Сигнальные пути ядерного транскрипционного фактора Каппа в (NF кb) в чувствительных нейронах

Метод EMSA широко используется для изучения активности регуляторных элементов генов, которые распознаются и связываются специфическими транскрипционными факторами. Следует, однако, отметить, что этот метод не в состоянии показать, способен ли изучаемый фактор на самом деле активировать транскрипцию, так как большинство из них обычно подвергаются дополнительной модуляции уже после того, как связываются с ДНК, в том числе NF-кB (Vermeulen et al., 2002) .

Таким образом, полученные нами данные EMSA свидетельствуют, что ДНК-связывающая активность NF-кB в ядерных экстрактах спинальных гангиев усиливается после перерезки седалищного нерва и TNF-б-стимуляции. Однако в связи с тем, что в последнее время появились работы, в которых говорится об изменении транскрипционной активности NF-кB даже при неизменной способности связываться с ДНК, требуются дополнительные исследования функциональной роли NF-кB в чувствительных нейронах. Результаты EMSA недостаточны для подтверждения способности NF-кB активировать транскрипцию генов, так как для этого необходимы дополнительные модификации фактора (ов) как до, так и после присоединения к ДНК (Saha et al., 2007) , а также взаимодействия NF-кB с дополнительными протеинами - коактиваторами и корепрессорами (Ashburner et al., 2001) .

Для того чтобы показать транскрипционную активность NF-кB in vivo и выяснить его биологическую роль, необходимо создание экспериментальной генетически модифицированной модели для изучения сложнорегулируемого сигнального каскада NF-кB.

3. Изучение роли NF-кB в чувствительных нейронах на трансгенной линии мышей Thy*IкBб-SI

Для изучения функционального значения NF-кB в зрелых чувствительных нейронах in vivo мы создали трансгенную линию мышей Thy*IкBб-SI, нейроны которых специфически экспрессируют суперингибитор NF-кB - IкBб-SI, являющийся мультимутантной формой ингибиторного протеина IкBб (Voll et al., 2000) (рис.4).

Рис.4. Создание генетической конструкции Thy*IкBб-SI. А - схема полученной генетической конструкции Thy*IкBб-SI для генерации трансгенных животных.

Мышиная Thy-1.2-трансгенная кассета содержит cis-действующий элемент для нейрон-специфической экспрессии после 8-го дня постнатального периода (Caroni, Becker, 1992) . Двойными стрелками показаны замещенные аминокислоты в мутантной форме IкBб - IкBб-SI. HА - гемагглютинина tag; Б - генотипирование трансгенных мышей. Pr-1 и Pr-2 - праймеры, амплифицирующие фрагмент трансгена (369 п. н) и мышиного геномного IкBб (733 п. н)

Мощный трансдоминантный ингибитор IкBб-SI был использован для целенаправленной экспрессии в зрелых нейронах трансгенных животных (tg) и ингибирования в этих клетках активности NF-кB. В мутантной форме IкBб серия аминокислот, чувствительных к сигналам для убиквитинирования, фосфорилирования и тирозин-фосфорилирования, замещена нечувстви-тельными аминокислотами (рис.4, А). Эта форма протеина не подвержена деградации и действует как суперрепрессор NF-кB-активности, удерживая и изолируя в цитоплазме каждый NF-кB/RelA-комплекс, предотвращая связывание с ДНК и активацию транскрипции. NF-кB-суперингибитор - IкBб-SI был включен в XhoI-сайт специфической нейральной Thy-1.2-кассеты (Caroni, 1997) для последующей генерации трансгенных мышей линии Thy*IкBб-SI.

Экспрессия Thy-1.2-кассеты, извлеченной из мышиного гена Thy-1.2 (Gordon et al., 1987) обнаруживает мощную экспрессию трансгена специфически в нейронах зрелых трансгенных животных. Мышиная трансгенная кассета Thy-1.2 (рис.4, А) содержит cis-действующий элемент (cis-acting elements) для нейрон-специфической экспрессии после 8-го дня постнатального периода, и поэтому экспрессия трансгена начинается на 9 - 10-й день постнатального развития.

Известно, что интенсивность экспрессии трансгена под влиянием Thy-1.2-промотора может варьировать между несколькими трансгенными линиями мышей, вероятно, в результате воздействия ядерного генетического окружения на трансгенную конструкцию. Таким образом, по степени проявления экспрессии нейроны могут быть разделены на несколько групп. В одной группе значительная экспрессия трансгена наблюдалась во всех тестируемых линиях мышей, в другой - зависела от трансгенной линии. Однако в большинстве таких линий с использованием Thy-1.2-кассеты обнаруживается достаточно генерализованная экспрессия в нейронах. Эти свойства могут использоваться для изучения эффекта трансгена в нервной системе в позднем периоде развития и в зрелом состоянии. В том числе появляется возможность анализировать эффекты различных комбинаций экспрессирующих и неэкспрессирующих нейронов трансгенных животных, взятых от нескольких линий (Caroni, Becker, 1992) .

