Главная
Коллекция "Otherreferats"
Биология и естествознание
Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами
Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами
Система идентификации родительских геномов и мониторинга чужеродного генетического материала в селекционных программах с использованием отдаленной гибридизации. Молекулярно-генетические ДНК-маркеры для оценки и характеристики исходного материала.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 05.09.2010 |
| Размер файла | 2,8 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Рис.10. ISSR-профили пяти видов томата - а-б, справа налево: S. cheesmanii, S. hirsutum, S. humboldtii, S. lycopersicum, S. pennellii, полученные с использованием двух праймеров: а - К13, б - К15.
Проведение ISSR-PCR с праймером К10 на растении F1 межвидового гибрида S. lycopersicum X S. hirsutum, позволило получить электрофоретический профиль ISSR-фрагментов геномной ДНК данного гибрида, в котором присутствовали все ISSR-фрагменты, характерные для обеих родительских форм (рис.11). Однако не все ISSR-праймеры обладали способностью идентифицировать данный гибрид. ISSR-фрагменты, типичные для S. hirsutum, не всегда выявлялись в профилях проанализированного гибрида. Также наблюдалось появление фрагментов не свойственных ни для одной из родительских форм.
Рис.11. Идентификация межвидового гибрида S. lycopersicum (Mo504) X S. hirsutum с помощью ISSR-праймера К10. Справа налево: Маркер размеров, S. hirsutum, F1 L. esculentum (Mo504) X S. hirsutum, S. esculentum (Mo504).
Таким образом, с помощью ISSR-PCR была выявлена высокая степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей у пяти видов рода Solanum, выбранных в качестве объектов исследования в данной работе. Это позволило провести четкое генотипическое маркирование проанализированных видов томата. Так же была проведена идентификация растения, полученного при проведении межвидовой гибридизации S. lycopersicum X S. hirsutum.
Использование ISSR-PCR для мониторинга интрогрессии чужеродного хроматина на примере линий томата S. lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Для проверки возможности использования метода ISSR-PCR для выявления интрогресси и создания генетических карт были использованы две линии S. lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Используя карту интрогрессий в хромосоме 6 линий WSL6 и IL 6-3 (Weide et al., 1993), мы смогли провести физическую локализацию 13 ISSR-маркеров на хромосоме 6 S. lycopersicum в соответствии с регионами интрогрессий (рис.12).
Рис.12 Физическое картирование ISSR-маркеров на линиях L. esculentum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями
Пять из 13 маркеров расположены в самом протяжённом регионе хромосомы, который соответствует участку интрогрессии линии WSL6, включая короткое плечо, большую часть длинного плеча и исключая только область перекрытия интрогрессии WSL6 с участком интрогрессии IL6-3 (Рис.13). В этой области также локализованы морфологические маркеры yv и m-2. Четыре маркера расположены в регионе длинного плеча хромосомы 6, который соответствует интрогрессии IL6-3, не включая область его перекрытия с интрогрессией WSL6. В данном участке также расположен ген gib-1. Ещё 4 ISSR-маркера локализованы в самой узкой области, которая расположена вокруг морфологического маркера с и соответствует участку перекрытия интрогрессий линий WSL6 и IL6-3.
Рис.13. Физическая карта 6-й хромосомы S. lycopersicum с локализованными на ней 13 ISSR-маркерами.
Таким образом, использование карты интрогрессий в хромосоме 6 линий IL6-3 и WSL6 позволило физически локализовать 13 ISSR-последовательностей на хромосоме 6 томата.8 из 13 последовательностей потенциально расположены вне прицентромерной области.
Использование ISSR-маркеров для создания интегрированной генетической карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата. Для создания интегрированной карты групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата с помощью ISSR-PCR нами была проанализирована популяция из 64 растений F2 межвидового гибрида S. lycopersicum X S. pennellii, ранее использовавшихся при создании генетической карты, основанной на AFLP маркерах. При этом были использованы праймеры ранее продемонстрировавшие полиморфизм между двумя видами томата. Данные по расщеплению ISSR-маркеров были получены для 14 праймеров. Всего при анализе исследуемой популяции было выявлено 82 ISSR-маркера. Для создания интегрированной генетической карты пригодными из них оказались 48 ISSR-маркеров, которые разделились на 11 групп сцепления, отнесённым к хромосомам 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,12. Маркеров, относящихся к хромосоме 11, выявлено не было (Табл.2).
Таблица 2
Распределение ISSR-маркеров по хромосомам томата
|
Хромосомы |
ISSR-маркеры |
|
|
1 |
К11Е1*, К17Е2, К11Р2, К18Р1, К24Р2, К27Р3 |
|
|
2 |
К12Е3, К19Е2, К27Р1, К32Р1 |
|
|
3 |
К11Е3, К12Е1, К18Е1, К27Е2, К18Е2, К18Р4, К13Р3, К24Р3 |
|
|
4 |
К17Е3, К30Е1, К12Р1, К12Р3, К30Е2 |
|
|
5 |
К15Е6, K13P4, K24E1, K26E4, K17P5 |
|
|
6 |
K12E4, K17P1, K17P3, K26P2 |
|
|
7 |
K15E5, K19E3, K13P1, K17P2, K27P2, K17E1 |
|
|
8 |
K32E1, K12P2, K18P5 |
|
|
9 |
K10E1, K16E2, K16E4 |
|
|
10 |
K26E1, K26E2, K27E3, K26P3 |
|
|
11 |
маркеры не выявлены |
|
|
12 |
K15E4 |
*Жирным шрифтом обозначены маркеры, интегрированные в генетическую карту (рис.10).
Из 48 ISSR-маркеров, отнесённых к различным группам сцепления, 32 были интегрированы на генетической карте групп сцепления томата относительно уже имеющихся молекулярно-генетических маркеров.21 маркер показал незначительную степень сцепления, что не позволило отнести их к выявленным группам сцепления и интегрировать в ранее созданную генетическую карту (Рис.14).
Таким образом, картирование ISSR-маркеров генома томатов показало, что межмикросателлитные последовательности и микросателлиты могут располагаться вне прицентромерной области хромосом томата. Этот результат наряду с тем фактом, что метод ISSR-PCR достаточно прост в использовании и хорошо воспроизводим, свидетельствует о высокой потенциальной эффективности использования межмикросателлитных маркеров для дальнейшего картирования генома томата и других видов.
