Фармако-токсикологические свойства гепатопротектора Диронакс

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГЕПАТОПРОТЕКТОРА ДИРОНАКС

ДУДАРЕВ АРТУР АЛЕКСАНДРОВИЧ

Краснодар - 2014

Работа выполнена на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО Башкирский государственный аграрный университет.

Научный руководитель:

Доктор ветеринарных наук, доцент, заместитель директора по ветеринарии ООО «Поливит» Кильметова Инна Робертовна

Научный консультант

Доктор технических наук, директор ООО «Базис» Струнин Борис Павлович

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, научный консультант отдела фармакологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии, Самотин Анатолий Митрофанович

Доктор ветеринарных наук, профессор кафедры общей патологии МГАВМиБ имени К.И. Скрябина Байматов Валерий Нурмухаметович

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО Воронежский государственный аграрный университет имени Императора Петра IЗащита состоится «05» сентября 2014 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 в Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Автореферат разослан «__» _________ 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.в.н. Родин Игорь Алексеевич

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время заболевания печени являются общемировой проблемой. Cпособность печени, как центрального органа процессов метаболизма, обмена ферментов, гормонов, микроэлементов и витаминов, нейтрализации токсинов к выполнению своих функций нередко снижается из-за многочисленных веществ, к которым относятся, в том числе, и некоторые лекарственные средства, при приеме в высоких, а иногда и в терапевтических дозах, повреждающие орган (В.Н. Денисенко, 2006; Е.Б. Бажибина, 2007; T.D. Gould, 2009).

Острые и хронические заболевания печени и желчевыводящих путей были и остаются важной проблемой ветеринарной медицины. Поскольку болезни печени широко распространены, их профилактика, лечение, изыскание способов ранней диагностики, коррекции нарушений метаболизма у животных являются одной из острых проблем в теоретической и практической работе (В.Н. Байматов, 1998; Г. Мюллер, 2006; С.В. Оковитый, 2010).

Несмотря на успехи в медицине и ветеринарии, обычные средства для лечения гепатопатий имеют нежелательные побочные эффекты, малоэффективны и являются дорогостоящими. Следовательно, существует большая потребность в безопасных альтернативных терапевтических средствах для лечения болезней печени (А.С. Логинов, 1997; В.А. Антипов, 2010; В. Бьюрж, 2010).

На отечественном рынке в настоящее время имеется широкий спектр препаратов и кормовых добавок, способствующих восстановлению печени при гепатопатиях различной этиологии, таких как гепатовет, лиарсин, глютаМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект, дюфалайт, гептрал, эссенциале, гепатосан, хофитол, аллохол, метионин, силимарин, лив 52, билигнин, фосфоглив, липоевая кислота, зиксорин и другие (Б.В. Уша, 2002; В.С. Бузлама, 2003; С. Кайзер, 2010).

Применение препаратов для лечения гепатопатий требует во многих случаях терапии в течение нескольких недель, часто с повторным курсом приёма, в результате чего затраты на лечение животных значительно повышаются. В связи с этим возникает необходимость в разработке гепатопротекторов, имеющих невысокую стоимость и не требующих длительного курса лечения.

В настоящее время разработан отечественный гепатопротектор Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетат). Препарат синтезирован в ООО «Базис» (г.Уфа) под руководством доктора технических наук Б.П. Струнина.

В настоящее время разработан отечественный гепатопротектор Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетат). Препарат синтезирован в ООО «Базис» (г.Уфа) под руководством доктора технических наук Б.П. Струнина.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение токсико-фармакологических свойств гепатопротектора Диронакс и его применение в ветеринарной практике для профилактики и лечения болезней печени.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- определить массовую долю основного вещества, изучить стабильность и подтвердить кристаллическую структуру Диронакса;

- дать токсикометрическую оценку Диронакса (острая и субхроническая токсичность, влияние на центральную нервную систему, функцию почек, массу внутренних органов):

- изучить влияние Диронакса на функциональное состояние печени на моделях экспериментальных гепатитов;

- определить терапевтическую эффективность Диронакса при гепатите собак и кошек;

- определить экономическую эффективность применения Диронакса в ветеринарии.

Научная новизна. Впервые по новой технологии синтезирован отечественный гепатопротекторный препарат Диронакс и доказана его химическая структура. Впервые проведены исследования широкого комплекса токсикологических показателей гепатопротектора Диронакс, позволившее выявить степень безопасности его применения. Установлено, что препарат Диронакс относится к четвёртому классу опасности.

Впервые изучены его токсико-фармакологические свойства, влияние на массу внутренних органов, функциональное состояние печени при экспериментальных гепатитах, морфологические и биохимические показатели крови у лабораторных и домашних животных, в частности, у кошек и собак. Препарат имеет положительные показатели на основании доклинических и производственных исследований.

Практическая значимость. Выполненные исследования и полученные результаты позволяют предложить препарат Диронакс как гепатопротектор при заболеваниях печени различной этиологии у собак и кошек. Предложенная доза не вызывает отрицательного действия и обладает лечебным действием.

Результаты исследований использованы в учебном процессе при преподавании дисциплины «Болезни собак» и «Болезни кошек» для студентов факультета биотехнологий и ветеринарной медицины.

Управлением ветеринарии Республики Башкортостан утверждены «Научно-практические рекомендации по применению гепатопротектора Диронакс для лечения домашних животных».

