Селекционно-генетическая характеристика исходного материала Capsicum L. по основным хозяйственно-ценным признакам

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Селекционно-генетическая характеристика исходного материала Capsicum L. по основным хозяйственно-ценным признакам

Специальности: 06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений 03.02.07 - генетика

Тимина Ольга Олеговна

Москва - 2012

Работа выполнена в Приднестровском научно-исследовательском институте сельского хозяйства и в Приднестровском государственном университете

Научный консультант - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Валерий Федорович Хлебников

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор кафедры растениеводства, Российский государственный аграрный заочный университет Жученко Александр Александрович мл.;

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией генетики и биотехнологии, Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева Соловьев Александр Александрович;

доктор сельскохозяйственных наук, ВНИИ овощеводства Россельхозакадемии, зав. лабораторией селекции капустных культур Бухаров Александр Федорович

Ведущая организация - ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Перец (Capsicum annuum L.) экономически значимая овощная культура во многих странах, в том числе в России и Приднестровье, обладает высокими пищевыми, технологическими и вкусовыми достоинствами и может быть отнесен в разряд культур, способствующих сохранению генофонда и здоровья нации.

В конце ХХ столетия селекция перца овощного была ориентирована главным образом на выведение продуктивных и устойчивых к вертициллезному увяданию сортов. Однако после успешного создания серии сортов с различной степенью устойчивости к болезни требования к культуре трансформировались. Приоритетным и актуальным направлением стало создание сортов с разнообразной продолжительностью фенологических фаз, различной формой и окраской перикарпия. Особую значимость приобрело создание сортов с улучшенными биохимическими показателями для целевого функционального питания и в частности с более высоким содержанием в-каротина в плодах, который совместно с витаминами С и Е является важнейшим элементом пищевого рациона человека. Кроме того, повышенные требования потребителя к комплексу признаков, изменения климатических условий и форм собственности диктовали необходимость скорейшего создания гибридов F₁, у которых легче сочетать нужный комплекс хозяйственно-ценных признаков (ХЦП) и которые вначале 90-х практически отсутствовали в производстве. Одновременно необходимо было наладить работу по совершенствованию их семеноводства, и в частности по использованию стерильных форм. Такой подход обеспечивал достаточным количеством семян и крупное производство, и мелких потребителей.

Селекционер при создании новых сортов и гибридов для получения конкретных результатов должен четко представлять, подбирая пары для скрещивания, насколько различаются исходные родительские формы по составу полигенов ХЦП. Поэтому представляются актуальными исследования, которые дифференцируют комплекс полигенов растений, определяющих основные параметры ХЦП: продуктивности, качества плодов, продолжительности вегетационного периода, адаптивности к биотическим и абиотическим стрессорам и ряду других параметров. Одним из таких приоритетных направлений является мониторинг генофонда с эколого-генетической идентификацией генотипов. Сведения в данной области по культуре перца не многочисленны и не достаточно обобщены. И связано это с тем, что фундаментальные основы организации растительных полигенных систем до конца не определены, и не выявлены детальные механизмы их работы. До сих пор для C.annuum отсутствует полная хромосомная карта, отображающая имеющиеся 12 групп сцепления. Созданная совсем недавно (Wu et al., 2009) рестрикционная карта, охватывающая весь геном перца, основана на серии общих генов, распределенных у томата, картофеля, баклажана и модельного растения Arabidopsis thaliana (L)Heynh., и еще не апробирована в достаточной степени на практике, а идентифицированный набор полигенов культуры пока ограничен. Поэтому исследования по разработке методов дифференциации генотипов по комплексу ХЦП и их использованию в селекционном процессе остаются актуальными. Одним из первоочередных этапов научных разработок в области количественных признаков растений в связи с этим является установление корреляционных взаимосвязей признаков и кодирующих их аллелей. Выявленные взаимосвязи, воссоздающие координированную экспрессию полигенов ХЦП, отражают упрощенную схему генной сети полигенов (ГС), которые либо формируют ХЦП, либо осуществляют реализацию конкретного процесса.

Цель и задачи исследований

Целью наших исследований стал селекционно-генетический мониторинг генофонда Capsicum L. по основным хозяйственно-ценным признакам. Для этого решались следующие задачи:

1. Изучение выраженности, изменчивости и наследования во взаимосвязи со средой признаков раннеспелости, высокого содержания в - каротина в плодах, устойчивости к болезням и переключения фаз репродукции в культуре in vitro.

2. Совершенствование методов оценки и отбора по признакам раннеспелость и устойчивость к болезням.

3. Изучение проявления и наследования комплекса ХЦП.

4. Разработка регрессионно-кластерного анализа комплекса полигенов ХЦП и их эколого-генетическая идентификация.

5. Определение состава цепочек ХЦП, обуславливающих структуру урожая в конкретной среде.

6. Установление структуры корреляционных взаимосвязей признаков важнейших ХЦП и кодирующих их аллелей.

7. Уточнение проявления эффекта гетерозиса по ХЦП в зависимости от условий.

8. Прогноз гетерозиса для моделируемой среды с уточненными приоритетными признаками, по которым в первую очередь должен проводиться отбор.

9. Создание нового исходного материала Capsicum с комплексом ХЦП.

10. Разработка и организация семеноводства перспективных гибридов F₁ на стерильной основе.

