Системи трансмембранного транспортування кальцію у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus Plumosus Linnaeus

Серед різноманіття травних залоз в організмі тварин розрізняють одно-, мало- і багатоклітинні. Досить ґрунтовно Са²⁺-транспортувальні системи досліджено у секреторних клітинах багатоклітинних залоз ссавців, таких як великі слинні (Di Julio et al., 1997; Zhang et al., 1997; Liu, Ambudkar, 2001; Федірко та ін., 2003; Федірко, 2006; Larina, Torn, 2005 та інші) та підшлункова (Tepikin et al., 1992; Petersen, 1996; Fitzsimmons et al., 2000; Park et al., 2001; Cancela et al., 2002 та інші). Цікавими для дослідження Са²⁺-транспортувальних систем є малоклітинні залози. Вони представляють собою популяцію відносно невеликої кількості клітин, спеціалізованих у різних напрямках, але структурно і хімічно зв'язаних між собою та здатних секретувати одночасно кілька речовин, які суттєво відрізняються за своїми властивостями і призначенням.

Відповідним модельним об'єктом для таких досліджень можуть служити слинні залози двокрилих. Вагомі здобутки у дослідженні Са²⁺-сигналізації проведені на слинних залозах мухи Calliphora (Zimmermann, Walz, 1997; 1999; Zimmermann, 2000). Ще одним об'єктом, який здавна використовується для електрофізіологічних досліджень (Loewenstein, Nakas, Socolar, 1967; Туркевич, 1970; Cohen, 1977; Клевець, 1975-1993), є слинні залози личинки комарів-дергунів Chironomus. У секреторних клітинах цих залоз досліджені високопровідні міжклітинні контакти (Rose, Loewenstein, 1975; 1976), K⁺-, Na⁺- і Cl^--канали витоку (Клевец, 1986), потенціалкеровані K⁺ - (Клевец, 1990) і Cl^--канали (Клевец, 1991). У них, використовуючи метод фіксації потенціалу, ідентифіковані потенціалкеровані Са²⁺-канали (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992; Манько, 1995). Дисертаційна робота присвячена ідентифікації і дослідженню властивостей інших Са²⁺-транспортувальних систем цих малоклітинних залоз.

Зв'язок роботи з науково-дослідною тематикою кафедри. Дисертація виконана в рамках таких держбюджетних науково-дослідних тем кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка: «Вияснення механізмів функціонування Nа⁺-Са²⁺-обміну мембрани секреторних клітин» (1995-1997 рр., № держреєстрації 0196V002178), «Дослідження Na⁺-залежного транспорту кальцію через мембрани секреторних клітин у прямому і зворотному режимах та ролі у ньому функціональних груп протеїну обмінника» (1998 р., № держреєстрації 0198V004853), «Кальцієвий гомеостаз і енергетичний метаболізм секреторних клітин травних залоз та їх зміни під впливом екстремальних факторів» (2000-2002 рр., № держреєстрації 0100О001452), «Механізми Са²⁺- і NO-залежної регуляції функціонування секреторних клітин» (2003-2005 рр., № держреєстрації 0103U001872) і частково за підтримки грантами для молодих вчених Західно-Українського біомедичного пошукового центру (WUBMRC).

мітохондрія залоза секреторний

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проведені на слинних залозах личинки Chironomus plumosus L. Для пермеабілізації секреторних клітин слинні залози обробляли сапоніном. Про функціональний стан Са²⁺-транспортувальних систем судили за зміною вмісту Са²⁺ у тканині залоз, виміряного за допомогою арсеназо ІІІ. Вміст білка визначали за методом Лоурі (Lowry, Rosenbrough, Farr et al., 1951).

Для реєстрації струмів Nа⁺-Cа²⁺-обміну використовували метод фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинної перфузії за допомогою пластикової мікропіпетки (Крышталь, Пидопличко, 1975). Вхідний струм Na⁺-Ca²⁺-обміну, який відображає функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника у прямому режимі, реєстрували у відповідь на тривале (3,5 с) гіперполяризувальне зміщення мембранного потенціалу від -20 мВ до -60 мВ, а вихідний струм Na⁺-Ca²⁺-обміну, що відповідає роботі антипортера у зворотному режимі, - у відповідь на деполяризацію плазматичної мембрани клітин до +20 мВ.

Про стан Са²⁺-транспортувальних систем судили також за зміною вмісту мембранозв'язаного Са²⁺. Для цього ізольовані слинні залози інкубували у базовому та дослідних розчинах протягом 20-30 хв при кімнатній температурі (19-22°С). Після такої інкубації залози 15-20 хв фарбували хлортетрацикліном (2 мкмоль/л), який додавали у розчини інкубації. Після відмивання залоз від барвника визначали інтенсивність флуоресценції за довжини збуджуючого світла (_збуд.) 380 нм; флуоресценцію реєстрували за _ф. 480-530 нм.