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, являющиеся основой диссертации, доложены, обсуждены и одобрены на V Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных « Молодежная наука и АПК: программы и перспективы» (Уфа, 2012), на II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Состояние и перспективы увеличения производства высококачественной продукции сельского хозяйства» (Уфа, 2013), на VI Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Наука молодых - инновационному развитию АПК» (Уфа, 2013), на Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию ФГБОУ ВПО Ижевская ГСХА «Научное обеспечение АПК. Итоги и перспективы» (Ижевск, 2013).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 научных статьях, 4 из которых - в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- определение массовой доли основного вещества, подтверждение его структуры и стабильности;

- токсикологическая характеристика препарата Диронакс;

- фармакологическая эффективность препарата Диронакс при экспериментальном поражении печени на модели острого гепатита у крыс;

- фармакологическая эффективность препарата Диронакс при гепатите у кошек и собак.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Изложена на 154 страницах компьютерного набора. Иллюстрирована 15 рисунками и 26 таблицами. Библиографический список включает 189 источников, в том числе 39 - иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась с 2011 по 2014 гг. на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», в институте органической химии Уфимского научного центра РАН, государственном бюджетном учреждении «Уфимская городская ветеринарная станция», в обществе с ограниченной ответственностью «Базис»(г.Уфа).

Основной объект исследований - субстанция / препарат Диронакс - диизопропиламмония дихлорацетат, синтезируемый ООО «Базис» (г.Уфа).

Массовую долю основного вещества определяли с помощью метода, основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим. По результатам исследований было установлено, что массовая доля основного вещества составила 99,8%.

Качественное определение Диронакса проводили методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессования образцов в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий порошок, а потом перемешаны с непоглощающим веществом - KBr. Измельченный и смешанный с KBr образец помещали непосредственно в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.

Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено на трёх последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при температуре 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г., 200 г., 300 г.

Определение кристаллической структуры Диронакса было выполнено методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА). Рентгеноструктурный анализ монокристаллов Диронакса проведён в Отделении рентгеноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН.

Кристаллографические характеристики соединения, параметры экспериментов и уточнения структур выполнены на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II CCD (MoКб графитовый монохроматор л 0.71073 ? 293 К). Структура была расшифрована с использованием программы SHELXS и уточнена методом наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов водорода (за исключением атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на основе стереохимических критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты атомов водорода аминогруппы выявлены из разностных карт электронной плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарной ячейки выполнены с использованием пакета программ АРЕХ 2. Bce расчёты произведены с использованием пакета программ WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведён с использованием программы PLATON. Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков.

В лабораторных и экспериментальных опытах было использовано 36 белых мышей, 352 белые крысы, 8 собак, 8 кошек.

Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических условиях вивария. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабораторных животных (СанПиН. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) М.:Закон, 1999).

Общетоксические свойства Диронакса были изучены и определены в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утверждёнными ГУВ СССР и «Методическими рекомендациями по токсикоэкологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).

Опыты проводили с соблюдением принципов, изложенных в Европейской Конвенции по защите животных, используемых для экспериментальных целей (г. Страсбург, Франция 1986; Хабриев Р.У., 2005).

Перед началом опыта животных взвешивали и рассчитывали количество препарата для каждого животного индивидуально в миллиграммах на 1 кг массы животного. На каждую группу брали не менее 6 животных, подобранных по принципу аналогов. Исследуемый препарат вводили перорально при помощи ротожелудочного зонда.

Параметры острой токсичности препарата вычислялись с помощью пробит-анализа по методу Литчфильда и Уилкоксона (Беленький М.Л., 1963).

Значения LD84 и LD16, найденные по характеристической кривой, использовались для вычисления коэффициента вариабельности смертельных доз, который характеризовали зону токсического действия и вычислялись как отношение LD84 к LD16.

Изучение субхронической токсичности проводили на белых крысах массой 170-190 г в течение 30 дней. Морфологические исследования крови проводили на гематологическом анализаторе Abacus junior vet, а также общепринятыми методами (Воронин, Е.С., 2003). Выведение лейкограммы проводили с помощью окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе.

Биохимические показатели крови (общий белок, глюкоза, холестерин, билирубин, щелочная фосфатаза, аланин-аминотрансфераза (АлАТ), аспартат-аминотранфераза (АсАТ), определяли на биохимическом и иммуноферментном автоматическом анализаторе ChemWell Combo и по общепринятым методам (Антонов, Б.И., 1989; 1991; Воронин, Е.С., 2003).

Исследование влияния препарата Диронакс на изменение массы внутренних органов изучали на беспородных белых крысах со средней живой массой 170-190 г. Были созданы 4 группы: 3 опытные и контрольная (интактная) по 15 животных в каждой группе. Исследуемый препарат ежедневно вводили перорально из расчета 1/10, 1/20 и 1/50 от среднелетальной дозы в течение 30 дней. Животных на 30-е сутки декапитировали под наркозом и производили взвешивание внутренних органов.

Влияние препарата Диронакс на центральную нервную систему проводили, исследуя ориентировочные реакции и исследовательский рефлекс крыс. Влияние препарата на функцию почек изучали в течение 30 дней. Для этого были подобраны на крысы средней массой 170-190 г. Исследуемый препарат вводили перорально в эффективной дозе 25 мг/кг. На 30-е сутки эксперимента исследовали влияние препарата на диурез. Мочу собирали с помощью индивидуальных мочесборников у животных, получивших водную нагрузку 5 мл на 100 г массы животного. За 12 часов до начала опыта животных лишали пищи и воды. Количество мочи измеряли каждый час в течение 3-х часов.

Гепатозащитное действие препарата Диронакс изучали на экспериментальных моделях поражения печени четырёххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом.