Хромосома 3
Рис.14. Пример интегрированной генетической карты по третьей группе сцепления
А - интегрированная генетическая карта групп сцепления межмикросателлитных последовательностей ДНК томата; Б - генетическая карта томата, созданная Tanksley et al. (1992); В - генетическая карта томата созданная Haanstra et al. (1999). Красным цветом на трех картах обозначены области локализации ISSR-маркеров. Синим цветом на карте Haanstra et al. (1999) обозначена область, где AFLP-маркеры располагаются с наибольшей плотностью. Черная вертикальная полоса слева на карте А обозначает приблизительную локализацию прицентромерной области хромосом.
Показанная возможность равномерного покрытия генома томата ISSR-маркерами делает их чрезвычайно привлекательным инструментом для маркирования генов хозяйственно-ценных признаков при проведении селекции с помощью маркеров (MAS - Marker Assisted Selection).
2. Молекулярно-генетические днк-маркеры для оценки и характеристики исходного материала
2.1 Межсортовой полиморфизм ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного
Структура и организация генома хмеля до настоящего времени мало изучены. Единичные работы посвящены оценке возможности применения некоторых молекулярных маркеров для идентификации сортов хмеля, филогенетических исследований, маркирования пола. Низкий уровень полиморфизма RAPD - и RFLP - маркеров образцов хмеля европейского и североамериканского происхождения выявлен Pillay и Kenny, 1996 и Patzak et al. 1999. В нашей работе проведено исследование межсортового полиморфизма ISSR-маркеров у хмеля обыкновенного. Оценивается возможность применения этого типа маркеров для филогенетических исследований, идентификации сортов хмеля и маркирования хозяйственно-ценных признаков.
Продукты амплификации были получены для 21 из 23 протестированных ISSR-праймеров,19 праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов ДНК. Их размер варьировал от 120 п. н. до 1900 п. н., а количество (учитывали только хорошо различимые фрагменты) - от 5 до 20 фрагментов на 1 праймер (в среднем 9 фрагментов на 1 праймер). Двадцать один праймер обеспечил амплификацию 183 фрагментов ДНК, из них 106 (57,9%) были полиморфными. Уровень полиморфизма, полученный нами для ISSR-маркеров выше AFLP-полиморфизма выявленного Seefelder et al., 2001 - 43,5% и RAPD-полиморфизма, описанного Sustar-Vozlic и Javornik, 2000 - 38,6%.
Обнаружены ISSR-маркеры, специфичные для отдельных сортообразцов. К 692266 из Японии: праймер К15 - отсутствует фрагмент размером 550 п. н.; К17 - получен фрагмент 250 п. н., отсутствующий у других сортов. Образец из местной популяции Алтая ЧА 89/19: К16 - отсутствуют фрагменты 300 п. н. и 500 п. н. Сорта Михайловский и Аполлон: отсутствуют отрезки размером 250 п. н. (К22) у первого и 450 п. н. (К24А) у второго.
Генетические расстояния и ISSR-группы сортов хмеля. Максимальные значения коэффициентов различия (от 0,45 до 0,53) получены для югославского сорта Аполлон, украинского Сполэчны и российских сортообразцов (Ранний, Чувашский местный, Гуслицкий, Подвязный, Э 88/20, Михайловский, Дружный), японского клона К-692266 и теми же российскими образцами. На основе значений коэффициентов различия был проведен кластерный анализ и построена дендрограмма. Большинство российских сортообразцов, а так же украинский сорт Заклад, Литовский местный и чешский Жатецкий поздний образуют один большой кластер. Европейские сорта, а также небольшая часть российских и украинские сорта образуют второй большой кластер. В нем российские образцы Э 88/20 (Чувашия, образец из местной популяции), Цивильский (НИПТИХ, Чувашия) и Сумерь (РНИСХ) образуют отдельный подкластер. Особняком стоят японский клон К-692266 и образец из местной популяции Алтая ЧА 88/19, которые генетически отдалены как от российских, так и от европейских сортов. До середины XIX века в России выращивали сорта и сортосмеси хмеля, созданные народной селекцией. К концу XIX века после завоза богемских, баварских и английских сортов хмеля они частично заменили российские. Широко применяли интродукцию иностранных сортов в 70-80-х годах XIX века и на Украине. В результате на хмельниках образовывались смеси отечественных и иностранных сортов. Этим можно объяснить например то, что полученный в результате клонового отбора из сортосмеси Житомирской области Клон 18, входит в один кластер с европейскими сортами.
Таким образом, в нашей работе выявлен высокий уровень межсортового ISSR-полиморфизма хмеля обыкновенного. Классификация сортов, полученная с помощью ISSR-ПЦР анализа генетического полиморфизма сортов хмеля, отражает существенные генетические различия между российскими, европейскими и дальневосточными группами сортов, но не согласуется с количественными показателями (средние продолжительность вегетации, масса хмеля с растения, содержание альфа-кислот) исследованных сортов. Данные, полученные в результате ISSR-ПЦР анализа, могут быть использованы в селекционном процессе для классификации и идентификации сортов хмеля, подбора пар для скрещивания с учетом их эколого-географического происхождения.
2.2 Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у малины
При выборе метода для молекулярно-генетического анализа малины мы, прежде всего, исходили из того, что структура и организация генома малины мало изучены и, следовательно, необходимо опираться на те методы, которые не требуют предварительного знания о последовательности анализируемой ДНК. Также необходимыми условиями при выборе метода для нас были: простота использования, скорость проведения анализа и низкая стоимость.
Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов и сортов малины было использовано 15 ISSR-праймеров. Продукты амплификации были получены для одиннадцати из пятнадцати протестированных праймеров. Десять праймеров обеспечили амплификацию полиморфных фрагментов.
В целом эффективными оказались только 8 из 15 ISSR - праймеров. С помощью этих восьми праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из генотипов малины.
