Системи трансмембранного транспортування кальцію у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus Plumosus Linnaeus

Підтвердження наявності SH-груп у молекулі Na⁺-Ca²⁺-обмінника. Внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину ДТТ (1 ммоль/л), а також GSH у концентрації 0,1, 0,5 і 1 ммоль/л амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну зростала. Це збільшення зумовлене, очевидно, хелатуванням катіонів важких металів, які в невеликих кількостях зв'язані з СОО^--групами транспортувального центру обмінника і характеризуються меншою спорідненістю до них, ніж до SH-груп досліджуваних сполук. У результаті збільшення концентрації GSH до 5 ммоль/л амплітуда струму Na⁺-Ca²⁺-обміну зменшилася відносно контролю на 5,92 0,96%. Причиною цього є, мабуть, хелатування катіонів важких металів, які зв'язані з SH-групами регуляторного центру обмінника.

Додавання ПХМБ до позаклітинного середовища не спричиняло достовірних змін амплітуди ні вхідного, ні вихідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну. Але внаслідок додавання ПХМБ до внутрішньоклітинного розчину у концентрації 1 і 5 мкмоль/л амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну збільшується на 11,02 1,69 і 22,50 2,97% відповідно (Р < 0,01, n = 6). Амплітуда ж вихідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну збільшувалася лише за наявності у внутрішньоклітинному розчині 1 мкмоль/л ПХМБ на 7,94 2,47% (Р < 0,05, n = 6).

Отже, ми маємо всі підстави вважати, що блокування SH-груп молекули Na⁺-Ca²⁺-обмінника із цитоплазматичного боку мембрани за допомогою ПХМБ спричиняє зміни її конформації, а відтак і зміни у процесах взаємодії катіонів із центрами катіонного зв'язування або транслокації катіонів, які приводять до активації Na⁺-Ca²⁺-обміну.

Залежність Na⁺-Ca²⁺-обміну від pH середовища. Для встановлення особливостей функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника досліджували залежність амплітуди його струму від рН позаклітинного і внутрішньоклітинного розчинів.

Зниження рН позаклітинного розчину від 7,2 до 4 викликало поступове зменшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну (рис. 11). Розрахунки показали, що залежність амплітуди від рН у цьому діапазоні задовільно описується рівнянням Хілла. Виходячи з величини рК, ми припускаємо, що в складі ділянок катіонного зв'язування обмінника функціонують СОО^--групи аспарагінової або глютамінової амінокислот, оскільки їхнє рК становить відповідно 3,81 і 4,25 (Ленинджер, 1974). Але внаслідок закислення позаклітинного розчину амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну змінюється повільніше, ніж того слід було очікувати за умови, що цей процес зумовлений протонуванням кислотних іоногенних груп однієї природи (коефіцієнт Хілла n < 1).

Внаслідок закислення зовнішнього розчину до рН 3 струм, який розвивається у відповідь на гіперполяризацію мембрани, у всіх випадках ставав вихідним. Цей струм може бути пов'язаний із зміною функціонування обмінника або ж мати іншу природу, встановлення якої потребує додаткових досліджень.

У ході дослідження залежності вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну від ступеня залужнення зовнішнього розчину з'ясувалось, що зміщення рН розчину від 7 до 8, 9 і 10 викликає суттєве збільшення амплітуди досліджуваного струму (рис. 11). Причиною зростання амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну внаслідок залужнення середовища може бути поява додаткових негативних зарядів у ділянці катіонного зв'язування, носіями яких, найімовірніше, є іонізовані тіосульфатні групи залишків цистеїнової амінокислоти.

Внаслідок залужнення внутрішньоклітинного розчину амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну суттєво зменшувалася (рис. 12). Значення рК вказує на те, що причиною цього зменшенням є, найімовірніше, депротонування SH-груп цистеїну великої цитоплазматичної петлі (рК' R-групи цистеїну становить 8,33 (Ленинджер, 1985)). Водночас, значення коефіцієнта n (< 1) дозволяє припустити, що одночасно депротонуються R-групи й інших амінокислот, з іншим значенням рК'.

Внаслідок зменшення концентраційного градієнта Na⁺ і його ліквідації зміни функціонування Na⁺-Са²⁺-обмінника мембрани секреторних клітин, спричинені залужненням внутрішньоклітинного розчину, є суттєвішими. Але ми не можемо категорично стверджувати, що залужнення дійсно призводить до порушення зв'язування Na⁺ з молекулою обмінника, оскільки і зменшення натрієвого градієнта, і залужнення спричиняють однакові зміни струму.

Ще суттєвіші зміни у функціонуванні Na⁺-Ca²⁺-обмінника внаслідок залужнення внутрішньоклітинного середовища спричинює збільшення концентраційного градієнта Ca²⁺. Якщо зменшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну, що зумовлене залужненням внутрішньоклітинного розчину до pH 9, за [Ca²⁺]_е = 1,76 ммоль/л становило 55,57 10,13%, то за [Ca²⁺]_е = 10 ммоль/л - 72,38 10,22%.

Оскільки збільшення градієнта Са²⁺ за рН 9 супроводжується не збільшенням, а зменшенням амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну, ми можемо однозначно стверджувати, що залужнення внутрішньоклітинного середовища призводить до пригнічення зв'язування Са²⁺ з внутрішньоклітинною петлею f обмінника.

Таким чином, залужнення внутрішньоклітинного розчину, на відміну від залужнення позаклітинного, веде до зменшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну, і, навіть, до зміни його напрямку і це є наслідком, мабуть, порушення каталітичної регуляції обмінника катіонами Са²⁺.

Слід зазначити, що каталітичне Са²⁺-регулювання забезпечує стимулювання функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника в кардіоміоцитів ссавців (NCX1-типу) і, навпаки, пригнічення Na⁺-Ca²⁺-обмінника дрозофіли (Levitsky et al., 1996; Ruknudin et al., 1997). Тому за цією властивістю Na⁺-Ca²⁺-обмінник плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus є ближчим до родини NCX.