Са²⁺, Mg²⁺-АТФазну активність гетерогенної фракції мембран секреторних клітин оцінювали за різницею вмісту неорганічного фосфату (Р_н) у різних середовищах після інкубації, концентрацію якого визначали за методом Фіске-Суббароу (Fiske, SubbaRow, 1925).

Для електронно-мікроскопічних досліджень інтактні залози фіксували охолодженим до 0 С 1,5% розчином глутарового альдегіду на какодилатному буфері, постфіксацію проводили 1% розчином OsO₄ у какодилатному буфері. Фіксовані зразки промивали і витримували у 1,5% водному розчині уранілацетату, зневоднювали в зростаючих концентраціях етанолу, окису пропілену та переносили в епоксидну смолу Epon-812. Ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-6 і контрастували солями свинцю за Рейнольдом. Перегляд і фотографування зразків виконували на електронному трансмісійному мікроскопі ПЕМ-100.

Статистично-математичне опрацювання даних здійснювали з використанням програмного пакета для персональних комп'ютерів Microsoft Excel. Для розрахунку параметрів рівнянням Хілла використовували модифіковані нами координати Іді-Хофсті.

Результати досліджень та їхнє обговорення

1. Ідентифікація Са²⁺-транспортувальних систем секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus

Потенціалкеровані Са²⁺-канали плазматичної мембрани. Деполяризація плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз гіперкалієвими розчинами супроводжувалася збільшенням вмісту Са²⁺ у їхній тканині (рис. 1). Залежність К⁺-стимульованого збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залози від [К⁺]_е задовільно описується рівнянням Хілла з близьким до одиниці коефіцієнтом n.

За зниженої до 35 ммоль/л [Na⁺]_e залежність змін вмісту Са²⁺ від [К⁺]_e виявилася менш вираженою і не описується рівнянням Хілла. Зумовлено це тим, що за фізіологічної [К⁺]_e зниження [Na⁺]_e супроводжується збільшенням вмісту Са²⁺ у тканині залоз у 2,01 ± 0,17 рази (P < 0,001, n = 6). За [К⁺]_e 20 ммоль/л це збільшення становило лише 1,36 ± 0,17 рази (P < 0,05, n = 6), а за вищих концентрацій взагалі виявилося статистично недостовірним. Це дає змогу розглядати зменшення [Na⁺]_e як своєрідне інгібування К⁺-стимульованого збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз. Зумовлене це «інгібування», швидше за все, обмеженістю Са²⁺-ємності внутрішньоклітинних органел, тому однозначної відповіді, який вклад Na⁺-Ca²⁺-обміну через плазматичну мембрану у К⁺-стимульоване збільшення вмісту Са²⁺ ми не отримали.

Встановлено також, що вміст Са²⁺ у тканині зростає із збільшенням [Ca²⁺]_e як у базальних умовах (5,36 ммоль/л К⁺), так і за гіперкалієвої деполяризації мембрани (40 ммоль/л К⁺). Згідно даних двофакторного дисперсійного аналізу вміст Са²⁺ у тканині залоз з високим ступенем ймовірності (Р < 0,001) визначається [Ca²⁺]_e на 67,87% і лише на 9,14% [K⁺]_e. Спільний вплив обох факторів є ще меншим і становить лише 5,17% (Р < 0,05). Властиво, це і має спостерігатися, оскільки малоймовірний є вхід Са²⁺ у цитоплазму із позаклітинного середовища, в якому він практично відсутній. За підвищеної до 5 ммоль/л [Ca²⁺]_e статистично достовірні зміни вмісту Са²⁺ у тканині під впливом гіперкалієвої деполяризації теж є відсутні. Причиною цього є зростання вмісту Са²⁺ у тканині із збільшенням [Ca²⁺]_e вже за фізіологічної [K⁺]_e. І лише за фізіологічної [Ca²⁺]_e гіперкалієва деполяризація спричиняє достовірне збільшення Са²⁺ у тканині.

К⁺-стимульоване збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз пригнічується La³⁺ з константою інгібування К_0,5 = 70 мкмоль/л. Значення коефіцієнта Хілла (n = 0,47) свідчить про можливу наявність негативної кооперативності і є наслідком, мабуть, того, що La³⁺ пригнічує не лише Са²⁺-транспортувальні системи, які забезпечують вхідний потік Са²⁺, але і системи вихідного потоку. Оскільки К_0,5 інгібування K⁺-стимульованих змін вмісту Са²⁺ у тканині суттєво менша, ніж К_0,5 інгібування струму Na⁺-Ca²⁺-обміну (див. рис. 10), то, найімовірніше, катіони La³⁺ пригнічують і потенціалкеровані Са²⁺-канали, і Са²⁺-помпу плазматичної мембрани.

