Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF кb) в чувствительных нейронах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора каппа В (NF-кB) в чувствительных нейронах

03.03.04. - клеточная биология, цитология, гистология

На правах рукописи

Гущина Светлана Валентиновна

Саранск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" и в Центре нейронаук Университета Лондона

Научные консультанты:

доктор медицинских наук

академик РАМН, профессор Волкова Ольга Васильевна

доктор биологических наук,

профессор Кругляков Павел Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ермолин Игорь Леонидович

доктор медицинских наук,

профессор Челышев Юрий Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Швалев Вадим Николаевич

Ведущая организация: Научный центр неврологии РАМН

Защита состоится "_15_" октября 2010 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.01 при ГОУ ВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева" (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева" (430000, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68).

Автореферат разослан "_______" ________________ 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор В.П. Балашов

Содержание

• 1. Общая характеристика работы
• 2. Материалы и методы исследования
• 3. Анализ экспрессии трансгена
• 3.1 Метод ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (Reverse Transcription, RT-PCR)
• 3.2 Метод гибридизации in situ (in situ hybridization)
• 3.3 Статистическая обработка данных
• 4. Результаты собственных исследований и их обсуждение
• Выводы
• Список работ, опубликованных по теме диссертацииэ

1. Общая характеристика работы

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Посттравматические молекулярные изменения зрелых чувствительных нейронов крыс породы Вистар включают в себя изменения уровня экспрессии ряда NF-кB -зависимых генов и ДНК -связывающей активности NF-кB in vivo и in vitro.

2. Созданная генетически модифицированная линия мышей Thy*IкBб-SI проявляет специфическую нейрональную экспрессию суперингибитора NF-кB.

3. Травма седалищного нерва in vivo и стимуляция культуры чувствительных нейронов TNF-б in vitro вызывает транслокацию р65 иммунореактивности в ядро нейронов у мышей дикого типа, в то время как трансгенная линия Thy*IкBб-SI мышей проявляет пониженную способность NF-кB к перемещению в ядро при повреждении периферического нерва in vivo и активации цитокинами in vitro.

4. Трансгенное ингибирование активности NF-кB в зрелых нейронах модифицированных мышей не влияет на основные физиологические параметры и посттравматическую выживаемость зрелых чувствительных нейронов in vivo.

5. Мониторинг экспрессии репортерного гена в NF-кB/LacZ трансгенной линии мышей, отражающей реальную транскрипционную активность NF-кB, показывает ее отсутствие как в интактных, так и в посттравматических нейронах спинномозговых ганглиев in vivo, в отличие от нейронов ЦНС.

6. Активность сигнальных путей NF-кB в чувствительных нейронах регулируется процессами ацетилирования/деацетилирования, и отсутствие влияния NF-кB в зрелых нейронах спинальных ганглиев объясняется процессами деацетилирования, подавляющими транскрипционную активность ядерного фактора.

Научная новизна. Несмотря на обилие в мировой литературе данных, показывающих важную роль ядерного транскрипционного фактора кB (NF-кB) в процессах нейродегенеративных состояний нервной системы, публикации, посвященные практическим вопросам создания и экспериментального применения моделей животных с генетически модифицированной активностью NF-кB специфически в зрелых нейронах, единичны. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно ингибируется активность NF-кB в зрелых нервных клетках in vivo. Для создания модели Thy*IкBб-SI была использована мутантная форма ингибитора NF-кB - IкBб-SI, которая не подвержена деградации и поэтому действует как супер-репрессор NF-кB активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-кB/RelA комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. Результаты анализа показали, что ген мутантной формы ингибитора NF-кB успешно экспрессируется исключительно в нейронах трансгенных мышей. Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что Thy-1.2-промотор, под регуляторным действием которого находится ген суперингибитора NF-кB, активируется строго специфически в зрелых нейронах трансгенных мышей на 8 день постнатального развития и не затрагивает механизмы нейронального развития.

С помощью созданной нами модели впервые показано, что трансгенное репрессирование NF-кB не влияет на основные физиологические свойства чувствительных нейронов in vivo, а также на их количество в спинномозговых ганглиях в норме и не ведет к изменениям выживаемости нейронов после травмы периферического нерва in vivo.

В данной работе предлагается также новый подход к регистрации транскрипционной активности NF-кB in vivo с использованием трансгенной репортерной линии мышей NF-кB/LacZ. Полученные данные впервые показывают, что даже при активации NF-кB-ДНК-связывающей активности в чувствительных нейронах, реальная транскрипционная активность может быть репрессирована действием гистоновых деацетилаз.