3. Взаємоузгодженість функціонування Са²⁺-транспортувальних систем

Просторова організація функціонування іонтранспортувальних систем плазматичної мембрани. Додавання до вихідного позаклітинного розчину уабаїну (25 мкмоль/л) не викликало змін у функціонуванні Na⁺-Ca²⁺-антипортера. Але збільшення [К⁺]_e від 0 до 5,36 та 20 ммоль/л приводило до збільшення амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну. Причому, збільшення [К⁺]_е від 5,36 до 20 ммоль/л за умов блокування Na⁺-K⁺-АТФази уабаїном спричиняло у два рази менше збільшення амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну, ніж у контролі, - на 7,13 2,01 і 16,56 1,57% відповідно. Аналогічно, збільшення [К⁺]_і від нуля до 129,14 ммоль/л за умови блокування Na⁺-K⁺-АТФази уабаїном спричиняло зменшення амплітуди струму, але у два рази менше, ніж у контролі. Таким чином, частковою причиною зміни струму Na⁺-Ca²⁺-обміну і внаслідок збільшення [K⁺]_і є пригнічення активності Na⁺-K⁺-помпи. Встановлено також, що зменшення [Na⁺]_е менш суттєво впливає на роботу Na⁺-Ca²⁺-обмінника, коли Na⁺-K⁺-помпа функціонує, ніж коли вона є заблокованою.

Виявилося, що функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника залежить від активності Са²⁺-помпи. Внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину еозину Y амплітуда вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну збільшувалася на 15,44 ± 1,64%. Аналогічно діє й інший блокатор Са²⁺-помпи ортованадат в концентрації 10 мкмоль/л, стимулюючий ефект якого, правда, зменшувався за концентрації 100 мкмоль/л. Введення в клітину АТФ (1 ммоль/л) на фоні 1 ммоль/л GSH супроводжується зменшенням амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну на 16,89 1,28%. Причиною зменшення струму у цьому випадку може бути стимуляція надлишком АТФ функціонування Са²⁺-помпи плазматичної мембрани, яке призводить до зменшення [Ca²⁺]_e, і, відтак, до пригнічення функціонування Na⁺Ca²⁺-обмінника.

На відміну від цього процес акумулювання Са²⁺ в ендоплазматичному ретикулумі не впливає на швидкість транспортування Са²⁺ системою Na⁺-Ca²⁺-обміну. Останнє підтверджується тим, що додавання теофіліну (8 ммоль/л) до внутрішньоклітинного розчину не впливало на амплітуду вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну. Не залежить Na⁺-залежне виведення Ca²⁺ з клітини і від функціонування Са²⁺-уніпортера мітохондрій, оскільки під впливом рутенію червоного (10 мкмоль/л) амплітуда вхідного струму, що виникає у відповідь на раптову гіперполяризацію мембрани, не змінюється.

Взаємодія між ріанодин - та ІФ₃-чутливими Са^2+-каналами. ІФ₃ (10 мкмоль/л) за наявності у середовищі ріанодину (5 нмоль/л) статистично достовірно не змінював вмісту Са²⁺ у пермеабілізованих клітинах слинних залоз. Без ріанодину в інкубаційному середовищі вміст Са²⁺ у тканині залоз під впливом ІФ₃ зменшувався за рахунок активації ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів. Отже, ефекти ріанодину та ІФ₃ за умови їх поєднання в інкубаційному середовищі не просто мають неадитивний характер - стимуляція каналів одного типу якимось чином запобігає одночасній стимуляції каналів іншого типу.

З'ясувалося також, що блокатор ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів гепарин (500 мкг/мл) за наявності у середовищі інкубації ріанодину у концентрації 5 нмоль/л досить суттєво і достовірно збільшував вміст Са²⁺ у тканині. За відсутності ріанодину у середовищі гепарин ні у цій серії, ні у попередніх не спричиняв збільшення вмісту Са²⁺ у пермеабілізованих клітинах. На основі цього ми зробили висновок, що за умов експерименту IФ₃-чутливі Са²⁺-канали є неактивні або кількість відкритих ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів є незначною. Малоймовірною нам видається здатність гепарину пригнічувати ріанодинчутливі Са²⁺-канали. Швидше за все, гепарин запобігає активуванню ріанодинчутливих Са²⁺-каналів, пригнічуючи ІФ₃-чутливі Са²⁺-канали. Але виникає закономірне питання: яким чином?

Для пояснення цього механізму ми пропонуємо ввести поняття Са²⁺-функціональна одиниця (рис. 13). У найпростішому випадку - це абстрактна модель, яка складається з одного Са²⁺-каналу (системи пасивного транспортування), Са²⁺-помпи (системи активного транспортування) та мембрани, що забезпечує компартменталізацію Са²⁺.

Власне будь-яку ділянку клітини можна абстрагувати до такої Са²⁺-функціональної одиниці. Умовно ми їх поділяємо на два типи. Са²⁺-функціональну одиницю І типу формують системи активного і пасивного транспортування однієї мембрани, наприклад, Са²⁺-канали і Са²⁺-помпа ендоплазматичного ретикуму або Са²⁺-канали і Са²⁺-помпа плазматичної мембрани.

До складу Са²⁺-функціональної одиниці ІІ типу входять, наприклад, Са²⁺-канали плазматичної мембрани і Са²⁺-помпа ендоплазматичного ретикулуму - системи активного і пасивного транспортування, які належать різним мембранам однієї клітини. Принципової відмінності між Са²⁺-функціональними одиницями двох типів немає (або нам про це нічого не відомо).

За дії будь-якого стимулятора Са²⁺-функціональна одиниця відповідає як єдине ціле - обмежене в просторі і швидкоплинне збільшення цитозольної [Са²⁺], яке називається локальним Са²⁺-спайком, пафом чи спарком.

У секреторних клітинах слинних залоз личинки комара-дергуна ІФ₃-чутливі і ріанодинчутливі Са²⁺-канали разом з Са²⁺-помпою мембрани ендоплазматичного ретикулуму формують ендоплазматичну Са²⁺-функціональну одиницю І типу (рис. 13). За відсутності агоніста спонтанне вивільнення Са²⁺ ріанодинчутливими каналами у цитозоль (Са²⁺-індуковане вивільнення Са²⁺) компенсується його транспортуванням помпою у люмен ендоплазматичного ретикулуму, тому фізіологічна відповідь не виникає. Встановлюється певна динамічна рівновага між двома постійними потоками Са²⁺.