Крім того, К⁺-стимульоване збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз пригнічується верапамілом (на 58,82%; P < 0,01, n = 6), дилтіаземом (на 64,50%; P < 0,05, n = 6) та ніфедипіном (на 62,02%; P < 0,05, n = 6). Дилтіазем і ніфедипін пригнічували і стимульоване гіперкалієвим розчином збільшення вмісту мембранозв'язаного Са²⁺. Це підтверджує наявність у мембрані досліджуваних секреторних клітин раніше ідентифікованих (Клевец, Гураль, 1990; Клевець, Манько, 1992) потенціалкерованих Са²⁺-каналів. Потенціалкеровані Са²⁺-канала ідентифіковані також у плазматичній мембран секреторних клітин слинних залоз амазонської п'явки Haementeria ghilianii (Wuttke, Berry, 1993; Wuttke, Munsch, Deitmer, 1996).

Функціональне підтвердження наявності Na⁺-Ca²⁺-обміну через плазматичну мембрану. Залежність змін нормалізованого вмісту Са²⁺ у тканині від [Na⁺]_e задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом n = 6,60 (рис. 2, крива 1). Але у цьому випадку розрахована крива віддаляється від експериментальних точок, отриманих за умови збереження фізіологічної осмотичності. Графік Хілла для тих експериментальних точок, які були визначені за фізіологічної осмотичності середовища (рис. 2, крива 2), характеризується значно меншим коефіцієнтом n (2,32). Ми схиляємося до думки, що високе значення коефіцієнта n у рівнянні Хілла для усіх експериментальних точок зумовлена порушенням осмотичності середовища. Тим не менше, той факт, що значення коефіцієнта n > 2, дає змогу стверджувати про електрогенність Na⁺-Ca²⁺-обміну через мембрану досліджуваних клітин.

Залежність збільшення вмісту Ca²⁺ у тканині, стимульоване інкубацією залоз у гіпонатрієвому середовищі, від [Сa²⁺]_е теж задовільно описується рівнянням Хілла (рис. 3). Високе значення коефіцієнта n цієї залежності аж ніяк не можна розцінювати як доведення здатності Na⁺-Ca²⁺-обмінника плазматичної мембрани транспортувати 2 катіони Са²⁺ у клітину взамін виведення кількох (скількох?) катіонів Na⁺. Швидше за все, зміни вмісту Са²⁺ у тканині залоз у цій серії дослідів спричинені не лише функціонуванням обмінника у зворотному режимі, а й зміною функціональної активності Са²⁺-помпи плазматичної мембрани. Збільшення позаклітинного Са²⁺ повинно зменшувати швидкість транспортування Са²⁺ помпою і навпаки. Це пов'язано не з афінністю Са²⁺-помпи плазматичної мембрани до цитозольного Са²⁺, яка є набагато вищою за афінність Na⁺-Ca²⁺-обмінника (Blaustein, Lederer, 1999), а лише з термодинамічним зміщенням.

Ідентифікація струму Na⁺-Ca²⁺-обміну. У відповідь на гіперполяризувальне зміщення мембранного потенціалу прямокутними імпульсами від рівня фіксованого потенціалу за наявності фізіологічного натрієвого градієнта (E_Na = +54,2 мВ) через мембрану секреторних клітин розвивається вхідний струм, що характеризується повільною кінетикою зростання (рис. 4 А). Ліквідація натрієвого градієнта (Е_Na = 0 мВ) призводить до суттєвого зменшення амплітуди вхідного струму. За зворотного натрієвого градієнта (Е_Na = -40,3 чи -46,3 мВ) у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вихідного напрямку (рис. 4 Б).

Вихідний струм розвивається і у відповідь на деполяризувальне зміщення мембранного потенціалу від рівня фіксованого потенціалу за фізіологічного натрієвого градієнта, наявності у середовищі верапамілу, еозину Y, відсутності у розчинах К⁺ та за хлорного градієнта, зміненого таким чином, щоб Е_Cl дорівнював тестованому потенціалу. Амплітуда виявленого за таких умов вихідного струму, як і вхідного, що розвивається у відповідь на гіперполяризацію мембрани, залежить від натрієвого градієнта: як зменшення [Na⁺]_е, так і збільшення [Na⁺]_і викликала її суттєве зменшення. Отримані результати узагальнені на рис. 5 у вигляді залежності амплітуди струмів, що розвиваються у відповідь на гіпер - та деполяризацію плазматичної мембрани, від рушійної сили іонів Na⁺ (ДЕ_Na = E_m - E_Na) при тестованому потенціалі.

