Селекционно-генетическая характеристика исходного материала Capsicum L. по основным хозяйственно-ценным признакам

У спорофита в культуре in vitro у контрастных по устойчивости к грибу V. dahliae генотипов C.baccatum (Л-115/5) и C.frutescens (33/5) также выявлен дифференцированный морфогенез первичных эксплантов на токсигенной среде. Если морфогенез устойчивого образца не отличался от контрольного варианта, то на токсигенной среде у восприимчивого образца отмечалась наиболее дифференцированная морфогенетическая реакция у сегментов семядолей. Наличие токсина в среде подавляло у них не только регенерацию, но также и каллусообразование. Найденный паттерн морфогенеза первичных эксплантов семядолей, гипокотилей и апексов, может быть использован для скрининга и первичной выбраковки сильно восприимчивых генотипов в

Таблица 8

Проявление признака устойчивости к токсину V.dahliae у гаметофитов в зависимости от устойчивости спорофита к возбудителю.

Гено-тип гаметофита	Иммунологи-ческая характеристи-ка спорофита	Доза токсина, мкг/мл	Реакция гаметофита на наличие токсина в среде для роста
			% проросшей пыльцы x±m	% к контролю	Длина ростковых трубок, мкм x±m	% к контролю
Л -4А	Устойчив	0	41,5±4,5	100	31,17±2,3	100
		40	12,8±2,7*	30,8	13,59±0,95*	43,6
		20	16,4±2,2*	39,5	15,18±1,2*	48,8
		10	30,8±4,1	74,2	15,44±1,3*	49,5
		5	39,4±6,1	95	19,86±1,6	63,7
Неж-ность	Восприимчив	0	85,3±4,4	100	42,7±1,8	100
		40	9,7±2,6*	11,4	6,98±0,2*	16,3
		20	7,6±2,6*	8,9	16,27±0,8*	38,1
		10	12,5±2,8*	14,7	17,3±0,9*	40,5
		5	36,4±5,7*	42,7	20,22±1,2*	47,3
Л-171	Высоковос-приимчив	0	100	100	49,8±6,7	100
		40	0	0	0	0
		20	1,7±0,6*	1.7	7.03±1.4*	14,2
		10	6,4±2,9*	6,4	31.1±5.1	62,2
		5	12,2±2,5*	12.2	35,2±5,2	70,7

Примечание: * - значимые отличия в сравнении с контролем.

МОДУЛЯЦИЯ ПРИЗНАКОВ РАННЕСПЕЛОСТИ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КОГЕРЕНТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Направленное изменение экспрессии аллелей ХЦП может вызвать координированную модификацию функции. В связи с этим уточнили модулирующий эффект излучения He-Ne лазера на проявление признаков раннеспелости и неспецифической устойчивости к фитофторозу и серой гнили.

Предпосевная обработка семян низко интенсивным излучением индуцирует меньшую поражаемость фитофторозной гнилью выносливых генотипов, при этом, не вызывая качественно новую реакцию в отсутствие генов устойчивости к возбудителю заболевания у растения хозяина. Аналогичные данные получены и с другим возбудителем Botrytis cinereae Pers., вызывающим серую гниль вегетативных и генеративных органов. Предварительно было выявлено, что пространственная структура поля и когерентность для данной конкретной системы хозяин - патоген не существенны, а значительными факторами в проявлении признака устойчивости является генотип и длина волны излучения. Дальнейшие эксперименты при искусственном заражении подтвердили эффективность облучения растений монохроматическим красным светом генотипа 5/92 в индукции устойчивости к возбудителю (Рис.1). Причем по воздействию оно не уступало эталону - фунгициду ровраль, а в сочетании с препаратом строби было даже более эффективным. Но необходимо учитывать специфику работы фитохрома. Это триггер, он запускает и выключает процесс, в котором участвует. Поэтому для поддержания необходимого уровня устойчивости в течение всего онтогенеза растений нужны дополнительные обработки растений лазерным или монохроматическим облучением. Подобные обработки отвечают требованиям получения экологически чистой продукции, т.к. красный свет не является дестабилизирующим фактором для растений и окружающей среды.