Звичайно, такі принципи організації функціонування Са²⁺-транспортувальних систем передбачають витрати великої кількості енергії. Але власне завдяки цьому локальне збільшення цитозольної [Са²⁺] підтримує чутливість Са²⁺-функціональної одиниці до ІФ₃ (і, відповідно цілої клітини до агоніста) на досить високому рівні (рис. 13 А). Як наслідок, навіть незначне зростання ІФ₃ у цитозолі спричиняє зміщення рівноваги у бік вивільнення Са²⁺ із депо (рис. 13 Б). Однак цей процес є обмежений у часі, оскільки високі [Са²⁺] пригнічують обидва типи каналів (рис. 13 В), запобігаючи надмірному спустошенню депо.

Наше припущення співзвучне з гіпотезою Канцели та співавт. (Cancela et al., 2000), що постулюють наявність осциляторної одиниці, яка складається з ріанодин - та ІФ₃-чутливого Са²⁺-каналів. Але гіпотеза про об'єднання Са²⁺-транспортувальних систем певної ділянки цитоплазми у Са²⁺-функціональну одиницю дозволяє глибше зрозуміти механізми взаємозв'язку між цими системами. Поняття Са²⁺-функціональна одиниця є значно ширшим, ніж осциляторна одиниця, оскільки його можна застосувати до набору Са²⁺-транспортувальних систем будь-якої ділянки цитоплазми, у тому числі і тих, діяльність яких не пов'язана з генерацією Са²⁺-хвиль.

Виходячи із наведених вище принципів організації ендоплазматичної Са²⁺-функціональної одиниці можна пояснити отримані нами результати, трактування яких раніше викликало деяке утруднення.

По-перше, ріанодин у високих концентраціях (500 нмоль/л) збільшує, діючи у стані спокою, вміст Са²⁺ у тканині залоз внаслідок зміщення рівноваги в сторону транспортування Са²⁺ у люмен ендоплазматичного ретикулуму.

По-друге, додавання ріанодину до середовища інкубації у низькій концентрації (5 нмоль/л) спричиняє вивільнення депонованого Са²⁺. Якщо викид Са²⁺ внаслідок цього не досягає певного критичного рівня, то це супроводжується незначною активацією ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів завдяки підвищенню чутливості системи до ендогенного ІФ₃, який, очевидно, продовжує спонтанно утворюватися за умов досліду. Як наслідок, ефект гепарину, який ми не могли зареєструвати у контрольних умовах, є досить вираженим за наявності ріанодину у середовищі інкубації.

І по-третє. У випадку, коли вивільнення Са²⁺ з депо ріанодином у часі співпадає з активацією його вивільнення екзогенним ІФ₃, Са²⁺-функціональна одиниця переходить у стан інактивації, що, мабуть, і спостерігалося у описаному вище експерименті.

Роль мітохондрій у Са²⁺-сигналізації секреторних клітин. Секреторні клітини слинних залоз личинки комара-дергуна суттєво відрізняються від секреторних клітин екзокринних залоз вищих тварин, хоча полярність їхньої будови є досить таки вираженою. Особливо це стосується розташування мітохондрій, які розміщені, в основному, вздовж базальної частини плазматичної мембрани. Тут ці органели, завдовжки 1269 ± 167 нм та завширшки 510 ± 33 нм, мають бобоподібну форму і орієнтовані, як правило, перпендикулярно до плазматичної мембрани. Фактично цей шар мітохондрій відокремлює плазматичну мембрану від усього іншого простору цитоплазми, зайнятого, в основному, гранулярним ендоплазматичним ретикулумом.

З'ясувалося також, що ефекти ріанодину (5 нмоль/л) та рутенію червоного (10 мкмоль/л) за умов поєднання їх у середовищі інкубації мають неадитивний характер. А, слід зазначити, ефекти цих речовин повинні бути адитивними, якщо функціонування Са²⁺-активованих Са²⁺-каналів ендоплазматичного ретикулуму і Са²⁺-уніпортера мітохондрій не залежить одне від одного.

За стимуляції ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів додаванням до середовища інкубації ІФ₃ та одночасному пригніченні функціонування Са²⁺-уніпортера мітохондрій рутенієм червоним не спостерігалося статистично достовірних змін вмісту Са²⁺ у тканині залоз, оброблених сапоніном, порівняно з контролем (середовище, яке не містило ні рутенію червоного, ні ІФ₃). Таким чином, блокування рутенієм червоним процесу акумуляції Са²⁺ мітохондріями запобігає активуванню вивільнення Са²⁺ з ІФ₃-чутливого депо.

Це дозволяє нам говорити про наявність ендоплазматично-мітохондріальної Са²⁺-функціональної одиниці (ІІ типу). У стані спокою внутрішньоклітинні Са²⁺-канали вивільняють певну кількість Са²⁺, які помпою транспортуються не тільки назад в ендоплазматичний ретикулум, а й уніпортером у матрикс мітохондрій, тому не відбувається генерація клітинної відповіді. Заблокувавши уніпортер мітохондрій, ми спричинили, очевидно, локальне підвищення [Са²⁺] поруч розташованого ІФ₃-чутливого депо. На ІФ₃-чутливому рецепторі, як відомо (Bootman, Lipp, 1999; Adkins Taylor, 1999), наявні інгібіторні та активуючі сайти зв'язування Са²⁺. Внаслідок суттєвого підвищення [Са²⁺] відбувається, ймовірно, швидке зв'язування Са²⁺ з інгібіторними сайтами. Це призводить до пригнічення, за принципом негативного зворотного зв'язку, подальшого вивільнення Са²⁺ з депо. Тому одночасне застосування ІФ₃ та рутенію червоного не викликає зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз. Аналогічно, за одночасної дії ріанодину та рутенію червоного зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз є менш вираженим, ніж за дії одного лише ріанодину, оскільки функціонування ріанодинчутливих Са²⁺-каналів теж залежить від цитозольної [Ca²⁺].