Научная новизна результатов исследований

Генетический мониторинг генофонда Capsicum, включающего свыше 3500 образцов и 26000 генотипов, выявил источники ХЦП, на основе которых:

- получены новые доноры с комплексом ХЦП: высокой продуктивностью, раннеспелостью, толерантностью к заболеваниям, улучшенным биохимическим составом, разнообразные по форме и окраске перикарпия, а также доноры по признаку образования эмбриоидов в культуре пыльников и регенерации полноценных растений;

- для случаев генных взаимодействий и материнского эффекта предложен регрессионно-кластерный анализ диаллельных скрещиваний, результаты которого визуализируются многомерными методами;

- с помощью регрессионно-кластерного анализа проведена эколого - генетическая идентификация генотипов по 16 ХЦП и кодирующих их доминантных аллелей в двух условиях;

- уточнена структура организации растительных полигенных систем в виде упрощенной схемы генной сети ХЦП, работающая на основе функциональных связей, которые переопределяют показатели признаков под воздействием триггерных факторов среды;

- предложен подход к определению приоритетных признаков при проведении отборов в моделируемой среде в случае эффекта гетерозиса по ХЦП;

- установлен полигенный механизм функционирования генов-переключателей, сопровождающийся неаллельными взаимодействиями, обуславливающий успех унипарентальной репродукции;

- выявлен паттерн функционирования генов-переключателей, от незрелой микроспоры (поздняя одноклеточная стадия или ранняя двуклеточная) до незрелого зиготического зародыша (торпедовидная фаза).

- установлена локализация мутантного гена bc, комплементарно взаимодействующего с у-геном, с относительным расстоянием по Косамби между локусами в пределах m_k=64,67cM.

- обнаружено, что между генами bc и y наблюдается явление цистранс эффекта, что обуславливает нестабильную выраженность признака «окраска перикарпия». Красно-оранжевая окраска перикарпия обусловлена функционированием генов bc и CrtZ-2;

- выявлена дифференцированная жизнеспособность гамет, несущих гены bc и y и летальность двойного рецессива (bcbcyy);

- установлена способность излучения He-Ne лазера с длиной волны 630 нм стабилизировать проявление ряда ХЦП при воздействии биотических и абиотических стрессоров.

Практическая ценность научного труда. Разработана регрессионно - кластерная оценка генотипов по комплексу доминантных аллелей, контролирующих ХЦП, что позволяет вести селекцию идентифицированного материала и целенаправленно подбирать пары для скрещивания. В результате многолетних исследований по генетическому мониторингу рода Capsicum выделены источники и доноры ХЦП раннеспелости, высокого содержания биологически-ценных компонентов в плодах, устойчивости к болезням, продуктивности, а также по комплексу ХЦП. Выведенные перспективные генетически разнокачественные новые линии перца легли в основу практического осуществления генетической программы по созданию генофонда перца для различных условий возделывания, отвечающего современным требованиям селекции культуры. Результаты работы по теме диссертации реализованы в пяти сортах и двух гибридах сладкого перца, включенных в государственные реестры селекционных достижений, допущенных к использованию по Российской Федерации и Республике Беларусь. Они защищены авторскими свидетельствами и патентами. Разработана и уточнена система ведения семеноводства новых гибридов на стерильной основе.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетический мониторинг полигенов ХЦП в генофонде Capsicum включающий:

· систему методов оценки, проявления, степени выраженности, варьирования и наследования важнейших ХЦП, обеспечивающую их достоверную идентификацию;

· идентифицированные доноры перца по важнейшим генам и блокам генов ХЦП: болезнеустойчивости, раннеспелости, содержанию в - каротина и витамина С, генам жизненной стратегии, определяющим тип репродукции в условиях in vitro;

· регрессионно-кластерный анализ скринирования генофонда растений с генетически обусловленным комплексом ХЦП;

· эколого-генетическую идентификацию генотипов по норме реакции с визуализацией ключевых аллелей, контролирующих важнейшие ХЦП по комплексу признаков;

· уточненный механизм организации и функционирования растительных полигенов ХЦП и эффекта гетерозиса для проведения адекватных отборов в моделируемой среде.

2. Практическое осуществление программы по генетическому мониторингу полигенов ХЦП и их использование в селекции сортов и гибридов перца.

3. Особенности семеноводства родительских форм и гибридов F₁ овощного перца для условий пленочных теплиц.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены на V International Solanaceae Conference, (Nijmegen, Holland, 2000); XI и XIII Международных конгрессах EUCARPIA “Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant” (Antalya, Turkey, 2001; Warsaw, Poland, 2007); IV Balkan Symposium on Vegetables and Potatoes (Plovdiv, Bulgaria, 2008), докладывались и обсуждались на заседаниях методических комиссий по генетике и селекции, Ученых и координационных советах Приднестровского НИИ сельского хозяйства, Приднестровского университета с 1976 по 2009 гг, а также на 19-ти Международных и Республиканских симпозиумах, совещаниях и конференциях по общей генетике, мутагенезу, биотехнологии, селекции, иммунитету и овощеводству: Кишинев, 1991, 2002, 2005; Тирасполь, 1996, 2001,2003, 2005; Москва, 1997, 1999, 2000, 2003, 2008; Саранск, 2001; Саратов, 2003; Минск, 2004; Харьков, 2005; Одесса, 2008, 2010, Вена, 2011.

Связь работы с крупными научными программами. Исследования выполнялись по государственной тематике Приднестровского НИИ сельского хозяйства «Создать генетические источники высокой адаптивности для культуры томата и перца с хозяйственно-ценными признаками», «Создать и передать в ГСИ высокопродуктивные сорта перца для открытого и защищенного грунта, выносливые к вертициллезному увяданию и мозаике», Приднестровского госуниверситета «Изучение механизмов переключения программы развития с гаметофитной на спорофитную у сладкого перца в культуре in vitro», а также по разделу “Оценка естественных и мутантных ресурсов по увеличению уровня биоактивных компонентов у овощей”, являющемуся также частью регионального гранта по линии МАГАТЭ RER5013 “Evaluation of Natural and Mutant Resources for Increased Phytonutrient Levels in Vegetable Crops and Potatoes”.