Полученную конструкцию - Thy*IкBб-SI - использовали для генерации трансгенных животных путем пронуклеарной микроинъекции эмбрионов гибридной линии CBAxC57BL/10 (F1). Все эксперименты были проведены с линией Tg (ThymutIkB) 74-3. Трансгенные животные определялись с помощью ПЦР, которая выявляла позитивных и негативных особей с использованием одной пары праймеров (рис.4, Б). Эти праймеры амплифицировали фрагмент длиной 733 пар нуклеотидов (п. н) мышиного эндогенного геномного IкBб-локуса, содержащего экзоны III и IV кодирующего участка, а также интроны. Эти же праймеры соответствовали кодирующему участку человеческого IкBб-SI-трансгена, в котором интроны были удалены, и поэтому у позитивных мышей амплифицируемый фрагмент был короче (369 п. н).

3.1 Анализ экспрессии IкBб-SI в трансгенной линии мышей. Был проведен молекулярный анализ генерированных трансгенных животных линии Tg (Thy-mutIкB) 74-3 для того, чтобы определить, действительно ли трансген и его продукт (белок IкBб-SI) экспрессируются в нервной системе, в частности в зрелых нейронах спинномозговых ганглиев.

Во-первых, методом ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (RT-PCR) было показано, что трансген экспрессируется только в нервной системе (головной мозг, мозжечок, спинной мозг и спинномозговые ганглии).

Затем методом вестерн-блот-анализа была изучена экспрессия продукта встроенного трансгена в экстрактах спинного мозга с использованием антител, специфичных к IкBб, позволяющие отличить эндогенную форму IкBб от ее мутантной формы (IкBб-SI). Результаты анализа показали, что протеин, соответствующий размеру IкBб-SI, выявлялся в экстрактах спинного мозга у животных трех трансгенных линий. Это доказывает, что данные животные несут активно экспрессирующийся трансген.

3.2 Гибридизация in situ (in situ hybridisation). Вестерн-блот-анализ и ПЦР с предварительным использованием обратной транскрипции (RT-PCR), подтвердившие экспрессию трансгена, проводились на гомогенатах целых органов трансгенных животных (головной мозг, спинной мозг, спинальный ганглий) и не позволяли выяснить, экспрессируется ли интересую-щий нас трансген строго в нейронах или также в других ненейрональных клетках. Для ответа на этот вопрос, а также для того, чтобы сравнить трансгенные линии и выбрать более подходящую для наших целей, была проанализирована экспрессия трансгена в нервной системе двух полученных трансгенных линий Tg (Thy-mutIкB) 74-3 и Tg (Thy-mutIкB) 74-5 методом гибридизации in situ (in situ hybridisation).

Гибридизация in situ была выполнена на криостатных срезах органов трансгенных животных двух полученных линий. Этот метод позволяет локализовать положение мРНК в цитоплазме клеток и дает возможность получить четкую морфологическую картину распределения продукта экспрессии трансгена (мРНК) в популяциях клеток этих трансгенных линий. Криостатные срезы нервной ткани (головной мозг, спинной мозг и спинальные ганглии) были подвергнуты гибридизации с ³⁵S-дАТФ-радиоактивно меченной олигонуклеотидной пробой (³⁵S-dATP radiolabelled oligonucleotide probe), специфичной к трансгену. Благодаря характеристикам трансгенной конструкции этот метод позволяет определить транскрипционную активность трансгена.

Гибридизация in situ показала, что обе линии имеют обширную экспрессию трансгена в нейронах, однако, с индивидуальными особенностями. В линии 5 отмечается высокая степень экспрессии в ограниченном количестве нейронов. Значительное сосредоточение гранул серебра было обнаружено в некоторых мотонейронах спинного мозга, в популяции крупных нейронов спинальных ганглиев (рис.5), в CA1 - и CA3-зонах гиппокампа и зубчатой извилине, а также в небольшом количестве нейронов коры мозга. В других нейронах экспрессия либо слабо проявлялась, либо полностью отсутствовала.

Линия 3 демонстрировала высокую экспрессию трансгена примерно одинаковой выраженности во всех типах нейронов. В частности, гранулы серебра были сосредоточены во всех нейронах головного и спинного мозга, а также во всех популяциях нейронов спинального ганглия (Рис.6). Большое значение имеет следующее наблюдение: в нервной системе не было обнаружено ненейрональной экспрессии трансгена. Негативные образцы включали клетки глии, входящие в состав периферического нерва, и клетки белого вещества ЦНС. Это доказывает, что экспрессия Thy*IкBб-SI-трансгена специфична и ограничена нейронами.

Рис.5. Гибридизация in situ срезов спинномозгового ганглия мышей трансгенной линии Tg (Thy-mutIкB) 74-5.

Криостатные срезы спинномозгового ганглия мышей были подвергнуты гибридизации с ³⁵S-дАТФ-радиоактивно меченной олигонуклеотидной пробой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия в светлом поле (А) и (Б) поляризационной эпифлюоресценции. В, Г - увеличенный участок тела нейрона с гранулами серебра в светлом поле (В) и при поляризационной эпифлюоресценции (Г). Отмечается концентрация гранул серебра в ограниченной группе нейронов. Множество нейронов не показывают экспрессии трансгена

Для контроля результатов гибридизация in situ была выполнена на образцах ткани, взятой от линии мышей дикого типа (wt). В этом случае на препаратах отмечались лишь низкий радиоактивный фон и гомогенно распределенные гранулы серебра, которые не были связаны с конкретными клетками и покрывали равномерно весь образец ткани (рис.7).

Основываясь на полученных результатах, все дальнейшие эксперименты были выполнены на трансгенной линии мышей Tg (Thy-mutIкB) 74-3 как наиболее отвечающей целям и задачам данной работы.