При сравнении ISSR-профилей образцов малины был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК. С помощью восьми выбранных праймеров оценили генетическое разнообразие видов и сортов малины. Было проанализировано 223 ампликона, из которых полиморфными оказались 202, что составило 90,6%. В целом выявлено широкое варьирование генетического полиморфизма в зависимости от праймера и группы анализируемых образцов. Всего учитывали 4 группы образцов: виды малины, ремонтантные сорта, обычные сорта и общая группа, объединяющая все сорта и виды. Самый высокий уровень полиморфизма наблюдался в объединенной группе сортов и видов, где он варьировал от 71,4 до 96,8%, и в среднем составил 89,2%, что можно объяснить тем, что в данной группе наряду с сортами учитывали данные по отдельным видам, которые имели большое количество уникальных фрагментов, специфичных только для данного вида и повышающих общий уровень полиморфизма. Межвидовой полиморфизм колебался в пределах от 66,7 до 94,7% и в среднем по восьми праймерам составил 82,75%. Наименьший же уровень полиморфизма наблюдался в группе неремонтантных сортов, где он составил 45,4% однако, в среднем он составил 74,6% и был очень близок к среднему уровню полиморфизма ремонтантных сортов - 74,1%. В целом, как видно из полученных результатов, геном малины отличается высокой степенью полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК.
В дендрограмме, построенной на основании результатов, полученных при использовании всех восьми праймеров, наблюдалась четкая кластеризация по группам исследуемых образцов. В частности, выделились все ремонтантные сорта и сорта с летним типом плодоношения, образовав отдельные кластеры. В кластер неремонтантных сортов также попал стародавний сорт Новость Кузьмина, который в наших исследованиях являлся представителем вида малины красной Rubus idaeus L.
Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины с использованием ISSR-PCR. При использовании праймера (AC) 8YA был обнаружен специфический маркерный фрагмент длиной около 270 п. н., присутствующий во всех 15 исследуемых сортах ремонтантной малины. Можно предположить, что данный фрагмент является маркером признака ремонтантности малины, так как при проведении PCR-анализа сортов малины с обычным неремонтантным типом плодоношения он не амплифицировался (рисунок 15).
Рис.15. Молекулярное маркирование ремонтантных сортов малины. Неремонтартные сорта: 1-Новость Кузьмина, 2-Пересвет, 3 - Рубин брянский, 4 - Брянская, 5 - Бальзам, 6 - Вольница; Ремонтантные сорта: 7-Элегантная, 8-Надежная, 9-Августина, 10 - Заря вечерняя, 11 - Абрикосовая, 12-Бабье лето1, 13-Бабье лето2, 14-Геракл, М-маркер размеров (1216,1045, 926,632,313,241).
2.3 Молекулярно-генетические маркеры для исследования генетического разнообразия и маркирования признаков у огурца
2.3.1 ISSR полиморфизм
Уровень ISSR полиморфизма был изучен на двух сортах, двух коммерческих гибридах F1 и 14 селекционных линиях различного происхождения. Четырнадцать из 19 использованных праймеров выявили различный уровень полиморфизма, который варьировал от 10 до 80%. Несмотря на высокий полиморфизм применение этого метода для маркирования устойчивости огурца к мучнистой росе не позволило выявить маркеров этого признака.
Таким образом, мы изучили полиморфизм межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК видов, сортов и линий рода Lycopersicon, Humulus, Cucumber и Rubus с помощью ISSR-PCR. Метод ISSR-PCR, который позволяет амплифицировать последовательности ДНК, расположенные между соседними повторяющимися последовательностями ДНК - микросателлитами, показал себя как простой, эффективный и надёжный метод изучения полиморфизма генома томатов. Проведение экспериментов в ходе исследования часто было разорвано по времени, при этом использовались разные партии реактивов. В таких условиях метод ISSR-PCR проявил высокую воспроизводимость результатов, что является одним из важнейших критериев, определяющих эффективность различных молекулярно-генетических методов.
Как и RAPD-PCR, ISSR-PCR не требует знания нуклеотидной последовательности ДНК для создания праймеров, что является преимуществом этих методов молекулярного маркирования. Однако, ISSR-PCR проявляет более высокую воспроизводимость по сравнению с RAPD-PCR.
Это связано с тем, что ISSR-праймеры могут быть использованы при гораздо более высоких температурах отжига в ходе амплификации, чем достигается высокая специфичность реакции (Kojima et al., 1998). Кроме того, ISSR-PCR позволяет получить комбинированные фрагменты ДНК, которые состоят из универсальной части, соответствующей какому-либо микросателлиту, и специфической межмикросателлитной последовательности. Данные, полученные с помощью ISSR-PCR, могут отражать как полиморфизм межмикросателлитных последовательностей, так и особенности организации в геномах изучаемых растений самих микросателлитов.
2.4 Анализ гомологов генов устойчивости к фитопатогенам
Наиболее актуальным на сегодняшний день является создание сортов и линий растений с генетической устойчивостью к фитопатогенам. К настоящему времени клонирован ряд генов устойчивости, проведена их молекулярная характеристика и выявлены их консервативные области (Feuillet at al., 2003, Wisser at al, 2005). Таким образом, с помощью амплификации с праймерами на консервативные домены можно клонировать последовательности гомологичные генам устойчивости к фитопатогенам.
2.4.1 Огурец
Нами было использовано 10 пар праймеров на различные домены генов устойчивости. В результате была получена амплификация фрагментов различной длины, хорошо разделяемых в полиакриламидном геле. Полученный полиморфизм был использован для маркирования устойчивости огурца к мучнистой росе. При использовании изогенных линий был получен фрагмент, который маркировал этот признак (Рис.16).
Рис.16. Электрофоретические профили ПЦР продуктов образцов огурца при использовании пары праймеров XLLR.1-7 - неустойчивые образцы; 8 - 14 - устойчивые образцы; 15 - маркер "100 bp leader".
2.4.2 Подсолнечник
С использованием комбинаций вырожденных праймеров, созданных на основе консервативных NBS - доменов генов устойчивости, нами проведена амплификация и последующее клонирование фрагментов аналогов генов устойчивости подсолнечника Helianthus argophyllus. Сиквенсы клонированных ПЦР - продуктов различались между собой и имели сродство к отрезкам NBS - доменов уже известных генов устойчивости и аналогов генов устойчивости растений, относящиеся к разным классам. Наибольшее сходство выявлено с участками NBS - доменов культурного подсолнечника и других представителей семейства сложноцветных. Два клонированных фрагмента имеют открытую рамку считывания, остальные последовательности имеют стоп-кодоны, являясь, по-видимому, псевдогенами. Проанализированные аминокислотные последовательности Helianthus argophyllus включают в себя консервативные участки, свойственные NBS домену продуктов генов устойчивости.