Практическое и теоретическое значение работы. Важность данной работы для фундаментальной науки и практической медицины обусловлена необходимостью понимания молекулярных и генетических программ, контролирующих процессы выживаемости нейронов и нейрональной регенерации. Результаты исследования позволяют расширить представления о сложноорганизованной системе регуляции транскрипционного фактора NF-кB в чувствительных нейронах. Выявленный молекулярный механизм, опосредованный гистоновыми деацетилазами объясняет транскрипционную репрессию NF-B в нейронах спинномозговых ганглиев, что позволяет говорить об ограничении функций NF-B in vivo в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

Результаты наших исследований указывают на необходимость дальнейших изысканий в области раскрытия роли транскрипционных механизмов в нейрональной репарации. Так, необходимо более детально изучить процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.

Использование созданной линии мышей Thy*IкBб-SI в экспериментальных моделях травмы, стресса и др. дает широкую возможность для изучения биологической роли NF-кB в зрелых нейронах как центральной, так и периферической нервной системы.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую работу и учебный процесс кафедры гистологии и эмбриологии педиатрического факультета Российского государственного медицинского университета, кафедры гистологии Московской медицинской академии им. Сеченова, и служат обоснованием для продолжения исследования молекулярных механизмов регуляции нейродегенеративных/нейрорегенеративных процессов при травмах периферического нерва, а также головного и спинного мозга.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, в том числе на William Harvey Day Conference (Queen Mary's School of Medicine and Dentistry, University of London (Великобритания, Лондон, 2003, 2004, 2005), международной конференции Society for Neuroscience, 34^th Annual Meeting San Diego (США, Сан-Диего, 2004), Всероссийской конференции "Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток" (Самара, 2008), международной конференции "Проблемы современной морфологии человека" (Москва, 2008), VI съезде ВНОАГЭ (Саратов, 2009)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ в отечественной и зарубежной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 253 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы, включающего 345 источников. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 5 таблицами.

2. Материалы и методы исследования

Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. Для эксперимента in vivo оперированные крысы были убиты через 6, 12, 24, 48 часов и 1 неделю после перерезки седалищного нерва. Два пула L_IV-L_V спинномозговых ганглиев (оперированной и контралатеральной сторон) были собраны вместе для последующей экстракции РНК, которую в эксперименте in vitro осуществляли из первичной культуры чувствительных нейронов (контрольной и после соответствующей TNF-б-стимуляции).

Для экстракции РНК использовали метод с тризолом (The TRIzol protocol, "Life Technologies", США). Для определения количества выделенной РНК 1 мкл растворенной РНК брали для обработки на спектрофотометре (Biorad SMARTSPECTRUM 3000, CA, США). Оставшийся раствор РНК хранили при -70 ^оС до дальнейшего использования.

Обратную транскрипцию осуществляли в амплификаторе ("Biometra", Дания) с использованием фермента обратной транскриптазы (The SuperScript^TM III RNAase H Reverse Transcriptase, "Life Technologies", США) следуя протоколу, предоставленному компанией-производителем. Режим инкубации: 5 мин при 25 ^оС, 60 мин при 50 ^оС, 15 мин при 70 ^оС После окончания реакции пробирки с реакционной смесью хранили при -70 ^оС.

Выбор праймеров для ПЦР проводили на основании данных GeneBank. Для дизайна праймеров были использованы известные последовательности генов: для гена IкBб крысы - номер в каталоге GeneBank XM_234230, для гена MCP-1 крысы - NM_031530. Праймеры и пробы для генов IкBб и MCP-1 были разработаны с помощью программы "Primer 3" в соответствии с требованиями, представленными компанией "Corbett research" (Австралия). Праймеры были изготовлены в компании "Invitrogen" (Великобритания), TaqMan-проба для гена IкBб - в компании "MWG-Biotech AG" (Великобритания) и для гена MCP-1 крысы - в компании "Applied Biosystems" (Великобритания). Нуклеотидные последовательности использовавшихся праймеров (прямой/обратный) в направлении 5' - 3' приведены ниже: IкBб - TGAGGAGAGCTATGACACGG (5`-primer) и TGGCCTCCAAACACACAGT (3'-primer) и TaqMan-пробы соответственно CACGGAAGATGAGTT-CCCTACGA; MCP-1 - CACTCACCTGCTGCTACTC (5'-primer) и CTGCTGCTGGTGATTCTCTT (3'-primer) и TaqMan-пробы соответственно TCCCAATGAGTCGGCTGGAGAA.5'-конец каждой пробы и 18S-рРНК-контроля были помечены флуоресцентными метками FAM и VIC соответственно, тогда как 3'-концы - гасителем флуоресценции TAMRA.