Рис. 1. Индукция устойчивости к серой гнили у генотипа 5/92 в зависимости от фактора обработки растений

Таким образом, генетический мониторинг генофонда позволил выполнить поставленные задачи по созданию доноров раннеспелости, высокого содержания в-каротина в плодах и устойчивости к болезням. Но поскольку создание сортов и гибридов предусматривает обязательным этапом селекцию на комплекс признаков, возникла необходимость более детальной проработки вопроса создания генофонда растений с генетически обусловленным комплексом ХЦП.

Теоретические основы создания генофонда растений с генетически обусловленным комплексом ХЦП

В работе применялся генетический параметр W_r+V_r, используемый Хейманом (Hayman,1954) в анализе диаллельных скрещиваний. Этот генетический параметр, представляя собой сумму коварианс родитель - потомок и варианс гибридов коррелирует со средними значениями признака при условии определения его аддитивно-доминантной генетической системой и отображает направление доминирования и эффекты доминантных аллелей. В случае эпистаза и зависимого распределения генов у родительских форм, линия регрессии наклонена к параболе Wr/Vr не под углом 45є и отличается от линии единичного наклона. Поэтому визуализацию взаимосвязей линейно нормированных параметров W_r+V_r в этом случае необходимо проводить многомерными методами, отказавшись от графиков Хеймана: анализом главных компонент, многомерным шкалированием и др., которые объективно группируют и сравнивают близость объектов согласно их реальным параметрам. Сравнение генетических параметров одних и тех же генотипов в разных средах определяет не абсолютные показатели, а относительные, но устанавливаемые и характерные для изучаемых условий, что позволяет выявить отличия у генотипов по доминантным аллелям. Более того, такой подход позволяет избежать эффекта шкалирования, имеющий место на графиках Хеймана (Драгавцев, Драгавцева, 2011), так как группировка объектов производится по принципу близости расстояний, а не их сравнения на линии регрессии. При этом объектом кластеризации выступали генотипы-среды, признаки-среды, а признаковым пространством - параметр W_r+V_r, аллели с доминантными эффектами. Выбранное признаковое пространство отвечает принципам достаточности, допустимой мультиколлинеарности и достоверности, а именно: выбран один (минимальность) признак (эффекты доминантных аллелей), достаточно емко характеризующий изучаемые объекты, признак представлен только одним показателем (параметр Wr+Vr), полученные статистические данные достоверны.

В настоящее время одной из теорий организации полигенов растений, подтвержденной молекулярными данными, является теория эколого-генетической организации сложного полигенного признака (Драгавцев и др., 1984; Чесноков и др., 2008). Эколого-генетическая теория обосновывает функционирование полигенов ХЦП и переопределение локусов ХЦП, а следовательно и спектра родительских аллелей, кодирующих ХЦП, при смене лимитирующих факторов среды, рассматривая организацию полигенных признаков по модульному принципу. Модуль состоит из трех взаимосвязанных признаков: результирующего и двух компонентных. В свою очередь модули подразделяются по значимости на более высокие и низкие ранги. В тоже время обоснована и предложена модель организации молекулярно-генетических систем в виде генных сетей (ГС), обеспечивающих формирование разнообразия фенотипических характеристик организмов (молекулярных, биохимических, структурных, морфологических и т.д.) на основе информации, закодированной в их геномах (Колчанов и др., 2000, Ананько, 2008). Если основываться на разработанной модели ГС с позиций эколого-генетической организации полигенных признаков растений, то последние будут представлять собой глобальную ГС соответствующих модулей ХЦП и подсетей взаимосвязанных иерархически компонентных признаков. В зависимости от конкретной среды ГС полигенов компонентных признаков одновременно являются регуляторами ГС результирующего признака. Таким образом, ХЦП - это результат координировано экспрессирующейся группы полигенов, для которых условия среды являются триггерными факторами. Сравнение генетических составляющих ХЦП в различных условиях является их визуализированной эколого-генетической идентификацией.

Оптимизация генетико-статистического метода анализа количественных признаков растений и их сравнительная идентификация

Регрессионно-кластерный анализ на основе диаллельных скрещиваний состоит из нескольких этапов:

1. Определения параметра W_r+V_r Проводится согласно классического диаллельного анализа для каждого условия и признака, в котором проводятся испытания родительских форм P₁-P_n и гибридов F_1.