Определение эффективной дозы исследуемой дозы было проведено на модели острого ССl4 - гепатита на 96 белых беспородных крысах линии Wistar обоего пола массой 170-200 г. Экспериментальный гепатит воспроизводился путём одно-, двух- , трёхдневного внутрибрюшинного введения 50%-го раствора ССl4 в дозе 0,4 мл на 100 г. веса крысы.

Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день, начиная с первого дня введения ССl4 (в течение 3-х дней) за 1 час до введения гепатотоксина и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до кормления животных.

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени парацетамолом изучали на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170-210 г. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30 дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина). Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10-й, 20-й, 30-й день эксперимента. Исследуемые соединения вводили в эффективной дозе (25 мг/кг), рассчитанной на модели поражения печени четырёххлористым углеродом. В качестве препарата сравнения использовали Карсил «Софарма» в дозе 25 мг/кг.

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени этанолом изучали на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170-190 г. Экспериментальное повреждение печени у крыс вызывали пероральным введением 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г массы животного в течение 4-х дней. Диронакс и препарат сравнения Карсил «Софарма» по 25 мг/кг каждый вводили перорально при помощи зонда на протяжении 30 дней с первого дня эксперимента.

Для гистологических исследований кусочки печени крыс фиксировали в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы получали на замораживающем микротоме после депарафинации и окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по Романовскому-Гимза, Ван Гизону по общепринятым методам (Г.А.Меркулов, 1969).

Микроскопические исследования проводили с использованием светового микроскопа JENAVAL фирмы «CARL ZEISS» (Германия).

Для оценки влияния препарата Диронакс при остром гепатите были сформированы опытные группы из домашних животных (собаки и кошки), поступивших в ветеринарную лечебницу. В каждой группе наблюдалось не менее 8 животных. Анализ крови проводили в день поступления заболевших животных, а также на 10-й и 20-й дни наблюдения.

Экономическую эффективность устанавливали по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий» (Ветеринарное законодательство, 2000).

Результаты проведённых исследований обрабатывали статистически с применением метода вариационной статистики и проверкой достоверности результатов с использованием уровня значимости и критерия Стьюдента (Р). Достоверность различий оценивали при Р? 0,05 (ГОСТ 11.004-72, Г.Ф.Лакин, 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Качественное и количественное определение Диронакса

Определение массовой доли Диронакса осуществляли с помощью метода, основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим. Интенсивность окрашивания при этом пропорциональна концентрации диизопропиламмония дихлорацетата. Реакция осуществлялась при рН=6,8.

Массовую долю основного вещества в процентах вычисляли по формуле: % = С*10-6*100*50*100/m = 0,5 *C/m, где

С - количество диизопропиламмония дихлорацетата, определенное по

калибровочному графику пробы, г.

m - навеска пробы, г.

За результат анализа принимали среднее арифметическое трёх параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допустимое расхождение, равное 1,0%. Допустимая относительная погрешность результатов анализа ± 6,5%, при доверительной вероятности 0,05.

По результатам исследований было установлено, что массовая доля основного вещества составила 99,8%.

Качественное определение. Структура Диронакса была подтверждена с помощью Фурье-спектроскопии (англ. Fourier-transformed spectroscopy) - метода оптической спектроскопии, позволяющего получать спектр в результате обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по частоте). Измерение проводили на приборе Vector-22 фирмы BRUKER.

Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессования образцов в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий порошок, а потом перемешаны с непоглощающим веществом - KBr. Измельченный и смешанный с KBr образец помещали непосредственно в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.

Характеристические шкалы спектра Диронакса полностью совпадают со шкалами стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата, находящегося в библиотеке прибора, что подтверждает его структуру.

3.2 Изучение стабильности Диронакса

Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено на 3-х последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при температуре 45С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г, 200 г, 300 г. В течение всего эксперимента поддерживалось строгое соблюдение температурного режима. Для этого использовали ультратермостаты, позволяющие поддерживать температуру на заданном уровне с точностью ±(0,2-1)°С. Свойства препарата изучались непосредственно перед опытом, затем на 46-е, 91-е, 137-е и 182-е сутки опыта. Стабильность препарата оценивалась визуально (порошок белого цвета), ИК-спектрометрией и определением массовой доли основного вещества. Результаты испытания приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Физико-химические показатели Диронакса.

Номер серии	Длительность анализа при 45єС, сут.	Срок годности при 20єС,год	Описание	Подлинность	Количественное определение диизопропиламмония дихлорацетата %*масс. препарата
1	2	3	4	5	6
			Порошок белого цвета	Качественные реакции 1. диизопропиламмония дихлорацетат. ИК- спектроскопия ИК- спектр поглощения субстанции с КВr в области от 434 до 4000 см-1, должен иметь полное совпадение полос поглощения с полосами поглощения спектра стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата.
1	2	3	4	5	6
040	0	0	соответствует	подтвержд.	99,7
040	46	0.5	соответствует	подтвержд.	99,6
040	91	1.0	соответствует	подтвержд.	99,6
040	137	1.5	соответствует	подтвержд.	99,5
040	182	2.0	соответствует	подтвержд.	99,3
041	0	0	соответствует	подтвержд.	99,3
041	46	0,5	соответствует	подтвержд.	99,2
041	91	1.0	соответствует	подтвержд.	99,2
041	137	1.5	соответствует	подтвержд.	99,1
041	182	2.0	соответствует	подтвержд.	99,0
042	0	0	соответствует	подтвержд.	99,2
042	46	0.5	соответствует	подтвержд.	99,2
042	91	1.0	соответствует	подтвержд.	99,0
042	137	1.5	соответствует	подтвержд.	99,0
042	182	2.0	соответствует	подтвержд.	98,9

По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что экспериментальный срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182 суток, что соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.