Количественная ПЦР в реальном времени. Экспрессию генов IB и MCP-1 изучали в каждом пуле спинальных ганглиев:

1) относящихся к левому перерезанному седалищному нерву,

2) контралатерально располагающихся.

3) контрольных и 4) TNF-б-стимулированных пулах культуры чувствительных нейронов. Количественную ПЦР в реальном времени проводили одновременно для всех экспериментальных образцов с использованием одинаковых условий и компонентов. Все образцы загружали в трехкратном повторении. Для качественной оценки уровня экспрессии исследуемых генов в каждой реакции одновременно использовали сравнение с уровнем экспрессии референсного гена - 18S-рРНК-контроль.

Для построения контрольной стандартной кривой 5 разведений сDNA селезенки включали в каждую реакцию. Наиболее концентрированным считалось кДНК селезенки (1: 0). Каждая последующая концентрация достигалась разведением 1: 10 предыдущего стандарта. При этом во все серии реакций включали безматричный контроль, в котором экспериментальный образец заменяла вода. Все образцы, стандарты и безматричный контроль загружали в трехкратном повторении в каждой серии ПЦР в реальном времени. Для контроля каждой реакции использовали праймеры и пробы референсного гена 18S-рРНК.

2 мкл матрицы добавляли к следующей смеси: 1,5 мкл IкBб-праймера 1; 1,5 мкл IкBб-праймера 2; 1 мкл IкBб TaqMan-пробы; 0, 25 мкл 18S-рРНК-праймера 1; 0, 25 мкл 18S-рРНК-праймера 2; 0, 25 мкл 18S-рРНК TaqMan-пробы; 25 мкл TaqMan Universal PCR Master Mix No AmpErase UNG ("Abgene", Германия) и 16,25 мкл очищенной от нуклеаз H₂O. Образцы помещали в амплификатор в реальном времени (the Rotogene 3000 quantitative real-time PCR machine, "Corbett Research", Австралия) и задавали следующую программу нагрева: 10 мин при 95 ^оС (для активизации Hot-Start Tаq-фермента), 1 мин при 60 ^оС (для стимуляции и обнаружения флуоресценции), 15 с при 95 ^оС. Этот цикл повторялся 45 раз. По окончании эксперимента данные обрабатывали программой "Rotogene software. Version 4.6" ("Corbett Research", Австралия). Рассчитанная концентрация образцов (число копий/мкл) была нормализирована к концентрации 18S-рРНК. Полученную относительную величину использовали для определения количества продукта исследуемых генов в каждом образце.

Метод сдвига электрофоретической подвижности (EMSA - electrophoretic mobility shift assay). Для приготовления клеточного экстракта первичную культуру нейронов спинномозговых ганглиев (в концентрации 2 - 4 х10⁶) осаждали центрифугированием, отмывали охлажденным до 0 ^оС PBS и затем ресуспендировали в 200 мкл низкосолевого буфера (10 мМ HEPES, pH 7,9, 10 мМ KCl, 2 мМ MgCl₂, 0,1 мМ EDTA, 10 мМ NaF, 10 мМ Na₄P₂O₇, 2 мМ Na₃VO₄ с добавлением ингибиторов протеаз - 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл леупептина, 100 мM AEBSF).

Для приготовления клеточного экстракта спинальных ганглиев 6 из них объединили, суспендировали в 200 мкл низкосолевого буфера и гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора 15 раз. Подобную процедуру провели и с другими образцами (селезенка крысы, зрелый мозг крысы, мозг новорожденных крысят). После 15-минутной инкубации на льду добавляли NP40 в конечной концентрации 0,6% и в дальнейшем придерживались методике, описанной Yousaf с соавторами (2005).

Трансгенная линия мышей Thy*IкBб-SI

1. Генерация трансгенной линии мышей Thy*IкBб-SI.

