Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов

Очистка, биофизическая и биохимическая характеристика вирусов

Введение

Для характеристики вирусов в первую очередь важны их биохимические и биофизические свойства. Чтобы исследовать эти свойства, вирусы необходимо очистить. Разные вирусы требуют специфических методов очистки. В этой работе рассмотрены методы изучения только простейших вирусов, состоящих из белковой оболочки и геномной нуклеиновой кислоты.

1. Очистка вирусов растений

1.1 Растения-хозяева

В идеале для наращивания вируса следует использовать растение, в котором вирус дает системную инфекцию, а для определения инфекционное™ на разных стадиях очистки -- растение, на котором образуются локальные поражения. При выборе системного хозяина необходимо принимать во внимание выход вируса, легкость его экстракции, легкость культивирования растения и возможность контаминации другими вирусами. Растение, на котором образуются локальные поражения, следует использовать для определения периода максимального накопления вируса в основном хозяине и для контроля количества вируса на разных стадиях очистки.

В большинстве случаев, однако, невозможно выполнить многие из этих требований. Часто не удается найти подходящее растение, на котором образуются локальные поражения. В этих случаях для контроля количества вируса можно использовать метод дот-блот гибридизации.

1.2 Экстракция вирусов из растений

Чтобы экстрагировать вирусные частицы из растения, необходимо разрушить клеточные стенки и высвободить содержимое клеток. Обычно экстракцию проводят в буферном растворе и в присутствии соединений, предотвращающих повреждение вирусных частиц высвобождающимися ферментами. Кроме того, действие ферментов замедляется, если экстракцию проводят на холоду. Если отсутствуют специальные указания, все стадии очистки следует проводить при 0--5°С.

Наиболее распространенное приспособление для разрушения растительных клеток -- это гомогенизатор с вращающимися ножами, которые приводятся в движение сверху или снизу. В продаже имеются различные типы гомогенизаторов, и выбор конкретной модели должен определяться эффективностью разрушения растительных тканей, которая зависит от скорости вращения ножей, размера лезвий, угла между ними и формы сосуда. Эффективность разрушения растительных клеток можно повысить путем их предварительного замораживания, хотя в некоторых случаях это приводит к снижению выхода вируса.

Использование гомогенизаторов неудобно, если ткани растения-хозяина очень богаты волокнами или частицы выделяемого вируса длинные и гибкие; в последнем случае при гомотенизации они могут разрушаться \3]. Этих трудностей легко избежать, используя соковыжималку или ступку с пестиком. При очистке вирусов, размножающихся только в сосудистых тканях, например лютео-вирусов, обнаруживаемых во флоэме, ткань листьев необходимо сначала разрушить целлюлазами и пектиназами.

Выбор экстрагирующего буферного раствора может оказать решающее влияние на эффективность очистки вируса. Вирусы с удлиненными частицами, склонные к агрегации или к адсорбции на клеточном дебрисе, лучше всего экстрагировать щелочными буферами с умеренной лонной силой; однако частицы некоторых палочковидных вирусов в щелочной среде повреждаются. Для экстракции многих изометрических вирусов удобны кислые буферные растворы с рН около 5; дополнительное преимущество подобных растворов -- осаждение многих клеточных белков при кислой реакции среды. Некоторые изометрические вирусы, например вирус мозаики огурцов и вирус кольцевой пятнистости табака, при рН около 5 выпадают в осадок, и поэтому для их выделения следует использовать растворы с рН, близким к нейтральному. С другой стороны, некоторые вирусы, например бромовирусы, при рН 7 набухают, и РНК становится доступной для нуклеаз; в этом случае лучше использовать кислые растворы.

Наиболее распространенные дополнительные компоненты используемых растворов -- это восстановители, препятствующие действию полифенолоксидаз, «задубляющих» вирусный капсид-ный белок. Обычно в качестве восстановителей используют 10 мМ аскорбиновую кислоту, 20 мМ аскорбат натрия, 0,5%-ный 2-меркапто-этанол, 20--40 мМ сульфит натрия, 10 мМ тиогликолат натрия или 10--20 мМ диэтилдитиокарбамат натрия; для растений с высокой «дубильной» активностью можно использовать кожевенную пудру. Для подавления активности ферментов и диссоциации рибосом используют также хелатирующие агенты, чаще всего натриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты в концентрации 5--50 мМ. Следует, однако, принимать во внимание возможность стабилизации вирусных частиц двухвалентными катионами. Частицы некоторых вирусов содержатся в белковых включениях, откуда их выделяют путем обработки 2,5--5%-ным тритоном Х-100 в присутствии 1--2 М мочевины в течение ночи.

1.3 Осветление экстрактов

Для очистки вирусных частиц их следует отделить от других компонентов цитоплазмы. В число последних входят органеллы, мембраны, рибосомы и белки, в первую очередь рибулозобис-фосфаткарбоксилаза и фитоферритин. В табл. 1.1 приведены способы обработки, позволяющие эффективно удалять различные контаминанты. При разработке новой методики очистки какого-либо вируса анализируется возможность применения каждого способа грубой очистки путем определения вируса методом локальных поражений или дот-блот гибридизации. Для удаления выпавших в осадок контаминантов или разделения фаз при экстракции органическими растворителями обычно применяют низкоскоростное центрифугирование при 10 000 g в течение 10 мин.

Таблица 1.1. Удаление основных контаминантов при очистке вирусов растений

Контаминант	Способ обработки')
Рибосомы РБФК Фитоферритин Мембраны и органеллы	10 мМ Na2 ЭДТА, 0,5М NaCl, 8%-ный бутанол, хлороформ, нагревание, бентонит 8%-ный бутанол, бутанол/хлороформ, рН 4,9, нагревание, бентонит 10 мМ Na2 ЭДТА, рН 4,9, 8%-иый бутанол, бутанол/хлороформ, нагревание, бентонит Органические растворители, неионные детергенты

1.4 Концентрирование вирусов

Концентрирование обычно осуществляют с помощью поли-этиленгликоля или путем высокоскоростного центрифугирования. Типичные условия осаждения ПЭГ следующие: для палочковидных вирусов используют 2,5% ПЭГ и 0,1 М NaCl, а для изометрических вирусов-- 10% ПЭГ в присутствии 0,1 М NaCl; для эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию соли. Обычно ПЭГ и соль добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном перемешивании и затем собирают осадок вируса центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин. Высокоскоростное центрифугирование большинства типичных изометрических вирусов проводят при 70000 g в течение 3 ч, а большинства палочковидных вирусов --при 50000 g в течение 2 ч.

