х (L. longiflorum х азиатский гибрид). Стрелками указаны сайты рекомбинации. L. longiflorum - зеленые хромосомы, азиатский гибрид - синие хромосомы, восточный гибрид - красные хромосомы).

В растении ALA-2 (2n=36) выявлено три рекомбинантных хромосомы, 10 принадлежащих L. longifloruт и 23 азиатскому гибриду. Две рекомбинантные хромосомы имели по два сайта кроссинговера и одна - один сайт. Три и шесть сайтов рДНК, принадлежащих L. longifloruт и азиатскому гибриду соответственно, было обнаружено в этом растении. Растение ALA-3 (2n=36) имело 12 хромосом от L. longif1oruт и 24 хромосомы азиатского гибрида. В растении ALA-4 было обнаружено 48 хромосом, из них 12 имеют свое происхождение от L. longif1oruт.

Гибрид F₁: Восточный гибрид х (L. longiflorum х азиатский гибрид) (OLA). Для визуализации и анализа геномной организации трехвидового гибрида мы успешно использовали метод многоцветной геномной in situ гибридизации. В растении OLA (2n=36) все три родительских генома были четко различимы (рис 1c). Анализ кариотипа показал, что данный гибрид содержит по 12 гомеологичных нерекомбинантных хромосом каждого родителя L. longiflorum, восточный гибрид и азиатский гибрид.

Итак, адаптированный нами применительно к лилиям метод геномной in situ гибридизации позволил четко различить геномы L. longiflorum, восточных и азиатских лилий в гибридах, полученных при их скрещиваниях. Исходя из этого, мы можем заключить, что L. longiflorum, восточная и азиатская лилии содержат в своих геномах различающиеся семейства высоко - и среднеповторяющейся ДНК. Изменчивость этих типов ДНК считается источником дифференциации видов (Dеаn and Schmidt, 1995). Такая дифференциация и позволяет визуализовать геномы в межвидовых гибридах с использованием геномной in situ гибридизации (Schwarzacher et аl. 1992).

Мониторинг чужеродного хроматина при интрогрессии генетического материала от одного вида к другому является очень важным. На данный момент геномная in situ гибридизация - наиболее эффективный метод для такого мониторинга и позволяет четко установить геномный состав межвидовых гибридов. Нами этот метод успешно применен на межвидовых гибридах лилий. При этом нам удалось визуализовать сайты рекомбинации и таким образом показать возможность интрогрессии генетического материала. Основным преимуществом метода геномной гибридизации in situ является и то, что интрогрессию в гибридах лилий из-за слабой изученности их геномов, невозможно установить с использованием других молекулярных методов (RFLP, RAPD, AFLP и др.).

Успех интрогрессии полностью зависит от гомеологической рекомбинации между родительскими геномами в мейозе F₁ гибридов и от их фертильности (van Tuyl and DeJeu, 1997). Растения F₁ L. longiflorum х азиатский гибрид обычно полностью стерильны. Для преодоления этой проблемы на лилиях в настоящее время используются два подхода: митотическое удвоение хромосом и применение растений, формирующих нередуцированные 2n-гаметы (van Tuyl et аl, 1989). Последний подход наиболее предпочтителен для селекционных программ, в которых упор делается на использование интрогрессии генетического материала от одного вида к другому. Формирование нередуцированных гамет связано обычно с двумя типами нарушения мейоза:

1. отсутствием первого мейотического деления (first division restitution - FDR);

2. отсутствием второго мейотического деления (second division restitution - SDR) (Mok and Peloquin, 1975; МсСоу, 1982; Hermsen, 1984). Для использования гибридных растений, формирующих 2n-гаметы в селекционных программах, необходимо знать путь формирования таких гамет (FDR или SDR). В нередуцированных гаметах, образующихся в результате FDR, в каждую гамету попадают несестринские хроматиды каждой гомологичной хромосомы, в то время как в результате SDR сестринские хроматиды попадают в одну гамету (Ramana, 1979). В случае межвидовых гибридов по одной хроматиде от каждого родителя попадает в гаметы, сформированные в результате FDR. Отсутствие гомологичных хромосом L. longiflorum в ALA и OLA гибридах указывает на механизм FDR формирования 2n-гамет в LА-гибридах, которые были использованы в качестве отцовской формы

При анализе геномов гибридных растений ALA-I и ALA-2 нами продемонстрировано наличие рекомбинации между геномами L. longiflorum и азиатских гибридов. Эти данные указывают на формирование хиазм в процессе формирования 2n-гамет. Отсутствие рекомбинантных хромосом в растениях АLА-3, ALA-4 и OLA, вероятно, связано с полным подавлением или низким уровнем спаривания между гомеологичными хромосомами.

Использование наряду с геномной пробой рибосомальной ДНК рТа 71 позволило получить дополнительную информацию и идентифицировать хромосомы, несущие ядрышкообразующие регионы. Проанализировав распределение рДНК в ALA-1 растении, мы также получили дополнительное подтверждение образования 2n-гамет через FDR механизм.

Таким образом, использование геномной гибридизации in situ позволило получить нам ценную информацию о частоте рекомбинации между геномами L. longiflorum и азиатского гибрида в образующих 2n гаметы F₁-гибридах. Результаты нашей работы указывают на то, что такие F₁-гибриды могут быть использованы для интрогрессии генетического материала от одного вида к другому.