Для создания трансгенной линии мышей Thy*IкBб-SI был использован мощный трансдоминантный ингибитор NF-кB (IкBб-SI) (Voll et al., 2000) , являющийся мультимутантной формой ингибиторного протеина IкBб. Суперингибитор NF-кB - IкBб-SI был включен в XhoI-участок специфической нейральной Thy-1.2-кассеты (Caroni, 1997) , обеспечивающей экспрессию трансгена строго в зрелых нейронах трансгенных животных (tg). В частности, IкBб-IR-кодирующий участок был амплифицирован из плазмиды IкBбRR (Voll et al., 2000) , с помощью прямой ПЦР, присоединивший фланкирующий сайт узнавания рестриктазы SalI к XhoI-участку Thy-1.2-кассеты. Праймеры для ПЦР: forward - 5'-gacgcgtcgacgcggccgccaccATGGACTACCCCTACGACGTC-CCCGACTAC-3', reverse: 5'-gacgcgtcgacgcggccgcTCATAACGTCAGACGCTGGCC-TCCAAACAC-3' (прописные буквы - последовательность, комплементарная кодирующему участку мутантной формы IкBб, подчеркнутые - сайт узнавания рестриктазы SalI, полужирные - сайт узнавания рестриктазы NotI). В реакции использовали фермент "Patinum Pfx DNA Polymerase" ("Invitrogen", Великобритания). Режим ПЦР: 94 ⁰C - 30 c, 50 ⁰C - 30 c, 72 ⁰C - 3 мин в течение 30 циклов.

Амплифицированный ДНК-фрагмент очищали с использованием набора "Qiagen-II agarose gel extraction method", разрезали с помощью SalI-эндонуклеазы и встраивали в комплементарный XhoI-участок Thy.1-кассеты. Полученную конструкцию Thy*IкBб-SI использовали для генерации трансгенных животных путем пронуклеарной микроинъекции генетической конструкции в зиготу гибридной линии CBAxC57BL/10. В поколении F1 обнаружили 7 позитивных животных, которых затем использовали для скрещивания с мышами линии СВА.3 трансгенные линии были получены и зарегистрированы в FESA (Frozen Embryo & Sperm Archive, MRC Harwell) как Tg (Thy-mutIkB) 74-3, - 5 и - 7.

2. Генотипирование мышей трансгенной линии Thy*IкBб-SI. Трансгенных животных генотипировали с помощью ПЦР, которая одновременно выявляла и трансген, и его эндогенный гомолог (см. рис.16, Б). Геномную ДНК выделяли из образца ткани уха животного с помощью набора реагентов "Direct PCR Lysis Reagent" ("Viagen Biotech, Inc", Великобритания) следуя протоколу компании, и подвергали амплификации методом ПЦР (Thermo-start High Performance PCR Master Mix ("Abgene", Великобритания)) (праймеры: 5'-TTGCCTGTGAGCAGGGCTGCCT-3' (Pr-1, forward) и 5'-GTCAGCTGGCCCAGCTGCTGCT-3' (Pr-2, reverse), режим нагрева: однократно 95 ⁰C в течение 15 мин и 30 циклов 95 ^оC - 30 с, 60 ^оC - 30 с и 72 ^оC - 90 с).

3. Анализ экспрессии трансгена

3.1 Метод ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (Reverse Transcription, RT-PCR)

У животных после ламинэктомии выделяли спинальные ганглии на уровне L_V, фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Каждый восьмой серийный срез (толщина 4 мкм) окрашивали метиленовым синим, подсчитывали количество чувствительных нейронов с видимыми ядрышками, как описано в работе Holmes с соавторами (2000).

Tрансгенная линия репортерных мышей NF-кB/LacZ

Tрансгенная линия репортерных мышей NF-кB/LacZ была создана и любезно предоставлена профессором Филипом Баркером (Мак-Гил Университет, г. Монреаль, Канада) и описана ранее Bhakar с соавторами (2002). Данные трансгенные репортерные мыши показывали конститутивную активность NF-кB в ЦНС как в период эмбрионального развития, так и в зрелом возрасте (Bhakar et al., 2002) .

Для генотипирования NF-кB/LacZ-мышей геномную ДНК выделяли из образцов хвостов трансгенных мышей по методике, предоставленной компанией-производителем набора для выделения ДНК ("Sigma", Великобритания). Трансгенных мышей, несущих конструкцию, описанную выше, идентифицировали методом ПЦР. Для реакции использовали праймеры к определенным участкам гена lacZ и следующим нуклеотидным последовательностям: к участку 595-572 (CTTCCAGATAACTGCCGTCAC-TCC) и к участку 70-92 (CTTAATCGCCTTGCAGC ACATCC).

Определение в-галактозидазы в тканях и первичной культуре чувствительных нейронов трансгенных репортерных мышей NF-кB/LacZ проводили методом окраски с X-gal, используя протокол, описанный в работе Bhakar с соавторами (2002).

Гистохимический анализ спинномозговых ганглиев.

Спинальные ганглии L_V анализировали для подсчета количества нормальных и апоптических нейронов методом TUNEL (the doxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labelling), используя набор реактивов и методику компании "Promega" (Великобритания).