1.5 Дальнейшая очистка

Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно чист для большинства биохимических и биофизических исследований. Дополнительной очистки достигают зональным или равновесным центрифугированием. Теоретические и практические аспекты центрифугирования детально изложены в другом руководстве. Для вирусов растений можно использовать следующие методы дополнительной очистки.

1.5.1. Зональное вирусов применяют 10--40%-ные сахарозные градиенты. Их можно приготовить одним из следующих способов:

1. С помощью устройства для приготовления градиентов, в котором соответствующим образом смешиваются исходные 10%-ный и 40%-ный растворы сахарозы.

2. Путем наслаивания друг на друга 10, 20, 30 и 40%-ного растворов сахарозы в количествах, приведенных в табл. 1.2, с последующей диффузией при 4 °С в течение ночи.

3. Путем замораживания 25%-ного раствора сахарозы в центрифужных пробирках и медленного оттаивания. Раствор, содержащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента. В большие пробирки не следует вносить больше 5 мг вируса, а в маленькие пробирки -- больше 1 мг. Центрифугирование проводят в роторах со свободно подвешенными стаканами; рекомендуемые режимы центрифугирования указаны в табл. 1.2.

Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху и отобрать через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку или фракционированием через дно пробирки. В последнем случае для контроля скорости вытекания раствора рекомендуется простое приспособление, показанное на рис. 1.1. Возможно использование и более сложных приспособлений, например прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в котором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спектрофотометрическую кювету для регистрации оптической плотности. Простейшее правило, которым следует пользоваться при извлечении зоны вируса из градиента, состоит в том, что вирус не должен проходить через те участки пробирки, в которых концентрируются примеси, т.е. если, например, РБФК находится выше зоны вируса, не следует вытеснять градиент снизу вверх или отбирать зону вируса шприцем через верх пробирки. Сахарозу можно удалить диализом против подходящего буферного раствора или осаждением вируса ПЭГ.

Таблица 1.2. Зональное центрифугирование в градиентах концентрации сахарозы

А. Для получения близких к линейным градиентов методом диффузии при1-веденные объемы растворов сахарозы наслаивают один на другой и оставляют на ночь при 4 С для диффузии.
Размер пробирки, дюймы	Ротор	Объем раствора сахарозы1), мл
		40%	30%	20%	10%
3X1 3,5X1 3,5X9/16 2X0,5	SW25 SW27 SW41 SW50,1	7 8 3 1	7 8 3 1	7 8 3 1	4 & 2 1

Б. Примерное время центрифугирования разных вирусов в градиентах концентрации сахарозы2»

Ротор	Скорость вращения, об/мин	Время центрифугирования разных вирусов3), ч
		вмк	ВЮМБ	втм.
SW27 SW41 SW50.1	24 000 36 000 45 000	4,0 2,5 1,5	3,0 2,0 1,25	2,5 1,5 1,0

1.5.2 Изопикничеекое центрифугирование

Изопикническое центрифугирование для очистки вирусов растений проводят обычно в растворах хлористого или сернокислого цезия. Частицы некоторых вирусов, например мозаики огурцов или мозаики люцерны, разрушаются CsCl, но стабильны в растворах Cs2S04. Частицы других вирусов, например бромовирусов, нестабильны в растворах CsCl при рН выше 7; поэтому их следует центрифугировать при рН 5. По возможности лучше использовать CsCl, так как ион С1~ обладает хаотропными свойствами и способствует удалению клеточных белков и других контаминантов.

Рекомендуемые исходные плотности растворов CsCl и H2SO4 для центрифугирования типичных вирусов в плотностных градиентах приведены в табл. 1.3. Вирус суспендируют в подходящем буферном растворе, а затем добавляют CsCl или H2SO4 в количестве, необходимом для получения нужной исходной плотности; концентрация вируса не должна превышать 1 мг/мл. Центрифужные пробирки с алюминиевыми крышками заполняют раствором CsCl или CS2SO4 только на три четверти, надевают крышки на сухие верхние части пробирок и доливают пробирки маслом. Алюминиевые крышки корродируют под влиянием солей цезия, что может в конце концов привести к аварии при центрифугировании. Изопикнические градиенты получают центрифугированием в роторе SW40 при 36 000 об/мин или SW50 при 40 000 об/мин в течение 18 ч. Лучший результат достигается при центрифугировании в угловых роторах, а не в бакет-роторах по причинам, изложенным в руководстве.

Зоны вируса обнаруживают при освещении пробирки сверху и извлекают шприцем, проколов пробирку сбоку. Соли цезия затем удаляют диализом.

1.6 Что такое «чистота»?

Необходимая степень очистки вируса определяется тем, какие биофизические или биохимические методы будут применены для его исследования в дальнейшем. Очевидно, что препараты, используемые для анализа вирусных нуклеиновых кислот или капсидных белков, должны быть очищены от клеточных примесей более тщательно, чем препараты, предназначенные для электронной микроскопии или седиментационного анализа.

1.7 Хранение вирусных препаратов

Очищенные препараты некоторых вирусов хранят в замороженном виде при --20°С, однако следует отметить, что замораживание влияет на структуру и стабильность некоторых вирусов. Полезной защитной добавкой может оказаться хлорбутанол, не влияющий ни на биологические свойства, ни на спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Для предотвращения бактериального роста добавляют один-два кристалла азида натрия; при работе с этим веществом следует соблюдать, осторожность.

1.8 Конкретные методики очистки

Ниже приведены четыре методики очистки вирусов, в которых используют рассмотренные выше приемы. Прежде чем начать работу с любым из вирусов, следует ознакомиться с действующими правилами защиты растений.

1.8.1 Вирус мозаики костра

Эту методику можно использовать при очистке изометрических вирусов, не выпадающих в осадок при рН 5.

1. Вирус наращивают на ячмене 10--12 дней. Собирают листья. Все дальнейшие процедуры проводят при 4°С.

2. Гомогенизируют листья в 2 мл 0,1 М ацетата натрия на 1 г листьев.

3. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g. Собирают супернатант.

4. К супернатанту добавляют ПЭГ 6000 до концентрации 10% и NaCl до 0,1 М и перемешивают в течение 1 ч.

5. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и ресу-спендируют осадок в 1/10 исходного объема в 0,1 М ацетате натрия.

6. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают супернатант.

7. Добавляют CsCl до плотности 1,36 г/см3 и центрифугируют 18 ч при 36 000 об/мин в роторе R40.

8. Из градиента извлекают вирусную зону и диализуют по меньшей мере против 100 объемов 0,1 М ацетата натрия 3--4 ч для удаления CsCl.

9. Повторяют стадии 4 и 5. Вирус ресуспендируют в 1 мл 0,1 М ацетата натрия на 100 г исходной листовой массы.