3.3 Определение кристаллической структуры Диронакса

Нами была изучена кристаллическая структура Диронакса методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА).

Бесцветные пластинчатые монокристаллы диизопропиламмония дихлорацетата были получены из раствора в термостатированных условиях при 20°С, с точностью до 0,1°С при медленном испарении

Рентгеноструктурный анализ монокристаллов диронакса проведён в Отделении рентгеноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН.

Эксперимент выполнен на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II CCD (MoКб графитовый монохроматор л 0.71073 ? 293 К). Структура была расшифрована с использованием программы SHELXS и уточнена методом наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов водорода (за исключением атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на основе стереохимических критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты атомов водорода аминогруппы выявлены из разностных карт электронной плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарной ячейки выполнены с использованием пакета программ АРЕХ 2. Bce расчёты произведены с использованием пакета программ WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведен с использованием программы PLATON. Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков.

В целом, упаковка молекул соединения в кристалле характеризуется образованием бислоевых супрамолекулярных структур с внутренними гидрофильными фрагментами молекул и внешними гидрофобными сторонами, состоящими из хлорсодержащих фрагментов. Причем, внутри подобного бислоя Н-связанные цепочки анионов и катионов плотно упаковываются вдоль кристаллографического направления 0с, но существенных межмолекулярных взаимодействий (за исключением обычных Ван-дер-ваальсовых) между цепочками не наблюдается.

3.4 Токсикологическая оценка Диронакса

Одним из параметров установления активности Диронакса было определение его токсичности, так как её выявление может стать основной причиной токсикозов у животных.

Острая токсичность Диронакса

Исследование острой токсичности Диронакса направлено на установление количественных параметров токсичности данного химического соединения, изучение характера его действия и специфического токсического эффекта. Гибель животных после однократного воздействия вещества может наступить не сразу: сроки смерти зависят от механизма действия вещества, поэтому в токсикологии принято наблюдать за животными в течение 14-ти суток.

Острую токсичность Диронакса определяли на мышах массой 18,0-20,0 г, подобранных по принципу аналогов (с учётом возраста, пола, массы тела и клинического состояния).

Животные содержались при постоянном доступе к воде и пище. Кормление проводили согласно нормам, принятым для лабораторных животных.

Регистрацию гибели животных осуществляли в течение первых суток после введения препарата, затем наблюдение за животными проводили в течение 14-ти суток (регистрировали клиническое состояние, характер токсического действия введённого препарата, поведение, двигательную активность, поедаемость корма и отправление физиологических функций), так как сроки смерти зависят от механизма действия препарата Диронакс.

Исследуемое вещество вводили внутрь вместе с водой однократно индивидуально по 0,5 мл на мышь в дозах от 1000 мг/кг до 7000 мг/кг. Токсическое воздействие Диронакса оценивали по срокам гибели, числу павших животных, по состоянию и поведению животных

В результате проведённых исследований нами установлено, что однократное введение Диронакса в дозе 3000 мг/кг не вызывает изменений клинической картины токсикоза у белых мышей. При увеличении дозы с 5000 мг/кг до 7000 мг/кг массы тела признаки отравления проявлялись через 6-10 часов после введения Диронакса. Смерть наступала через 20-24 часа после введения препарата в токсических дозах.

Среднесмертельная доза (LD50) препарата составляет для белых мышей 5450 мг/кг (5068ч5784), LD16=5000 мг/кг. LD84=6000 мг/кг.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что согласно ГОСТ 12.1.007. - 76 Диронакс относится к четвёртому классу опасности (малоопасные вещества).

Субхроническая токсичность Диронакса

Субхроническую токсичность Диронакса изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160-190 г в течение 30 дней, которые были разделены на 4 группы по 15 животных в каждой.

Первые три опытные группы животных получали водный раствор Диронакса из расчета 1/10, 1/20 и 1/50 от среднелетальной дозы, соответственно. Четвёртая группа животных служила контролем. В начале опыта, через 15 и 30 дней у животных оценивали токсическое действие по следующим параметрам: интегральные показатели (внешний вид, симптомы интоксикации, прирост массы тела, потребление пищи и воды); биохимические показатели крови (уровень белка, холестерина, билирубина, аминотрансфераз: АлАТ, АсАТ); на периферическую кровь (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин). Кроме того, внутренние органы подвергались визуальному осмотру.

В течение всего эксперимента не отмечали падежа животных. Поведение животных и внешний вид волосяного покрова и кожи на протяжении эксперимента оставались без изменений.

Показатели морфологического состава крови, её биохимические параметры не выходили за пределы колебаний физиологической нормы в течение всего эксперимента. Биохимические показатели крови изменились лишь к 30-му дню.

Весовые коэффициенты внутренних органов животных, получавших Диронакс, незначительно повысились относительно контрольных животных лишь к 30-му дню эксперимента. При визуальном осмотре они не отличались от органов животных контрольной группы. Незначительные сгустки крови обнаружены лишь на внутренних органах крыс 1-й группы.

В результате проведенных исследований установлено, что Диронакс при пероральном введении не вызывает значительных изменений морфологических и биохимических показателей периферической крови, незначительно влияет на массу органов крыс и не вызывает гибели животных.

Влияние Диронакса на функцию почек

Влияние препарата на мочевыделительную систему изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160-190 г в течение 30 дней. Животным ежедневно вводили в желудок с помощью зонда водный раствор Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг. На 30-е сутки эксперимента исследовали влияние препарата на диурез.