Рис.6. Гибридизация in situ срезов спинномозгового ганглия мышей трансгенной линии Tg (Thy-mutIкB) 74-3.

Криостатные срезы спинномозгового ганглия мышей были подвергнуты гибридизации с ³⁵S-дАТФ-радиоактив-но меченой олигонуклеотидной про-бой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия при поляризационной эпифлюресценции (А) и светлопольной микроскопии (Б); В - увеличенный участок спинального ганглия с гранулами серебра в телах нейронов. Отмечается концентрация гранул серебра во всех группах нейронов. Практически все нейроны имеют высокий уровень экспрессии трансгена.

Рис.7. Гибридизация in situ срезов спинно-мозгового ганглия мышей дикого типа.

Криостатные срезы спинномозгового ганг-лия мышей были подвергнуты гибриди-зации с ³⁵S-дАТФ-радио-активно меченой олигонуклеотидной про-бой, специфичной к трансгену. А, Б - срез спинномозгового ганглия в светлом поле (А) и при поляризационной эпифлюоресценции (Б). Отмечается гомогенное распределение гранул серебра, не связанных с клетками

3.3 Влияние Thy*IкBб-SI трансгена на выживаемость и физиологические функции зрелых нейронов спинальных ганглиев

В данной части работы была проведена оценка численности нейронов спинальных ганглиев трансгенных животных в сравнении с диким типом. Был произведен подсчет общего количества нейронов в спинальном ганглии на уровне L_V и выполнен иммуногистохимический анализ нейронов спинальных ганглиев с применением антител к широко распространенному белку CGRP для оценки CGRP⁺-нейронов у трансгеннных животных в сравнении с диким типом, как описано ранее (Holmes et al., 2000; Shi et al., 2001) . Результаты подсчета показали, что количество чувствительных нейронов, экспрессируемых CGRP, общего количества нейронов в спинальном ганглии не были изменены у трансгенных животных.

В заключение были исследованы основные функции чувствительных нейронов, такие, как чувствительность температурная, к холоду и тактильная у взрослых мышей трансгенной линии и дикого типа. Было показано, что экспрессия суперингибитора NF-кB в нейронах спинальных ганглиев не оказывает какого-либо эффекта на поддержание физиологических функций у мышей трансгенной линии Thy*IкBб-SI.

3.4 Ингибирование ядерной транслокации NF-кB в нейронах мышей Thy*IкBб-SI трансгенной линии

Активная форма NF-кB локализуется в ядре, поэтому был произведен иммуногистохимический анализ с использованием моноклональных специфических антител к субъединице p65 для выявления внутриклеточной локализации NF-кB в нейронах мышей трансгенной линии Thy*IкBб-SI. В задачу данного этапа экспериментов входило выяснение влияния трансгена IкBб-SI на внутриядерную локализацию NF-кB в нейронах спинальных ганглиев после TNF-б-стимуляции in vitro и после перерезки седалищного нерва in vivо.

При иммуногистохимическом анализе культуры нейронов спинномозговых ганглиев внутриядерная локализация NF-кB (p65) обнаруживалась в небольшом количестве чувствительных нейронов мышей дикого типа (5%) уже после 1-го дня in vitrо и у 60% нейронов спинальных ганглиев после TNF-б-стимуляции. Однако ядерное перемещение NF-кB, стимулированное TNF-б, подверглось значительному ингибированию в нейронах спинальных ганглиев трансгенных животных (до 92% нейронов) (рис.8).

На следующем этапе исследования был проведен иммуногистохимический анализ NF-кB в спинальных ганглиях на уровне L_V через 4 часа и 1 день после перерезки периферического нерва. Полученные результаты свидетельствуют о том, что р65 перемещается в ядра примерно у 25% нейронов спинальных ганглиев через 4 часа после аксотомии и выявляется там же через 1 день после перерезки. Оценка численности нейронов с ядерной локализацией р65 у tg - и wt-мышей до и после перерезки периферического нерва показала, что вызванное аксотомией ядерное перемещение р65 значительно уменьшено (на 90%) у мышей трансгенной линии (рис.9).

Рис.8. Ингибирование ядерного перемещения NF-кB в нейронах спинальных ганглиев трансгенных мышей линии Thy*IкBб-SI.

Редукция ядерного перемещения р65 в культуре нейронов мышей трансгенной линии (tg) в сравнении с диким типом (wt) после стимуляции их TNF-б.

Рис.9. Редукция ядерной локализации NF-кB в нейронах поврежденных спинальных ганглиев (ипсилат) у мышей трансгенной линии (tg).

Контралат - контралатеральные (неповрежденные) ганглии. М ± m, где М - среднее значение, m - ошибка среднего значения, n=6 (число животных в группах), ***p<0,001 (two way ANOVA)

3.5 Выживание нейронов спинальных ганглиев после перерезки периферического нерва у мышей трансгенной линии Thy*IкBб-SI

Выживаемость нейронов спинальных ганглиев в условиях травмы in vivo была изучена на модели экспериментальной перерезки седалищного нерва. TUNEL-анализ был выполнен на спинальных ганглиях L_V через 2 и 14 дней после перерезки периферического нерва. Результаты анализа показали, что лишь единичные нейроны (4-5 в одном спинальном ганглии) были TUNEL-положительные. Не было выявлено значительных различий в количестве TUNEL⁺-нейронов в спинальных ганглиях между мышами дикого типа (wt) и трансгенными (tg) животными (рис.10)

Выживаемость нейронов спинальных ганглиев также определяли путем оценки общего количества нейронов в спинальном ганглии. Через 2 дня после перерезки периферического нерва их число было одинаково в ганглиях, располагающихся со стороны как перерезанного, так и интактного нерва у мышей дикого типа (wt) и у трансгенных (tg) животных (рис.11). Однако после двух недель аксотомии, общее количество нейронов уменьшилось на 25% в спинальных ганглиях L_V как у трансгенного, так и у дикого типа мышей.