1.8.2 Вирус мозаики люцерны

Эту методику можно использовать для очистки вирусов, выпадающих в осадок при кислых рН и чувствительных к высоким концентрациям солей.

1. Вирус наращивают на табаке 10-- 12 дней. Собирают листья. Все дальнейшие процедуры проводят при 4 °С.

2. 100 г листьев гомогенизируют в 100 мл 10 мМ раствора К2Н/КН2РО4, рН 7,1', к которому предварительно добавляют 1 г аскорбиновой кислоты и 3,5 мл 50%-ного К2НРО4.

3. Добавляют равный объем смеси хлороформ/бутанол и повторяют гомогенизацию.

4. Смесь центрифугируют 5 мин при 5000 g. Собирают водную фазу.

5. Центрифугируют водную фазу 3 ч при 27000 об/мин в роторе R30.

6. Осадок ресуспендируют в 1/10 исходного объема в 10 мМ фосфатном буфере.

7. Добавляют CS2SO4 до плотности 1,30 г/см3 и центрифугируют 18 ч при 36 000 об/мин в роторе R40.

8. Зону вируса извлекают из градиента и диализуют по меньшей мере против 100 объемов 10 мМ фосфатного буфера <рН 7,1).

9. Повторяют стадии 5 и 6, ресуспендируя осадок вируса в 10 мМ фосфатном буфере, из расчета 1 мл на 100 г исходной листовой массы.

1.8.3 Вирус табачной мозаики

Настоящая методика применима только к вирусам с очень стабильными частицами. Она не требует использования ультрацентрифуги.

1. Вирус наращивают на табаке 2-- 3 нед..

2. Листья гомогенизируют в 1 мл 10 мМ трис-HCl на 1 г листовой массы. Сок фильтруют через марлю.

3. Сок прогревают 10 мин при 55 °С.

4. Сок центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают су-пернатант.

5. Добавляют ПЭГ до конечной концентрации 2,5% и NaCl до 0,1 М, перемешивают 1 ч и центрифугируют 10 мин при 10 000 g.

6. Осадок ресуспендируют в 10 мМ трис-HCl, центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают супернатант.

7. Стадии 5 и 6 повторяют 2--3 раза. Последний осадок ресуспендируют в 10 мМ трис-HCl.

Метод позволяет получить препарат средней степени чистоты. Дальнейшую очистку можно провести зональным или изопикни-ческим центрифугированием, что требует использования ультрацентрифуги.

1.8.4 Х-вирус картофеля

1. Вирус наращивают на табаке 2--3 нед.

2. Каждый грамм листьев гомогенизируют в 1 мл 0,02 М бората натрия, содержащем 0,01 М аскорбата натрия.

3. Суспензию фильтруют через марлю и добавляют к соку тритон Х-100 до конечной концентрации 0,5%; перемешивают 1 ч.

4. Суспензию центрифугируют 10 мин при 10 000 g и собирают супернатант.

5. Экстракт наслаивают на 5-мл столбик 30%-ной сахарозы в 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА в пробирке от ротора R30; центрифугируют 3 ч при 27 000 об/мин.

6. Осадок ресуспендируют в 1/10 объема 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА в течение ночи.

7. Экстракт центрифугируют 10 мин при 10 000 об/мин, собирают супернатант и центрифугируют 1,5 ч при 45000 об/мин в роторе R50.

8. Осадок ресуспендируют в 1 мл 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА на 50 г исходной листовой массы.

При необходимости дальнейшую очистку проводят изопикническим центрифугированием.

2. Биофизическая характеристика

2.1 Необходимость биофизической характеристики

Биофизические свойства вирусов изучаются для того, чтобы получить информацию о размере, форме, молекулярной массе и структуре вирусных частиц. Во многих случаях с вирусными частицами можно работать как с простыми макромолекулами, у которых периодически повторяются элементы поверхностной структуры. Для исследования вирусов в настоящее время применяют высокочувствительные методы, но я остановлюсь только на тех методах, которыми можно воспользоваться в стандартных лабораторных условиях.

2.2 Ультрафиолетовые спектры

Подавляющее большинство простых вирусов состоит в основном из белка и нуклеиновой кислоты; каждый из этих компонентов имеет характерный спектр поглощения в ультрафиолете. Спектр поглощения целых вирусных частиц таким образом представляет собой комбинацию спектров белка и нуклеиновой кислоты. Поскольку для нуклеиновых кислот в области максимума удельное поглощение намного выше, чем для белка, спектр вирусных частиц в основном определяется спектром нуклеиновой кислоты. Удельное поглощение нуклеиновых кислот мало зависит от нуклеотидного состава, однако для белков оно определяется содержанием ароматических аминокислот. Поэтому спектральные характеристики вируса нельзя использовать для определения процентного содержания нуклеиновой кислоты.



Спектр поглощения можно использовать для определения концентрации вируса. Чтобы определить коэффициент экстинк-ции неизученного вируса, можно воспользоваться следующим методом:

1. Препарат вируса диализуют против большого объема подходящего буферного раствора, например 10 мМ ацетата натрия или 10 мМ фосфатного буфера. Диализный раствор сохраняют.

2. Отбирают часть препарата, разводят в необходимое число раз и определяют спектр поглощения при 220--360 им. Если требуется, уточняют значение для 260 нм, вводя поправку на светорассеяние.

3. В предварительно высушенные сосуды известной массы переносят равные объемы образцов препарата и диализного буфера. Растворы упаривают досуха либо путем лиофилизации, либо поместив их сначала в термостат на 50 °С, а затем в вакуумный испаритель.

4. Сосуды периодически взвешивают до достижения постоянного веса.

5. Коэффициент экстинкции рассчитывают, разделив значение Егбо на разность сухих весов препарата вируса и диализного буфера.

Поправку на светорассеяние определяют следующим образом:

1. Измеряют поглощение при нескольких длинах волн между 300 и 360 нм.

2. Строят график зависимости log от log и экстраполируют к 260 нм.

3. Взяв антилогарифм экстраполированного значения для 260 нм и разделив на 100, подсчитывают величину светорассеяния.

4. Путем вычитания величины светорассеяния при 260 нм из А26ОНМ для вирусного препарата получают исправленную величину поглощения.

2.3 Седиментационные свойства

Седиментационные характеристики частиц, содержащихся в вирусных препаратах, можно исследовать либо методом зонального центрифугирования в градиентах концентрации сахарозы, либо методом аналитического ультрацентрифугирования.

Детальное описание обоих методов имеется в руководстве. Дополнительные данные об использовании аналитической ультрацентрифуги и простые графические приемы определения коэффициента седиментации можно найти в работе. Поскольку данная тема подробно отражена в этих двух работах, я приведу здесь лишь простой метод расчета коэффициента седиментации.