4. Роль внутрішньоклітинних сигнальних молекул у регулюванні Са²⁺-транспортувальних систем

Регулювання кальмодуліном Са²⁺-транспортувальних систем. За наявності блокатора кальмодуліну хлорпромазину у концентраціях 5-100 мкмоль/л нестимульоване збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз (тобто, протягом часу їхньої інкубації у базальних умовах) є суттєвішим, ніж у контролі. Залежність змін вмісту Са²⁺ у тканині залоз від концентрації хлорпромазину задовільно описується рівнянням Хілла з коефіцієнтом n = 1,01. Це свідчить, що за умов цього досліду ефект хлорпромазину визначається порушенням функціонування лише однієї Са²⁺-транспортувальної системи. І цією системою є, найімовірніше, Са²⁺-помпа плазматичної мембрани. Це підтверджується тим, що додавання хлорпромазину (100 мкмоль/л) на фоні еозину Y (5 мкмоль/л) не спричиняє достовірних змін нестимульованого збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз.

Стимульоване гіпонатрієвими розчинами збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз під впливом хлорпромазину суттєво зменшувалось. Це дозволяє стверджувати про здатність хлорпромазину ефективно пригнічувати Na⁺-Ca²⁺-обмін мембрани досліджуваних клітин у зворотному режимі. Причому, цей процес досить добре описується рівнянням Хілла в діапазоні концентрацій хлорпромазину від 5 до 50 мкмоль/л (рис. 14, крива 1). Але значення коефіцієнта n (< 1) засвідчує, що хлорпромазин за цих умов пригнічує не лише Na⁺-залежний вхід Са²⁺ в клітину, а й виведення його Са²⁺-помпою плазматичної мембрани.

Встановлено також, що хлорпромазин (100 мкмоль/л) на 16,46% (Р < 0,01, n = 6) пригнічує функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника у прямому режимі, спричинене збільшенням [Na⁺]_e до 180 ммоль/л.

Ефект хлорпромазину на К⁺-стимульоване збільшення вмісту Са²⁺ теж досить добре описується рівнянням Хілла з n = 0,44 (рис. 14, крива 2). Отже, кальмодулін стимулює і пасивне транспортування Са²⁺ через потенціалкеровані Са²⁺-канали. Цілком можливо, що низьке значення коефіцієнта Хілла зумовлено пригніченням Са²⁺-помпи плазматичної мембрани, оскільки Na⁺-Са²⁺-обмінник, якщо і функціонує, то у зворотному режимі. Правда, константа К_0,5 пригнічення хлорпромазином К⁺-стимульованого збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз суттєво є більшою, ніж це ми постулюємо для пригнічення Са²⁺-помпи плазматичної мембрани.

За наявності хлорпромазину (100 мкмоль/л) у середовищі ні ріанодин у концентрації 5 нмоль/л, ні ІФ₃ не викликали достовірних (P = 0,190, n = 7 і P = 0,834, n = 6 відповідно) змін вмісту Са²⁺ у тканині залоз. Отже, кальмодулін необхідний для активації як ріанодинчутливих, так і ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна.

Парадоксальним, на перший погляд, є те, що Са²⁺-кальмодуліновий комплекс спричиняє однаковий вплив на функціонування різноспрямованих Са²⁺-транспортувальних систем секреторних клітин. Згідно з сучасною клітинною парадигмою для узгодження функціонування Са²⁺-транспортувальних систем одного і того ж домену фізіологічно-активні речовини повинні мати різноспрямовану дію на ці системи. Але така схема не є енергетично вигідною - не варто активувати Са²⁺-помпу плазматичної мембрани, коли Са²⁺-канали є заблоковані.

Більш вигідним є застосування принципу «зміщених фаз»: максимальна активність активних Са²⁺-транспортувальних систем зміщена в часі відносно максимальної активності пасивних Са²⁺-транспортувальних систем того самого Са²⁺-домена, а не перебуває в протифазі (рис. 15). Клітина ніби заздалегідь «готується» до локального підвищення цитозольної [Са²⁺], тому із підвищенням ймовірності активації Са²⁺-каналів плазматичної мембрани відбувається стимуляція Na⁺-Ca²⁺-обмінника і Са²⁺-помпи цього ж домену. Лише за цих умов є можливою активація локальної Са²⁺-хвилі, яка максимально відповідала б фізіологічним потребам клітини і, водночас, не була б енергетично обтяжливою для неї.

Відомо, що кальмодулін може реалізовувати свій ефект прямо або опосередковано через зміну активності протеїнкінази, і це дозволяє змістити в часі його дію. Мабуть у цьому полягає доцільність наявності такої великої кількості регуляторних шляхів у клітині.

Звичайно, наведені тут міркування є чисто теоретичними і їхньою метою є лише обґрунтування можливої доцільності односпрямованих змін активностей систем активного і пасивного транспортування Са²⁺ під впливом хлорпромазину. Для підтвердження цих міркувань необхідно провести низку досліджень на експериментально вищому рівні, ніж ми це можемо сьогодні здійснити.

Внутрішньоклітинні Са²⁺-транспортувальні системи за дії циклічних нуклеотидів. За дії екзогенного цАМФ у концентрації 1 мкмоль/л вміст Са²⁺ у тканині залоз зменшувався на 34,50 ± 11,92% (P < 0,05, n = 9). Під впливом цАМФ у концентрації 10 і 100 мкмоль/л зменшення виявилося менш суттєвим і недостовірним.

За наявності у середовищі гепарину (500 мкг/мл) середньоарифметичне значення вмісту Са²⁺ у тканині залоз під впливом цАМФ дозозалежно зменшувалося, але достовірною виявилася лише зміна за 100 мкмоль/л (на 29,26 ± 13,54%, P < 0,05, n = 9). Оскільки на фоні гепарину цАМФ у концентрації 1 мкмоль/л не спричиняв достовірного зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз, то це свідчить, що він у цій концентрації активує неіндуковане вивільнення Са²⁺ з ІФ₃-чутливого депо, стимулюючи, мабуть, ІФ₃-чутливі Са²⁺-канали. Тим не менше, за наявності у середовищі інкубації цАМФ (1 мкмоль/л) ІФ₃ не змінював вмісту Са²⁺ у тканині залоз. Отже, присутність у середовищі інкубації цАМФ у низькій концентрації стимулює спонтанне вивільнення Са²⁺ з гепаринчутливого депо, але запобігає дії екзогенного ІФ₃.