Рис.10. Анализ количества TUNEL-позитивных нейронов спинальных ганглиев L_V через 2 и 14 дней после перерезки се-далищного нерва у мышей дикого типа и трансгенной линии Thy*IкBб-SI. аксот СГ - ганглии, располагающиеся со стороны перерезанного нерва, контр СГ- интактного нерва

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.11. Анализ выживания чувствительных нейронов после травмы седалищного нерва у мышей дикого типа (wt) и трансгенной линии (tg) путем оценки общей численности нейронов спинального ганглия (СГ), процентного отношения субпопуляций CGRP - и NPY-экспрессирующих нейронов спинального ганглия. M ± S. E. M, n=6 (число животных в группах), *** -p<0.001, * - p<0,1 (two way ANOVA)

Было также произведено сравнение процентного соотношения нейронов, экспрессирующих маркеры CGRP и NPY, в спинальных ганглиях мышей дикого типа (wt) и трансгенных (tg) животных после травмы нерва. Известно, что эти нейрональные маркеры имеют различную динамику экспрессии в чувствительных нейронах после аксотомии (Shi et al., 2001) . Как и ожидалось, в поврежденном ганглии количество CGRP-экспрессирующих нейронов уменьшилось, а количество NPY - - увеличилось, причем не наблюдалось различий в распределении данных нейрональных популяций в ганглиях трансгенного (tg) и дикого типов мышей (wt) (рис.11).

Таким образом, для изучения функционального значения NF-кB в зрелых чувствительных нейронах in vivo мы создали и клонировали трансгенную линию мышей Thy*IкBб-SI, нейроны которых экспрессируют суперингибитор NF-кB - IкBб-SI. До настоящего времени это единственная трансгенная модель, в которой целенаправленно угнетается активность NF-кB строго в зрелых нервных клетках (Memet, 2006; Pasparakis et al., 2006) . Была выявлена значительная редукция ядерной транслокации NF-кB в зрелых нейронах спинального ганглия мышей этой трансгенной линии в ответ на такие известные сигналы-активаторы NF-кB как TNF-б (Fernyhough et al., 2005) и аксотомия (Doyle, Hunt, 1997b; Ma, Bisby, 1998) . Хотя трансгенные мыши линии Thy*IкBб-SI показывали пониженную способность к активации NF-кB в нейронах, подтвержденную уменьшением ядерной р65-иммунореактивности, основные физиологические свойства чувствительных нейронов и их количество не были изменены. Это указывает на то, что NF-кB не является обязательным транскрипционным фактором для функционирования нейронов спинномозговых ганглиев в нормальных физиологических условиях.

В некоторых работах выдвинуты предположения о вовлечении NF-кB в процессы, необходимые для выживания зрелых чувствительных нейронов после повреждения периферического нерва (Doyle, Hunt, 1997b; Fernyhough et al., 2005; Ma, Bisby, 1998) . Полученные нами данные свидетельствуют о том, что перерезка седалищного нерва не вызывает апоптоза в чувствительных нейронах через 2 дня после травмы в спинальных ганглиях мышей ни дикого типа, ни линии Thy*IкBб-SI. В частности, мы показали, что одинаково небольшое количество нейронов спинномозговых ганглиев дает положительную окраску при использовании метода TUNEL как у животных дикого типа, так и у трансгенных мышей. Для контроля результатов TUNEL параллельно выполнялась окраска срезов спинного мозга, полученных после его компрессионного повреждения, которая выявила значительное количество TUNEL-положительных нейронов (Chew et al., 2008) , что подтверждает достоверность реакции на срезах спинального ганглия.

Для оценки эффективности модели перерезки седалищного нерва в нашем эксперименте произведен подсчет субпопуляций нейронов спинальных ганглиев, экспрессирующих маркеры NPY или CGRP. Известно, что после периферической аксотомии количество нейронов, экспрессирующих NPY повышается, а CGRP - снижается (Holmes et al., 2000; Shi et al., 2001) . Наши результаты также подтверждаются в работе, авторы которой отмечают минимальный уровень апоптической смерти нейронов в первые дни после травмы периферического нерва (Koliatsos, Price, 1996; Shi et al., 2001) . Однако через 2 недели после аксотомии нами мы обнаружили значительный уровень гибели нейронов (25%). Это несоответствие между отсутствием апоптических нейронов и уменьшением общей численности нейронов может объясняться, вероятно, очень коротким временным промежутком, в течение которого метод TUNEL способен регистрировать изменения в нейронах, или тем, что в гибели нейронов через 2 недели после аксотомии участвовали неапоптические механизмы. Вместе с тем эти изменения в количестве нейронов спинальных ганглиев были практически одинаково выражены как у трансгенных животных, так и у мышей дикого типа. В другой работе существенное снижение общей численности нейронов было зарегистрировано в более отдаленном периоде после травмы (30-90 дней) (Рагинов, Челышев, 2003), причем степень нейрональной гибели имела прямую зависимость от экспериментальных животных и используемой методологии (McKay et al., 2002; Pierucci, Oliveira, 2006) .