Как видно из таблицы 2, в начале эксперимента уровень выделяемой мочи практически не отличался у опытных и контрольной группы и составлял 2,7±0,19 мл и 3,03±0,14 мл, соответственно. На 30-е сутки опыта в группе опытных крыс, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг, суммарное количество мочи за 3 часа составило 3,18±0,14 мл, тогда как в контроле - 2,91±0,19 мл.

Таблица 2 - Влияние препарата Диронакс на диурез крыс (n=6)

Соединение	Доза, мг/кг	Время наблюдения, сут.	Количество мочи, мл
			Через 1 час	Через 2 часа	Через 3 часа	Всего
Диронакс	25	исходное	0,77±0,10	1,03±0,15	0,9±0,10	2,7±0,19
		через 30 сут.	1,3±0,20	0,82±0,07	1,07±0,17	3,18±0,14
Контроль	-	исходное	1,27±0,21	0,68±0,12	1,1±0,26	3,03±0,14
		через 30 сут.	1,12±0,15	1,12±0,14*	0,67±0,14	2,91±0,19

*- достоверно по отношению к исходным данным (P?0,05).

В течение всего эксперимента во всех группах моча была светло-жёлтого цвета, прозрачная, без примесей и резкого специфического запаха. Акты мочеиспускания были произвольными и производились в естественной позе.

Таким образом, согласно данным, приведённым в таблице, диурез у опытных животных через 30 дней введения соединения аналогичен таковому у контрольных, что позволяет сделать вывод, что Диронакс не влияет на функцию почек.

Влияние Диронакса на центральную нервную систему

Для изучения влияния препарата Диронакс на функции центральной нервной системы крыс был использован тест «Открытое поле», для чего было сформировано 2 группы животных: опытная, животные которой получали Диронакс ежедневно в течение 30 дней в дозе 25 мг/кг, и контрольная.

Через сутки после последнего введения препарата Диронакс в течение 3 минут регистрировали:

- число вертикальных стоек, как показатель неспецифического уровня возбуждения;

- число исследованных отверстий, отражающих исследовательскую активность;

- число актов чистки (грумминг), выявляющих эмоциональную активность. гепатопротектор диронакс печень ветеринария

После 30-дневного введения Диронакса число вертикальных стоек, исследуемых отверстий и актов чистки в течение 3 минут были аналогичны как в опытной, так и в контрольной группах.

Таким образом, длительное применение Диронакса не оказывает влияния на функцию центральной нервной системы.

Влияние Диронакса на детоксицирующую активность печени

Нами было изучено влияние препарата на функциональную активность печени. Изучали влияние Диронакса на продолжительность сна, вызванного гексеналом, хлоралгидратом и тиопенталом. На 21-е сутки эксперимента за 1 час до введения снотворных веществ животным перорально вводили Диронакс в дозе 25 мг/кг. Затем внутрибрюшинно вводили раствор гексенала в дозе 80 мг/кг в виде 0,2%-ного раствора, хлоралгидрат в дозе 325 мг/кг и тиопентал в дозе 35 мг/кг.

Эффект снотворных препаратов оценивали по длительности утраты гравитационного рефлекса. Продолжительность гексеналового и хлоралгидратового сна в опытных группах была больше, чем у контрольных животных, но разница статистически недостоверна. Продолжительность тиопенталового сна в группе опытных животных была достоверно меньше, чем в контрольной группе.

Таким образом, Диронакс не влияет на продолжительность снотворного действия гексенала и хлоралгидрата и не вызывает угнетения активности печени, но уменьшает продолжительность сна, вызванного тиопенталом. Уменьшение продолжительности сна, вызванного тиопенталом, может быть связано с усилением катаболизма препарата печенью под влиянием Диронакса.

3.5 Гепатопротекторное действие Диронакса

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени четырёххлористым углеродом

Определение эффективной дозы было проведено на модели острого гепатита, который воспроизводился путем одно-, двух-, трёхдневного внутрибрюшинного введения 50%-го раствора четырёххлористого углерода (ССl4) в дозе 0,4 мл на 100 г. веса крысы.

Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) и Карсил (25 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день, начиная с первого дня введения ССl4 (в течение 3 дней) за 1 час до введения гепатотоксина и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до кормления животных.

Лечебное действие Диронакса определяли:

- по биохимическим показателям сыворотки крови крыс - уровню активности аланин- и аспартат-аминотрансфераз сыворотки крови (АЛТ, АСТ) и по коэффициенту де Ритиса);

- по желчеобразовательной функции печени (определяли общий объём выделенной желчи в мг на 100 г массы животного за 3 часа).

Во всех группах наблюдается повышение уровня АЛТ и билирубина, а так же понижение коэффициента де Ритиса относительно интактного контроля, что говорит о развитии гепатита после введения четырёххлористого углерода. Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) в группе, получавшей Диронакс в дозе 25 мг/кг в течение 15-ти дней, соответствовал величине 0,88 ± 0,071 в группе Карсила - 1,02±0,087, в контроле - 0,69 ± 0,078.

На 20-й день эксперимента во всех группах было выявлено улучшение биохимических показателей крови, относительно контрольной группы (гепатит). Наиболее положительная динамика выявлена в группах, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил, хотя величина АЛТ во всех группах была выше нормы в 1,3 раза, что говорит о неполном восстановлении функции печени.

На 25-й день эксперимента также отмечали положительную динамику во всех группах. В группах, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил, биохимические параметры крови достигли пределов физиологической нормы (таблица 3). Так, количество общего билирубина составляло 6,1 ± 0,51 и 6,2 ± 0,42 мкмоль/л соответственно, тогда как в контрольной группе уровень этого параметра составлял 13,6 ± 1,51 мкмол/л.