Крива залежності амплітуди вихідного струму, який розвивається у відповідь на гіперполяризацію плазматичної мембрани за фізіологічного натрієвого градієнта, від рушійної сили транспорту Na⁺ (криві 3 і 4 на рис. 5) не перетинає вісь абсцис при ДЕ_Na = 0 мВ. Аналогічна закономірність характерна і для вихідних струмів, спричинених деполяризацією плазматичної мембрани (криві 6 і 8). Тобто, внаслідок зміни знаку ДЕ_Na при тестованому потенціалі не змінюється ні напрям струму, ні характер залежності амплітуди вихідного струму від ДЕ_Na. Це свідчить, що вихідні струми, спричинені як гіперполяризацією мембрани, так і деполяризацією, є не канальними та визначаються не тільки натрієвим електрохімічним градієнтом.

Знак ДЕ_Na при фіксованому потенціалі визначає напрям струму. За негативного значення ДЕ_Na у відповідь на гіперполяризацію мембрани виникає струм вхідного напрямку (криві 1, 2, 5 і 7), а за позитивного - вихідного напрямку (криві 3 і 4). Для струму, що виникає у відповідь на деполяризацію мембрани, притаманна зворотна закономірність: за негативного значення ДЕ_Na при тестованому потенціалі виникає струм вихідного напрямку (криві 6 і 8).

Є також усі підстави вважати, що струм, зареєстрований у відповідь на раптову зміну мембранного потенціалу, визначаються й електрохімічним градієнтом Ca²⁺. На рис. 6 представлено залежність амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну від [Сa²⁺]_e. Вхідний струм Na⁺-Ca²⁺-обміну, зареєстрований за фізіологічного натрієвого градієнта, відображає Na⁺_e-залежне виведення з клітини цитозольного Са²⁺. У зв'язку з цим його амплітуда мала би прямо залежати від [Сa²⁺]_і і обернено - від [Сa²⁺]_е при тестованому потенціалі. Встановлена ж залежність задовільно описується рівнянням Хілла. Це можна пояснити, виходячи з твердження, що за тривалого фіксування мембранного потенціалу внаслідок функціонування Na⁺-Ca⁺-обмінника встановлюється термодинамічна рівновага між Дм_Na і Дм_Сa. Якщо припустити, що в умовах поза- і внутрішньоклітинної перфузії Дм_Na є досить стабільною величиною, то внаслідок збільшення [Сa²⁺]_е збільшиться і [Сa²⁺]_і. Тому встановлена залежність вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну від [Сa²⁺]_е відображає, по суті, його залежність від [Сa²⁺]_і. Високе значення коефіцієнта n зумовлене, на нашу думку, не стільки здатністю обмінника одночасно транспортувати велику кількість катіонів Са²⁺, скільки його активацією цими іонами.

Са²⁺-помпа плазматичної мембрани та ендоплазматичного ретикулуму. Ще однією транспортувальною системою, що забезпечує виведення Са²⁺ з цитозолю чи не всіх клітин, є Са²⁺-помпи плазматичної мембрани і ендоплазматичного ретикулуму. Тому наші зусилля були спрямовані на підтвердження наявності Са²⁺-помпи у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, використовуючи метод визначення Са²⁺, Mg²⁺-АТФазної активності.

Рівень Р_н у середовищі, яке містило 0,1 ммоль/л Са²⁺ і 5 ммоль/л АТФ, після 30 хв інкубації фракції клітинних мембран збільшився і становив 12,46 0,11 мкмоль / мг білка. Під впливом строфантину К він зменшувався на 19,98 1,17% (P < 0,001, n = 16), що свідчить про наявність Nа⁺, К⁺-АТФази у плазматичній мембрані клітин слинної залози. Додавання до безкальцієвого середовища інкубації ЕГТА (0,65 ммоль/л) на фоні строфантину К призводило до блокування і Са²⁺-помп. Розрахована Са²⁺, Мg²⁺-АТФазна активність становила 15,94 0,13 мкмоль Р_н / мг білка за 30 хв (22,88 0,56% від загальної АТФазної активності).

Залежність Са²⁺, Мg²⁺-АТФазної активності фракції клітинних мембран досліджуваних залоз від [Са²⁺] у середовищі має куполоподібний характер з максимумом за наявності у середовищі 0,1 ммоль/л Са²⁺. Така ж закономірність характерна і для інших Са²⁺, Mg²⁺-АТФаз, зокрема плазматичної мембрани еритроцитів людини (Sarkadi, 1980), міометрію корів (Костерин, 1990) та міокарда морських свинок (Курский, Костерин, Воробец, 1987), а також саркоплазматичного ретикулуму скелетних м'язів (Болдырев, 1977).

Еозин Y (10 мкмоль/л) повністю пригнічував Са²⁺, Мg²⁺-АТФазну активність фракції клітинних мембран слинних залоз (P < 0,001, n = 6). Са²⁺, Mg²⁺-АТФазна активність під впливом бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) зменшувалася на 68,62 9,26% (P < 0,05, n = 6), а під впливом окситоцину (100 мкмоль/л) - на 65,74 13,50% (але P = 0,079, n = 5).