Следовательно, полученные результаты не поддерживают нашу изначальную гипотезу о том, что трансгенное ингибирование ядерной транслокации NF-кB может приводить к гибели нейронов спинальных ганглиев после аксотомии. Экспериментальные данные показывают, что NF-кB не определяет внутреннюю устойчивость зрелых нейронов спинальных ганглиев к апоптической смерти в результате аксотомии, которая не изменилась, несмотря на трансгенное ингибирование внутриядерной транслокации NF-кB в ответ на TNF-б-стимуляцию или травму нерва.

Наши данные косвенно подтверждаются в опубликованном в научном журнале "Nature" исследовании (Nickols et al., 2003) , в котором показано, что в седалищном нерве крыс in vitro и в кокультуре шванновских клеток и чувствительных нейронов in vivo активация NF-кB происходит параллельно с процессами миелинизации. Блокирование NF-кB-активности в кокультуре c помощью ингибитора SN50 или использование клеток генетически модифицированных мышей p65^{-/ -} сильно ингибирует миелинизацию, но при этом не выявляется высокий уровень апоптоза (методом TUNEL) несмотря на полное отсутствие миелина. Более того, обратимость процессов блокирования миелинизации после удаления из среды SN50 может поставить под сомнение наличие апоптоза в нейронах и шванновских клетах. Авторами также показано одинаковое количество нейронов в кокультуре, полученной от генотипов p65^+/+, p65^+/-, p65^-/-, что исключает возможность объяснения дефектов миелинизации различиями в способности к выживанию между нейронами дикого типа и p65^{-/ -} (Nickols et al., 2003) .

Предыдущие предположения о вовлечении транскрипцион-ного фактора NF-кB в процесс выживания зрелых чувствительных нейронов были сделаны только на основе его ядерной транслокации методом иммуногистохимии и EMSA ядерного экстракта спинальных ганглиев в ответ на травму седалищного нерва (Doyle, Hunt, 1997; Fernyhough et al., 2005; Ma, Bisby, 1998) . Однако в работах последних лет показано, что анализ лишь ядерной локализации NF-кB и ее последующее связывание с фрагментами ДНК не обязательно отражают активацию именно транскрипционной активности NF-кB. Другими словами, если NF-кB находится в ядре и даже "села" на участок ДНК, необходимы другие компоненты и условия, чтобы этот фактор инициировал траскрипцию гена-мишени. Например, некоторые сигнальные каскады (p38MAPK) могут угнетать транскрипционную активность NF-кB в культуре астроцитов даже без изменения его внутриядерной ДНК-связывающей активности, лишь регулируя ацетилирование р65-субчастицы путем модулирования ацетилтрансферазной активности р300 с помощью фосфорилирования (Saha et al., 2007) . В других описанных случаях индуцированная цитокинами ДНК-связывающая активность NF-кB может угнетать, а не активировать NF-кB-зависимую транскрипцию (Campbell et al., 2004; Ho et al., 2005) .

4. Выявление транскрипционной активности NF-кB с использованием трансгенной линии репортерных мышей NF-кB/LacZ

4.1 Tрансгенная линия репортерных мышей NF-кB/LacZ. Мы оценивали транскрипционную активность NF-кB в зрелых чувствительных нейронах, используя трансгенную линию репортерных мышей NF-кB/LacZ. Эта линия обладает способностью экспрессировать ядерную форму фермента в-галактозидазы E. сoli, кодируемую геном lacZ, находящимся под транскрипционным контролем NF-кB. В качестве положительного контроля активности в-галактозидазы производилась окраска срезов головного мозга, где нейроны проявляли конститутивную активность NF-кB.

4.2 Отсутствие экспрессии в-галактозидазы в нейронах спинномозговых ганглиев после травмы периферического нерва и при экспериментальном воспалении. Параллельно с контролем для выявления активности в-галактозидазы окрашивали спинномозговые ганглии L_V через 2 дня после перерезки седалищного нерва. в-gal-позитивные нейроны не были обнаружены как в ганглиях, относящихся к поврежденному нерву, так и с контралатеральной (неповрежденной) стороны (рис.12, A, Б). Тот же результат получен после анализа экспрессии гена lacZ через 7 дней после травмы. Кроме этого, для выявления активности в-галактозидазы мы исследовали образцы мышечной ткани, окружающей участок повреждения и проксимальный отрезок перерезанного нерва. На срезах образцов мышечной ткани, взятой на уровне верхней части бедра в участке повреждения, была выявлена яркая экспрессия репортерного гена lacZ (рис.13, A, Б), в то время как в неповрежденной мышце на контралатеральной стороне она отсутствовала (см. рис.13, В). в-gal-позитивные клетки были также обнаружены в проксимальном отрезке рассеченного нерва (см. рис.12, В).