Таблица 3 - Биохимические показатели крови крыс с ССl4-индуцированным гепатитом на 25-й день эксперимента

Группы	Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ)	АЛТ, мккат/л	ACT, мккат/л	Билирубин общий, мкмоль/л
Контроль (гепатит)	0,96 ± 0,043 ****	0,0528 ± 0,003	0,051 ±0,003***	13,6 ± 1,51*
Карсил 25 мг/кг	1,06 ±0,068	0,0495 ± 0,005	0,051 ±0,002	6,2 ± 0,42*
Диронакс 20 мг/кг	0,96 ± 0,089	0,047 ± 0,0026	0,044 ± 0,003	7,9 ± 0,81
Диронакс 25 мг/кг	1,01 ±0,12	0,0432 ± 0,0034*	0,0425 ± 0,003**	6,1 ± 0,51**
Диронакс 30 мг/кг	0, 95 ±0,08 ****	0,044 ± 0,003	0,041 ±0,0026*	6,4 ± 0,62

*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,05);

** - достоверно по отношению к группе Карсил (P<0,05);

*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,02);

**** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,05).

После 15-дневного введения Диронакса в ежедневной дозе 25 мг/кг на фоне токсического гепатита, вызванного ССl4, наблюдали выраженный желчегонный эффект по сравнению с другими группами, в среднем, в 1,5 раза (таблица 4).

Таблица 4 - Желчеобразовательная функция печени на 15-й день эксперимента.

Группы Показатели	Интактный контроль	Карсил 25 мг/кг	Диронакс 20 мг/кг	Диронакс 25 мг/кг	Диронакс 30 мг/кг
Относительная масса печени	0,040 ±0,0031	0,0335 ± 0,0024	0,034 ±0,0014	0,030 ±0,0012*	0,036 ± 0,002
Общее количество желчи мг на 100 г за 3 часа	779,0 ± 35,87	826,1 ±76,3**	992,5 ± 84,0*	1204,4 ±72,7	848,7 ± 84,9

*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,01);

**- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,05);

*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01).

На 20-й день эксперимента желчегонная активность печени в группах, получавших Диронакс и Карсил была значительно выше относительно группы контроля (гепатит)

В результате изучения гепатозащитного действия Диронакса в различных дозах, мы выявили наиболее эффективную дозу, которая составляет 25 мг/кг. В этой дозе Диронакс обладает выраженным желчегонным эффектом и способствует восстановлению функции печени уже к 25-му дню.

Для гистологической оценки эффективности Диронакса было сформировано пять групп: в I-III группах животным ежесуточно перорально вводили водный раствор Диронакса в дозе 20, 25 и 30 мг/кг, соответственно; животные IV группы находились на обычном рационе; контролем служили интактные особи (V группа).

Печень интактных животных (V группа) была неизменённой величины. Под микроскопом было установлено, что дольки имели светло-красную окраску. Междольковые артерии и вены сопровождались желчными протоками и образовывали триады, хорошо видна междольковая соединительная ткань. Отчётливо видны внутридольковые (синусоидные) капилляры, которые располагались раздельно и сливались в центре. Гепатоциты располагались радиально.

Через 15, 20 и 25 суток после введения ССl4 под микроскопом были выявлены изменения в печени и гепатоцитах (IV группа). Центральные вены и впадающие в них синусоиды были расширены и заполнены кровью, в печёночных пластинках наблюдалась их дискомплексация, гепатоциты имели нечёткую окраску, нечёткие границы, по периферии долек располагались набухшие гепатоциты с темными ядрами и зернистой цитоплазмой.

В клеточном детрите в зоне некроза отмечено скопление эритроцитов и лейкоцитов, глыбок пигмента в макрофагах. При гистологическом исследовании выявлены нарушения структуры печёночных тяжей, дистрофические изменения гепатоцитов, увеличение размера последних и появление клеток неправильной формы с ячеистой или сетчатой цитоплазмой. Наблюдались уменьшенные в объёме, сморщенные формы ядра гепатоцитов. Центральные вены были расширены и заполненные кровью. В междольковой соединительной ткани, портальных зонах, участках микронекрозов наблюдалась инфильтрация лимфоидными, плазматическими клетками, гистиоцитами и фибробластами. В некоторых дольках обнаружены очаги некроза, характеризующиеся кариолизисом гепатоцитов. Следовательно, после отравления к 20-му дню в печени белых крыс развивается паренхиматозный гепатит, характеризующийся альтеративными изменениями паренхимы, инфильтрацией стромы органа клетками гематогенного и тканевого происхождения.

В течение первых 15 суток в группах, где животным ежедневно вводился Диронакс, наблюдалась аналогичная картина, как и в IV группе. Далее отмечалось, что в участках печени с относительно хорошо сохранившейся паренхимой отмечено повышение числа гепатоцитов с признаками гипертрофии, что проявлялось увеличением появления большого количества ядрышек, появлением двухъядерных и делящихся печёночных клеток.

На 20-е сутки у животных, получавших Диронакс, после отравления четырёххлористым углеродом в печени выявлена белковая и жировая дистрофия гепатоцитов центральных частей долек. В печени выявлены слабо выраженные признаки венозной гиперемии и зернистой дистрофии гепатоцитов периферических участков долек, что свидетельствует о снижении гипоксического состояния.

Компенсаторно-приспособительные процессы в печени белых крыс характеризуются гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена, регенерацией паренхимы печени. К 25-му дню морфологические признаки функциональной активности печени белых крыс возвращаются к норме с сохранением зернистой дистрофии гепатоцитов в центральных зонах долек.

Эффективность Диронакса при экспериментально поражении печени парацетамолом

Опыты проведены на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170-210 г. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30-ти дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина). Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10-й, 20-й, 30-й день эксперимента.