Зменшення ж вмісту Са²⁺ у тканині залоз під впливом цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л, яке спостерігалося за наявності у середовищі гепарину, спричинене зміною функціонування інших внутрішньоклітинних депо Са²⁺, найімовірніше, ріанодинчутливих. Це підтверджується тим, що за наявності у середовищі інкубації цАМФ (100 мкмоль/л) під впливом ріанодину у концентрації 500 нмоль/л вміст Са²⁺ в тканині залоз збільшився на 89,54 ± 30,96%. За відсутності цАМФ у середовищі збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз під впливом ріанодину становило лише 40,72 ± 12,52% (P < 0,05, n = 7). Це означає, що присутність цАМФ у середовищі інкубації підсилює блокуючу дію ріанодину. Цей факт можна пояснити тим, що ріанодин легше зв'язується із відкритими каналами, ніж із закритими (Sutko et al., 1997).

Таким чином, зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз за дії цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л зумовлене активацією ріанодинчутливих Са²⁺-каналів. Хоча одночасно спостерігається і пригнічення ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів. Таке твердження базується на тому, що недостовірне і незначне зменшення вмісту Са²⁺ під впливом цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л стає більш інтенсивнішим і статистично достовірним, коли у середовищі інкубації був присутній гепарин. Більше того, одночасна наявність в розчині блокаторів обох класів каналів - ріанодину (500 нмоль/л) і гепарину (500 мкг/мл) - цілковито запобігало будь-яким змінам вмісту Са²⁺ під впливом цАМФ у концентрації 100 мкмоль/л (Р = 0,86, n = 6).

Додавання цГМФ у концентраціях 1-100 мкмоль/л до середовища інкубації оброблених сапоніном залоз спричинило збільшення вмісту Са²⁺, яке, однак, не досягало першого рівня достовірності у жодному із випадків. За наявності у середовищі інкубації гепарину (500 мкг/мл) середньоарифметичні значення вмісту Са²⁺ в тканині залоз у контролі та за дії цГМФ у концентрації 100 мкмоль/л майже не відрізнялися. Так само не чинив цГМФ достовірного впливу за присутності в середовищі інкубації ріанодину у блокуючій концентрації (500 нмоль/л), хоча слід відзначити тенденцію до зменшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз за цих умов. Лише за наявності тапсигаргіну (1 мкмоль/л) - селективного блокатора Са²⁺-помпи ендоплазматичного ретикулуму - цГМФ викликав збільшення вмісту Са²⁺ в тканині залоз на 50,65 ± 17,44% (Р = 0,022, n = 7).

Одержані нами дані теж вказують на різноспрямованість ефектів, спричинених цГМФ. Перш за все, він пригнічуює неіндуковане вивільнення Са²⁺ із депо. Це може відбуватись через фосфорилювання цГМФ-залежними протеїнкіназами цГМФ як ІФ₃-чутливих, так і на ріанодинчутливих Са²⁺-каналів або внаслідок прямої дії на них. Але наявність ефекту цГМФ за умови блокування Са²⁺-помпи ендоплазматичного ретикулуму вказує, що цей циклічний нуклеотид впливає також і на неї.

Вплив на Ca²⁺-гомеостаз секреторних клітин донора NO. Залежність секреції білка та вмісту Са²⁺ у тканині залоз від концентрації нітропрусиду натрію у середовищі інкубації має складний характер (рис. 16). За концентрації нітропрусиду 1 мкмоль/л спостерігається зменшення вмісту білка у середовищі (від 34,86 1,61 до 27,44 3,43% від сумарного вмісту білка), а також зменшенням вмісту Ca²⁺ у тканині залоз від 0,66 0,12 до 0,59 0,11 нмоль на залозу, яке не досягало першого рівня достовірності. Підвищення концентрації нітропрусиду натрію у середовищі інкубації слинних залоз до 10, 50, 100 та 200 мкмоль/л спричиняло відновлення рівня секреції білка до його контрольних значень.

Зміни секреції, спричинені наявністю у середовищі інкубації залоз нітропрусиду натрію у концентрації 10 мкмоль/л, супроводжувалися зменшенням вмісту Ca²⁺ у тканині слинних залоз. Але підвищення концентрації нітропрусиду натрію до 50 мкмоль/л викликало збільшення вмісту Ca²⁺ у тканині залоз. Додавання до середовища інкубації слинних залоз нітропрусиду натрію у концентрації 100 та 200 мкмоль/л призводило до повторного зменшення вмісту Ca²⁺ у тканині залоз.

Виявлені нами зміни вмісту Ca²⁺ у тканині залоз, спричинені дією нітропрусиду натрію у різних концентраціях, зумовлені, мабуть, його дією на функціонування різних Са²⁺-транспортувальних систем досліджуваних клітин, у тому числі і Na⁺-Ca²⁺-обмінника плазматичної мембрани.

Для підтвердження припущення про вплив NO на функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна були проведені дослідження впливу нітропрусиду натрію на амплітуду вхідного і вихідного струмів Na⁺-Ca²⁺-обміну.

Ми встановили, що нітропрусид натрію у концентраціях 20 та 50 мкмоль/л збільшував амплітуду вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну на 23,33 та 25,48% (Р < 0,05, n = 8) відповідно (рис. 17 А). Додавання до внутрішньоклітинного розчину нітропрусиду натрію у концентраціях 100 і 200 мкмоль/л теж викликало збільшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну відносно контролю, але лише на 15,43 і 16,03% відповідно і статистично недостовірно. Подібним чином змінювалася й амплітуда вихідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну (рис. 17 Б), правда, за цієї експериментальної вибірки зміни не досягали першого рівня достовірності за жодної концентрації нітпропрусиду натрію.