На следующем этапе работы активность NF-kB в нейронах спинномозговых ганглиев индуцировали путем экспериментально вызванного воспаления. Для этого в левую заднюю конечность мышей трансгенной линии NF-kB/lacZ была сделана инъекция адъюванта Фройнда (complete Freund's adjuvant). На срезах спинномозговых ганглиев и мышечной ткани задней части бедра через 2 дня после инъекции была визуализирована морфологическая картина воспаления, характеризующаяся массивной клеточной инфильтрацией. Однако даже в этом случае экспрессия репортерного гена lacZ не обнаружена в клетках спинального ганглия и в нерве. Только единичные в-gal-позитивные ядра выявлялись в бедренной мышечной ткани конечности, в которую была сделана инъекция.

Рис.12. Отсутствие экспрессии lacZ в спинномозговых ганглиях трансгенных NF-кB/LacZ-репортерных мышей после травмы периферического нерва.

Экспрессия репортерного гена lacZ отсутствует как в ганглии со стороны повреждения (Б), так и с контра-латеральной стороны (A). в-gal-позитивные клетки выявляются в проксимальном сегменте поврежденного седалищного нерва (В); A, В - масштабная линия 50 мкм, Б - масштабная линия 25 мкм

Рис.13. b-gal-экспрессия в мышечной ткани нормальных и оперированных трансгенных мышей. А - мощная экспрессия репортерного гена lacZ в мышечной ткани, окружающей участок повреждения в верхней части бедра; масштабная линия 50мm. Б - большое увеличение участка мышцы, показывающее яркое в-gal-окрашивание в ядрах поврежденной мышечной ткани, обозначенной в рамке на A; масштабная линия 10 мкм. В - отсутствие экспрессии lacZ в мышце на контралатеральной (неповрежденной) стороне; масштабная линия 10 мкм

4.3 Трихостатин А способствует экспрессии b-gal в культуре чувствительных нейронов, стимулированных TNF-a и LPS. На данном этапе мы исследовали активность NF-кB in vitro в культуре чувствительных нейронов, выделенных из спинальных ганглиев трансгенных мышей линии NF-kB/lacZ. Необходимо было выяснить, активируется ли экспрессия репортерного гена в зрелых нейронах спинальных ганглиев in vitro при действии классических активаторов NF-кB, таких, как TNF-a и LPS. Для этого культуру трансгенных нейронов инкубировали в течение 16 часов на стерильных покровных стеклах, стимулировали добавлением TNF-a (30 нг/мл) или LPS (10 нг/мл) на следующие 24 часа инкубации и затем анализировали на в-gal-аккумуляцию методом окрашивания с X-gal.

Рис.14. Отсутствие экспрессии lacZ в культуре нейронов спинномозговых ганглиев NF-kB/lacZ-репор-терных мышей. A - в-gal-позитивные клетки не обнаружены в контрольной нестимулированной культуре чувствительных нейронов, масштабная лини 25 мкм; Б - культивируемые в течение 16 часов нейроны спинномозговых ганглиев были стимулированы TNF-б (30 нг/мл). Отмечается экспрессия репортерного гена в большинстве ненейрональных клеток, окружающих нейроны, но не в самих чувствительных нейронах, масштабная линия 10 мкм

Как видно из рис.14, транскрипционная активность NF-kB в нейронах, культивируемых в нормальной среде роста, отсутствует. Отметим, что встречались единичные в-gal-позитивные ненейрональные клетки, предположительно, клетки-сателлиты, которые были связаны с телами нейронов и могли попасть в культуру в результате неполного ресуспендирования гангиев. После TNF-a-стимуляции культуры чувствительных нейронов b-gal-экспрессия выявлялась в большинстве ненейрональных клеток, окружающих тела нейронов. Эти клетки можно интерпретировать как клетки-сателлиты, основываясь на их морфологии и местоположении. Однако в нейронах спинномозговых ганглиев, культивируемых с добавлением TNF-a (30 нг/мл), не обнаружено значительной транскрипционной активности NF-kB (рис.14, Б).

В ходе исследования мы выявили эффект трихостатина А (Trichostatin A - TSA) (5 мM) на экспрессию репортерного гена lacZ в нейронах, одновременно стимулированных TNF-a. Трихостатин А один из наиболее эффективных и хорошо изученных ингибиторов гистоновых деацетилаз (histone deacetylases - HDAC) (Yoshida et al., 1990; Yoshida et al., 1995) .

Рис.15. Транскрипционная активность NF-kB индуцируется трихостатином А в культуре нейронов спинномозговых ганглиев NF-kB/lacZ-репортерных мышей. А - нейроны спинномозговых ганглиев зрелых мышей трансгенной репортерной линии NF-кB/LacZ находились in vitro в течение 16 часов. Трихостатин А (5 мM) был добавлен в культуральную среду на следующие 24 часа инкубации. Отмечается индукция lacZ-активности в ненейрональных клетках и в части чувствительных нейронов, масштабная лини 25 мкм. Б - нейроны спинномозговых ганглиев культивировали в течение 16 часов. TSA (5 мM) одновременно с TNF-б (30 нг/мл) (Б) или LPS (10 мкг/мл) (В) были добавлены в культуральную среду на следующие 24 часа инкубации. Обнаруживается усиление экспрессии репортерного гена в ненейрональных клетках и чувствительных нейронах. Б, В - масштабная линия 25 мкм

Так, при 24-часовой инкубации культуры нейронов с TSA только 3-5% клеток проявляли в-gal-активность (рис.15, A). Однако у значительного количества чувствительных нейронов отмечалась положительная окраска, когда культуру нейронов инкубировали с добавлением одновременно TSA и TNF-a (рис.15, Б). Сходный эффект TSA наблюдался при стимуляции клеток LPS (10 мкг/мл) (рис.15, В), другим известным стимулятором NF-кB в различных типах клеток. Увеличение времени инкубации с TSA до 40 часов не привело к повышению количества в-gal-положительных клеток.