Для детекции нейрональных антигенных маркеров использовали антитела к NPY (Affiniti Na1233, разведение 1: 2000) и к CGRP (Affiniti, CA1134, разведение 1: 3000).

Для анализа ядерной локализации NF-кB срезы спинальных ганглиев и культуру нейронов фиксировали с помощью параформальдегида (4%) и иммунногистохимию проводили согласно протоколу, описанному Herrmann с соавторами (2005), с использованием моноклональных специфических антител к субъединице p65 (Chemicon, MAB3026) и вторичных ослиных антимышиных антител, связанных с FITC (fluorescein isothiocyanate) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Для контроля специфичности антител одну серию срезов окрашивали в отсутствие первичных антител, которые были заменены раствором фосфатного буфера (PBS).

3.3 Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили в парных выборках, применяя t-критерий Стьюдента или two way ANOVA (GraphPads Prism). Для анализа использовали данные 4-6 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при р<0,05, n - число независимых экспериментов. В таблицах и на графиках данные представлены в виде М ± m, где М - среднее значение, m - ошибка среднего значения.

4. Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Анализ экспрессии NF-кB-зависимых генов в спинномозговых ганглиях in vivo и in vitro

Наиболее распространенный метод изучения активности сигнального каскада NF-кB - измерение уровней мРНК генов, содержащих NF-кB-связывающие сайты на промоторах. Анализ экспрессии генов, которые регулируются данным транскрипционным фактором, позволит понять, как функционируют сигнальные пути NF-кB и, возможно, обнаружить связи с другими сигнальными каскадами.

Методом количественной ПЦР в реальном времени была изучена экспрессия двух генов, которые известны как NF-кB-зависимые в различных типах клеток. Один из генов - IкBб, цитоплазматический ингибитор, который играет значимую роль в регуляции активности NF-кB. Другой ген - МСР-1 (monocyte chemoattractant protein-1 - протеин хемоаттракции моноцитов 1) - важный участник воспалительного процесса после травмы периферического нерва (Subang, Richardson, 2001) .

Для анализа экспрессии данных генов экстракцию РНК производили из спинальных ганглиев L_IV-L_V взрослых крыс, взятых в период от 6 часов до 8 дней после перерезки периферического нерва, а также из чувствительных нейронов, культивированных в течение 16 часов и стимулированных добавлением в питательную среду TNF-б в концентрации 10 нг/мл в течение от 10 минут до 2 часов. РНК была подвергнута обратной транскрипции, и число образованных копий мРНК IкBб и MCP-1 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени (quantitative Real-Time PCR). Контролем служила 18S-рибосомальная РНК (18S-рРНК).

Было обнаружено, что in vivo после травмы периферического отростка и in vitro после стимуляции TNF-б - активатором NF-кB в различных типах клеток нейроны спинальных ганглиев экспрессируют NF-кB-зависимые гены, такие, как MCP-1 и IкBб. Однако профиль изменений экспрессии этих NF-кB-зависимых генов и аккумуляции их мРНК в спинальных ганглиях был различен как после перерезки нерва in vivo, так и в культуре нейронов спинальных ганглиев после стимуляции их TNF-б in vitro.

После перерезки седалищного нерва повышенный уровень экспрессии MCP-1 мРНК наблюдался в поврежденных спинномозговых узлах уже к первым 6 часам после травмы и достигал максимальной величины, в 5 раз превышающей уровень экспрессии в контралатеральных узлах через 12 часов после аксотомии. Однако лишь двукратное увеличение уровня экспрессии IкBб мРНК наблюдалось в узлах через 24 часа после аксотомии.

Синтез и аккумуляция МСР-1 мРНК при TNF-б-стимуляции культуры спинномозговых нейронов были также более быстрые и интенсивные, чем IкBб мРНК при тех же условиях. Инкубация чувствительных нейронов в течение 1 часа с TNF-б повышала уровень IкBб мРНК в 5 раз, тогда как MCP-1 мРНК в 10 раз в сравнении с нестимулированными нейронами.

Таким образом, наши данные показывают, что изменения IкBб и MCP-1 мРНК имеют различную динамику в посттравматических спинальных ганглиях и в культуре чувствительных нейронов после TNF--стимуляции. Это отражает тот факт, что активирующиеся в клетке сигнальные каскады, которые регулируют экспрессию NF-кB-зависимых генов, возможно, различаются в условиях in vivo и in vitro. В научной литературе отмечается, что временные промежутки до начала индукции разных NF-кB-зависимых генов неодинаковы (Saccani et al., 2001) . Это может отражать факт участия других транскрипционных факторов, кофакторов или изменений конформации хроматина, специфичных для активации каждого промотора.