Таким образом, наличие полиморфизма между гомологами генов устойчивости может быть использовано при создании молекулярно-генетических маркеров.
3. Разработка и создание ДНК маркеров на хозяйственно-ценные признаки для оценки исходного материала и ускорения селекционного процесса
3.1 Маркеры, связанные с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС)
ЦМС растений широко используется в сельском хозяйстве при производстве гибридных семян. Она позволяет устранить затраты, связаные с ручной кастрацией, и тем самым снизить себестоимость семян. Растения с ЦМС образуют стерильную пыльцу, которая не способна к оплодотворению. Это явление известно у многих сельскохозяйственных культур. ЦМС является результатом взаимодействия цитоплазматических и ядерных компонентов. Многочисленные исследования сосредоточены на различиях в митохондриальных геномах между линиями с ЦМС и их линиями закрепителями. Однако высокая степень полиморфизма митохондриального генома между линией с ЦМС и ее закрепителями не позволяет идентифицировать митохондриальные факторы, контролирующие мужскую стерильность.
3.1.1 Рис (Oryza sativa)
Геномную ДНК ЦМС линий (А линий) и их линий закрепителя (B линий) риса использовали в качестве матрицы для ПЦР анализа.
Амплификация митохондриальной ДНК RAPD-методом. Для выявления полиморфизма митохондриальной ДНК между ЦМС линиями и их закрепителями ЦМС использовали RAPD метод с применением 34 RAPD-праймеров (Operon Technology, USA). Геномную ДНК ЦМС линии Neda-А (А линии) и ее линии закрепителя Neda-B (B линии) использовали в качестве матрицы для ПЦР с RAPD-праймерами. В RAPD - анализе, 30 из 34 праймеров воспроизводимо амплифицировали ДНК, среди которых четыре выявили полиморфизм между линией ЦМС Neda-A и ее фертильным аналогом закрепителем Neda-B. Праймеры OPA09, OPA14, OPC02 и OPC05, с высокой воспроизводимостью выявляли полиморфные фрагменты между двумя изогенными линиями. OPA09 и OPA14 амплифицировали специфичные фрагменты для стерильной линии, длиной ~200 п. н и ~800 п. н., соответственно. Для идентификации RAPD маркеров и их ассоциации с цитоплазматической мужской стерильностью, ДНК 4-х стерильных линий и их линий закрепителей была амплифицирована с 4 идентифицированными полиморфными RAPD праймерами. Только один RAPD - праймер (OPC05) амплифицировал фрагмент, размером ~500 п. н, специфичный для всех 4-х линий ЦМС (рис.17).
Рис.17. ПЦР амлификация RAPD-праймером OPC05. P1: Neda-A и B; P9: IR67017-180-2-1-2-A и B; P10: Usen-A и B; P11: IR68897-A и B. Стрелками показан полиморфный бэнд.
При амлификации ДНК 4-х ЦМС линий и линий закрепителей с использованием комбинации RAPD - праймеров серии А (OPА01-04) и серии B (OPB02-04), всего 12 пар, праймеры OPA01-OPB04 выявили полиморфизм между ЦМС линиями и линиями закрепителями. С комбинацией праймеров OPA01-OPB04 амплифицировался полиморфный фрагмент размером ~370 п. н., специфичный для ЦМС линий (рис.18).
Рис.18. ПЦР с комбинацией RAPD-праймеров OPA01-OPB04
Эти результаты отражают различие в цитоплазматическом геноме линий с ЦМС и их закрепителей.
Обнаруженные RAPD-маркеры могут использоваться для создания линий с ЦМС в селекционных программах гибридного риса, а также в оценке чистоты семян.
SCAR маркеры ЦМС.
Для идентификации молекулярных маркеров, различающих генотипы ЦМС линий и линий закрепителей, были разработаны 2 специфичных праймера (SCARmt01F и R) на основе митохондриальной последовательности AY187000 от линий "Zhenshan 97-A" и 2 специфичных праймера (SCARmt02F и R) на основе митохондриальной последовательности AY181205 от линий "Zhenshan 97-B", соответственно (Yang et al., 2002). Одна пара специфичных праймеров SCARmt01F и R при ПЦР дала кодоминантные фрагменты, различающие генотипы ЦМС линии и линии закрепителя (рис.17). Амплифицируемые фрагмент у всех линий закрепителей был немного длиннее, чем у ЦМС линий.
Рис.19. Образцы ПЦР - амплификации праймером SCARmt01. S - ЦМС. N - закрепитель
Результаты секвенирования показали, что фрагмент ДНК у линии закрепителя (IR68897-B) на 6-7 п. н. длиннее, чем у ЦМС линий. Сравнение секвенированной последовательности локуса SCARmt01 у ЦМС линии “Neda-A" с последовательностями ДНК базы данных ГенБанк показало, что данная последовательность почти полностью (96%) гомологична участку митохондриальной последовательности риса линии 93-11 (подвида indica) и линии Nipponbare (подвида japonica).