Під впливом еозину Y у концентраціях 1-5 мкмоль/л вміст Са²⁺ у тканині інтактних слинних залоз суттєво збільшився (рис. 7), що є підтвердженням наявності у плазматичній мембрані досліджуваних клітин Са²⁺-помпи. Причому, це збільшення задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом n = 1. Це, на нашу думку, - надзвичайно цікавий факт, оскільки засвідчує, що еозин Y у заданих концентраціях діє лише на одну Са²⁺-транспортувальну систему.

Ефект еозину Y у концентрації 10 мкмоль/л (рис. 7), навпаки, є наслідком дії еозину Y не лише на Са²⁺-помпу плазматичної мембрани, але і Са²⁺-помпу внутрішньоклітинних депо. Пригнічення цієї Са²⁺-транспортувальної системи призводить до зменшення акумуляції Са²⁺, відповідно його вміст у тканині зменшується. Оскільки при цьому пригнічене функціонування і Са²⁺-помпи плазматичної мембрани, вказане зменшення є відносне.

Внаслідок дії еозину Y у концентрації 20 мкмоль/л на залози, оброблені сапоніном з метою пермеабілізації плазматичної мембрани, вміст Са²⁺ у їхній тканині зменшився відносно контролю на 20,27 ± 6,92% (Р < 0,05, n = 17). Тапсигаргін у концентрації 1 мкмоль/л теж зменшував вміст Са²⁺ у тканині залоз на 40,61 ± 9,91% (Р < 0,05, n = 7). Це є прямим підтвердженням функціонування у внутрішньоклітинних мембранах досліджуваних секреторних клітин Са²⁺-помпи.

Внутрішньоклітинні канали вивільнення Са²⁺. Вміст Са²⁺ у тканині оброблених сапоніном залоз внаслідок додавання до середовища інкубації IФ₃ (10 мкмоль/л) зменшився на 41,14 ± 11,75% (Р < 0,05, n = 11). За наявності гепарину (500 мкг/мл) вміст Са²⁺ у тканині під впливом IФ₃ не змінювався. Не змінювався він під впливом ІФ₃ і за наявності еозину Y (20 мкмоль/л), який, пригнічуючи Са²⁺-помпу ендоплазматичного ретикулуму, призводить до спустошення внутрішньоклітинного депо Са²⁺. Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара, як і в ацинарних клітин підшлункової (Nathanson et al., 1994; Cancela, Van Coppenolle, Galione, Tepikin, 2002), слинних (Lee et al., 1997; Ambudkar, 2000) та шлункових (Дубицький, 2006) залоз вищих тварин, наявні ІФ₃-чутливі Са²⁺-канали.

В ході ідентифікації ріанодинчутливих Са²⁺-каналів ми з'ясували, що зміни вмісту Са²⁺ у тканині інтактних слинних залоз та їхня секреторна активність внаслідок додавання до базового розчину кофеїну у концентраціях 1-15 ммоль/л мають складний характер. Спочатку спостерігалося збільшення вмісту Са²⁺ у тканині та секреції загального білка, яке виявилося найсуттєвішим під впливом кофеїну у концентрації 4 ммоль/л. За вищих концентрацій кофеїну спостерігалося відносне зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз.

У присутності бутилгідроксихінону (25 мкмоль/л) і еозину Y (10 мкмоль/л) кофеїн в концентрації 4 ммоль/л спричиняв не збільшення, а зменшення вмісту Са²⁺ в тканині залоз відповідно на 31,66 ± 4,32 і 62,24 ± 4,51% (P < 0,001, n = 7). Тому ми вважаємо, що збільшення вмісту Са²⁺ в тканині залоз під впливом низьких концентрацій кофеїну спричинене або пригніченням Са²⁺-помпи плазматичної мембрани, або стимуляцією Са²⁺-помпи ендоплазматичного ретикулуму. Під впливом кофеїну у концентрації 10 ммоль/л зменшення вмісту Са²⁺ у тканині інтактних залоз виявилося значно суттєвішим на фоні еозину Y і бутилгідроксихінону, ніж у контролі. Отже, кофеїн у високих концентраціях дійсно сприяє вивільненню Са²⁺ з внутрішньоклітинних депо досліджуваних клітин, інкубованих у базових умовах.

Під впливом ріанодину у концентрації 5 нмоль/л вміст Са²⁺ у тканині слинних залоз, оброблених сапоніном, зменшився на 35,18 ± 3,87% (Р < 0,001, n = 13), а у концентрації 500 нмоль/л - збільшився на 40,72 ± 12,52% (Р < 0,05, n = 7). Зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз під впливом ріанодину у низькій концентрації зумовлене, власне, активацією ріанодинчутлих Са²⁺-каналів і переконливо свідчать про їхню наявність. Мабуть, частина цих каналів при інкубації у контрольному розчині знаходиться у активному стані, оскільки ріанодин у вищій концентрації, спричинив збільшення вмісту Са²⁺ у тканині.