2. Стандартизации показателей параметра W_r+V_r, определенных у признаков, имеющих различные единицы измерений.

3. Кластеризации всего полученного и нормализованного массива данных W_r+V_r, по всем условиям.

4. Определения качества кластеризации всего массива полученных данных по ее оптимальности. Оптимальность кластеризации определяется при сопоставлении результатов кластеризации с данными, полученными методами главных компонент, многомерного шкалирования и др.

5. Идентификации доминантных аллелей, проводимой кластеризацией при перемене местами объекта (кластер - признак-среда) и признака (Wr+Vr) - эффекты доминантных аллелей.

6. Последующей визуализации идентифицированных доминантных аллелей в виде расшифрованных схем с одинаковым обозначением, находящихся в одном кластере. Допускается, что внутри кластера выраженность признаков идентична и обуславливается идентичными аллелями.

7. Подсчета количества наблюдений (Cases) в кластере по формуле:

C = n • n₁ • n₂,

где n -- число признаков, объединенных в общий кластер, n₁ -- число условий, в которых выращивались растения, n₂ -- число исследуемых родительских генотипов

8. Определения процента идентичности выраженности признака в зависимости от принадлежности к кластеру. Подсчитывается по проценту совпадения обозначенных соответствующих признаков в общем кластере при наложении схем сравниваемых генотипов.

9. Определения плейотропного эффекта гена по фенотипическому эффекту в благоприятных условиях при анализе состава доминантных аллелей сравниваемых генотипов.

10. Визуализации состава доминантных аллелей и изучения типов их взаимосвязей. Проводится согласно имеющимся программам визуализации: например пакет для визуализации графов Graphviz. Он доступен в интернете на сайте http://www.graphviz.org/

11. Прогноза гетерозиса по ХЦП для моделируемой среды по выявленным закономерностям для данных генотипов и выбора приоритетных признаков, по которым необходимо проводить отборы. Определяется по коэффициентам корреляции между доминантными аллелями, кодирующими различные ХЦП, сгруппированными в общем кластере и эффектом гетерозиса по конкретным ХЦП.

Параметр W_r+V_r для каждого исследуемого генотипа определяли согласно программному продукту разработки Приднестровского госуниверситета (автор Цикалюк Р.А.), позволяющему оперировать с полной и не полной диаллельной схемой (до10 родительских форм). Многомерные анализы и стандартизация данных выполнялись по программе Statistika, версии 6,0. Анализ методом нечеткой кластеризации выполнялся по модернизированной программе GA Fuzzy Clastering, предоставленной в бесплатное пользование разработчиками (Тараскина и др., 2004).

Проявление и наследование комплекса ХЦП

Провели регрессионно-кластерный анализ 16 признаков для двух различных условий (Рис.2), так как по большинству из них отмечались как неаллельные взаимодействия, так и зависимость проявления от условий выращивания. Сопоставление результатов кластеризации итерационными и иерархическими методами выявило очень хорошее совпадение данных (100 %), свидетельствующее об относительной оптимальности разбивки на кластеры. Результаты кластеризации свидетельствовали о группировке генотипов в 4-х кластерах (Рис. 2,А), и выявили определенную универсальность некоторых из них (Л48 и Прометей) для обоих условий выращивания, возможно, за счет механизмов стабильной выраженности комплекса ХЦП. Признаки по результатам кластеризации сгруппировались в 9-ти кластерах (Рис. 2, Б). Полученные результаты обосновывают и уточняют стратегию селекции на продуктивность, которую можно вести в направлении увеличения не только количества плодов, или массы плодов, но и обоих признаков, поскольку они ассоциируются с разными кластерами.

Представляет интерес и вскрытая сопряженность поражаемости увяданием и толщины стенки, в конечном итоге также модулирующих проявление продуктивности для уточнения механизмов функционирования полигенов, контролирующих этот признак.

Рис.2. Дендрограммы, характеризующие идентичность изученных генотипов в различных условиях выращивания (А) и 16 хозяйственно- ценных признаков (Б), построенных на основе нормализованных значений W_r+V_r критерий объединения - полная связь; функция расстояния -1- коэффициент парной корреляции Пирсона).