Исследуемые соединения вводили в дозе 25 мг/кг, рассчитанной на модели поражения печени четырёххлористым углеродом. В качестве препарата сравнения использовали Карсил в дозе 25 мг/кг.

Было сформировано 3 группы (контроль гепатит, Карсил и Диронакс)

Желчегонную активность соединения оценивали по желчесекреторной (мг/мин на 100 г массы) и желчевыделительной (общее количество желчи за 3 часа в мг на 100 г) функциям гепатоцитов. О гепатозащитном действии судили по активности ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ), билирубина в сыворотке крови.

Так, данные проведенных исследований свидетельствуют о том, что введение парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней увеличивает содержание АЛТ на 80% и АСТ на 9%. На фоне введения исследуемого соединения отмечается уменьшение активности биохимических показателей крови, характеризующих цитолиз и холестаз.

Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) в группах, получавших Карсил и Диронакс, в среднем был равен 1, что на 45-50% выше, чем в контрольной группе (гепатит) (таблица 5).

Таблица 5 - Биохимические показатели сыворотки крови при экспериментальном поражении печени парацетамолом

Группа животных	АСТ, мккат/л	АЛТ, мккат/л	Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ)	Билирубин общий, мкмоль/л
10-й день
Интактный контроль	0,045±0,0020	0,035±0,0020	1,28±0,044	4,9±0,22
Контроль (гепатит)	0,044±0,0036	0,063±0,0040	0,70±0,039	13,2±1,56
Карсил	0,043±0,0020	0,041±0,0031	1,08±0,080	9,6±0,50
Диронакс	0,046±0,0014	0,049±0,0019	0,94±0,017	11,4±0,58
20-й день
Контроль (гепатит)	0,049±0,0017	0,056±0,0048	0,89±0,056	10,1±0,71
Карсил	0,046±0,0015	0,039±0,0039	1,20±0,075	7,3±0,83
Диронакс	0,047±0,0012	0,047±0,0015	0,94±0,017	9,4±1,02
30-й день
Контроль (гепатит)	0,047±0,0026	0,50±0,0032	0,94±0,029	7,4±1,00
Карсил	0,047±0,0014	0,038±0,0015	1,24±0,071	5,2±0,24
Диронакс	0,046±0,0015	0,046±0,0012	0,98±0,036	6,7±0,94

При интоксикации парацетамолом наблюдаются значительные нарушения уровня билирубина. Содержание билирубина у больных животных было повышено в 2,7 раза по отношению к интактной группе. Диронакс и Карсил оказывали эффективное фармакотерапевтическое действие на функциональное состояние печени, снижая уровень билирубина в среднем на 20% по отношению к контрольной (гепатит) группе.

Также, введение исследуемого соединения на фоне поражения печени парацетамолом увеличивает скорость секреции желчи и общее количество желчи по сравнению с контролем (гепатит).

Таким образом, введение Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг при поражении печени парацетамолом уменьшает выраженность синдромов цитолиза и холестаза, приводит в норму уровень трансаминаз (АСТ, АЛТ) и содержание билирубина, увеличивает интенсивность секреции и выделение желчи гепатоцитами.

Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени этанолом

Опыты проводили на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170-190 г. Было сформировано 3 группы: 1-я группа служила контролем, 2-я группа - Карсил (25 мг/кг) и 3-я группа - Диронакс (25 мг/кг).

На 10-й, 20-й и 30-й день эксперимента проводили оценку желчеобразовательной и гепатопротекторной активности Диронакса. О степени выраженности воспалительных процессов в печени судили по отношению массы печени к массе тела.

Результаты проведенного исследования показали, что пероральное введение 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г живой массы в течение 4-х дней приводит к значительным изменениям биохимических показателей сыворотки крови. Повышаются уровни АЛТ (в 2,4 раза) и АСТ (в 1,2 раза), наблюдается гипербилирубинемия (в 3,2 раза) по отношению к интактным животным. Биологическое действие соединения Диронакс на функциональное состояние печени при введении этилового спирта подобно влиянию известного препарата Карсил. Так, уже на 20-й день лечения у животных, получавших Диронакс и Карсил, коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) приблизился к 1, снизились уровни АЛТ, АСТ и билирубина.

На 30-й день лечения Карсилом и Диронаксом наблюдалось повышение активности АЛТ. Так, её уровень составлял в контроле 0,060±0,0034 мккат/л, во второй группе - 0,040±0,0024 мккат/л и третьей группе - 0,051±0,0012 мккат/л.

Выраженность изменений в функциональном состоянии печени при поражении этанолом сопровождается также степенью угнетения желчеобразовательного и желчеотделительного процессов. У крыс, подвергнутых воздействию этанола, отмечается значительное снижение скорости секреции и падение общего количества желчи, что свидетельствует о развитии активности холестатического синдрома.

Диронакс и Карсил по сравнению с контролем (гепатит) увеличивают дебит желчи. На 30-й день лечения общее количество желчи за 3 часа (мг/100 г) в этих группах было выше, чем у интактных животных. Так, общее количество желчи на 10-й день у интактных животных составляло 855,8±32,2 мг/100 г, у контрольных - 591,2±37,3 мг/100 г, в группах, где вводили Карсил и Диронакс - 869,4±66,1 мг/100 г и 678,6±54,4 мг/100 г, соответственно.

На 30-й день опыта общее количество желчи за 3 часа составило в контрольной группе 789,9±61,3 мг/100 г, а в группах, где задавали Карсил и Диронакс - 942,7±35,5 мг/100 г и 890,1±39,27 мг/100 г, соответственно.