Отже, у секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна, як і в секреторних клітинах екзокринних залоз вищих тварин (Lee et al., 1997; Di Julio et al., 1997; Zhang et al., 1997; Fitzsimmons et al., 2000; Федірко, 2006) наявні й ріанодинчутливі Са²⁺-канали, які досить ефективно блокуються ріанодином у субмікромолярних концентраціях.

Са²⁺-уніпортер мітохондрій. Рутеній червоний (10 мкмоль/л) зменшував вміст Са²⁺ у тканині інтактних залоз на 28,95 ± 6,70%. Проте за наявності у середовищі еозину Y (5, 10 і 20 мкмоль/л) рутеній червоний практично не змінював вмісту Са²⁺ у тканині інтактних залоз. З'ясувалося також, що під впливом рутенію червоного за наявності у середовищі інкубації еозину Y (20 мкмоль/л) вміст Са²⁺ у тканині слинних залоз, оброблених розчином сапоніну, зменшився на 26,98 ± 9,00% (P < 0,05, n = 7). Швидше за все, це зменшення воно зумовлене впливом рутенію червоного на акумуляцію Са²⁺ мітохондріями.

Пуринові рецептори. Внаслідок додавання у середовище з фізіологічною [Са²⁺] АТФ у концентраціях 0,1, 1 і 2 ммоль/л вміст Са²⁺ у тканині залоз статистично достовірно не змінювався (рис. 8). Лише за дії АТФ у концентрації 0,01 ммоль/л спостерігалося незначне (на 16,33 ± 6,24%) зменшення вмісту Са²⁺. Таке ж зменшення збереглося і за підвищеної до 10 ммоль/л [Са²⁺]_e - на 12,93 ± 4,74%. За дії АТФ у вищих концентраціях зміни вмісту Са²⁺ у тканині залоз, інкубованих у середовищі з підвищеною [Са²⁺], також не змінювалися відносно контролю. Ми припускаємо, що індуковане АТФ у низькій концентрації зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз в обох випадках може бути зумовлене його вивільненням з депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Вивільнений у цитозоль Са²⁺ виводиться системами активного транспортування у позаклітинне середовище, тому його сумарний вміст у тканині зменшується. За вищих концентрацій АТФ активує, очевидно, P2X-рецептори, що спричиняє збільшення надходження Са²⁺ у клітину з позаклітинного середовища. Це і нівелює зменшення Са²⁺ у тканині залоз, спричинене активацією P2Y-рецепторів.

Зовсім інша картина спостерігалася за інкубування залоз у номінально безкальцієвому середовищі. За цих умов АТФ у всіх зазначених концентраціях спричиняв зниження вмісту Са²⁺ у тканині залоз (рис. 8). Причому, за 0,01 ммоль/л АТФ у середовищі інкубування нормалізоване зменшення вмісту Са²⁺ у тканині виявилося більшим, ніж за наявності у середовищі фізіологічної і підвищеної [Са²⁺], і становило 29,31 ± 7,30%. Але найпомітніше зниження було під впливом АТФ у концентрації 1 ммоль/л - на 57,93 ± 12,35%. АТФ-стимульоване зменшення вмісту Са²⁺ у тканині за його відсутності у середовищі переконливо свідчить про наявність у досліджуваних клітинах P2Y-рецепторів.

Внаслідок додавання до ЕГТА-вмісного безкальцієвого середовища АДФ у тих же концентраціях, що й АТФ, ми спостерігали зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз. Більше того, спорідненість P2Y-рецепторів досліджуваних клітин до АДФ, як і в епітеліальних клітинах (Yang, 2000), є більшою, ніж до АТФ.

Ще одним підтвердженням наявності у досліджуваних клітинах Р2Y-рецепторів є те, що вміст мембранозв'язаного Са²⁺ після інкубування у номінально безкальцієвому розчині зменшився під впливом АТФ (0,1 ммоль/л) на 19,6% (Р = 0,018, n = 5).

Отже, зменшення вмісту Са²⁺ як у тканині залоз, так і мембранозв'язаного зумовлене вивільненням його з ІФ₃-чутливого депо внаслідок активації Р2Y-рецепторів. Відсутність змін вмісту Са²⁺ у тканині залоз у відповідь на дію АТФ у високих концентраціях за наявності Са²⁺ у середовищі може бути спричинене одночасною активацію P2Y - та Р2X-рецепторів. Тому, на нашу думку, АТФ може виконувати функцію первинного посередника у досліджуваних клітинах.