Выявление молекулярных маркеров генов восстановления фертильности риса. С целью выявления полиморфных молекулярных маркеров, сцепленных с Rf-генами, первоначально была проведена ПЦР - амплификация ДНК восьми генотипов (Neda-A, IR24, IR28, IR36, IR62030, IR60966, Amol1 и Amol2) с использованием 2-х SSR-праймеров, имеющих сцепление с Rf3 и Rf4 генами. SSR маркер RM1 имеет сцепление с Rf3 геном на коротком плече 1-ой хромосомы (He et al., 2002), а RM171 с Rf4 на длинном плече 10-ой хромосомы (Jing et. al, 2001). Оба праймера детектировали полиморфизм между ЦМС линией (Neda-A) и 7 фертильными линиями. Для проведения первоначального анализа, индивидуальные растения F2 разделяли на две группы, состоящие из десяти растений каждая (BSA - анализ). При этом, группы растений различаются между собой по аллелям исследуемого гена, распределение же остальных признаков в пределах группы - случайное. Результат этого первоначального тестирования показал, что SSR - маркер RM1 в популяциях Neda-A/IR36 и Neda-A/IR60966, сцеплен с Rf3 геном на коротком плече 1-ой хромосомы, а RM171 - с Rf4 в популяциях Neda-A/IR24, Neda-A/IR28, Neda-A/Amol1 и Neda-A/Amol2 на длинном плече 10-ой хромосомы. Высокоразрешающее картирование региона гена Rf4. Так как Rf4 ген был картирован между двумя маркерами RM171 и RM304, нами выбраны допольнителные SSR - маркеры на генетической карте риса [McCouch et al., 2002] и разработаны новые праймеры на основе последовательностей EST - и RFLP-маркеров в этом регионе. Праймеры (SPRFA01-03), созданные на основе последовательности ранее клонированого гена Rf1A, не выявляли полиморфизма между родительскими линиями даже после рестрикции с 14 рестриктазами (CAPS-маркеры). Кроме того, два других RFLP - маркера (S10019 и S12564) не обнаруживали полиморфизм между двумя родительскими линиями. BSA-анализ показал, что один SSR маркер, RM6737, находится в этом регионе и был тесно сцеплен с Rf4 геном на расстоянии 1.6 сМ. Кроме вышеупомянутых маркеров, два разработанных нами праймера на основе последовательности AB110443 (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/), AB443 F и R, амплифицировали два полиморфных фрагмента ДНК, специфичных для стерильной линии, размерами ~400 и ~500 п. н., соответственно. Они были тесно сцеплены с рецессивным rf4-аллелем (рис.18) на расстоянии ~0.5 и 1.03 сМ, соответственно. Эти два маркера локализованы на теломерной стороне между RM171 и геном Rf4.
Рис.20. Высокоразрешающее картирование Rf4 гена на длинном плече 10-ой хромосомы риса
Физическая локализация гена Rf4. Для определения физической локализации Rf4 - гена и сцепленных с ним маркеров использовали программу BLASTN (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/blast/Genome/PlantBlast. shtml? 5) в базе данных геномной последовательности ДНК сорта 93-11 (http://rise. genomics.org. cn/rice/index2. jsp).
Этот поиск дал возможность идентификации контигов, несущих сцепленные с Rf4 маркеры, от SSR - маркера RM6737 на одной стороне (центромерной) до маркера AB443 на другой (теломерной).
Сравнение последовательностей праймеров SSR - маркера RM6737 и праймеров AB443 с последовательностью ДНК сорта 93-11 показало, что последовательности праймеров RM6737 находятся в контиге Ctg030205, а последовательности праймеров AB443 - в Ctg030228. Физическая карта, построенная на основе этих данных состояла из 15 контигов, охватывая ~206 т.п. н подвида indica риса.
Так как общей характерной особеннотью Rf-генов растений является кодирование пентатрикопептидного (PPR) белка, имеющего в своём N-конце последовательность, необходимую для транспорта в митохондрию [Bentolila et al., 2002; Akagi et al., 2004], этот регион был проанализирован на наличие таких генов программами MitoProt II (http://ihg. gsf. de/ihg/mitoprot.html) и Pfam 11.0 (http://www.ncbi. nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi). Результаты этого анализа показали, что среди ~45 генов в этом регионе, только пять генов, включая OsIFCC036677, OsIFCC036680, OsIFCC036693, OsIFCC036694 и OsIFCC036695на контигах Ctg30207, Ctg30216, Ctg30225, Ctg30225 и Ctg30227, соответственно, удовлетворяли критериям характерным для Rf - генов (рис. 19).
Рис. 21. Структура фрагмента ДНК, несущего маркеры, сцепленные с Rf4 - геном на 10-ой хромосоме подвида риса indica
В нашем исследовании молекулярные маркеры, сцепленные с геном восстановления фертильности ЦМС WA-типа риса, были успешно идентифицированы и картированы на длинном плече 10-ой хромосомы с использованием SSR-маркеров и разработанных нами праймеров в комбинации с BSA-анализом. Сравнение разных молекуляных карт сцепления маркеров показывает, что три гена восстановления фертильности 3-х ЦМС-типов (BT, HL и WA) тесно сцеплены на длинном плече 10-ой хромосомы риса. Однако, как показано в нашей работе, три пары праймеров, разработаные на основе последовательности гена Rf1A не выявили полиморфизм между исходными родителями даже после обработки с 14 рестриктазами. Поскольку данный ген является функциональным для ЦМС BT-типа, т.е. линии, несущие Rf1A восстановливают фертильность ЦМС BT, а не ЦМС WA (например, линия MTC-10R, несущая данный ген, восстановливает фертильность только для ЦМС BT; [Akagi et al., 2004]), можно отметить, что ген восстановления фертильности ЦМС WA отличается от гена Rf1A.
3.1.2 ДНК-маркеры для изучения ЦМС у Brassica
Для исследований были взяты фертильные и стерильные растения капусты пекинской B. pekinensis (Lour) Rupr., капусты абиссинской (горчицы эфиопской) В. carinata A. Braun, турнепса B. rapa L. var. rapa (L) Thell., капусты цветной B. oleracea convar. botrytis (L) Alef. var. botrytis L., капусты белокочанной В. oleracea L. convar. capitata L. Alef. var. capitata L. f. alba DC, горчицы сарептской B. juncea (L) Czern., брюквы B. napus L. var. napobrassica (L) Rchb., редиса Raphanus sativus L. var. radicula Pers., рапса B. napus L. ssp. oleifera (Metzg) Sinsk. В опыте использовались стерильные растения как с типом ЦМС ogura, так и с неизвестным типом. Для изучения молекулярной структуры митохондриальной ДНК фертильных и стерильных форм растений использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). На основании литературных данных о нуклеотидных последовательностях, специфичных для того или иного типа ЦМС, были синтезированы 12 пар праймеров. Для ПЦР анализа на тип ЦМС Ogura использовали семь пар праймеров, специфичных на данный тип стерильности - Og1 и Og2, ogu-5' и ogu-3', orf138-5' и orf138-3', orf138-F1 и orf138-R, orf138-F2 и orfB-R1, orfB-F и orfB-R2, TRNAFM-F и TRNAFM-R (Motegi et al., 2003; Giancola et al., 2007). При проведении ПЦР с этими праймерами амплифицировались фрагменты ДНК ожидаемых размеров. В результате было выявлено, что у образца с неизвестным типом ЦМС, спонтанно возникшей в результате межвидовой гибридизации, амплифицируется ДНК только с прамерами на Ogura тип ЦМС. Клонирование и секвенирование полученных продуктов подтвердило их полную гомологию с митохондриальной ДНК специфичной для Ogura типа ЦМС.