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что введение Диронакса в дозе 25 мг/кг приводит к уменьшению проявлений интоксикации и восстановлению функционального состояния печени.

Лечение Диронаксом приводит к достоверному снижению АЛТ, АСТ и билирубина по отношению к контролю (гепатит), а также нормализует желчегонную функцию печени.

3.6 Эффективность применение Диронакса при гепатите домашних животных

Целью данной работы является изучение гепатопротекторных свойств Диронакса при гепатите собак и кошек. Для опыта было отобрано по 8 животных в каждой группе. Собаки и кошки поступали в ветеринарную клинку в возрасте от 1 года до 6 лет. В опыте были использованы беспородные кошки и собаки мелких и средних пород (чау-чау, чихуахуа, той -терьеры и йоркширские терьеры и другие).

Диагностику гепатита у поступивших в ветеринарную лечебницу животных проводили с учётом анамнеза, клинических признаков, результатов ультразвукового исследования органа, общего и биохимического анализа крови, исключалось инфекционное и паразитарное происхождение заболевания. При сборе анамнеза было установлено, что практически во всех случаях имело место кормление пищей «со стола» (молочные и кисломолочные продукты с высоким содержанием жира, свинина, птица с кожей и жирная птица, копчёности, сыр, кондитерские изделия).

У животных наблюдалась внезапная потеря аппетита, рвота, температура тела поднималась до 40-41°С. Отмечалось угнетение животных, одышка и учащённое дыхание, расстройство сердечно-сосудистой системы, болезненность печени при пальпации, диспепсические расстройства, зуд, шёрстный покров был тусклым и взъерошенным. При ультразвуковой диагностике печени устанавливали выраженную в разной степени неоднородность структуры, которая проявлялась чередованием участков сниженной, средней и относительно повышенной эхогенности. Общая эхогенность паренхимы была заметно снижена, капсула утолщена и четко визуализировалась. Границы печени были ровными. Сосудистый рисунок обогащен за счет более четкой визуализации стенок печёночных вен. Размеры печени были увеличены. Острый гепатит протекает одновременно с холециститом, что характеризовалось обнаружением соответствующих ультразвуковых признаков, таких как отёк стенки желчного пузыря.

Для выявления влияния Диронакса на обменные процессы в организме собак и кошек было проведено морфологическое и биохимическое исследование крови. Взятие крови проводили во время первичного обращения в клинику, а также на 10-й и 20-й день комплексного лечения с применением препарата Диронакс.

Влияние Диронакса на морфологические и биохимические показатели крови собак

Одним из наиболее важных диагностических методов воздействия различных физиологических и патологических факторов является, в первую очередь, общеклиническое исследования крови и определение биохимических показателей в сыворотке крови подопытных животных.

Итак, уровень эритроцитов у заболевших животных был равен 7,92±0,31х1012/л; на 10-й и 20-й день лечения препаратом Диронакс количество эритроцитов составляло 7,66 ± 0,4х1012/л и 7,31±0,42х1012/л.

Установлено, что количество лейкоцитов во все сроки исследования оставалось в пределах нормы и составляло 10,96±1,37х109/л; 12,29±1,86х109/л и 11,36±1,17х109/л (до лечения, на 10-й и 20-й день соответственно). Однако полученные результаты статистически не подтверждены.

Количество лимфоцитов до лечения составило 38,23±9,05 %, а эозинофилов 4,39±1,0 %, при норме 12,0-30,0 % и 2,0-4,0 %, соответственно. На 20-й день применения Диронакса их количество доходило до физиологической нормы (29,16 ± 1,42 % и 4,9 ± 0,81 %, лимфоциты и эозинофилов, соответственно), но различия не подтверждаются статистикой.

Уровень нейтрофилов в начале эксперимента был понижен и составлял 57,38±8,11%, а на 20-й день лечения Диронаксом повышался до 65,94±2,12 %.

Незначительное снижение количества эритроцитов в пределах нормы определяло и уровень гемоглобина. Так, до лечения его количество составляло 184,0±7,67 г/л, а после терапии Диронаксом - 170,63±5,98 г/л и 169,0±4,8 г/л (10-й и 20-й день, соответственно), однако полученные данные были не достоверными.

Анализ результатов исследований показал, что у подопытных животных во все сроки наблюдения не происходило изменения гематокрита. В начале опыта уровень гематокрита составил 52,18±1,71 % в конце - 50,60±2,03 %.

Усреднённый объём эритроцита (УОЭ) у заболевших животных составлял 66,37±1,3фл, лечение Диронаксом не изменяло данный показатель, и на 20-е сутки эксперимента он находился в пределах физиологической нормы (66,25±1,04 фл).

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) в начале опыта составлял 23,24±0,44 пг, а в конце - 23,6 ±0,79 пг.

Во все сроки исследования наблюдалось незначительное повышение уровня СКГЭ (средней концентрации гемоглобина в эритроците), которое составляло на начало опыта 349,63±1,56 г/л и в конце 345,43±8,55 г/л. Полученные результаты статистически не подтверждены.

Количество тромбоцитов составило 291,5±43,81х109/л, а на 20-й день дачи Диронакса - 295,29±21,75х109/л.

УОТ (усреднённый объём тромбоцитов) у подопытных животных находился в пределах физиологической нормы для данного вида животного и составлял 8,7±0,47 ф/л на начало опыта и 9,14±1,01 ф/л на 20-й день дачи препарата Диронакс.

Наиболее важными показателями в диагностике заболеваний печени являются определение ферментов из группы трансфераз - АСТ и АЛТ, а также ГГТ, ЛДГ, щелочная фосфатаза, холестерин и триглицериды (таблица 6).