Публикации. По материалам докторской диссертации опубликовано 83 работы: в том числе одна монография (в соавторстве), два методических указания и восемь статей в рецензируемых журналах из «Перечня…» ВАК РФ, семь авторских свидетельств и три патента на сорта и гибриды, выданных Госкомиссией РФ по сортоиспытанию и одно свидетельство - Госкомиссией Республики Беларусь.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из Приднестровского НИИ сельского хозяйства, Приднестровского государственного университета, Института Общей генетики Республики Молдова, Всероссийского НИИ овощеводства, Института систем информации РАН, Новосибирск, а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит составление программы исследования, схем всех экспериментов, непосредственное выполнение ключевых опытов и селекционных разработок, а также теоретическое обобщение полученных результатов. Участие и помощь всех, способствовавших выполнению работы, отображена в совместных публикациях. Всем сотрудникам, принимавшим участие в совместных исследованиях, автор приносит глубокую благодарность. Особенно признательна академикам Жученко А.А.и Драгавцеву В.А., профессорам Н.Н. Балашовой и Т.Р.Стрельниковой, которые оказали решающее воздействие на выбор направления и объекта исследований. Автор признательна профессору С. Даскалову (БАН, София), предоставившему для исследования уникальные мутантные линии, канд. с.-х. наук Ильенко Т.С. за многолетнюю и продуктивную совместную работу, светлая память о которых всегда будет связана с одними из лучших селекционных разработок. Благодарю научного консультанта, профессора В.Ф. Хлебникова и докторов биологических наук Ю.В. Чеснокова и И.Т. Балашову за поддержку и плодотворное обсуждение работы, а также докторов с.-х. наук А.П. Погребняка и А.В. Садыкина за ценные замечания по структуре и оформлению рукописи.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 354 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, включает 99 таблиц, 45 рисунков, 8 приложений. Список использованной литературы содержит 400 наименований, в том числе 264 на иностранных языках.

Материалы и методика проведения исследований. Объектом исследований явились полигенные ХЦП и кодирующие их доминантные аллели, а материалом для исследований - спорофит и гаметофит представителей Capsicum.

При проведении исследований был использован коллекционный материал, поступивший из Всероссийского научно-исследовательского института растениеводства, дикий и полукультурный генофонд рода Capsicum, полученный из Белтвилского генцентра (США), коллекционный материал, мутантный питомник лаборатории «Частной генетики овощных культур», селекционный материал лаборатории селекции Приднестровского НИИ сельского хозяйства, а также сорта и гибриды перца других научно - исследовательских учреждений и селекционных организаций. В дальнейшем основным экспериментальным материалом в наших исследованиях явились сорта и линии собственной селекции. За период с 1976 по 2009 гг. в изучении находилось свыше 3800 образцов отечественной и зарубежной селекции в коллекционном питомнике и 26795 селекционных образцов, включая гибриды F₁, полученные в процессе исследований.

Линии, гибриды, сорта, коллекционные образцы проходили оценку в различных культурооборотах и типах теплиц на экспериментальной базе ПНИИСХ, в фермерских хозяйствах Приднестровья, в ряде научных учреждений и хозяйств России, Болгарии и Венгрии.

Агротехника, используемая в опытах, была общепринятой (Ершова, 1990; Методические рекомендации…, 1976, 1997), а селекционный материал оценивался комплексно по спорофиту и гаметофиту.

У спорофита изучали раннеспелость, содержание витаминов в плодах, устойчивость к болезням, а также комплекс ХЦП, обуславливающий продуктивность.

Плоды перцев оценивались по содержанию витаминов в технической и биологической фазах спелости на базе НИИ пищевой промышленности, г. Кишинев, Молдова, методом определения по ГОСТ - 8756.22-80, а также ВЭЖХ для в-каротина. Витамин С определяли стандартным методом, ГОСТ 24556. Полученные данные обрабатывались двух и трехфакторным дисперсионным анализом, (Рокицкий, 1974, Лакин 1990). Определяли общую (ОАС_i) и специфическую (САС_i) адаптивность, стабильность (Sg_i) генотипов, их селекционную ценность (СЦГ_i), а также типичность (t_k) и относительную дифференцирующую способность среды (S_ek) по Кильчевский., Хотылева, 1985. Генетическая терминология использована согласно Картель, Макеева, Мезенко, 1999, ботаническая номенклатура по Baral, Bosland, 2002. Эффект гетерозиса определяли по Даскалову (1973).

Наследование окраски перикарпия и содержание в-каротина определяли по результатам анализирующих скрещиваний с рецессивными формами. Вычисление рекомбинации проводили у рекомбинантной инбредной популяциии F₃, полученной из особей F₂ посемейным отбором при самоопылении. Проводили прямой расчет пропорции рекомбинантных форм R= n/N, где n - фактическое количество рекомбинантных форм в популяции, N - общее число учтенных особей, и результат увеличивали в 2 раза согласно частоте кроссоверных гамет. Частоту рекомбинации определяли по формуле r=R/2(1-R), используемой для популяций рекомбинантных инбредных линий, которых получают из особей F₂ (Чесноков, 2009)_. Расчет генетической дистанции между локусами с аллелями желтой окраски y и высокого содержания в-каротина bc проводили по формуле Косамби: m_K=25 ln[(1 + 2r)/(1-2r)]. Прямой анализ в-каротина проводили только у F₁, о содержании в-каротина в F₂ поколении судили по маркерной окраске перикарпия. Изучение ХЦП проводилось регрессионно-кластерным анализом в диаллельных скрещиваниях по схеме [Ѕ P(P + 1)] (5 х 5), рассмотренном в экспериментальной части.