1.1.2 Геномная гибридизация in situ на моносомно дополненных линиях томата

Геномная гибридизация in situ продемонстрировала свою эффективность и в случае анализа дополненных линий томата по второй хромосоме S. lycopersicoides. При этом мониторинг чужеродного хроматина в геноме томата возможно было проводить, как на митотических, так и мейотических хромосомах.

1.2 Совместное использование молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов

1.2.1 Тритикале

Тритикале - это относительно новая и перспективная культура, получившая признание производителей сельскохозяйственной продукции в последние десятилетия. В производстве представлены в основном гексаплоидные тритикале. Причем, как демонстрируют исследования, перспективные линии и сорта тритикале часто несут замещения или транслокации (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984; Соловьев, 2007). Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как это показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, устойчивости к прорастанию на корню, толерантности к ионам алюминия и другие (Rybka, 2003; Oracka and Јapiсski, 2006; Wos et al., 2006). Таким образом, идентификация и подробная молекулярно-генетическая характеристика таких линий является важной проблемой. Эта информация будет основой для создания новых перспективных линий тритикале с заданными свойствами.

Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов - дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомных наборов тритикале.

С целью разработки такого подхода в нашей работе использовалась модельная линия тритикале 131/7, несущая пшенично-ржаную транслокацию. Для идентификации хромосом, вовлеченных в эту транслокацию, применяли в комплексе молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы. На первом этапе была физически картирована точка транслокации с использованием адаптированного нами метода гeномной гибридизации in situ после дифференциального окрашивания на одной и той же метафазной пластинке (Рис.2).

Рис.2. Совмещение дифференциального окрашивания и гибридизации in situ на одной и той же метафазной пластинке хромосом линии тритикале 131/7 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).

После анализа рисунка дифференциального окрашивания хромосом нами определено, что в геноме линии 131/7 присутствует замещение 2В хромосомы на 2D-хромосому и транслокация длинного плеча хромосомы 2В в хромосому 2R.

Однако, применение только цитологических маркеров для характеристики хромосом не может полностью исключить ошибок при идентификации генетического материала (Devos et al., 2000, Pestsova et al., 2000; Salina et al., 2003). Для подтверждения данных молекулярно-цитогенетического анализа нами был использован метод молекулярного маркирования. Для этого экспериментальным путем были подобраны микросателлитные маркеры, специфичные для конкретных хромосом. Отсутствие амплификации таких маркеров на других геномах дало возможность нам использовать их как STS-маркеры. Это позволило удешевить проведение такого анализа, так как не требуется проведение дорогостоящего денатурирующего гель-электрофореза. К преимуществам такого подхода можно отнести и отсутствие необходимости выявления полиморфизма исходных форм, участвовавших в создании тритикале. Нами были подобраны следующие микросателлитные маркеры на длинное и короткое плечи 2В хромосомы: Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332,Xgwm120, Xwmc441, Xbarc167, Xbarc1064, Xbarc1139, Xwmc592, Xwmc477, Xbarc13, Xgwm429 (рис.3), а также маркеры, специфичные на короткое и длинное плечо всех хромосом генома D (Табл.1).

Таблица 1.

Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для D-генома у линии тритикале 131/7.

Примечание: здесь и далее + маркер присутствует, - - маркер отсутствует. Маркеры Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332, Xgwm120, Xwmc441, Xbarc167, Xbarc1064, Xbarc1147, локализованные в длинном плече хромосомы 2В, присутствовали в геноме линии 131/7. Маркеры Xwmc592, Xwmc477, Xbarc13, Xgwm429 отсутствовали в геноме линии 131/7 (рис.3). Таким образом, точка рекомбинации находится между маркерами Xwmc592, локус 63,9 сМ, и Xwmc441, локус 76,8 сМ, по карте сцепления (Wheat, Consensus SSR, 2004 NA-SSR-2004-2B, http://wheat. pw. usda.gov). По физической карте (Wheat, Physical, SSR, http://wheat. pw. usda.gov) точка рекомбинации располагается в районе C-2BL2-0.36.

Для подтверждения замещения хромосомы 2R на хромосому 2D использовали молекулярный STS-маркер на локус запасного белка Sec-2, картированный в коротком плече хромосомы 2R.

Рис 3. Локализация точки транслокации между хромосомой пшеницы и ржи на физической и генетической картах.

Для выявления хроматина генома ржи мы использовали рожь-специфичный ДНК-маркер (RYE) (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997, Katto et al., 2004). С помощью этого маркера можно идентифицировать даже небольшие интрогрессии хроматина ржи (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997).

1.3 Конвертирование днк-маркеров в молекулярно-цитогенетические маркеры на примере капустных, хмеля и томата

1.3.1 Молекулярно-цитогенетическое маркирование генома В капустных с использованием геном-специфичного ДНК маркера

1.3.2 Хромосом-специфичные маркеры на примере половых хромосом хмеля

1.4 Молекулярно-генетические методы анализа геномов растений для идентификации генетического материала у отдаленных гибридов

1.4.1 Использование ISSR-PCR