10--40%-ные градиенты концентрации сахарозы готовят, как описано в разд. 2.5.1. При этом лучше всего использовать специальное приспособление. Маркерные вирусы подбирают с таким расчетом, чтобы коэффициент седиментации исследуемого вируса лежал между коэффициентами седиментации маркеров, а содержание нуклеиновой кислоты в исследуемом вирусе и в маркерах было по возможности одинаковым. Последняя предосторожность позволяет избежать искажения коэффициента седиментации из-за увеличения плотности раствора сахарозы. Достаточные для обнаружения зон количества исследуемого вируса и маркеров центрифугируют в параллельных градиентах. Коэффициент седиментации исследуемого вируса можно определить путем сравнения расстояния, пройденного им в градиенте, с расстоянием, пройденным маркерами. В этом случае зоны локализуют визуально, освещая пробирки сверху и измеряя расстояние от мениска. Можно также пропустить градиент через проточную спектрофотометрическую кювету или фракционировать его и измерить А2бо в каждой фракции, что позволяет более точно определить миграцию исследуемого вируса и маркеров в градиенте. При использовании небольших количеств вируса фракции, содержащие исследуемый вирус и маркеры, можно идентифицировать методом дот-блот гибридизации.

2.4 Коэффициенты диффузии

Хотя коэффициент диффузии вирусной частицы обратно пропорционален ее стоксовскому радиусу, его нельзя определить, измеряя частицы под электронным микроскопом. Это связано с тем, что частицы, исследуемые с помощью электронного микроскопа, не гидратированы; в растворе же частицы гидрати-руются, и это влияет на их истинный радиус.

Единственный реальный способ измерения коэффициента диффузии вируса состоит в том, чтобы создать четкую границу между раствором вируса и растворителем и затем измерить скорость ее смещения. Это делается в аналитической ультрацентрифуге; соответствующие методы подробно описаны в работе.

2.5 Определение молекулярной массы

Известны два стандартных метода определения молекулярной массы вирусных частиц: на основе гидродинамических данных и по содержанию капсидного белка и нуклеиновой кислоты.

Расчет с использованием гидродинамических данных основан на уравнении Сведберга

где М -- молекулярная масса вируса; R -- универсальная газовая постоянная; s -- коэффициент седиментации; D -- коэффициент диффузии; v -- парциальный удельный объем; б -- плотность растворителя; Т--абсолютная температура. Парциальный удельный объем можно непосредственно определить с помощью пикнометра или рассчитать непрямым способом, исходя из удельного содержания нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц. Так, если процентное содержание нуклеиновой кислоты известно, парциальный удельный объем можно вычислить, используя для РНК значение v = 0,55 см3/г и для белка v = 0,74 см3/г.

Поскольку коэффициент диффузии и коэффициент седиментации обычно определяют при 20 °С и вводят поправку на концентрацию солей, можно принять 6 = 0,9982 и Т = 293,3 К.

Второй метод расчета молекулярной массы включает определение процентного содержания нуклеиновой кислоты, ее молекулярной массы и числа молекул в вирусной частице. Вместо этих данных можно использовать сведения о процентном содержании капсидного белка, числе субъединиц и их молекулярной массе. Если в расчетах используются данные о нуклеиновой кислоте, а молекулярная масса капсидного белка известна, можно рассчитать число субъединиц в составе одной вирусной частицы. Расчеты могут быть полезны при интерпретации структуры, наблюдаемой на электронных микрофотографиях.

Основное различие между двумя методами состоит в том, что при гидродинамическом подходе определяется молекулярная масса гидратированной частицы, в то время как другой подход никак не учитывает гидратацию. Поэтому для некоторых целей гидродинамический подход незаменим. Однако, если значение молекулярной массы вирусной частицы нужно исследователю для определения, например, числа субъединиц капсидного белка или молекул нуклеиновой кислоты в составе частицы, оптимальным является второй подход.

2.6 Плавучая плотность

Факторы, которые следует принимать во внимание при изопикническом центрифугировании вирусов в растворах CsCl или CS2SO4, рассмотрены в разд. 2.5.2. Детальное описание других сред, используемых для приготовления плотностных градиентов, можно найти в руководстве. Как и коэффициент седиментации, плавучую плотность можно определить в аналитической или препаративной ультрацентрифуге. Использование аналитической ультрацентрифуги описано в работе. Чтобы определить плавучую плотность в препаративной ультрацентрифуге, вирусные частицы центрифугируют до равновесия в угловом роторе, градиенты фракционируют, определяют плотности фракций и идентифицируют фракции, содержащие вирусные частицы. Фракционировать градиент можно с помощью устройства, показанного на рис. 1.1, или ему подобного. Плотности фракций можно измерить, используя рефрактометр и таблицу перехода от показателя преломления к плотности или взвешивая образцы с известным объемом. Фракции, содержащие вирус, можно идентифицировать путем измерения А2ео или методом дот-блот гибридизации. Последний метод полезен, если для центрифугирования применяется среда, интенсивно поглощающая в ультрафиолете.

Использование значения плавучей плотности для определения относительного содержания нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц может привести к ошибочным результатам за счет различий в связывании или проникновении ионов Cs+ в вирусные частицы, а также влияния используемой для центрифугирования среды на их гидратацию.

2.7 Электронная микроскопия

В настоящей работе не представляется возможным подробно описать методы приготовления образцов для электронной микроскопии и работу с электронным микроскопом. Но, поскольку электронная микроскопия является одним из самых важных и полезных методов исследования формы и структуры вирусных частиц, я все же привожу здесь некоторые соображения.

2.7.1 Негативное контрастирование

Негативное контрастирование -- основной метод визуального исследования вирусных частиц. Для многих вирусов в качестве негативного контрастирующего вещества подходит ФВК, но некоторые вирусные частицы повреждаются или разрушаются в присутствии этого вещества. Альтернативным контрастирующим веществом может быть УА, но и оно повреждает некоторые вирусы. Существуют и другие, более мягкие контрастирующие вещества, в том числе молибдат аммония, вольфрамат натрия, доведенный до рН 6,5 муравьиной кислотой, и незабуференный метиламинвольфрамат. Проверив несколько контрастирующих веществ, можно подобрать то, которое наилучшим образом выявляет структуру капсида данного вируса.

2.7.2 Контроль увеличения

Увеличение на электронных микрофотографиях должно быть тщательно откалибровано, лучше всего с использованием внутреннего маркера, помещенного на ту же сеточку, что и исследуемый материал. Увеличение, установленное на электронном микроскопе, не всегда отражает реальность; могут даже наблюдаться вариации увеличения на разных участках одной и той же сеточки. Одним из лучших внутренних маркеров могут служить кристаллы каталазы; можно использовать и частицы ВТМ, имеющие среднюю длину 300 нм-и шаг спирали 2,3 нм.