Используя лазерное излучение низкой интенсивности с энергией 2,3 Дж и 6,85 Дж, исследовали возможность стабилизации выраженности ХЦП под воздействием биотических и абиотических стрессоров по энергии всхожести проростков, % всхожести и скорости роста корешков, устойчивости к болезням (фитофтороз, серая гниль). Повторность в варианте - стократная, повторность вариантов - трехкратная. Облучали семена и сеянцы генотипов, контрастных по изучаемым признакам с повторными подсветками растений в соответствии с запланированными вариантами. Контролем служили варианты без облучения. Устойчивость к фитофторозу и серой гнили перца изучали при искусственном заражении согласно Методическим указаниям по селекции..1997, и Рекомендациям Госкомиссии РФ по сортоиспытанию. В экспериментах с серой гнилью набухшие семена облучали различными источниками электромагнитного излучения. Повторность в опыте 4-х кратная, в каждой повторности заражалось не менее 50 растений. В качестве эталона для серой гнили использовали препарат ровраль в 0,2% концентрации.

Создание сортов и гибридов F₁ проводилось согласно Методическим рекомендациям по селекции культуры, 1976, 1997 гг. В селекционной работе использовали методы гибридизации, беккроссы и рекуррентную селекцию.

Семеноводство гибридов разрабатывалось на стерильной основе. Для этого создали и использовали линии с генной мужской стерильностью (ГМС) с мутантными генами ms-3 и ms-8, на базе болгарских доноров (БАН, София).

Для оценки комбинационной способности родительских форм применялся метод топкросса (Методические рекомендации по изучению …, 1980).Все полученные данные математически обрабатывали с помощью программы Statistica 6.0 для персонального компьютера (ПК).

Скрининг генофонда рода Capsicum по болезнеустойчивости проводился общепринятыми методами (Методические указания по селекции сортов и гибридов перца и баклажана, 1976; 1997). Изучение нормы реакции признака устойчивости к ВТМ проводили в вегетационных сосудах, вместимостью 4 кг почвы (Журбицкий, 1968). Использовались растения, контрастные по устойчивости к возбудителю: со сверхчувствительным типом реакции и с системной реакцией на заражение. Повторность варианта трехкратная, в каждом варианте использовали по 20 растений. Зависимость устойчивости от влагообеспеченности изучалась в условиях нормальной влажности (90% от ППВ) и в условиях дефицита влаги при небольшом увядании растений, (30-40% от ППВ). Фон пониженной освещенности (3000 лк) создавали, затеняя растения при выращивании в вегетационных сосудах, либо выращивая растения без подсветки в осенне-зимний период (1200 лк). Фон несбалансированного минерального питания создавали, внося только азотное удобрение при каждой подкормке, контролем служил вариант N₁₂₀-P₆₀- K₆₀ согласно общепринятым рекомендация (Ершова, 1990). В течение опыта произвели 3 подкормки.

Заражение ВТМ и ХВК проводили инфекционным соком с растений томатов и картофеля. Множественность инфекции моделировали объемами инфекционного сока, используемого для заражения. В качестве стандарта инфекционного начала ВТМ использовали растения томата сорт Ранний -83 с 3 настоящими листьями через 2 недели после заражения, выращиваемые в фитобоксах, а ХВК - листья местных сортов картофеля до начала цветения с ярко выраженными симптомами крапчатости. Наличие вирусов определяли по местной реакции на растениях индикаторах: ВТМ на Nicotiana glutinosa L, Х-вирус картофеля - на Gomfrena globosa L.

Устойчивость к фитофторозу изучалась при искусственном заражении чистой культурой возбудителя, предоставленной болгарскими коллегами (Милкова Л., Витанов А.).Заражали сеянцы, отделенные листья и плоды.

Процессы соматического эмбриогенеза индуцировали у незрелых зиготических зародышей по методике Binzel, Sankhla, 1996. Идентификацию генов переключателей гетерофазной репродукции на гомофазную проводили регрессионно-кластерным анализом пяти генотипов (Прометей, Л 48, Колобок, Л 49, Добрыня Никитич). Опыты in vitro закладывали в 2-кратной повторности (не менее 10 флаконов на каждый вариант, помещая на питательную среду 5-6 зародышей в каждый флакон).

Изучение образования побегов in vitro у овощного перца проводили по методике Gunay, Rao., 1978.

Жизнеспособность пыльцевого зерна определяли по Паушевой, 1980. Оплодотворяющую способность - прямым методом, опыляя пыльцой, обработанной изучаемым фактором, рыльце пестиков у растений с ГМС. Опыляли по 50 цветков в 3-х кратной повторности в динамике. Половина этой же пыльцы не обрабатывалась и служила контролем. Учитывался % завязываемости плодов и осемененность. Результаты обрабатывались с помощью t-критерия.

Проявление устойчивости пыльцы к токсинам V. dahliae проводили по методике Бино (Bino,1988). Частичную очистку токсина выполняли по Nachmias et al., 1982. Активность фракций устанавливали по Уэно и др., 1985. Специфичность токсинов для культуры перца уточняли биопробой на листьях, используя шкалу дифференциаторов по устойчивости к болезни.

Метод культуры пыльников in vitro воспроизводился согласно Dumas de Vaulex et al., 1981. Исследования проводили в динамике в зависимости от фазы развития микроспоры. Критерием служил размер бутона и соотношение высоты чашечки к высоте нераскрытого венчика: меньше, равен, больше. Мелким бутонам соответствовала одноклеточная фаза, средним - начало двуклеточной фазы, а крупным - завершение развития двуклеточной фазы микроспоры. Опыты закладывали в двухкратной повторности (не менее 10 флаконов на каждый вариант, в каждый флакон высаживали по 5-6 пыльников). Учитывали процент переключения на спорофитный путь развития, % регенерации, % нормальных и аберрантных эмбриоидов, а также тип аберраций. Определение генетических параметров проводили регрессионно-кластерным анализом.

СТРАТЕГИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГЕНЕТИКО-СЕЛЕКЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО СОЗДАНИЮ ДОНОРОВ РАННЕСПЕЛОСТИ, ВЫСОКОГО СОДЕРЖАНИЯ в -КАРОТИНА В ПЛОДАХ, УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ

Многокомпонентная иерархическая организация ХЦП предполагает детальное изучение функционирования комплекса полигены - ХЦП - среда. Исследования этого комплекса целесообразно начинать с генетического мониторинга генофонда, включающего первичный скрининг доноров ХЦП, с уточненными показателями выраженности, варьирования и наследования. Изучение генофонда перца осуществляли в первую очередь по приоритетным признакам, в связи с необходимостью создания нового исходного материала с комплексом ХЦП: раннеспелостью, качеством плодов, устойчивостью к болезням.

Оценка генофонда C.annuum var. annuum по признаку раннеспелости. Оценка генофонда C.annuum var. annuum (374 образца) по продолжительности вегетационного периода от массовых всходов до биологической спелости и составляющих его фенофаз выявила преимущества по признаку скороспелости букетного сортотипа, у представителей которого одновременно укороченные первая и третья фазы спелости (Табл.1). Причем коэффициенты вариации продолжительности трех фенофаз у этого сортотипа самые низкие, что свидетельствует и об относительной выравненности признака. Выявлена контрастность по данному признаку сортотипа Grossum, для которого характерно наличие образцов как раннеспелых, не уступающих сортотипу Fasciculatum, так и позднеспелых, недружных форм, с удлиненными 1 и 3 фазами. Такие образцы, напоминающие формы томатов с генами замедленного созревания rin, nor или alkobako, могут быть интересны в качестве исходного материала для создания сортов или гибридов с замедленным созреванием, предназначенных для хранения. Раннеспелость данной популяции обуславливалась в первую очередь за счет короткой 1-ой фенофазы при низких коэффициентах вариации. Cкринирование генофонда C.annuum var. annuum установило потенциальную дифференциацию продолжительности фенофаз у сортотипов и выявило конкретные источники раннеспелости, на основе которых были созданы новые раннеспелые линии с укороченными фенофазами: Л-3/98, Л-5/98, и др.

Таблица 1

Продолжительность вегетационного периода у популяций сортотипов С. annuum,1987-98 гг., необогреваемые пленочные теплицы.

Источники высокого содержания витамига С и в-каротина в популяции C.annuum var. annuum

Биохимическая оценка определила относительную выравненность содержания в-каротина у популяций различных сортотипов (Табл.2).

селекционный генетический мониторинг capsicum

Таблица 2

Содержание и варьирование в-каротина и витамина С в плодах биологической спелости у популяций сортотипов С. annuum var. annuum (необогреваемые пленочные теплицы) 1998-2003 гг.

Относительное выравнивание произошло благодаря длительной целенаправленной селекционно-генетической работе. Высокая внутрипопуляционная вариабельность содержания в- каротина свидетельствовала о наличии в популяции контрастных генотипов с высоким и низким содержанием провитамина А. У сортотипов Pomifera и Longum отмечено статистически значимое повышенное содержания витамина С в плодах.

Для всех сортотипов наблюдалось и дифференцированное внутрипопуляционное варьирование признака с соответствующими коэффициентами вариации. По результатам анализа были определены перспективные генотипы с наиболее высокими показателями содержания в-каротина, мутантного происхождения: Оранжевая капия, Л-49, Л-29, которые были использованы в селекции для создания сортов и гибридов с повышенным содержанием витаминов антиоксидантов. Полученные нами результаты переданы в электронную базу данных отдела генетики и селекции при МАГАТЭ Database of Mutant Variety and Genetics Stocks (MVGS) (http://mvgs.iaea.org/).

Доноры устойчивости к болезням в генофонде Capsicum Устойчивый сорт составляет основу интегрированной борьбы с болезнями и вредителями растений. Приоритетными остаются исследования как по выявлению механизмов, управляющих изменчивостью у патогена, так и поиск разнокачественных генов резистентности растений-хозяев, что позволяет при соответствующем мониторинге взаимосвязи хозяин - патоген выделить формы с долговременной и комплексной устойчивостью.

В Приднестровском регионе выявлены наиболее экономически значимые заболевания культуры перца: увядание - возбудитель Verticillium dahliae Kleb., различные типы мозаик (возбудители: ВОМ, ВБТ, ВТМ, ХВК, YВК), альтернариоз на томатовидном перце, столбур (возбудитель - не идентифицированная фитоплазма). Причем значимость возбудителей в зависимости от экологических условий и сортового состава хозяина динамично переопределяется по годам. Поэтому важно иметь резерв идентифицированных источников и доноров устойчивости к самым различным заболеваниям для упреждения возникновения эпифитотий на производственных посадках культуры.

Комплексная фитопатологическая характеристика имеющегося генофонда рода Capsicum (более 2000 образцов) в условиях естественного и искусственного заражений выявила иммунологический статус популяций культурных сортов и полукультурных разновидностей в отношении возбудителей вертициллезного увядания и мозаики. В полевых условиях при естественном заражении отмечена видовая дифференциация по поражению мозаикой (ВТМ, ВОМ), определена устойчивость к мозаике у видов C. chinense, C. frutescens, C. pendulum и полукультурных разновидностей C.annuum, подтвержденная данными искусственного заражения ВТМ (лимиты баллов поражения 2,7 - 2,9). У культурных сортов преобладали сильно восприимчивые формы (средний балл поражения 3,5), часть из которых уже к 10 суткам в фазе семядолей после заражения погибала. Искусственное заражение ВТМ выявило в популяциях исследуемых видов генотипы со сверхчувствительной реакцией, обусловленной R-генами вертикальной устойчивости к патогену. При этом максимальная частота встречаемости генотипов с R-генами приходится на виды C. chinense, C. frutescens, C. pendulum (5-12%) и особенно на C. pendulum. Выделенные источники устойчивости к ВТМ являются резервным фондом разнообразных генов резистентности.