А: 1 и 2 -- сорт Добрыня Никитич, 3 и 4 -- сорт Колобок, 5 и 6- линия Л 49, 7 и 8 -- сорт Прометей, 9 и 10 -- линия Л 48 для каждого генотипа соответственно защищенный и открытый грунт).

Б: 1-16 -- соответственно продолжительность I фенофазы, продолжительность II фенофазы, продолжительность III фенофазы, высота куста, длина, диаметр, индекс плода, число камер в плоде, толщина стенки плода, средняя масса плода, товарная масса плода, число плодов с растения, общий урожай с растения, товарный урожай с растения, увядание в условиях монокультуры, гниль плодов.

Состав и характеристика кластеров ХЦП овощного перца

Дальнейшая кластеризация при перемене местами объекта (кластер - признак-среда) и признака (W_r+V_r) - эффекты доминантных аллелей идентифицировала генотипы по доминантным аллелям, результаты которой схематично представлены на Рис.3. Сравнение состава доминантных аллелей, контролирующих ХЦП, образующих 9 кластеров, в 2-х условиях выращивания отвечает их эколого - генетической идентификации. Полученная кластерная группировка, показав стабильность выраженности ряда признаков у некоторых генотипов в меняющихся условиях, определила потенциальных доноров стабильного проявления комплекса ХЦП. Кластеризация дифференцировала изучаемые генотипы по комплексу доминантных аллелей, контролирующих ХЦП, на высоко (1,3; 3,5; 1,4 здесь и далее в скобках указаны сравниваемые генотипы), средне (1,2; 2,3; 2,4; 2,5; 3,4) и мало идентичные (4,5; 1,5). Кроме того, проведенный анализ определил плейотропный эффект у ряда полигенов в кластерах: длина плода - индекс плода; товарный урожай - общий урожай с растения; средняя - товарная масса плода; длина 2-ой и 3-ей фенофаз; вертициллезное увядание - толщина стенки плода; количество камер в плоде - длина 1-ой фенофазы. Плейотропный эффект полигенов проявлялся дифференцированно в зависимости от генетического фона и условий выращивания. Выполненная эколого-генетическая идентификация важнейших аллелей ХЦП способствовала установлению структуры как внутрикластерных взаимосвязей, так и между идентичностью аллелей и эффектом гетерозиса.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.3. Визуализация состава доминантных аллелей 16 признаков, сгруппированных в девяти кластерах, у пяти генотипов. Примечание: о - открытый грунт, з - защищенный грунт, 1-5 обозначения генотипов согласно рисунку 2. Одинаковая штриховка обозначает идентичные доли доминантных аллелей у сравниваемых генотипов.

Структура взаимосвязей важнейших ХЦП

Гетерозис у используемых генотипов проявился в отношении признаков: товарный урожай, количество плодов на растении, высота растения и масса плода. Визуализированная структура взаимосвязей между величиной и знаками корреляций в кластерах ХЦП у доминантных аллелей и эффектом гетерозиса для обоих условий выращивания представлена на рис.4. Визуализация помогает выявить значимость доминантных аллелей в кластерах ХЦП для проявления гетерозиса и уточняет формирование 8-ми ХЦП: высоту куста, количество плодов с растения, товарного урожая, массы плода, длины, диаметра, индекса плода и толщины стенки плода. В тоже время обнаружено закономерное варьирование структуры отмеченных взаимосвязей в меняющихся условиях среды (Табл.9). Так, выраженность признака «товарный урожай» в открытом грунте определялась аллелями из следующих кластеров с показателями взаимосвязей: >(0,68)длина - индекс плода > (-0,25) урожай товарный - общий - количество плодов на растении > (-0,1) диаметр плода > (-0,26) высота куста > (0,34) гниль плода > (-0,74) средняя и товарная масса плода > (-0,49) длина 2-ой и 3-ей фенофаз > (-0,28) толщина стенки плода - увядание вертициллезное >(-0,21) камерность - длина 1-ой фенофазы средняя - товарная масса плода (-0,74). В условиях пленочной теплицы эта цепочка опосредованно переопределилась с соответствующими измененными показателями взаимодействий в кластерах: > (0,28) длина - индекс плода > (0,05) урожай товарный- общий - количество плодов на растении >(-0,17) диаметр плода >(0,18) высота куста >(0,23) гниль плода >(0,34) средняя и товарная масса плода> (-0,09) длина 2-ой и 3- ей фенофаз > (-0,45) толщина стенки плода - увядание вертициллезное >(-0,47) камерность - длина 1-ой фенофазы.