2. Характеристика Na⁺-Ca²⁺-обміну через плазматичну мембрану секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна

Специфічність обмінника до одноваленитних катіонів. Внаслідок еквімолярної заміни Na⁺ катіонами Cs⁺, NH₄⁺ або K⁺ відбувається збільшення амплітуди вхідного струму відносно струму Na⁺-Ca²⁺-обміну на 69,94 ± 4,03 (P = 0,0003, n = 10), 60,83 ± 15,11 (P = 0,042, n = 7) і 50,60 ± 8,75 (P = 0,031, n = 6)% відповідно. А внаслідок заміни Na⁺ у позаклітинному середовищі на OHNH₃⁺, Li⁺ та NH₂NH₃⁺ амплітуда вхідного струму зменшувалася на 33,02 ± 5,52 (P = 0,003, n = 6), 41,52 ± 4,50 (P = 0,0009, n = 9) і 64,52 ± 1,71 (P = 0,0002, n = 6)% відповідно. Таким чином, одновалентні катіони за здатністю замінювати Na⁺ у Me⁺-залежному виведенні Ca²⁺ з цитозолю секреторних клітин слинних залоз комара-дергуна утворюють такий ряд:

Cs⁺ ? NH₄⁺ ? K⁺ > Na⁺ > OHNH₃⁺ ? Li⁺ > NH₂NH₃⁺,

де співвідношення між амплітудами вхідних струмів, що супроводжують функціонування Cs⁺-Ca²⁺ - та Li⁺-Ca²⁺-обмінів, становить 2,91.

Отриманий нами ряд дозволяє зробити кілька висновків. По-перше, Na⁺-Ca²⁺-обмінник плазматичної мембрани досліджуваних клітин не належить до родини NCKX. Це випливає з того, що вхідний струм Me⁺-Ca²⁺-обміну (відображає фізіологічний режим функціонування обмінника) реєструється без наявності катіонів K⁺ у внутрішньоклітинному середовищі. Крім того, додавання катіонів К⁺ до позаклітинного середовища супроводжується збільшенням, а не зменшенням амплітуди вхідного струму. І, нарешті, ряд, що описує здатність одновалентних катіонів активувати K⁺-залежний Na⁺-Ca²⁺-обмін секреторних клітин (Lee et al., 2007), суттєво відрізняється від отриманого нами ряду. По-друге, за здатністю транспортувати катіони Li⁺ досліджуваний нами Na⁺-Ca²⁺-обмінник є близьким до описаної недавно родини NCLX (Palty et al., 2004).

Спорідненість обмінника до двовалентних катіонів. При еквімолярній заміні Са²⁺ у позаклітинному середовищі на Sr²⁺ і Ва²⁺ у відповідь на гіперполяризацію мембрани реєструється вхідний струм, за кінетикою досить близький до вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну. Тому ми припустили, що катіони Sr²⁺ і Ва²⁺ можуть транспортуватися Na⁺-Ca²⁺-обмінником і, відповідно, ці струми відображають Na⁺-Sr²⁺ - чи Na⁺-Ва²⁺-обмін через плазматичну мембрану.

За частоти гіперполяризувальних імпульсів 0,1 Гц амплітуда струму Na⁺-Sr²⁺-обміну виявилася більшою від амплітуди струму Na⁺-Са²⁺-обміну у 1,05 ± 0,01 раз (P < 0,01, n = 6). Амплітуда струму Na⁺-Ва²⁺-обміну теж була більшою від амплітуди струму Na⁺-Са²⁺-обміну у 1,22 ± 0,05 раз (P < 0,01, n = 6). Внаслідок збільшення частоти гіперполяризувальних імпульсів до 0,2 Гц як амплітуда струму Na⁺-Sr²⁺-, так і Na⁺-Ва²⁺-обміну суттєво зменшилися - на 62,05 ± 2,89 і 59,34 ± 2,65 відповідно. Причому, зменшення струму Na⁺-Ва²⁺-обміну виявилася статистично достовірно (P < 0,01, n = 6) суттєвішим, ніж аналогічне зменшення амплітуди струму Na⁺-Са²⁺-обміну, яке у цій серії дослідів становило 49,24 ± 1,77%.

У ході порівняння параметрів рівняння Хілла, розрахованих для залежності амплітуди вхідних струмів Na⁺-Me²⁺-обмінів від [Me²⁺]_e (рис. 9), напрошуються досить цікаві висновки. Перш за все, розраховане значення І_max зростає в послідовності Ca²⁺ > Sr²⁺ > Ba²⁺. А значення коефіцієнта n і K_0,5, навпаки, у названій послідовності суттєво зменшуються. Оскільки здатність до комплексоутворення у названій послідовності теж зменшується (Доссон и др., 1990), то зменшення коефіцієнта n, на нашу думку, зумовлене порушенням процесів каталітичної активації обмінника. Про здатність Ва²⁺ і Sr²⁺ замінювати Са²⁺ у каталітичній активації обмінника у літературі даних практично немає. Відомо лише, що катіони Ва²⁺ здатні каталітично активувати Na⁺-Ca²⁺-обмінник кардіоміоцитів (NCX1), але менш ефективно (K_D ~10 мкмоль/л), ніж Са²⁺ (K_D ~0,3 мкмоль/л; Trac et al., 1997). Про інші родини Na⁺-Сa²⁺-обмінників відомо лише те, що NCLX не каталізує, на відміну від NCX-білків, Na⁺-Ba²⁺-обмін навіть у зворотному режимі, чим він є подібніший до NCKX (Palty et al., 2004). Тому за здатністю транспортувати катіони Ba²⁺ і Sr²⁺ Na⁺-Сa²⁺-обмінник плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна ближчий є до обмінників родини NCX.