2. Анализ ДНК-связывающей активности NF-кB в зрелых чувствительных нейронах крысы в ответ на TNF-б-стимуляцию in vitro и после перерезки периферического нерва in vivo

Одновременно с изучением изменения экспрессии NF-кB-зависимых генов был проведен анализ способности транскрипционного фактора NF-кB соединяться с фрагментами ДНК, несущими специфическую консенсусную последовательность нуклеотидов, что характеризует активность транскрипционного фактора и рассматривается как потенциальная способность активизировать экспрессию зависимых генов.

Активация NF-кB в зрелых чувствительных нейронах крысы в ответ на TNF-б-стимуляцию была исследована в экстракте ядерных белков методом сдвига электрофоретической подвижности фрагментов ДНК в геле (EMSA - electrophoretic mobility shift assay). Метод EMSA позволяет определить способность белков связываться с ДНК и характеризует их транскрипционную активность. Первоначально он использовался для кинетической характеристики очищенных прокариотических транскрипционных факторов (Garner, Revzin, 1981) и в последующем был значительно модифицирован для идентификации ДНК-связывающих белков, присутствующих в целом ядерном экстракте. В основе метода лежат 2 принципа электрофореза через низкомолекулярный полиакриламидный гель: во-первых, неприсоединенные фрагменты ДНК мигрируют быстрее, чем ДНК-белковые комплексы, и, во-вторых, последние стабилизируются при прохождении через гель, что позволяет отследить даже нестабильные комплексы с коротким периодом полураспада (half-lives).

Месторасположение комплекса радиоактивно меченной ДНК с присоединенным белком визуализируется путем авторадиографии. Если белок не присоединился к радиоактивно меченной пробе, последняя будет двигаться сквозь гель быстрее и определится внизу него. В случае если образовались ДНК-белковые комплексы, они будут выявляться ближе к верхней части геля ввиду их медленной миграции. Так как миграция комплексов в целом определяется мобильностью белка, многочисленные белковые комплексы из единого ядерного экстракта, которые присоединяются к одной пробе, могут быть разделены методом EMSA. Более того, компетитивный контроль (competition assays) позволяет определить специфичность присоединения белков к определенной нуклеотидной последовательности. Для этого в реакционную смесь добавляют избыток немеченых "холодных" олигонуклеотидов, к которым присоединяются белки, и радиоактивно меченный комплекс при этом не выявляется.

Для контроля и идентификации комплексов NF-кB-ДНК был проведен EMSA селезенки и мозга зрелых крыс. NF-кB имеется в цитоплазме в неактивной форме в большинстве клеток, однако его высокая конститутивная активность определяется в ядрах различных клеток иммунной системы и иммунокомпетентных органов (Baeuerle, Henkel, 1994; Li, Verma, 2002) . Высокий уровень NF-кB-активности также описан в нейронах различных регионов мозга, особенно гиппокампа, коры мозга, зернистого слоя мозжечка (Kaltschmidt et al., 1994) , причем максимальный фиксировался в поздний пренатальный и ранний постнатальний периоды (Schmidt-Ullrich et al., 1996) . Как и ожидалось, EMSA-анализ ядерного экстракта селезенки крыс выявил интенсивную полосу комплекса NF-кB-ДНК (рис.1, дорожка 1).

Мы также обнаружили более высокий уровень NF-кB-ДНК-связывающей активности в экстракте коры мозга (рис.1, дорожка 2), чем в экстракте интактных спинномозговых ганглиев (рис.1, дорожка 4). Интересно, что профиль EMSA мозга 1-дневных крысят отличался от полученного для зрелой кортикальной ткани и выявил мощную экстраполосу комплекса NF-кB-ДНК (рис.1, дорожка 3). Этот комплекс был полностью нивелирован добавлени-ем в 25-кратном молярном избытке немеченых "холодных" консенсусных ДНК-олигонуклеотидов к NF-кB (рис.2, дорожка 9). Причем добавление немеченых ДНК-олигонуклеотидов к AP-1 при тех же условиях не оказало никакого эффекта на проявление NF-кB-ДНК-комплекса (рис.2, дорожка 10), что доказывает образование этого комплекса именно ДНК-олигонуклеотидами к NF-кB.

В качестве позитивного контроля NF-кB-ДНК-связывающей активности использовался экстракт ядерных белков, выделенных из культуры клеток линии 293Т, стимулированных TNF-б в концентрациях 20 или 100 нг/мл (рис.1, дорожки 5-7).