2.8 Обнаружение вирусов методом дот-блот гибридизации

Данный метод включает иммобилизацию вирусной нуклеиновой кислоты на нитроцеллюлозе и гибридизацию ее с комплементарной нуклеиновой кислотой в качестве зонда. Экстрагировать нуклеиновую кислоту из вирусных частиц перед нанесением на нитроцеллюлозу нет необходимости. Фракции, сахарозных или цезиевых градиентов можно наносить непосредственно, не удаляя среды, используемой для центрифугирования.

2.8.1 Иммобилизация однонитевых вирусных РНК и ДНК

1. Лист нитроцеллюлозы размечают мягким карандашом для того, чтобы пятна после нанесения можно было обнаружить. Работать с нитроцеллюлозой следует в резиновых перчатках.

2. Нитроцеллюлозу смачивают в дистиллированной воде,, а затем вымачивают в растворе 20XSSC 5--10 мин.

3. Избыток SSC, оставшийся на нитроцеллюлозе, удаляют фильтровальной бумагой.

4. В случае необходимости готовят соответствующие разведения препарата вируса или фракций градиента в 50 мМ натрий-фосфатном буфере.

5. В отмеченные точки на листе нитроцеллюлозы наносят по 5 мкл препарата вируса или фракций градиента. Дают раствору впитаться.

6. Нитроцеллюлозу накрывают листом бумаги Whatman ЗММ и прогревают при 80 °С в вакууме по крайней мере 2 ч. При отсутствии вакуумной печи нитроцеллюлозу сушат сначала на воздухе, затем -- под лампой, после чего прогревают 2 ч при 80 °С.

2.8.2 Иммобилизация двунитевых вирусных РНК и ДНК

1. Нитроцеллюлозу подготавливают, как указано выше.

2. Отбирают аликвоты препарата вируса или фракций градиента объемом 8 мкл и добавляют к каждой 2 мкл 0,5 М NaOH. Раствор инкубируют при комнатной температуре 10 мин в случае ДНК или 5 мин в случае РНК.

3. Добавляют по 2 мкл 3 М. ацетата натрия; в случае необходимости готовят соответствующие разведения на буфере 1XSSC.

4. Образцы объемом 5 мкл наносят на нитроцеллюлозу и прогревают, как описано выше.

Если ДНК суперспирализована, ее следует депуринизиро-вать, приливая к аликвотам объемом 5 мкл по 5 мкл 0,5 М. НС1 перед добавлением NaOH.

2.8.3 Приготовление зондов

Зонды обычно представляют собой двунитевую ДНК или однонитевую комплементарную ДНК, полученную путем обратной транскрипции РНК. Существует много методов получения зондов. Ниже приведены два широко распространенных метода.

Ник-трансляция двунитевой ДНК

1. Исходные растворы: буфер 10XNT:

50 мМ трис-HCl 5 мМ MgCl2

10 мМ 2-меркаптоэтанол Концентрированные растворы дезоксирибонуклеотидов: 0,1 мМ dATP, dTTP, dCTP и dGTP. Растворы хранят замороженными до использования. Размораживают как можно быстрее.

2. ДНКаза: следует пользоваться ДНКазой, не содержащей РНКазы, например DN-EP фирмы Sigma. Раствор с концентрацией 2 мг/мл хранят в замороженном виде в 10 мМ трис-HCl и 1 мМ MgCl2. Перед использованием раствор разводят в 1000 раз.

Смешивают 1 мкг ДНК, 2,5 мкл буфера 10xNT, доводят водой до общего объема 24 мкл и добавляют 1 мкл разведенного раствора ДНКазы. Смесь инкубируют 15 мин при 37 °С, после чего прогревают 10 мин при 70 °С для инактивации ДНКазы.

3. Высушивают 20 мкКи -dATP или -dCTP в вакуумном испарителе.

4. К высушенному меченому dNTP добавляют раствор ДНК и по 0,5 мкл каждого из трех оставшихся концентрированных растворов dNTP. Добавляют 2 единицы ДНК-по-лимеразы-I Escherichia coli и инкубируют смесь 60 мин при 15 °С или при комнатной температуре. Реакцию останавливают прогреванием смеси при 70 °С в течение 10 мин.

5. Не включившиеся в ДНК dNTP удаляют хроматографией на колонке. Для этого суспендируют сефадекс G-100 в буфере G-100. Колонку делают из пластмассовой пипетки объемом 1 мл, из нее удаляют большую часть ватной пробки, а остальную вату помещают в кончик пипетки. Пипетку заполняют буфером G-100 и удаляют пузыри воздуха. По мере вытекания раствора добавляют суспензию сефадекса G-100 до тех пор, пока колонка не будет набита. Колонку промывают буфером G-100 примерно 30 мин. К раствору ДНК после ник-трансляции добавляют 2 мкл 0,06% раствора красителя оранжевого G в 10%-ном фиколле и 0,5% додецилсульфат натрия и наносят полученную смесь на колонку. Прохождение радиоактивной метки по колонке можно контролировать с помощью стандартного мини-счетчика Гейгера или собирая фракции. ДНК, меченная ник-трансляцией, должна элюироваться в свободном объеме, а не включившиеся dNTP вместе с оранжевым G -- в полном объеме.

Обратная транскрипция РНК. При использовании для обратной транскрипции статистической затравки получают популяцию кДНК, в которой представлены копии всех участков рнк.

1. Исходные растворы: буфер 10XRT:

0,5 М трис-HCl

0,1 М MgCl2,

1,4 М КС1. 10ХМЕ:

0,3 М 2-меркаптоэтанол. Концентрированные растворы dNTP:

10 мкл 10 мМ раствора каждого из немеченых dNTP и

10 мкл 0,1 мМ раствора тех же меченых dNTP. Затравка.

ДНК тимуса теленка или спермы лосося суспендируют в концентрации 5 мг/мл в 10 мМ трис-HCl и 10 мМ MgCl2. Добавляют ДНКазу I до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубируют раствор 2 ч при 37 °С, после чего автоклавируют 10 мин при 121 °С.

2. Смешивают 1 мкг РНК, 20 мкл ДНК-затравки и воду до конечного объема 30 мкл. Раствор прогревают 1 мин при 100 °С и охлаждают при комнатной температуре.

3. Высушивают в вакуумном испарителе 20 мкКи -dATP или -dCTP.