3.2 Создание ДНК маркеров генов устойчивости на основе данных сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей устойчивых и неустойчивых генотипов
Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов устойчивости. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре локусов генов устойчивости у устойчивых и чувствительных к фитопатогену генотипов. Сравнительный анализ и изучение организации кластеров и локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов в пределах одного вида проливает свет на эволюцию формирования устойчивости к различным фитопатогенам. Информация о структуре локусов у неустойчивых форм растений, аналогичных таковым у устойчивых генотипов, дополнит наши знания о строении и функциях доменов, свойственных генам устойчивости. В нашем исследовании был проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав I2 и Ve, у неустойчивых форм томата.
3.2.1 Создание ДНК маркера на основе данных анализа локуса I2 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата
Для сравнительного анализа локуса I2 у устойчивых и неустойчивых к фузариозу генотипов томата были использованы два праймера UP78 и LF79. Праймеры были синтезированы на основании нуклеотидной последовательности ранее клонированного гена I2C-2 (Ori N. etal., 1997). При проведении ПЦР с данными праймерами синтезировались ПЦР-продукты размером около 1100 п. н. Причем фрагменты одинакового размера синтезировались как на устойчивых, так и на неустойчивых генотипах. Для выявления полиморфизма между устойчивыми и неустойчивыми к фузариозу генотипами томата, ампликон был обработан ретриктазами. При гидролизе ПЦР-продукта рестриктазой Acc I были выявлены отличия между устойчивыми и неустойчивыми генотипами. При анализе рестрикционной картины было выявлено, что сумма размеров рестрикционных фрагментов у устойчивого генотипа значительно превышает размер ПЦР-продукта до рестрикции. Нами было сделано предположение, что с помощью данной пары праймеров синтезируются ПЦР-продукты с нескольких генов-гомологов, входящих в состав кластера I2, и каждый из них имеет свои сайты рестрикции для рестриктазы Acc I. Важно отметить, что структура локуса I2 у устойчивых генотипов достаточно хорошо изучена, и данный локус перенесен в S. lycopersicum из дикого вида S. pimpinellifolium (Segal et al., 1992; Ori N. et al., 1997; Simons et al., 1998; Sela-Buurlage et al. 2001; Couch, 2006). С другой стороны, структура аналогичного локуса у S. lycopersicum не изучена, и остается неизвестным, какие гены-гомологи входят в его состав у неустойчивых генотипов. Анализ клонированных ПЦР-продуктов показал, что с праймерами UP78-LF79 на гомозиготных устойчивых растениях синтезируются два гена гомолога из локуса I2. Один из гомологов имеет два сайта рестрикции для рестриктазы Acc I, а второй не имеет сайтов рестрикции для этой рестриктазы. Секвенирование показало, что один из клонированных генов-гомологов имеет высокую степень гомологии к ранее изученному гену I2C-5 (Simons, G. et al., 1998), входящему в состав локуса I2 S. pimpinellifolium и, также как и ген I2C-5, не имеет сайта рестрикции Acc I в исследованном регионе. Второй клонированный ген-гомолог хотя и имеет высокую степень идентичности к ранее клонированным генам из локуса I2, является уникальным по наличию одного сайта рестрикции Acc I, а также по его положению. Ни один из ранее изученных генов-гомологов локуса I2 не имел сайта рестрикции в положении, характерном для клонированного нами участка ДНК из локуса, аналогичного I2.
Таким образом, нами впервые было показано, что в состав локуса I2 у S. lycopersicum входит, по меньшей мере, два гена-гомолога. Один из них имеет высокую степень сродства к ранее клонированному гену I2C-5, и, возможно, данный ген входит в состав кластера у неустойчивой формы. Второй клонированный нами фрагмент ДНК является ранее неизвестной, уникальной последовательностью ДНК, входящей в состав локуса I2.
На основании обнаруженных различий в строении локуса I2 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата, нами был разработан ДНК-маркер устойчивости томатов ко 2-й расе фузариоза. Созданный ДНК-маркер является кодоминантным, т.е. позволяет выявлять скрытых носителей неустойчивого аллеля - гетерозиготные по данному признаку генотипы. Еще одной важной особенностью предложенного нами маркера является то, что маркерная последовательность находится внутри локуса I2. Таким образом, исключается несцепленное наследование ДНК-маркера и признака.
3.2.2 Создание ДНК-маркера на основе данных анализа локуса Ve у устойчивых и неустойчивых генотипов томата
Для сравнительного анализа локуса Ve у устойчивых и неустойчивых
форм томата, нами были синтезированы две пары праймеров (VVF1+VVR1; VVF2+VVR2), которые позволяют амплифицировать участок гена Ve1 (Kawchuk, 2001) протяженностью около 1500 п. н. Данный участок расположен в начале гена. В результате ПЦР с синтезированными праймерами и на устойчивых, и на неустойчивых генотипах были получены ампликоны одинакового размера. Таким образом, можно сделать вывод, что у неустойчивых генотипов томата локус в целом присутствует, однако его функциональность нарушена в результате изменений на молекулярном уровне. Так как явных различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами непосредственно после ПЦР выявить не удалось, было проведено клонирование ПЦР-продуктов, полученных на устойчивой и неустойчивой формах томата. Анализ нуклеотидных последовательностей клонированных участков гена Ve показал высокую степень гомологии по данному локусу между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата. Поиск последовательностей с высокой гомологией к клонированным фрагментам в базе данных GenBank дал схожие результаты на устойчивом и неустойчивом к вертициллезу генотипах. Как и ожидалось, была обнаружена высокая степень гомологии к ранее клонированным генам Ve1 и Ve2. Анализ нуклеотидных последовательностей полученных клонов не выявил никаких крупных (делеций, инсерций, дупликаций) различий между локусами Ve устойчивых и неустойчивых форм томата. Следующим шагом нашей работы был поиск полиморфизма по сайтам рестрикции в этом локусе между устойчивым и неустойчивым генотипами. Обнаружение такого полиморфизма позволило бы создать молекулярный маркер непосредственно на ген Ve. При анализе ПЦР-продукта, полученного с парой праймеров VVF1+VVR1, полиморфизма по сайтам рестрикции между устойчивым и неустойчивым генотипами нами обнаружено не было. ПЦР-продукты, полученные с парой праймеров VVF2+VVR2, были также проверены на полиморфизм по сайтам рестрикции на устойчивых и неустойчивых генотипах. Одна из рестриктаз - Xba I - позволила выявить различия между устойчивыми и неустойчивыми к вертициллезу формами томата. Было выявлено, что в регионе, амплифицируемом с помощью указанной пары праймеров, у неустойчивого генотипа имеется один дополнительный сайт рестрикции для рестриктазы Xba I по сравнению с устойчивым генотипом. Такой сайт возникает благодаря однонуклеотидной замене в последовательности ДНК, в результате чего появляется новый стоп-кодон.