Рис.4. Визуализация взаимодействий важнейших аллелей ХЦП и эффектов гетерозиса у сладкого перца в условиях открытого и защищенного грунта.

Примечание: сплошная линия - положительные, пунктирная - отрицательные связи; показатели идентичности долей доминантных аллелей в кластерах в условиях теплицы (Var1-Var9) и открытого грунта (Var181-Var189):Var1, Var 181- длина-индекс плода, Var2, Var182 - общий-товарный урожай-количество плодов с растения, Var3, Var183 - диаметр плода, Var4, Var184 - высота куста, Var5, Var185 - гниль плодов, Var6, Var186 - средняя-товарная масса плода, Var7, Var187 - длина 2 и 3 фенофаз, Var8, Var188 - толщина стенки плода-вертициллезное увядание, Var9, Var189 - длина 1 фенофазы-количество камер в плоде; эффект гетерозиса в условиях теплицы (Var 10, NewVar1-NewVar6, NewVar) и открытого грунта (Var1810 - Var1817) по признакам: Var10, Var1810 - длина плода, NewVar1, Var1811 - диаметр плода, NewVar2, Var1812 - индекс плода, Var 3, Var1813 - толщина стенки плода, NewVar4, Var1814 - товарный урожай, NewVar5, Var1815 - количество плодов с растения, NewVar6, Var1816 - масса плода, NewVar, Var1817 - высота куста.

Т.е. выраженность признака «товарный урожай» в условиях пленочной теплицы определялась четырьмя отрицательными межаллельными и межкластерными коэффициентами корреляции и пятью положительными, а в

открытом грунте количество корреляций с отрицательным знаком увеличилось на три единицы, но одновременно уменьшилось на такую же величину количество положительных взаимосвязей в этих же условиях. Значит, между изменчивостью знаков корреляций в кластере при формировании признака в зависимости от среды наблюдается функциональная зависимость (Табл.9).

Таблица 9

Структура изменчивости корреляционных связей в кластерах ХЦП в зависимости от условий выращивания

Признак	Изменчивость знаков и показателей коэффициентов корреляции r в 9 кластерах ХЦП	Количество пере - определенных r в кластерах	Суммарный показатель r в среде с учетом знака корреляции
	Открытый грунт (I)	Пленочные укрытия (II)
	П	В	П	В		I	II
Высота куста	1	8	6	3	5	2.15	-0.22
Кол-во плодов на растении	4	5	5	4	1	0.41	-0.28
Товарный урожай	7	2	4	5	3	-1,31	-0,1
Масса плода	8	1	4	5	4	-1,54	0,44
Длина плода	3	6	3	6	0	-0,71	0,75
Диаметр плода	7	2	5	4	2	0,42	-2,26
Индекс плода	4	5	5	4	1	0,28	-0,6
Толщина стенки плода	7	2	4	5	3	-1,52	0,37
?	41	31	36	36	19	-1,82	-1,9
Примечание: П - количество переполюсовок, изменений знака r на противоположный; В - количество r c варьирование величины в пределах 0? r ?1

.

а) методом кластеризации б) многомерным шкалированием в 2-х плоскостях

Рис.5. Моделирование двумя методами (а, б) взаимосвязи эффекта гетерозиса по товарному урожаю и степени идентичности доминантных аллелей ХЦП для универсального гибрида перца, предназначенного для выращивания, как в условиях пленочной теплицы, так и открытого грунта. Примечание: Var1- эффект гетерозиса,Var2-Var10 кластера соответственно длина-индекс плода, общий - товарный урожай - количество плодов, диаметр плода, высота куста, гниль плодов, средняя - товарная масса плода, продолжительность 2-ой и 3-ей фенофаз, толщина стенки плода - увядание, продолжительность 1-ой фенофазы - камерность плодов.