Еще ярче эффект TSA проявлялся, когда культуру нейронов преинкубировали в присутствии TSA в течение 16 часов, а затем стимулировали TNF-a или LPS (рис.16). В этом случае практически у всех нейронов наблюдалась мощная ядерная в-gal-активность.

Рис.16. Экспрессия lacZ в культуре нейронов спинномозговых ганг-лиев, преинкубированных с TSA и стимули-рованных TNF-б или LPS.

Нейроны спинно-мозговых ганглиев зрелых мышей трансгенной репортерной линии NF-кB/LacZ находились в культуре в течение 16 часов в присутствии TSA (5 мM). Затем TNF-б (30 нг/мл) (A) или LPS (10 мкг/мл) (Б) были добавлены к культуре на следующие 24 часа инкубации. Отмечается мощная экспрессия репортерного гена в большинстве чувствительных нейронов. A, Б - масштабная линия 25 мкм

Рис.17. Процентное соотношение в-gal-положительных нейронов при действии различных комбинаций модификаторов (TSA, TNF-б, LPS и SN50) активности NF-кB in vitrо.

TSA усиливает проявление индуцирующего действия TNF-б и LPS на экспрессию NF-кB-репортерного гена, и этот ответ блокируется SN50. Более того, мощная индукция транскрипционной активности NF-кB выявляется, когда культура нейронов спинномозговых ганглиев преинкубируется с TSA в течение 16 часов перед действием TNF-б и LPS, содержание в-gal-положительных нейронов повышается до 90%

Было также показано, что индуцированная экспрессия lacZ в чувствительных нейронах ингибируется при добавлении в среду олигопептида SN50 - специфического ингибитора ядерной транслокации NF-кB в клетках. После проникновения в клетку SN50 блокирует систему импорта, необходимую для перемещения NF-кB в ядро, не вступая во взаимодействие с цитоплазматическими процессами, ведущими к активации NF-кB. Лишь единичные клетки были в-gal-положительны (3%), когда SN50 добавляли в среду одновременно с TSA и TNF-б. Более того, экспрессия lacZ в чувствительных нейронах полностью исчезала, когда нейрональная культура была преинкубирована с SN50 в течение 16 часов перед добавлением TSA и TNF-б.

На рис.17 представлено процентное соотношение в-gal-положительных чувствительных нейронов после действия in vitrо различных комбинаций TSA, TNF-б, LPS и SN50.

4.4 Регуляция активности NF-кB в чувствительных нейронах.

Результаты, полученные в ходе экспериментов с использованием трансгенной репортерной линии мышей NF-кB/LacZ, показали, что NF-кB транскрипционно не активен как в норме, так и после повреждения периферического нерва, что было подтверждено неспособностью NF-кB транскрибировать репортерный ген lacZ в нейронах спинномозговых ганглиев. Мы обнаружили, что NF-кB не активен в чувствительных нейронах после экспериментально вызванного воспаления периферического нерва, хотя эта модель способна индуцировать молекулы NF-кB сигнального каскада в других типах клеток (Inglis et al., 2005) .

Мы показали, однако, что конститутивная транскрипционная активность NF-кB выявляется в нейронах головного мозга, как было отмечено ранее (Bhakar et al., 2002) . Это свидетельствует о том, что отсутствие активности NF-кB в спинальных ганглиях регистрируется не вследствие неадекватного X-gal окрашивания в нашем эксперименте. Более того, мы выявили в-gal-положительные ненейрональные клетки в месте повреждения седалищного нерва. Особенно ярко репортерный ген lacZ проявлялся в ядрах поврежденной мышечной ткани, вероятно, в результате индукции NF-кB цитокинами воспаления и/или регенерации мышечной ткани.

Мы не исключали возможности, что отсутствие детекции транскрипционной активности в зрелых чувствительных нейронах связано с особенностями линии репортерных мышей, используемых в нашем эксперименте. Однако в исследованиях, проводимых с другими линиями трансгенных NF-кB-репортерных мышей также не отмечалась активность NF-кB в зрелых чувствительных нейронах (Memet 2006) . В частности, сходная линия трансгенных репортерных мышей была генерирована с использованием промотора р105, который содержал NF-кB-связывающий участок для экспрессии репортерного гена lacZ (Schmidt-Ullrich et al., 1996) . Перерезка седалищного нерва приводила к активации транскрипционной активности NF-кB в некоторых мотонейронах, которая не была показана в чувствительных нейронах (Pollock et al., 2005) . Не была выявлена транскрипционная активность NF-кB в периферической нервной системе и другой трансгенной линии мышей, в которой репортерный ген люциферазы находился под контролем NF-кB (Carlsen et al., 2002) .

Мы продемонстрировали, что отсутствие активности NF-кB в зрелых нейронах спинальных ганглиев регистрируется в результате действия репрессионного механизма, регулируемого процессами ацетилирования и деацетилирования. В частности, мы показали, что трихостатин А, являющийся ингибитором гистоновых деацетилаз (Quivy, Van Lint, 2004) , значительно усиливает индукцию NF-кB-активности, вызванную TNF-б и LPS в культуре спинномозговых нейронов. Подобные результаты отражены в работе Chen с соавторами (2001) на других типах клеток.