4. К высушенной радиоактивной метке добавляют раствор РНК, после чего добавляют:

5 мкл 10хбуфера,

5 мкл 10ХМЕ,

10 мкл каждого из dNTP, 10--12 единиц обратной транскриптазы вируса птичьего миелобластоза. Инкубируют смесь 1,5 ч при 37 °С.

5. Добавляют 11 мкл 3 М NaOH, 10 мМ ЭДТА и прогревают смесь 3 ч при 70 °С или в течение ночи при 37 °С.

6. Добавляют 11 мкл 3 М НС1.

7. Добавляют 5 мкл раствора оранжевого G и пропускают смесь через колонку с сефадексом G-50.

2.8.4 Гибридизация на нитроцеллюлозе

Сначала проводят предгибридизацию нитроцеллюлозы, чтобы блокировать участки неспецифического связывания, а затем инкубируют с зондом в условиях, способствующих гибридизации. Гибридизацию можно проводить двумя путями: при 65 °С в 3XSSC или при 42°С в 3XSSC в присутствии 50% формами-да. В первом случае гибридизация идет быстрее, но иногда возможно повреждение иммобилизованной на фильтре РНК; если это происходит, следует проводить гибридизацию в присутствии формамида.

1. 20X раствор Денхардта:

0,4% бычьего сывороточного альбумина, 0,4% фи-колла 400, 0,4% поливинилпирролидона, 5 мМ ЭДТА. 20XSSC:

3 М NaCl,

0,3 М цитрат натрия. ДНК:

10 мг/мл ДНК спермы лосося или тимуса теленка в 5 мМ ЭДТА обрабатывают ультразвуком, пока раствор не утратит вязкость, прогревают и быстро охлаждают. Формамид:

формамид деионизируют, перемешивая со смолой «Амберлит МВЗ» до достижения рН 6,8--7,0, удаляют смолу фильтрованием через марлю и используют немедленно или хранят при --70°С. Растворы для предгибридизации и гибридизации:

а) 4Храствор Денхардта, 3XSSC,

10 мкг/мл ДНК;

б) тот же раствор, содержащий 50% формамида.

2. Сухой нитроцеллюлозный фильтр помещают в мешочек из толстого полиэтилена и заплавляют с трех сторон достаточно близко к фильтру. Добавляют раствор для предгибридизации из расчета 0,2 мл на 1 см2 фильтра, удаляют пузыри воздуха и заплавляют четвертую сторону мешочка, оставив место, чтобы мешочек можно было разрезать и вновь заплавить. Мешочек инкубируют в водяной бане при 65°С или при 42 °С в течение 2--5 ч.

3. Готовят смесь для гибридизации, представляющую собой свежий раствор для предгибридизации, к которому добавлено 1--5-Ю6 имп/мин зонда, полученного методом ник-трансляции, или 0,5--2,5-106 имп/мин зонда, полученного обратной транскрипцией. Зонд следует прогреть 1--2 мин при 100°С и быстро охладить во льду перед внесением в смесь для гибридизации. Мешочек разрезают, выливают предгибридизационный раствор, добавляют смесь для гибридизации, удаляют пузыри воздуха и вновь запаивают мешочек. Мешочек инкубируют в водяной бане при 65°С или при 42°С в течение 18--24 ч.

4. Мешочек открывают и вынимают фильтр. Фильтр помещают в подходящий сосуд и промывают 4 раза 250 мл 2XSSC, содержащего 0,1% ДДС-Na. Для раствора а каждую промывку следует проводить в течение 10--15 мин при 65°С, а для раствора б фильтр нужно сначала один раз промыть при комнатной температуре, а затем -- при 65 °С.

5. Фильтр промокают бумагой Whatman ЗММ, сушат на воздухе, помещают на другой лист такой же бумаги, прикрывают липкой пленкой и проводят авторадиографию.

3. Биохимический анализ

В данном разделе описаны методы определения типа, содержания и размера нуклеиновой кислоты вирусных частиц, а также числа и молекулярной массы индивидуальных белков, образующих капсид.

В сочетании с биофизическими данными, полученными, как описано в разд. 3, результаты этих исследований можно использовать для характеристики состава и структуры вирусных частиц.

3.1 Выделение нуклеиновых кислот

Легкость экстракции нуклеиновых кислот неодинакова для разных вирусов. Перед тем как удалять капсидный белок, полезно понизить прочность белок-белковых взаимодействий. Для этого обычно используют буферные растворы с щелочным рН и хелатирующие агенты, например ЭДТА. Ниже приведены три метода, пользуясь которыми можно выделить нуклеиновую кислоту из большинства вирусов. Первые два метода включают денатурацию и последующее удаление капсидного белка. Третий метод применим к вирусам, капсидные белки которых устойчивы к денатурирующим воздействиям.

При работе с нуклеиновыми кислотами следует делать все возможное, чтобы избежать загрязнения нуклеазами. Для всех процедур нужно использовать либо пластиковую посуду одноразового пользования, автоклавируемую перед употреблением, либо высококачественное стекло, которое следует вымыть детергентом, тщательно промыть дистиллированной водой и прокалить при 200 °С. При необходимости посуду перед использованием можно сполоснуть 0,1%-ным раствором диэтилпирокар-боната. Все растворы по возможности следует авто-клавировать, а затем хранить в стерильных условиях. Полезно помнить, что активность ДНКазы подавляется ЭДТА. Ингибировать РНКазу труднее, но ДДС-Na или ДЭП подавляют и ее активность. Однако при этом следует иметь в виду, что ДЭП может повлиять на биологическую активность нуклеиновых кислот, а ДДС-Na ингибирует многие ферменты и трансляционные системы.

3.1.1 Экстракция фенолом в присутствии ДДС-Na

1. Насыщенный буфером фенол готовят, добавляя к 500 г кристаллического фенола 55 мл буфера и нагревая колбу в горячей воде. Когда все кристаллы растворятся, следует добавить еще ПО мл буфера. При охлаждении раствор должен расслаиваться на фенольную и водную фазы. Можно добавить к насыщенному фенолу 8-гидроксихинолин и ж-крезол, чтобы предотвратить окисление фенола и связать имеющиеся в нем примеси; раствор фенола не должен быть окрашен в розовый или бурый цвет.

При работе с растворами фенола следует соблюдать предельную осторожность, поскольку они могут вызвать серьезные ожоги. Работать нужно только в перчатках, а если приходится встряхивать пробирки, надевать защитные очки. Ни в коем случае не следует набирать содержащие фенол растворы с помощью пипетки ртом. Использованные растворы необходимо вылить, также соблюдая меры безопасности, а посуду -- тщательно сполоснуть, прежде чем передать для мытья обслуживающему персоналу. Если фенол все же попал на кожу, пострадавшее место нужно промыть раствором, состоящим из трех частей насыщенного раствора полиэтиленгликоля и одной части 95%-ного этанола. Затем следует обратиться к врачу.