За наявності у розчині для внутрішньоклітинної перфузії ПХМБ (5 мкмоль/л) додавання до нього нітропрусиду натрію у концентраціях 20 та 50 мкмоль/л спричиняло збільшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну відповідно на 11,56 та 13,74%, яке в обох випадках було приблизно вдвічі меншим, ніж за відсутності блокатора сульфгідрильних груп (рис. 17 А). Нітропрусид натрію у концентраціях 100 та 200 мкмоль/л, навпаки, за умови блокування SH-груп викликав збільшення амплітуди вхідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну на 29,50 та 28,76% відповідно. Аналогічна залежність виявлена і для вихідного струму Na⁺-Ca²⁺-обміну - за наявності ПХМБ ефект нітропрусиду у концентрації 20 і 50 мкмоль/л був менше виражений, ніж у контролі, а у концентрації 200 мкмоль/л, навпаки, суттєвіший (рис. 17 Б).

Збільшення амплітуди вхідного і вихідного струмів Na⁺-Ca²⁺-обміну, що спостерігається за присутності ПХМБ, реалізується, ймовірно, цГМФ-залежним механізмом. Тим не менше, активація Na⁺-Ca²⁺-обміну нітропрусидом у низьких концентраціях зумовлена дією NO на SH-групи молекули обмінника. Відомо, що блокування цих груп молекули Na⁺-Ca²⁺-обмінника із цитоплазматичного боку мембрани за допомогою ПХМБ супроводжується активацією Na⁺-Ca²⁺-обміну. Пригнічення Na⁺-Ca²⁺-обміну нітропрусидом натрію у високих концентраціях, яке не спостерігається за наявності ПХМБ у внутрішньоклітинному розчині, є наслідком залучення до реалізації ефекту NO інших внутрішньоклітинних сигнальних шляхів.

Узагальнення

На основі встановлених фактів про наявність Са²⁺-транспортувальних систем, а також даних про їхні властивості і взаємозалежність функціонування пропонується гіпотетична схема Са²⁺-сигналізації секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus (рис. 18).

Розглядаючи загальні положення про просторову організацію Са²⁺-сигналізації будь-яких клітин, тим більше таких полярних, якими є секреторні клітини екзокринних залоз, необхідно ввести поняття кальцієвого домена. Особливо це актуально для секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна. Загальноприйняті положення про те, що цитозольний рівень Са²⁺ визначається його потоками через плазматичну мембрану і через мембрану ендоплазматичного ретикулуму, на сьогодні є недостатніми. Мабуть, клітинна організація Са²⁺-сигналу складається в основному із локальних хвиль, виникнення яких неможливо пояснити, виходячи із «макроцитозольної позиції».

У досліджуваних секреторних клітинах функціонують не менше трьох просторово окреслених кальцієвих доменів, які сформовані за участю плазматичної та внутрішньоклітинних мембран, мають різний набір Са²⁺-траспортувальних сисітем і виконують різне функціональне навантаження.

Кальцієвий домен, який пов'язаний з функціонуванням базальної (базо-латеральної) частини плазматичної мембрани, - це примембранний простір, відокремлений від іншої частини цитоплазми надзвичайно щільним шаром мітохондрій. Са²⁺-сигнал у цьому базальному кальцієвому домені генерується завдяки узгодженому функціонуванню потенціалкерованих Са²⁺-каналів, Na⁺-Ca²⁺-обмінника та Ca²⁺-помпи плазматичної мембрани, які формують Са²⁺-функціональну одиницю плазматичної мембрани, а також Са²⁺-уніпортера мітохондрій. Можливим первинним посередником (або одним з можливих первинних посередників) для досліджуваних клітин є АТФ. Активація цією молекулою P2X-рецепторів спричиняє надходження у цитозоль Са²⁺ з позаклітинного середовища та деполяризацію плазматичної мембрани (2). Деполяризація плазматичної мембрани забезпечує активацію потенціалкерованих Са²⁺-каналів (3a) та наступну їхню Са²⁺- і потенціалозалежну інактивацію. Крім того, деполяризація мембрани має часове обмеження для розвитку кальцієвої відповіді ще й за рахунок активації високопорогових потенціалокерованих К⁺- і Cl^--каналів (3c). Гіперполяризація мембрани, що виникає внаслідок виходу катіонів К⁺ потенціалкерованими К⁺-каналами (калієвий електрохімічний градієнт спрямований з клітини) та входу аніонів Cl ^- потенціалкерованими Cl^--каналами (хлорний електрохімічний градієнт спрямований у клітину), обмежує в часі можливість Na⁺-Ca²⁺-обмінника транспортувати Са²⁺ у клітину (3b). Головне значення Na⁺-Ca²⁺-обмінника, як і Са²⁺-помпи плазматичної мембрани, є виведення Са²⁺ у позаклітинне середовище (4). Са²⁺-уніпортер мітохондрій має важливе значення у просторовому і, можливо, часовому обмеженні кальцієвої відповіді (5). Цілком логічно припустити, що завданням Са²⁺-сигналу, спричиненого зміною функціональної активності Са²⁺-транспортувальних систем базального кальцієвого домену (1-5), є регулювання процесів ендоцитозу та енергетичного забезпечення секреторних клітин.

Апікальний кальцієвий домен - це частина цитоплазми над шаром мітохондрій, за винятком, мабуть, ядра. Доцільність функціонування такого домену виникає із необхідності виокремити процеси екзоцитозу, а також синтетичні процеси на мембранах гранулярного ендоплазматичного ретикулуму. Забезпечує генерацію Са²⁺-сигналу у межах цього домену ендоплазматична та ендоплазматично-мітохондріальна Са²⁺-функціональні одиниці. Активація P2Y-рецепторів (6) запускає продукування ІФ₃ та вивільнення Са²⁺ з ІФ₃-чутливого депо (7). Підсилюється це вивільнення активацією ріандинчутливих Са²⁺-каналів (8). Са²⁺-сигнал в часі обмежується у цій частині клітини лише Са²⁺-помпою внутрішньоклітинних депо (9), а також блокуванням каналів вивільнення Са²⁺, яке реалізується згідно принципу негативного зворотного зв'язку. Водночас молекули ІФ₃ можуть вільно проникати у сусідні секреторні клітин через високопровідні міжклітинні контакти, чим забезпечують генералізацію секреторного процесу. Але цей процес теж є обмежений у часі, оскільки збільшення цитозольної [Са²⁺], спричиненої активацією тим же ІФ₃ внутрішньоклітинних Са²⁺-каналів, блокує високопровідні міжклітинні контакти.