На следующем этапе изучался эффект перерезки седалищного нерва на NF-кB-ДНК-связывающую активность в нейронах люмбальных спинальных ганглиев методом EMSA после 6 часов аксотомии. Для получения одного ядерного экстракта ганглии L_IV-L_V были выделены у крыс и объединены вместе следующим образом: 1 - шесть ганглиев, относящихся к перерезанному нерву (ипсилатеральные); 2 - шесть ганглиев относящихся к интактному нерву (контралатеральные); 3 - шесть ганглиев контрольных животных.

Сгруппированные ганглии подвергались гомогенизированию в низкосолевом буфере с помощью гомогенизатора. Клеточные гомогенаты ипсилатеральных, контралатеральных и контрольных ганглиев были лизированы с использованием ядерного экстракционного буфера и затем анализировались методом EMSA для выявления специфического присоединения NF-кB к консенсусным ДНК-олигоуклеотидам.

Рис.1. EMSA-анализ ДНК-связывающей активности NF-кB в различных тканях крысы.

Дорожка 1 - ядерный экстракт селезенки; 2 - коры мозга; 3 - мозга 1-дневных крысят; 4 - интактных спинномозговых узлов; дорожки 5-7 - EMSA-анализ ядерного экстракта культуры клеток линии 293Т, стимулированной TNF-б in vitro 10 минут в указанной концентрации: дорожка 5 - нестимулированная культура, дорожка 6-20 нг/мл, дорожка 7 - 100 нг/мл. Позиция комплекса NF-кB-ДНК обозначена стрелкой. Позиция TNF-б-индуцированного экстракомплекса NF-кB-ДНК в культуре клеток 293Т обозначена треугольником

Рис.2. Конкурентный анализ NF-кB-ДНК-комплексов спинальных ганглиев крыс после аксотомии.

Ядерный экстракт был выделен из спинальных ганглиев L_IV -L_V через 6 часов после перерезки седалищного нерва. ДНК-связывающая активность NF-кB анализирована методом EMSA. Пробоспецифичность комплексов определялась путем инкубации реакционной смеси с консенсусными "холодными" немечеными олигонуклеотидами к NF-кB или AP-1, добавленными в соответствующие пробы в 25-кратном превышении концентрации. "холодные" олиго 25х - 25-кратный молярный избыток немеченых "холодных" NF-кB или AP-1 олигонуклеотидов. Дорожка 1 - негативный контроль в отсутствии ядерного экстракта, дорожки 2 - 4 (СГ ипсилат) - ядерный экстракт спинальных ганглиев со стороны поврежденного нерва, дорожки 5 - 7 (СГ контра) - спинальные ганглии с неповрежденной контралатеральной стороны, дорожки 8 - 10 (мозг 1) - ядерный экстракт мозга новорожденных крысят. Позиция NF-кB-ДНК-комплекса обозначена стрелкой

На полученных авторадиограммах проявилась достаточно выраженная полоса задержки в геле комплекса NF-кB-ДНК в ядерных экстрактах как из ипсилатеральных, так и из контралатеральных ганглиев (рис.3, дорожки 6, 7, 9,10). Только очень бледная полоса визуализировалась на этой же позиции в экстрактах, полученных из ганглиев интактных животных (рис.3, дорожки 5,8).

Специфичность NF-кB-ДНК-комплексов, образующихся после перерезки нерва (рис.2, дорожки 2,5), была подтверждена вытеснением радиоактивно меченных олигонуклеотидов и нивелированием специфической полосы задержки в геле комплекса NF-кB-ДНК уже при 25-кратном молярном избытке немеченых "холодных" консенсусных ДНК-олигонуклеотидов к NF-кB (рис.2, дорожки 3,6). Причем добавление немеченых ДНК-олигонуклеотидов к AP1 при тех же условиях не повлияло на проявление полосы NF-кB-ДНК-комплекса (рис.2, дорожки 4,7).

Для изучения влияния TNF-б на способность NF-кB присоединяться к ДНК чувствительные нейроны зрелых крыс культивировали в течение 16 часов, как описано в прил.2, и стимулировали добавлением в питательную среду TNF-б в концентрации 30 нг/мл в течение 10,20 и 30 минут. После этого нейроны вместе с питательной средой переносили в центрифужную пробирку и осаждали центрифугированием. Затем осадок промывали PBS, ресуспендировали в низкосолевом буфере и лизировали, используя ядерный экстракционный буфер. Полученный ядерный экстракт анализировали методом EMSA на специфическое присоединение NF-кB к ДНК. Рис.15 дорожка 1 иллюстрирует, что EMSA экстракта ядерных белков культуры чувствительных нейронов выявил одиночную полосу задержки в геле, сходную с той, что наблюдалась в интактных спинальных ганглиях in vivo, но большей интенсивности. Инкубация с TNF-б значительно повысила ДНК-связывающую активность NF-кB уже через 10 минут. Однако 20-минутная инкубация приводит к снижению интенсивности проявления полосы, а 30-минутная - к максимальному проявлению полосы задержки в геле NF-кB-ДНК-комплекса (рис.3, дорожки 2, 3,4).