Вплив катіонів перехідних металів. Внаслідок додавання Cd²⁺ у концентраціях 0,5-10 ммоль/л до позаклітинного розчину з фізіологічною [Ca²⁺] амплітуда струму Na⁺-Са²⁺-обміну збільшувалася. Але за 10 ммоль/л Cd²⁺ зростання струму було меншим, ніж за 5 ммоль/л. Таке зростання струму Na⁺-Са²⁺-обміну не зумовлене збільшенням [Ca²⁺]_e внаслідок витіснення його катіонами Cd²⁺ з мембранозв'язаного стану чи значним транспортуванням Cd²⁺ обмінником. На користь цього свідчить той факт, що при збільшенні [Ca²⁺]_e до 10 ммоль/л катіони Cd²⁺ теж збільшують амплітуду струму Na⁺-Са²⁺-обміну. А, слід зазначити, що за [Ca²⁺]_e = 5 ммоль/л амплітуда вхідного струму Na⁺-Са²⁺-обміну вже практично не зростає. Це дає підставу стверджувати, що викликане Cd²⁺ збільшення струму Na⁺-Са²⁺-обміну зумовлене стимуляцією функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника.

Внаслідок дії Ni²⁺ за фізіологічної [Ca²⁺]_e амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обмiну дозозалежно зменшувалася. Розрахована на основі середніх значень константа інгібування К_0,5 для Ni²⁺ становила 7,93 ммоль/л, а коефіцієнт Хілла n виявився близьким до одиниці. Цікаво, що за підвищення позаклітинної [Ca²⁺] до 10 ммоль/л амплітуда струму Na⁺-Ca²⁺-обмiну внаслідок дії Ni²⁺ не зменшувалася, а зростала. Це свідчить, що катіони Ni²⁺ взаємодіють, по крайній мірі, з двома ділянками обмінника, викликаючи різні ефекти.

Катіони La³⁺, діючи на зовнішню поверхню плазматичної мембрани, спричиняють зменшення амплітуди струму Na⁺-Са²⁺-обміну як за фізіологічної, так і за підвищеної [Ca²⁺]_e. В обох випадках залежність ефекту La³⁺ задовільно описується рівнянням Хілла (рис. 10).

Збільшення константи інгібування К_0,5 за підвищеної [Ca²⁺]_е дає змогу стверджувати, що La³⁺ у конкурентний спосіб зв'язується з Ca²⁺-зв'язуючою транспортувальною ділянкою і тим самим пригнічує функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінного механізму. Крім того, наші результати підтверджують дані інших авторів (Katzung, Reuter, Porzig, 1973; Shimizu, Borin, Blaustein, 1997) про відносно низьку афінність Na⁺-Ca²⁺-обмінника до La³⁺. Зокрема, здатність La³⁺ інгібувати Na⁺-Ca²⁺-обмінник плазматичної мембрани збудливих клітин оцінюється K_0,5, не меншим, ніж 0,5 ммоль/л (Blaustein, Lederer, 1999). Те, що за підвищеної [Ca²⁺]_е коефіцієнт n є дещо більший, ніж за фізіологічної [Ca²⁺]_е, і в обох випадках є меншим від одиниці, дозволяє говорити про наявність конкуренції La³⁺ з Са²⁺ за Са²⁺-зв'язуючу ділянку регуляторної петлі обмінника. Можливість стимуляції Na⁺-Cа²⁺-обмінника катіонами La³⁺ (паралельно із блокуванням та транспортуванням) доведена недавно у дослідженнях на клітинах яєчника китайського хом'ячка, в які експресували NCX1.1 (Reeves, Condrescu, 2003).

Таким чином, катіони перехідних металів по-різному впливають на Na⁺-Ca²⁺-обмін. Катіони Cd²⁺, які в еквімолярних концентраціях віддають перевагу з утворенню зв'язків з P - та S-вміснимими лігандами білків, стимулюють функціонування обмінника. Катіони La³⁺ досить ефективно взаємодіють з O - та N-вмісними лігандами, тому пригнічують Na⁺-Ca²⁺-обмін. Катіони Ni²⁺, які мають проміжні властивості, за низької [Ca²⁺]_e пригнічують, а за високої - стимулюють.