Активація кальцієвої відповіді за участю ендоплазматичної Са²⁺-функціональної одиниці (6-9) повинна супроводжуватися підвищенням синтезу продуктів секреції та їхнім екзоцитозом. Ендоплазматично-мітохондріальна Са²⁺-функціональна одиниця виконує важливу роль у регулюванні наповнення внутрішньоклітинних депо катіонами Са²⁺, а також забезпечує узгодження інтенсивності екзоцитозу, синтезу і функціонування іонтранспортувальних систем, з одного боку, та окисного фосфорилювання, з другого.

Значні розміри ядра дозволяють припустити, що у цій частині клітини Са²⁺-сигнал має свої особливості, тому потрібно говорити про наявність ще одного, третього, ядерного кальцієвого домену. На жаль, фактів, які стосуються цього домену секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна, ми не маємо, але, виходячи з даних літератури (Petersen, Burdakov, Tepikin, 1999), ми можемо передбачити, що вивільнення Са²⁺ з перинуклеарного простору ІФ₃-чутливими та ріанодинчутливими є тривалим у часі і забезпечує інтенсифікацію процесів транскрипції та трансляції генетичного матеріалу. Без сумніву, канали вивільнення Са²⁺ з перинуклеарного простору разом з Са²⁺-помпою повинні бути об'єднані у спільну функціональну одиницю. Враховуючи це, а також наявність негативних зворотних зв'язків у регуляції каналів катіонами Са²⁺, можна стверджувати, що Са²⁺-сигнал і у цій частині клітини є не статичним, а обмеженим у часі.

Усі Са²⁺-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна зазнають різноманітних впливів з боку інших внутрішньоклітинних сигнальних молекул (кальмодуліну, цАМФ, цГМФ, NO). Кальмодулін забезпечує позитивний (за низьких [Са²⁺]_i) зворотний зв'язок у регулюванні чи не всіх Са²⁺-транспортувальних систем. Це може реалізовуватися безпосередньою взаємодією Са²⁺-кальмодулінового комплексу з молекулою відповідної Са²⁺-траспортувальної системи або опосередковано через Са²⁺-кальмодулінзалежну протеїнкіназу. Наявність таких додаткових ланок є необхідною умовою для зміщення в часі процесів (принцип «зміщених фаз»), пов'язаних із стимуляцією систем пасивного і активного транспортування Са²⁺.

Складним є також і регулювання Са²⁺-транспортувальних систем секреторних клітин за участю цАМФ, цГМФ та NO. Чутливість до цих сигнальних молекул є свідченням, що Са²⁺-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна зазнають регуляції з боку гормонів або медіаторів.

Висновки

Використовуючи різні експериментальні та теоретичні підходи дослідження у секреторних клітинах слинних залоз личинки Chironomus plumosus відповідно до поставленої мети і завдань ідентифіковано потенціалкеровані Са²⁺-канали, Na⁺-Ca²⁺-обмінник, Са²⁺-помпу плазматичної мембрани і ендоплазматичного ретикулуму, Са²⁺-уніпортер мітохондрій, IФ₃-чутливі та ріанодинчутливі Са²⁺-канали, P2Y- і P2X-рецептори, а також досліджено їхні властивості і особливості функціонування.

На основні аналізу отриманих результатів зроблено наступні висновки:

Na⁺-Ca²⁺-обмінник плазматичної мембрани секреторних клітин слинних залоз личинки Chironomus plumosus характеризується низькою специфічністю до одновалентних катіонів. Ряд спорідненості катіонзв'язуючого центру Na⁺-Ca²⁺-обмінника із зовнішнього боку плазматичної мембрани до одновалентних катіонів має такий вигляд: Cs⁺ ? NH₄⁺ ? K⁺ > Na⁺ > OHNH₃⁺ ? Li⁺ > NH₂NH₃⁺, де співвідношення між амплітудами вхідних струмів, що супроводжують функціонування Cs⁺-Ca²⁺ - та Li⁺-Ca²⁺-обмінів, становить 2,91.

Максимальне значення амплітуди вхідних Na⁺-Me²⁺-обмінів зростають у послідовності Ca²⁺ > Sr²⁺ > Ba²⁺, отже специфічність Na⁺-Ca²⁺-обмінника до двовалентних катіонів теж не є високою. А значення коефіцієнта Хілла n і K_0,5, навпаки, у названій послідовності суттєво зменшуються, що є свідченням наявності каталітичної регуляції Na⁺-Ca²⁺-обміну цитозольним Са²⁺.

Катіони перехідних d-елементів по-різному впливають на Na⁺-Ca²⁺-обмін через плазматичну мембрану секреторних клітин, що визначається їхньою здатністю до комплексоутворення з різними лігандами. Катіони Cd²⁺ за низької (фізіологічної) та високої [Ca²⁺]_e стимулюють функціонування Na⁺-Ca²⁺-обмінника. Катіони Ni²⁺ за низької [Ca²⁺]_e пригнічують Na⁺-залежне виведення Са²⁺ з К_0,5 = 7,93 ммоль/л, n = 1,05, а за високої - стимулюють. Катіони La³⁺ пригнічують Na⁺-Ca²⁺-обмін як за низької (К_0,5 = 0,28 ммоль/л, n = 0,33), так і за високої (К_0,5 = 2,40 ммоль/л, n = 0,42) [Ca²⁺]_e. Залежність спрямованості ефекту катіонів перехідних металів на струм Na⁺-Ca²⁺-обміну, а також констант напівінгібування та коефіцієнтів Хілла від [Ca²⁺]_e свідчить про здатність цих катіонів витісняти Са²⁺ як з транспортувального, так і з каталітичного центру обмінника.