Устойчивость популяций видов C. chinense, C. frutescens к вертициллезному увяданию в открытом грунте не подтвердилась данными искусственного заражения и была такой же, как и у культурных сортов. Наиболее сильно поразился увяданием при естественном заражении в условиях монокультуры наблюдалось у сортотип Grossum (х=2,9), несколько меньшее - у сортотипа Longum (х=2,4) и толерантность показали мутантные формы (х=1,8). Однако их меньшая поражаемость не подтвердилась при высокой множественности заражения. Среди культурных сортов в категории высокоустойчивых значился Подарок Молдовы, специальной селекции по этому признаку, толерантных - Золотая Медаль (х=0,8), Бяла Капия (х=1,2), Сиврия 600 - К-1285 (х=1,3), Капия 1005 - К-1832 (х=1,5), Молдова 118, К-1894 (х=1,6), Ласточка (х=2,0). Толерантность Бяла Капия, Золотая Медаль и Сиврия-600 подтверждены при искусственном заражении патогеном (средние баллы поражения не превышали 2,0).

Представители Capsicum дифференцировано поражались и другими заболеваниями: бактериозом (Xantomonas vesicatoria Douch.), альтернариозом (Alternaria solani Sor.), узколистностью (ВОМ). Популяция C.pendulum отличалась выносливостью к ВОМ и вертициллезу. У полукультурных разновидностей отмечали низкую поражаемость альтернариозом.

Первичный скрининг устойчивых генотипов проводили при искусственном заражении белой и серой гнилями. Выявлена меньшая поражаемость генотипа C.chinense №5 к белой и C.pendulum №14 к серой гнилям. Данный тип устойчивости к патогенам наиболее эффективен в случае короткого периода, благоприятного для развития инфекций.

В связи с наблюдаемыми изменениями климата и благоприятными условиями для развития такого заболевания как фитофтороз (Phytophtora capsici Leonian), очень актуальным являются упреждающий скрининг генофонда, поиск генов резистентности и селекция на устойчивость к этому заболеванию. Несмотря на принимаемые меры, в странах с влажным и теплым климатом фитофтороз наносит ощутимый ущерб (Tamietti, Bruatto, 1986; Palloix et al.,1986; Bosland, Lindsey, 1991). Данных по поражаемости генофонда культурных сортов молдавской и российской селекции очень мало. Предполагалось, по аналогии с зарубежными сортами и гибридами, что их уровень устойчивости к патогену довольно низкий. Однако искусственное инфицирование сеянцев при непосредственном внесении чистой культуры возбудителя в почву показало, что имеющийся местный генофонд C.annuum var.annuum не однороден по поражаемости патогеном. Различия проявляются в продолжительности инкубационного периода, в проценте гибнущих растений на определенную учетную дату (Табл. 3).

Таблица 3.

Уровень выносливости к фитофторозу различных сортотипов и сортов C.annuum var.annuum,искусственное заражение сеянцев, 1996 г., теплица.

Согласно полученным результатам определенной толерантностью к фитофторозу перца характеризуются представители сортотипа Grossum: Подарок Молдовы, Ласточка, Виктория. Из раннеспелых и крупноплодных сортов более вынослив - Тополин. Причем выносливость сортов Подарок Молдовы и Виктория была подтверждена при искусственном и естественном заражениях и в условиях Болгарии. Выделенные доноры устойчивости использованы в рекурентной селекции линий с ГМС: Л 226, Л 218, Л117. Гибриды F₁ на их основе хорошо передают потомству устойчивость к патогену, причем Л 226 и Л 218 преимущественно к листовым формам заболевания, а Л 217 - и к вегетативным, и к генеративным формам болезни.

Норма реакции признаков раннеспелости, высокого содержания в-каротина в плодах и устойчивости к болезням

Изучение нормы реакции раннеспелости у представителей C.annuum var. annuum выявило определенное преимущество Fasciculatum в сравнении с Grossum. У представителя Fasciculatum сорта Винни-Пух - донора раннеспелости, не стабильная выраженность признака «продолжительность 1-ой фенофазы», стабильная - «продолжительность 3-ей фенофазы», высокая продуктивность, с низкими вариансой САС_i и Sg_i, слабой отзывчивостью на изменение условий среды возделывания (b_i<1), что подтверждает его адаптивность и высокую СЦГ_i. Сочетание продуктивности и стабильности у этого донора можно использовать при создании раннеспелых полуинтенсивных сортов или гибридов, для которых характерна высокая потенциальная экологически устойчивая продуктивность, обеспечивающая не максимальную, но стабильно высокую урожайность (табл.4).

Продолжительность вегетационного периода у гибридов F₁ и их родительских форм от массовых всходов до массового биологического созревания наследовалась промежуточно со сдвигом в сторону раннеспелого родителя. На степень доминирования признака влиял как генетический фон, так и материнский эффект. Характер изменчивости степени доминирования варьировал дифференцированно в каждой фенофазе. В первой фенофазе отмечена высокая частота встречаемости сверхдоминирования, что свидетельствует о возможной селекции на гетерозис по этому признаку. Дифференцированный характер степени доминирования у различных фаз, косвенно подтверждал предположение о нескольких блоках генов, контролирующих в целом продолжительность вегетационного периода.

Таблица 4

Параметры адаптивности доноров раннеспелости перца сладкого по раннему урожаю.