Таким образом, нами показано, что в локусе Ve у неустойчивых генотипов томата (S. lycopersicum) находятся последовательности ДНК, имеющие высокую степень гомологии к ранее изученным генам Ve1 и Ve2, расположенным в аналогичном локусе устойчивых форм. В данном регионе нам удалось выявить полиморфизм по сайту рестрикции Xba I между устойчивыми и неустойчивыми формами томата. На основании выявленного полиморфизма был создан эффективный кодоминантный ДНК-маркер (Рис. 20).
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 21. Рестрикция ПЦР-продуктов с рестриктазой Xba I (1 - Мегана (устойчивый гомозиготный); 2 - Moneymaker (неустойчивый); 3 - Белый налив (неустойчивый); 4 -Ампаро (устойчивый гомозиготный); 5 - Indiko (гетерозигота); 6 - Durason (гетерозигота); 7 -Pitenza (гетерозигота).
Примененный нами методологический подход - сравнительный анализ локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых к фузариозу и вертициллезу генотипов томата - позволил нам выявить нуклеотидные последовательности новых генов-гомологов у неустойчивых форм томата. Анализ данных локусов у неустойчивых форм томата был проведен впервые. На основании выявленных нами различий между устойчивыми и неустойчивыми генотипами томата по локусам устойчивости к фузариозу и вертициллезу созданы новые эффективные ДНК-маркеры, а на их основе ДНК-диагностикумы. Эти диагностикумы были испытаны на расщепляющихся популяциях и продемонстрировали высокую эффективность при оценке селекционного материала на наличие генов устойчивости к фитопатогенам. Применение таких диагностикумов позволяет снизить затраты и сократить сроки создания устойчивых форм томата в два раза.
3.3 Использование межмикросателлитного полиморфизма для создания ДНК маркеров
Для создания ДНК-маркера на пол хмеля обыкновенного был использован метод анализа межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR-PCR), который продемонстрировал высокую эффективность в ранее проведенных нами исследованиях на этой культуре. Двадцать два ISSR праймера были применены для амплификации ДНК на 53 женских и 33 мужских образцах растений хмеля различного географического происхождения. В результате два праймера после амплификации продемонстрировали специфичные бенды для мужских растений. Эти бэнды были клонированы и секвенированы. На основе этих сиквенсов были созданы пол-специфичные STS маркеры (Рис.21).
Рис.22. Результат амплификации STS-маркеров STS-K10 (a) и STS-K22 (b) на мужских и женских образцах хмеля обыкновенного.
4. Выбор оптимального высокопроиз-водительного метода выделения ДНК
Для проведения массового скрининга растительного материала с использованием ДНК-маркеров требуются удобные и высокопроизводительные методики выделения ДНК. Нами были протестированы семь методов выделения ДНК на 8 культурах. В результате часть методик демонстрировала воспроизводимые результаты только на отдельных культурах. В связи с низким содержанием полифенольных соединений и других ингибиторов полимеразной цепной реакции в растительном материале огурца, на этой культуре возможно применение упрощенной методики выделения ДНК, основанной на инкубации материала в слабом растворе щелочи с последующей нейтрализацией его соляной кислотой. Следует отметить, что на этой культуре амплификацию специфичных продуктов отмечали и при экстракции ДНК кипячением в стерильной воде. Однако в целом для всех культур наилучшие результаты показал экспресс-метод выделения ДНК с наличием в экстракционном буфере SDS.
5. Автоматизация анализов
При массовых анализах стадия электрофореза, необходимая для визуализации результатов ПЦР, остается достаточно трудоемкой, занимает до половины времени, необходимого для скрининга популяций, расщепляющихся по маркируемому признаку. Избежать данную стадию, а также автоматизировать детекцию и хранение результатов и предотвратить контаминацию ПЦР-продуктом, позволяет метод флуоресцентного маркирования, основанный на применении молекулярных беконов.
Нами был синтезирован зонд на нуклеотидную последовательность, отсутствующую у неустойчивых форм растений, который используется в комбинации с ранее подобранными праймерами VF+VR (рис.22). В ходе ПЦР, при наличии устойчивого аллеля, зонд гибридизуется на ДНК-мишени и разрушается Taq-полимеразой, в результате чего флуоресцентная метка освобождается, и мы можем детектировать излучение определенной длины волны.
Рис.23. Сайты гибридизации праймеров (зеленый) и флуоресцентного зонда (красный) в локусе Ve томата.
На рисунке 23 представлены результаты детекции флуоресценции на приборе "Джин". Высокий уровень сигнала по каналу FAM ("Специфика") указывает на то, что в исследуемом образце присутствует доминантный аллель гена устойчивости томата к вертициллезу. Уровни сигнала представлены графически в правой части окна программы. Образцы, несущие признак устойчивости к вертициллезному увяданию, отмечаются знаком "+" в колонке "Результат", образцы, чувствительные к заболеванию, отмечаются знаком "НД" ("нет детекции") в той же колонке. В качестве фоновых по уровню флуоресценции образцов, используется та же реакционная смесь, что и для других образцов, но без добавления матричной ДНК. Это позволяет избежать ложных результатов, вследствие спонтанного разрушения зонда Taq-полимеразой.