Важливу роль у підтриманні певної функціональної активності Na⁺-Ca²⁺-обмінника мембрани досліджуваних клітин відіграють SH-групи, оскільки сірковмісний протектор цих груп GSH внаслідок додавання до внутрішньоклітинного розчину у низьких концентраціях ( 1 ммоль/л) стимулює, а у вищих - пригнічує Na⁺-залежне виведення Ca²⁺. Блокування SH-груп молекули Na⁺-Ca²⁺-обмінника із цитоплазматичного боку мембрани за допомогою ПХМБ супроводжується активацією Na⁺-Ca²⁺-обміну.

Залужнення внутрішньоклітинного середовища спричиняє зменшення амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну, в основі чого може лежати порушення каталітичної регуляції обмінника. Причиною збільшення амплітуди струму Na⁺-Ca²⁺-обміну внаслідок залужнення позаклітинного розчину, а також зменшення амплітуди струму в результаті закислення позаклітинного чи внутрішньоклітинного розчинів є зміна процесів асоціації-дисоціації транспортованих катіонів з молекулою обмінника.

Між Na⁺-Ca²⁺-обмінником і Са²⁺-помпою плазматичної мембрани, з одного боку, та Na⁺-Ca²⁺-обмінником та потенціалкерованими Са²⁺-каналами, з другого, існують тісні функціональні зв'язки навіть за умов внутрішньоклітинної перфузії, тому ми маємо підстави говорити про наявність, в першу чергу, Са²⁺-функціональної одиниці плазматичної мембрани. Стан цієї Са²⁺-функціональної одиниці визначається також залежністю Na⁺-Ca²⁺-обміну від активності Na⁺-K⁺-помпи.

Друга - ендоплазматична Са²⁺-функціональна одиниця об'єднує Са²⁺-помпу ендоплазматичного ретикулуму, ІФ₃-чутливі та рінодинчутливі Са²⁺-канали. Цей висновок підтверджується такими фактами: 1) додавання ріанодину до середовища інкубування залоз у субмікромолярній концентрації спричиняє збільшення вмісту Са²⁺ у їхній тканині; 2) стимуляція ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів запобігає одночасній стимуляції ріанодинчутливих Са²⁺-каналів чи навпаки; 3) гепарин спричиняє збільшення вмісту Са²⁺ у тканині залоз, оброблених сапоніном, але лише за наявності у середовищі ріанодину в активуючій ріанодинчутливі Са²⁺-канали концентрації.

Можна виділити ще одну, ендоплазматично-мітохондріальну Са²⁺-функціональну одиницю, яка складається з каналів вивільнення Са²⁺ ендоплазматичного ретикулуму та Са²⁺-уніпортера мітохондрій, оскільки дія на вміст Са²⁺ у тканині слинних залоз ріанодину у наномолярній концентрації та рутенію червоного, а також ІФ₃ та рутенію червоного за умови поєднання їх у середовищі інкубації є неадитивними.

Са²⁺-транспортувальні системи секреторних клітин слинних залоз личинки комара-дергуна є чутливими до кальмодуліну, який стимулює одночасно і системи активного, і системи пасивного транспортування Са²⁺. Зокрема, ефект блокатора кальмодуліну хлорпромазину на вміст Са²⁺ у тканині залоз в значній мірі реалізується через пригнічення Са²⁺-помпи, Na⁺-Ca²⁺-обмінника і потенціалкерованих Са²⁺-каналів плазматичної мембрани. Крім того, хлорпромазин запобігає активації вивільнення Са²⁺ з ріанодинчутливого та ІФ₃-чутливого депо. Така односпрямованість регуляції кальмодуліном різноспрямованих Са²⁺-транспортувальних систем має, без сумніву, фізіологічну доцільність і відповідає принципу «зміщених фаз».

Екзогенний цАМФ впливає на функціонування різних Са²⁺-транспортувальних систем внутрішньоклітинних депо по-різному: у концентрації 1 мкмоль/л запобігає дії екзогенного ІФ₃, але підсилює спонтанне вивільнення Са²⁺ з гепаринчутливого депо, а у концентрації 100 мкмоль/л - ріанодинчутливими Са²⁺-каналами. У концентрації 10 мкмоль/л цАМФ, який вводили екзогенно, а також при стимуляції аденілатциклази форсколіном, спостерігалося збільшення нагромадження Са²⁺ у гепаринчутливому депо або за рахунок стимуляції Са²⁺-помпи, або пригнічення ІФ₃-чутливих Са²⁺-каналів. Екзогенний цГМФ пригнічує і спонтанну активацію ІФ₃-чутливих та ріанодинчутливих Са²⁺-каналів, і Са²⁺-помпу ендоплазматичного ретикулуму.

Зареєстровано також суттєві зміни кальцієвого гомеостазу під впливом донора NO нітропрусиду натрію. Частково ці зміни реалізуються через модуляцію Na⁺-Ca²⁺-обміну через плазматичну мембрану. Причому, за низьких концентрацій донора NO стимулює функціонування обмінника як у фізіологічному, так і зворотному режимах, діючи на SH-групи його молекули. За високих концентрацій до реалізації ефекту NO залучаються інші внутрішньоклітинні сигнальні шляхи.

Таким чином, у досліджуваних секреторних клітинах функціонують не менше трьох просторово окреслених кальцієвих доменів, які сформовані за участю плазматичної та внутрішньоклітинних мембран, мають різний набір Са²⁺-траспортувальних систем і виконують різне функціональне навантаження. Кальцієва сигналізація у базальному кальцієвому домені здійснюється за участю Са²⁺-функціональної одиниці плазматичної мембрани і Са²⁺-уніпортера мітохондрій. У межах апікального кальцієвого домену кальцієва сигналізація реалізується ендоплазматичною та ендоплазматично-мітохондріальною Са²⁺-функціональними одиницями. Ядерний кальцієвий домен сформований Са²⁺-транспортувальними системами ядерної мембрани.

Список вибраних публікацій за темою дисертації

1. Клевець М.Ю., Дубицький Л.О., Гальків М.О., Манько В.В., Федірко Н.В. Na⁺-залежний транспорт кальцію у травних залозах // Вісник Київ. ун-ту ім. Тараса Шевченка. Інститут фізіології: Проблеми регуляції фізіологічних функцій. - Вип. 2. - 1996. - С. 3-10.