2. Вирус должен быть суспендирован в подходящем буфере, содержащем при необходимости ЭДТА. К суспензии добавляют ДДС-Na до концентрации 1% и прогревают 5 мин при 50 °С. После этого раствор должен быть прозрачным.

3. К содержащему вирус раствору добавляют равный объем насыщенного фенола и встряхивают до образования гомогенной эмульсии. Не следует затягивать пробирки парафильмом, так как он растворяется в присутствии фенола1'; лучше использовать липкую пленку.

4. Фазы разделяют центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин и отбирают водную фазу.

5. Стадии 3 и 4 повторяют до тех пор, пока в интерфазе не перестанет обнаруживаться денатурированный белок.

6. Водную фазу дважды промывают безводным диэтиловым эфиром, отбрасывая каждый раз верхнюю фазу.

7. Если ионная сила в растворе полученной нуклеиновой кислоты ниже 0,1 М, добавляют 1/20 объема 3 М ацетата натрия. После этого нуклеиновую кислоту осаждают, добавляя 2,5 объема охлажденного абсолютного этанола и оставляя пробирку на 18 ч при --20 °С или на 1 ч при --70 °С.

Примечания: для эффективной экстракции нуклеиновой кислоты концентрация белка в вирусной суспензии не должна превышать 5 мг/мл. Если нуклеиновая кислота содержит последовательность poly, для экстракции нужно использовать смесь фенол: хлороформ.

3.1.2 Экстракция перхлоратом натрия в присутствии ДДС-Na

Данный метод не требует использования фенола.

1. К раствору вируса добавляют 0,25 объема 25%-ного ДДС-Na и прогревают 3 мин при 60 °С в пробирке из полиалломера.

2. Добавляют три объема 100%-ного NaC104 и смесь интенсивно встряхивают.

3. Пробирку центрифугируют в бакет-роторе в микроцентрифуге 3--5 мин. В результате образуется слой белка, связанного с ДДС-Na, расположенный над жидкой фазой.

4. Жидкую фазу собирают, прокалывая дно пробирки.

5. Нуклеиновую кислоту осаждают, как описано выше.

3.1.3 Экстракция с помощью ДДС-Na и протеазы

1. Проназу или протеазу К растворяют в SSC в концентрации 10 мг/мл и преинкубируют 30 мин при 37 °С для разрушения нуклеаз.

2. Раствор вируса в SSC инкубируют с проназой и 0,1--0,5% ДДС-Na 3--18 ч при 37°С.

3. Проводят экстракцию фенолом или NaC104 в присутствии ДДС-Na, как описано выше.

3.2 Определение типа нуклеиновой кислоты

Нуклеиновая кислота вируса может быть представлена дву-нитевой или однонитевой РНК или ДНК. Тип нуклеиновой кислоты можно определить ферментативным или химическим путем.

3.2.1 Химическое определение типа нуклеиновой кислоты

В настоящее время этот подход широко не используется. Однако в некоторых случаях может возникнуть необходимость применить какой-либо из химических методов. Для обнаружения ДНК проводят дифениламиновую реакцию, а в случае РНК -- реакцию с орцинолом или ее модификацию.

3.2.2 Ферментативное определение типа нуклеиновой кислоты

Этот подход применяют в сочетании с гель-электрофорезом нуклеиновых кислот. Обработка РНКазой

1. Для освобождения РНКазы от ДНКазы раствор РНКазы А в 10 мМ трис-HCl и 15 мМ NaCl прогревают 15 мин при 100°С, медленно охлаждают до комнатной температуры, делят на аликвоты и хранят при --20 °С.

2. Однонитевая РНК гидролизуется РНКазой А при 25°С в течение 15 мин в 2XSSC. Двунитевая РНК в этих условиях устойчива к РНКазе, но гидролизуется при концентрации соли менее O.lXSSC.

Обработка ДНКазой

1. Нужно использовать ДНКазу, свободную от РНКазы; ее растворяют в концентрации 10 мг/мл в 10 мМ трис-HCl и 2 мМ MgCl2.

2. Для выявления ДНК нуклеиновую кислоту обрабатывают ДНКазой 15 мин при 37 °С в 10 мМ трис-HCl и 2 мМ MgCl2. Реакцию можно остановить прогреванием в течение 5 мин при 70 °С или добавлением ЭДТА до концентрации 5 мМ.

3.3 Определение содержания нуклеиновой кислоты

Как отмечено в разд. 3.5, сведения об относительном содержании нуклеиновой кислоты и белка в составе вирусных частиц необходимы для того, чтобы непрямым методом рассчитывать их парциальный удельный объем. Использование для определения доли нуклеиновой кислоты спектров поглощения в ультрафиолете или плавучей плотности может приводить к неправильным результатам. Существует четыре метода определения содержания РНК, из них три прямых и один непрямой.

3.3.1 Определение содержания фосфора

Вирусные РНК содержат 8,1--9,6% фосфора; точное значение зависит от нуклеотидного состава, методы определения которого описаны в работе. В принципе можно пользоваться приблизительной величиной 9,3%.

1. Вирус диализуют против большого объема дистиллированной воды и доводят до известной концентрации.

2. Аликвоты вируса объемом 0,5 мл переносят в три мерные пробирки объемом 4 мл.

3. В каждую пробирку добавляют 0,5 мл 60%-ной хлорной кислоты.

4. Готовят стандарт, растворяя 112,5 мг безводного КН2Р04 в 500 мл воды. Образцы этого раствора переносят в мерные пробирки, доводят при необходимости объем до 0,5 мл и добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл 60%-ной хлорной кислоты.

5. Пробирки инкубируют в термостате при 190--200 °С в течение 20--30 мин. Необходимо убедиться, что растворы вирусов не содержат больших количеств посторонних органических веществ, например глицерина, так как это может вызвать взрыв.

6. Пробирки охлаждают при комнатной температуре и добавляют в каждую по 5 капель не содержащей фосфора перекиси водорода.

7. Вновь помещают пробирки в термостат на 15 мин.

8. Пробирки охлаждают при комнатной температуре и добавляют в каждую по 0,4 мл 5%-ного раствора молибдата аммония, перемешивают раствор, вращая пробирки, и добавляют по 0,1 мл водного раствора, содержащего 0,2% 1,2,4-аминонафтолсульфоновой кислоты, 12% бисульфита натрия и 2,4% сульфита натрия. Объем доводят водой до 4 мл.

9. С помощью спектрофотометра определяют поглощение в синей области спектра против контроля, приготовленного, как описано выше, но с 0,5 мл воды вместо исследуемого раствора.