Согласно полученным нами данным, наблюдаемое действие TSA специфично для NF-кB-активности, так как ингибитор ядерного перемещения NF-кB - SN50 нивелирует дерепрессивный эффект TSA в культуре спинномозговых нейронов. Следовательно, полученные данные объясняют, что влияние NF-кB в зрелых спинальных ганглиях не отмечается в результате процессов деацетилирования, подавляющих транскрипционную активность ядерного фактора.

Таким образом, появившиеся в последнее время сообщения о том, что процессы ацетилирования и деацетилирования на клеточном и молекулярном уровнях, в том числе в ядре, вовлечены в регуляцию транскрипционной активности NF-кB (Natoli, 2006; Quivy, Van Lint, 2004) , расширили наши представления о многоуровневой регуляции активности этого фактора. Во-первых, ацетилирование гистонов регулирует доступность NF-кB-зависимых генов. Во-вторых, неидентифицированные процессы ацетилирования временно модулируют IKK-активность, а следовательно, длительность присутствия и ДНК-связывания NF-кB в ядре. В-третьих, прямое ацетилирование р65 - и р50-субъединиц регулирует различные функции NF-кB, включая транскрипционную и ДНК-связывающую активность, а также присоединение IkBa. В заключение отметим, что ацетилтрансферазы и деацетилазы взаимодействуют напрямую с несколькими протеинами, вовлеченными в сигнальные каскады NF-кB, в том числе с самим NF-кB, другими транскрипционными факторами и гистонами, ассоциированными с NF-кB-регулируемыми генами (Quivy, Van Lint, 2004) (см. рис.45).

Проведенный нами эксперимент с SN50 - ингибитором ядерной транслокации NF-kB выявил зависимость степени экспрессии репортерного гена в культуре нейронов спинномозгового узла от продолжительности действия ингибитора. Это можно объяснить, если принять во внимание следующее: деацетилирование и конденсация хроматина, окружающего промотор репортерного гена lacZ, могут не допустить экспрессии этого гена в чувствительных нейронах, хотя сам транскрипционный фактор присутствует в клетках (Kaltschmidt et al., 1994) . Когда нейроны подвергаются действию TSA, гистоновые деацетилазы ингибируются, что влечет за собой ацетилирование и деконденсацию (расслабление) хроматина. Это в свою очередь делает промотор доступным для NF-kB и других кофакторов после стимуляции нейронов TNF-б. В то же время IkBa входит в ядро и переносит NF-kB в цитоплазму. Известно, что через 60-75 мин после начала стимуляции ни одного NF-kB-комплекса не остается в ядре (Lipniacki et al., 2004) , а так как новые молекулы NF-kB не могут быть транслоцированы в него в связи с блокадой специфическим ингибитором SN50, ядерный пул NF-kB исчерпывается.

При одновременном действии SN50, TSA и TNF-б на нейроны in vitro молекулы NF-kB, которые конститутивно представлены в ядре, связываются с промотором репортерного гена NF-kB, и в результате мы наблюдаем небольшое количество клеток, экспрессирующих b-gal в первые минуты стимуляции. В связи с присутствием ингибитора ядерная транслокация NF-kB и соответственно экспрессия b-gal прекращаются, но все еще регистрируются в отдельных клетках. Однако когда мы инкубируем клетки в присутствии SN50 в течение 16 часов, ядерный пул NF-kB истощается вследствие ингибирования способности фактора транслоцироваться в ядро. Следовательно, даже после добавления в среду роста TSA и TNF-б экспрессия b-gal не наблюдается ни в нейронах, ни в клетках-сателлитах, потому что ни в ядре, ни в цитоплазме нет молекул NF-kB, способных связаться с промотором.

Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что гистоны в высшей степени деацетилированы в зрелых чувствительных нейронах, поэтому присутствующий в ядре комплекс NF-kB не может связаться со специфическим промотором и активировать NF-kB-зависимые гены.

Таким образом, механизм, с помощью которого p300/CBP и другие коактиваторы усиливают, а HDAC и остальные корепрессоры ингибируют транскрипционную активность NF-кB, является многофакторным (см. рис.45) и включает действие непосредственно на этот транскрипционный фактор и изменения в структуре хроматина. В общем роль деацетилирования гистонов заключается в ингибировании NF-кB путем молекулярных механизмов, специфичных для конкретного стимула и отдельно взятого промотора.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что NF-kB не является обязательным внутренним нейропротекторным фактором в зрелых чувствительных нейронах в условиях перерезки периферического нерва. Более того, мы выявили молекулярный механизм, который опосредован гистоновыми деацетилазами и может объяснить транскрипционную репрессию NF-kB в нейронах спинномозговых ганглиев. Это позволяет предположить, что in vivo функции NF-kB ограничены в зрелой ПНС в отличие от таковых в ЦНС.

Результаты наших исследований указывают на необходимость дальнейших изысканий в области раскрытия роли транскрипционных механизмов в нейрональной репарации. Так, необходимо более детально изучить процессы ацетилирования/деацетилирования гистонов в чувствительных нейронах, в частности их участие в регенерации.

Выводы