Изменчивость и наследование признака высокого содержания в - каротина у представителей Grossum и Fasciculatum

Каротиногенез представляет собой автономный функциональный процесс, в котором задействованы шесть (1, 2, 3, 4, 6, 9-я) из 12 хромосом перца. Сравнительное изучение варьирования содержания провитамина А у линий с различным содержанием каротиноидов показало отсутствие генотипов с высоким, но стабильным проявлением этого признака. Поэтому остается необходимость дальнейшего поиска таких генотипов в генофонде Capsicum, либо их создание. Создание в свою очередь предусматривает уточнение закономерностей наследования признака. Генетический анализ зависимости содержания в - каротина и окраски перикарпия, показал доминирование красной окраски по отношению к желтой и оранжево-красной и комплементарное взаимодействие между генами, обуславливающими оранжево-желтую и оранжево-красную окраски, приводящее к возврату темно-красного варианта окраски. При дальнейшем самоопылении красноокрашенных F₁ у F₂ поколения в большинстве комбинаций скрещивания расщепление по окраске укладывалось в двухфакторную схему наследования: 9красных: 3 оранжево-красных: 4 желто-оранжевых. Проведенный тест на аллелизм рецессивных мутаций bc (высокое содержание в - каротина, оранжево - красная окраска перикарпия) и y (желто-оранжевый перикарпий, низкое содержание в - каротина) подтвердил, как независимость наследования признаков окраски перикарпия и содержания в - каротина, так и неаллельность желтой и оранжево-красной мутаций, затрагивающих разные сайты комплементации. Наши экспериментальные данные подтвердили правомочность картирования генов CrtZ-1 и CrtZ-2 на виртуальной карте Thorup et al.,2000, а анализирующее скрещивание уточнило локус, где произошла мутация у одного из этих генов. Обнаруженные растения с красноокрашенными плодами в потомстве семей с плодами, окраска которых контролировалась рецессивно, свидетельствовали о наличие цис-транс-эффекта между генами bc и y. В то же время данный эффект подтверждал нахождение в одной и той же хромосоме обоих мутантных генов, а именно в 6 - ой, где локализация y гена точно установлена (Табл.5). Следовательно, bc - это мутация гена CrtZ-1, а красно-оранжевая окраска перикарпия у мутанта обусловлена функционированием генов bc и CrtZ-2. Гены bc и y находятся в 6 хромосоме, но располагаются достаточно далеко друг от друга и, как правило, сегрегируют независимо. Но в некоторых комбинациях скрещиваниях ч² значимо отличался от табличного значения. Это явление объясняется возможной пониженной жизнеспособностью двойного рецессива. Расчеты пропорций рекомбинантных форм в семьях оранжево-красных и желто-оранжевых показали хорошее совпадение показателей частоты рекомбинации (Табл.5), с учетом которой определено относительное расстояние между локусами оранжево-красной и желто-оранжевой окраски по Косамби, где m_k=64,67cM.

Таблица 5.

Вариация окраски плодов в популяциях F₃ оранжево-красных и желто-оранжевых семьях комбинации Л-144 х {(Дуэт х Т-119/8) х Л-61}, 2006 г.

Таким образом, к известным генам окраски перикарпия и содержания в-каротина (Wang, Bosland, 2006) можно добавить новый идентифицированный мутантный ген bc. Несмотря на то, что присутствие гена bc способно увеличить содержание в-каротина в плодах в 1,5-2 раза, использование данного мутанта в селекции имеет ограничения, связанные с наличием двух генов, кодирующих окраску и одновременно одного из них - содержание в-каротина, а также цис-транс-эффекта, обусловленного кроссинговером. Но использовать полученный мутант в гетерозисной селекции можно, если в скрещивание будут привлечены линии с одинаковой оранжево-красной окраской, созданные без участия желтоокрашенных форм. Имеется и перспектива дальнейшего увеличения содержания в-каротина за счет возможного получения новой мутации гена CrtZ-2 и потенциального увеличения уровня антиоксиданта в перикарпии еще в 1.5-2 раза.

Варьирование устойчивости к ВТМ и ее наследование в зависимости от экологических факторов, множественности инфекции и генотипической среды у представителей Capsicum

Известно, что среда выступает одним из основных модуляторов взаимоотношений паразита и растения-хозяина. Репродукция патогена на устойчивом хозяине под воздействием факторов среды может привести к колебанию величины и структуры популяции патогена и явиться возможным объяснением причин потери устойчивости растений к возбудителям и распространению новых рас и штаммов патогенов. Поэтому изучение нормы реакции генов резистентности и проявление признаков устойчивости к заражению наряду с изучением и адаптивности способствует созданию базы данных по наличию генотипов со стабильной и долговременной устойчивостью.

Проведенные исследования идентифицировали в условиях неблагоприятной внешней среды (среднесуточная температура 3-10 на фоне пониженной освещенности 1200 лк) не 100% -ю пенетрантность L гена. Анализ расщепляющейся популяции показал, что снижение пенетрантности L гена происходит за счет поражения части гетерозигот. Причем определенные экологические фоны способны выявить границы функционирования как гетерозигот, так и гомозигот. В модельных опытах с гомозиготными линиями по L гену показано (Табл.6), что его пенетрантность к ВТМ достигает 100% при одинарной инфекции ВТМ на фонах пониженной освещенности, дефицита влаги и несбалансированного минерального питания. Устойчивость к патогену сохраняется и при комбинации этих абиотических стрессоров. В случае же со смешанной инфекцией с Х-вирусом картофеля пенетрантность L гена понижается, что визуально выражается у части растений в виде системного некроза. Аналогичные данные по пенетрантности и экспрессивности генов Tm-2 и Tm-2² получены нами и на томатах. И в этом случае - сочетание определенных абиотических и биотических стрессоров явились ключевыми факторами изменения пенетрантности генов устойчивости и снижения их экспрессивности. Важно также отметить в этой связи специфику воздействия биотического стрессора, значение конкурентоспособности в смешанной инфекции различных штаммов и роль множественности инфекции. Наиболее эффективно подавляют пенетрантность генов сверхчувствительности и гена толерантности у томатов к ВТМ второй компонент - ХВК.

Таблица 6.

Норма реакции гена L на фоне пониженной температуры и освещенности в комбинации с различными абиотическими и биотическими стрессорами при искусственном заражении, вегетационные сосуды, 1982-1983 гг.