10. Строят калибровочную кривую и определяют содержание фосфора.

3.3.2 Дифениламиновая или орциноловая реакции

Содержание ДНК или РНК в препарате вируса можно определить с помощью количественных вариантов дифениламиновой или орциноловой реакций. Описание этих реакций можно найти в работах и или.

3.3.3 Гидролиз РНК

Чтобы провести точный расчет на основе данного метода, необходимо знать нуклеотидный состав РНК. Методы определения нуклеотидного состава приводятся в работе.

1. К известному количеству вируса в 0,01 М натрий-фосфатном буфере добавляют 1/10 объема 11,9 М соляной кислоты и инкубируют в плотно закрытой пробирке в течение ночи при комнатной температуре.

2. Центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин для удаления денатурированного белка и отбирают супернатант, содержащий освободившиеся при гидролизе нуклеотиды.

3. Используя для разведений 1 М НС1, измеряют Е2бо супер-натанта.

4. Используя данные о нуклеотидном составе РНК и коэффициенты экстинкции индивидуальных нуклеотидов, рассчитывают количество РНК в образце вируса известной массы.

3.3.4 Непрямой метод

В некоторых случаях можно рассчитать относительное содержание нуклеиновой кислоты, зная число белковых субъединиц в вирусной частице, их молекулярные массы и молекулярную массу нуклеиновой кислоты.

3.4 Гель-электрофорез нуклеиновых кислот

Количество различных типов нуклеиновых кислот в вирусном препарате и их молекулярные массы можно установить с помощью гель-электрофореза, который используют и для определения типа и структуры нуклеиновой кислоты.

Для точного определения молекулярных масс одноцепочечных нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза исследуемую нуклеиновую кислоту и маркеры необходимо денатурировать для разрушения вторичной структуры, которая зависит от типа нуклеиновой кислоты, а также от концентрации одно- и двухвалентных катионов.

3.4.1 Денатурация глиоксалем

1. 40%-ный глиоксаль деионизируют, перемешивая с ионообменной смолой AG 501-Х8 до установления постоянного рН. Процедура может занять несколько часов и потребовать нескольких смен смолы. После этого смолу уда ляют фильтрованием через марлю, делят деионизированный глиоксаль на порции и хранят его при --70 °С.

2. Готовят денатурирующий раствор следующего состава:

деионизированный глиоксаль -- 0,894 мл деионизированный формамид --3,89 мл 500 мМ фосфат натрия --0,111 мл дистиллированная вода -- 0,195 мл Всего: 5,0 мл Раствор делят на порции и хранят при -- 70 °С.

3. 2 мкл раствора ДНК или РНК смешивают с 18 MKn^GFP, прогревают 10 мин при 55°С и охлаждают до комнатной температуры, после чего добавляют 3 мкл раствора для нанесения образцов.

4. Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разделения РНК длиной 2000--5000 нуклеотидов в трис-ацетатном буфере. Электрофорез ведут в том же буфере до выхода оранжевого G из геля.

5. Окрашивание. Если РНК полностью денатурирована, она не окрашивается интеркалирующими красителями, такими как бромистый этидий, что может служить хорошим контролем полноты денатурации, РНК можно освободить от глиоксаля обработкой геля 50 мМ NaOH в течение 10--15 мин, затем нейтрализовать гель в 200 мМ ацетата натрия и окрасить РНК бромистым этидием. Флуоресцирующие полосы РНК можно затем обнаружить при освещении геля ультрафиолетом. Альтернативный подход заключается в использовании неинтеркалирующих красителей, например то-луидинового синего. Гели окрашивают 0,05%-ным толуидино-вым синим в 10 мМ фосфате натрия в течение 60 мин, после чего отмывают краску фосфатным буфером.

3.4.2 Денатурация формальдегидом

1. 10Х буфер для электрофореза: 200 мМ HEPES, 10 мМ Na2 ЭДТА, рН 7,8.

2. Подготовка образца: смешивают 3 мкл 10Х буфера, 15 мкл деионизированного формамида, 5 мкл 36--37%-ного формальдегида, 1 мкг РНК и раствор для нанесения образцов до конечного объема 30 мкл. Раствор нагревают до 65 °С и охлаждают во льду.

3. Готовят агарозный гель, например 1,2%-ный, для разделения РНК длиной 2000--5000 нуклеотидов. Для приготовления геля используют 1,2 г агарозы, 10 мл 10Х буфера, 16,7 мл 36--37%-ного формальдегида и 73,3 мл воды. Образцы наносят на гель и проводят электрофорез в 1х буфере до выхода оранжевого G из геля. Окрашивание проводят, как описано в разд. 4.4.1.

3.4.3 Денатурация формамидом

Денатурация формамидом легко обратима без повреждения РНК. Поэтому, если есть необходимость использовать денатурированную РНК для биологических опытов, данный метод имеет преимущества. Денатурация при этом бывает не столь полной, как при использовании двух описанных выше методов.

1. Исходные растворы:

а) 50X буфер:

трис -- 21,7 г, NaH2P04-2H20 --23,4 г, Ыа2ЭДТА-2Н20 -- 1,85 г, вода -- до 1л.

Раствор должен иметь рН 7,6--7,8;

б) деионизированный формамид. Важно, чтобы рН формамида был близок к 7,0;

в) раствор для нанесения образцов: 30% сахарозы, 0,06% бромфенолового синего, 0,06% оранжевого G в формамиде.

2. Образцы готовят, добавляя к РНК равный объем раствора для нанесения образцов. Полученный раствор прогревают 2 мин при 90 °С и охлаждают.

3. Агарозный гель готовят, растворяя агарозу в смеси IX буфера с формамидом. Выливают агарозу в прибор для электрофореза, охлаждают до комнатной температуры и выдерживают при 4°С до формирования геля. После нанесения образцов проводят электрофорез в смеси IX буфера с формамидом; во время электрофореза необходима циркуляция буфера.

4. После электрофореза гель около 15 мин промывают водой и окрашивают бромистым этидием.

3.5 Гель-электрофорез белков

Как и в случае нуклеиновых кислот, электрофорез в геле -- лучший метод определения типов и размеров капсидных белков. Перед электрофорезом белки денатурируют ДДС-Na, устраняя тем самым большинство проблем, вызываемых различиями удельных зарядов неденатурированных белков. Методы денатурации и гель-электрофореза белков описаны в руководстве. Особое внимание следует обратить на методы обнаружения нетипичной миграции денатурированных ДДС-Na белков в геле. Ниже описана быстрая методика диссоциации вирусных частиц и получения нуклеиновых кислот и белков для гель-электрофореза.

3.5.1 Быстрая денатурация вирусов