Рис.24. Результаты детекции флуоресценции у устойчивых и неустойчивых к вертициллезу форм томата.
Заключение
Нами продемонстрированы возможности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических подходов для создания селекционного материала растений с заданными свойствами. Эффективность применения таких методов зависит от каждого конкретного случая и напрямую связана с возможностью ускорения селекционного процесса. Стратегия применения должна основываться на надежности, эффективности, информативности и взаимодополняемости вышеуказанных подходов, а также базироваться на достижениях в геномике и биоинформатике. При этом в программах с использованием методов отдаленной гибридизации на первых этапах главную роль могут играть современные молекулярно-цитогенетические методы исследований.
Выводы:
Адаптированная методика геномной in situ гибридизации позволяет идентифицировать геномный состав межвидовых гибридов лилий, получаемых с использованием 2n-гамет. Установлен механизм формирования 2n-гамет основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). С использованием разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации для лилий впервые установлена возможность создания трехгеномных гибридов (2n=36). Показана возможность преодоления стерильности межвидовых гибридов лилий и получения форм с различным геномным составом при использовании образцов формирующих 2n-гаметы.
Оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяет проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале.
Высокоповторяющиеся геномспецифичные последовательности ДНК на примере GenBR-1 (специфичного для генома В) могут быть использованы в качестве молекулярно-цитогенетических маркеров геномов капустных.
Высокоповторяющиеся последовательности ДНК Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов являются эффективными молекулярно-цитогенетическими маркерами для изучения организации геномов растений. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Прицентромерная локализация ретротранспозонов указывает на невысокую эффективность ДНК маркеров создаваемых на их основе для маркирования хозяйственно - ценных признаков томата. В тоже время для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением C-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.
Клонирована высокоповторяющаяся последовательность ДНК хмеля - размером 378 п. о., которая является эффективным цитогенетическим маркером для идентификации половых хромосом хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на аутосомах. Для Х и Y хромосом выявлено характерное распределение сайтов гибридизации. Поиск в геномных базах данных не выявил гомологий с ранее клонированными последовательностями ДНК.
Установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.
Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри - и межвидовой гибридизации, а также форм растений с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR-маркеров создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.
Созданы эффективные SCAR маркеры для выявления пола растений хмеля.
Идентифицированые молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса и молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, могут быть использованы в селекционных программах по созданию гибридного риса.
Клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.
Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа локусов генов устойчивости устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Сравнительный анализ ДНК последовательностей показал высокую степень гомологии между нуклеотидными последовательностями локусов Ve и I2 у устойчивых и неустойчивых генотипов томата. У аллеля i2 неустойчивого генотипа S. lycopersicum выявлены последовательность, имеющая высокую степень гомологии к гену I2C-5, и ранее неизвестная последовательность ДНК, гомологичная гену I2 S. pimpinellifolium. Создан ДНК маркер гена устойчивости к фузариозному увяданию томата. Выявлен полиморфизм по сайту рестрикции рестриктазы Xba I между аллелями гена Ve устойчивых и неустойчивых генотипов и на основании данного полиморфизма создан кодоминантный CAPS - маркер.
Установлено наличие Ogura-типа ЦМС, возникшей в растениях капусты пекинской Brassica pekinensis Jusl, в результате межвидовой гибридизации с турнепсом и капустой абиссинской.
Подобные документы
Фенотипические последствия гибридизации животных. Молекулярные методы определения видов. Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila. Разработка специфических праймеров для полимеразной цепной реакции. Особенности секвенирования по Сэнгеру.
дипломная работа [3,7 M], добавлен 25.06.2017Характеристика крупного рогатого скота айрширской и голштинской породы. Молекулярно-генетические маркеры. Структура белка лептина и его физиологические функции у коров. Выявление особенностей селекции животных по признаку функционального долголетия.
дипломная работа [776,4 K], добавлен 10.11.2015Применение клеточных технологий в селекции растений. Использование методов in vitro в отдаленной гибридизации. Работы по культивированию каллуса с целью получения нового селекционного материала. Гибридизация соматических клеток и ее основные результаты.
реферат [28,6 K], добавлен 10.08.2009Способность организмов передавать свои признаки и особенности развития потомству на молекулярно-генетическом уровне. Изменчивость наследственного материала. Процесс возникновения мутаций. Результаты, причины и значение генетических мутаций у человека.
презентация [21,5 M], добавлен 03.10.2014Научное определение жизни по Ф. Энгельсу. Молекулярно-генетический, организменный, популяционно-видовой уровень организации жизни. Прокариоты как одноклеточные доядерные организмы. Строение метафазной хромосомы. Уровни упаковки генетического материала.
реферат [30,3 K], добавлен 29.05.2013Исследование механизмов передачи генетического материала и создание новых способов генетического картирования. Перенос генетического материала с помощью плазмид, с помощью рекомбинации и посредством трансдукции. Генетическое картирование актиномицетов.
реферат [25,9 K], добавлен 15.12.2010Молекулярно-генетические гипотезы старения. Феномен долгожителей горных народов культурными и средовыми факторами. Понятие геронтологии и гериатрии, возрастные изменения. Прогерия, симптомы заболевания. Критерии оценки биологического возраста человека.
презентация [1,8 M], добавлен 21.02.2014Фундаментальные свойства живого: наследственность и изменчивость. История формирования представлений об организации материального субстрата наследственности и изменчивости. Свойства генетического материала и уровни организации генетического аппарата.
дипломная работа [2,8 M], добавлен 30.07.2009Этапы проведения экспериментов по переносу генетического материала, применение технологий для изучения процессов дифференцировки, канцерогенеза. Условия культивирования клеток. Виды и назначение селекции. Перенос генов, опосредованный хромосомами и ДНК.
учебное пособие [25,1 K], добавлен 11.08.2009Изучение химических основ наследственности. Характеристика строения, функций и процесса репликации рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот. Рассмотрение особенностей распределение генов. Ознакомление с основными свойствами генетического кода.
контрольная работа [38,4 K], добавлен 30.07.2010