Таким образом, полученные нами результаты EMSA свидетельствуют о том, что зрелые чувствительные нейроны в интактных люмбальных спинальных ганглиях in vivo имеют очень низкую NF-кB-ДНК-связывающую активность (Wood, 1995; Fernyhough et al., 2005) . Это указывает на отсутствие необходимости участия NF-кB во внутриклеточных механизмах, поддерживающих жизнеобес-печение нейронов в норме. В противоположность этому показано, что кортикальным нейронам и нейронам гиппокампа для выживания необходимо присутствие активного NF-кB (Bhakar et al., 2002) . Мы также определили более высокий уровень NF-кB-ДНК-связывающей активности в интактной кортикальной ткани, чем в интактных спинальных ганглиях. В некоторых работах выявлено, что пик активности NF-кB приходится на поздний постнатальный и ранний пренатальный периоды (Schmidt-Ullrich et al., 1996) , что коррелирует с полученными нами данными EMSA мозга однодневных крысят.

Наши результаты показали, что уже через 6 часов после перерезки седалищного нерва ДНК-связывающая активность NF-кB была заметно увеличена в поврежденном ганглии. Однако уже к этому времени выявлялась менее интенсивная полоса задержки в геле комплекса NF-кB-ДНК в неповрежденном контралатеральном ганглии, что свидетельствует о паракринном эффекте. В отдельных работах также отмечены раннее повышение ДНК-связывающей активности NF-кB в модели передавливания нерва и проявление паракринного эффекта к 24 часам после травмы (Fernyhough et al., 2005) .

Рис.3. ДНК-связывающая активность NF-кB в культуре чувствительных нейронов и спинальном ганглии после перерезки периферического нерва.

Дорожки 1-4: EMSA-анализ ДНК-связывающей активности NF-кB в культуре чувствительных нейронов после обозначенного времени инкубации с TNF-б (30 нг/мл). Ядерный экстракт был выделен из культуры спинномозговых нейронов, стимулированных TNF-б в течение обозначенного времени (10-30 минут). Дорожка 1 - нестимулированная культура чувствительных нейронов; 1 мкг общего протеина использовался для EMSA. Дорожки 5-10: ДНК-связывающая активность NF-кB через 6 часов после повреждения седалищного нерва. Ядерный экстракт был выделен из спинальных ганглиев L_IV-L_V через 6 часов после перерезки седалищного нерва, и ДНК-связывающая активность NF-кB анализирована методом EMSA. Количество общего протеина ядерного экстракта, взятого для анализа: дорожки 5-7: 1 мкг, дорожки 8-10: 2 мкг. n - ядерный экстракт интактных неоперированных спинальных ганглиев, i - ипсилатеральных спинальных ганглиев со стороны поврежденного нерва, c - контралатеральных спинальных ганглиев с неповрежденной стороны. Позиция NF-кB-ДНК-комплекса обозначена стрелкой

В ходе экспериментов мы обнаружили, что в экстракте ядерных белков чувствительных нейронов, культивируемых в течение 17 часов, полоса ДНК-связывающей активности NF-кB характеризовалась более высокой интенсивностью, чем в интактных спинальных ганглиях. Последующая инкубация с TNF-б повышала интенсивность полосы через 10 минут с максимумом проявления через 20 минут.

Выделение спинальных ганглиев и диссоциация нейронов во время процедуры культивирования могут имитировать в какой-то степени аксотомию и запускать сходные молекулярные процессы, включая изменение ДНК-связывающей активности NF-кB в культуре чувствительных нейронов. Цитокин TNF-б является потенциальным активатором NF-кB в различных типах клеток (Baldwin, 1996; Barger et al., 2005) . Показано, что после травмы периферического нерва IL-6 мРНК аккумулируется в популяциях средних и крупных нейронов с последующим выявлением в них же протеина TNF-б (Murphy et al., 1995; Schafers et al., 2003) . Более того, рецепторы к TNF - TNFR1 и TNFR2 - выявлялись на зрелых чувствительных нейронах интактных спинальных ганглиев (Shubayev, Myers, 2001) .