Причем в варианте при последовательном заражении сначала ХВК, а затем 0-ым штаммом ВТМ, снижается пенетрантность гена Tm-2 и экспрессивность гена Tm-1, а при замене 0-го штамма на 1-ый снижается пенетрантность и гена Tm-2². Множественность инфекции при одновременном заражении выявляет и различную конкурентоспособность штаммов патогена, что необходимо учитывать при создании инфекционных фонов. Таким образом, пониженная пенетрантность и экспрессивность генов устойчивости являются предпосылкой дивергенции популяции возбудителя, выражающейся в накоплении в популяции новых конкурентоспособных патогенных вариантов. На модельной системе ВТМ - перец нами показано, что абиотические стрессоры в комбинации со смешанной инфекцией могут индуцировать появление нового варианта ВТМ.

Оптимизация методов оценки и отбора по признакам раннеспелости и устойчивости к болезням

Для получения гарантированного урожая разрабатываются различные подходы, изменяющие норму реакции генотипа в нужную для человека сторону. Одним из таких подходов является использование культуры in vitro. Эмбриокультура, наиболее воспроизводимый и относительно не сложный метод in vitro, прежде всего, использовался для преодоления несовместимости при получении межвидовых гибридов перца и для увеличения количества поколений в год (Fari, Csillery, 1983; Pickersgill, 1992). Но вопросы использования эмбриокультуры в селекции перца на важнейшие ХЦП, изменчивости их выраженности и сопоставимости с отборами у генотипов, выращенных традиционными методами, были изучены не достаточно для применения их на практике.

На селекционном материале, который насчитывал более 3,5 тысяч незрелых зиготических зародышей 40 различных гибридов F₁, изъятых в основном на стадии трости и полукольца (терминология по Fari, Csillery, 1983), и был высажен на различные варианты питательных сред, обнаружено, что условия формирования растеньиц перцев влияли на проявление ряда ХЦП, в зависимости и от среды, и от генотипа (Табл.7). Но оптимальная питательная среда вызывала минимальные модификации у основных ХЦП (масса, параметры плодов) и не снижала общую продуктивность. У сильно восприимчивого к увяданию генотипа симптомы болезни усиливались, что необходимо учитывать при использовании данного метода в селекционной практике.

Нами установлено, что эмбриокультура в селекции овощного перца может использоваться не только для получения 3-4-х поколений в год в зависимости от группы спелости генотипа с одновременной оценкой по комплексу хозяйственно-ценных признаков, но также и для первичной оценки раннеспелости образца. По литературным данным (Barchi et al., 2007)

Таблица 7

Выраженность ряда ХЦП у сладкого перца, выращенного in vitro из незрелых зиготических зародышей в зависимости от состава питательной среды, на провокационном фоне по вертициллезу

Примечание: * - значимые отличия в сравнении с контролем. В качестве контроля использовалась рассада растений, выращенных по обычной технологии из зрелых семян.

У перца продолжительность 1-й фенофазы, длина плода, скорость роста междоузлий и главного побега контролируются полигенами с плейотропными эффектами, сгруппированными в одном кластере. Найденные нами показатели коэффициента корреляции между скоростью роста незрелого зиготического зародыша на питательной среде и длиной 1-ой фенофазы свидетельствовали об отсутствии подобного эффекта. Но в тоже время положительная корреляционная зависимость выявлена между скоростью развития незрелых зародышей, 3-ей фенофазой и длиной всего вегетационного периода у использованных генотипов (r=0.9, p?0.05), т.е. чем продолжительней третья фенофаза и весь вегетационный период, тем медленней растут зародыши в эмбриокультуре. Это в свою очередь позволяет проводить первичную оценку и подбор исходных форм для селекции на скороспелость на одной из самых ранних фазах онтогенеза растений - в эмбриокультуре.

Эмбриокультуру можно использовать и для оценки толерантности исходного материала к вертициллезному увяданию на ранних фазах in vitro, применяя в качестве селективного фона токсический фильтрат гриба V. dahliae.

Помещая зародыши восприимчивого сорта Гогошары на питательную среду с токсическим фильтратом возбудителя вертициллеза в различной концентрации, обнаружили, что в среде он исполняет роль селективного фактора. Критерием воздействия токсичного фильтрата на проростки явилось угнетение роста и развития растеньиц на токсигенной среде адекватно его концентрации. Выявлено, что при добавлении в среду 40% токсичного фильтрата снижаются в два раза и масса, и длина корешков. 50% концентрация является сублетальной, а 60% - летальной для проростков. Дифференцированный рост растений из незрелых зиготических зародышей на токсигенной среде в сравнении со средой без токсичного фильтрата подтвердил способность последнего заменять живого возбудителя.

Метод оценки исходного материала на устойчивость к вертициллезному увяданию по гаметофиту и спорофиту

Метод гаметной селекции основан на отборе гамет, устойчивых к экстремальным факторам (биотическим или абиотическим), обеспечивающих появление спорофитного поколения со сходной устойчивостью. В связи с этим в стандартных условиях была установлена специфичность частично очищенного токсина возбудителя вертициллезного увядания и его токсигенная активность по рабочей сублетальной концентрации (40мкг/мл.), дифференцирующей устойчивость спорофита, и его пороговой концентрации (20 мкг/мл), когда дифференциация еще имеет место. При добавлении в среду сублетальной концентрации токсина V. dahliae (Табл.8) отмечалось снижение жизнеспособности пыльцы устойчивого образца на 69%, длины пыльцевых трубок - на 56%. У восприимчивого образца - соответственно на 90% и 93%, а у сильно восприимчивого генотипа пыльца вообще теряла жизнеспособность. При этом реакция мужского гаметофита на токсин фитопатогенного гриба совпала с иммунологическим статусом генотипа, что позволяет дифференцировать генотипы по устойчивости к вертициллезному увяданию на самых ранних фазах онтогенеза растений.