Наличие функциональных межкластерных и межаллельных связей указывает на присутствие группы координировано экспрессирующихся генов с общей функцией - формированием признака, т.е. свидетельствует о структуре организации полигенов ХЦП в виде генной сети (ГС) и соответствует ее определению (Колчанов и др., 2000; Ананько, 2008). Выявленные межкластерные и межаллельные связи в свою очередь представляют собой общую упрощенную схему регуляторных контуров ГС продуктивности без детальной молекулярной расшифровки, где положительные связи знаменуют переход к новой функции в новых условиях, а отрицательные - выступают регуляторными стабилизаторами. Об этом свидетельствуют суммарные коэффициенты межкластерных и межаллельных корреляций для условий теплицы и открытого грунта, которые определились как отрицательные и почти одинаковые по абсолютной величине, что подтверждает стабильность ГС продуктивности и соответствует определению отрицательной связи ГС как регуляторной. Информация о лимитирующих факторах среды, нормы реакции признаков, состава ГС, определяющей признак, и эффекта переопределения доминантных аллелей ХЦП позволяет моделировать конечную функцию - формирование признака в моделируемом пространстве (Рис.5). Так, если поставлена задача получить универсальный гибрид для обоих условий, проявляющий эффект гетерозиса по товарному урожаю при развитии болезней плодов, первоочередным объектом отбора должна быть степень идентичности доминантных аллелей в кластерах длина - индекс плода, продолжительность второй и третьей фенофаз и гниль плодов (Рис.5). Но поскольку у переменных функциональная связь между знаками корреляций, то следует учесть и групповое воздействие остальных переменных на проявляемый эффект гетерозиса. Полученные результаты дополняют имеющиеся представления о возможном регулировании полигенного функционирования, причем явление гетерозиса выступает с этих позиций только частным случаем общей работы ГС

Особенности методологии исследований генофонда C.annuum var.annuum по признаку переключения фаз репродукции с помощью культуры тканей

Известно, что у многих растений (пионовых, цитрусовых, луковых, злаковых и др.) для преодоления негативного влияния окружающей среды и генетических факторов, препятствующих опылению, выработалась репродуктивная стратегия взаимной замены: когда условия для полового воспроизводства неблагоприятны, семенное размножение заменяется на вегетативное.

Особенностью вегетативного размножения является гомофазность, что проявляется в способе возникновения спорофита (спорофит из спорофита) в противоположность семенному, гетерофазному, характеризующемуся развитием спорофита из гаметофита. Получение регенерантов у цветковых растений in vitro демонстрирует процесс, имеющий место и в природной популяции: переключение гетерофазной репродукции с бипарентальным наследованием на гомофазную с унипарентальным типом наследования, т.е. кардинальная смена путей морфогенеза или их перепрограммирование. Однако механизмы такого перепрограммирования до конца не выявлены, а надежда на удачный поиск одного ключевого гена -переключателя не увенчалась успехом (Hosp et al., 2007). В связи с этим перепрограммирование рассматривается как полигенный признак, а методы исследования, применяемые в данном случае, не отличались от методов исследования других ХЦП.

Переключение фаз репродукции и особенности регенерации растений перца в культуре in vitro

Проведенные исследования подтвердили литературные данные о прямом способе переключения фаз репродукции у клеток незрелой пыльцы в культуре пыльников овощного перца. Через две недели после высадки на индукционную питательную среду пыльники набухали, бурели и раскрывались, а при пересадке на регенерационную среду еще через две недели у отзывчивых генотипов формировались эмбриоиды (Рис.6).



Рис.6. Прямое образование эмбриоидов (глобулярная и торпедовидная фазы) и регенерантов у сорта Добрыня Никитич в культуре пыльников (МБС, увеличение 24).

Полный цикл развития полноценных растеньиц: первоначальная посадка пыльников на индукционную среду, формирование эмбриоидов и последующее вызревание на ростовых средах - составлял два с половиной - три месяца. Для гарантированного положительного результата (один регенерант) необходимо брать в работу не менее 100 бутонов или 500 - 600 пыльников. Полученные растения-регенеранты лучше всего приживались в горшечной культуре в фазе четырех - пяти настоящих листьев. Они отличались фенотипически размерами и интенсивностью окраски листьев, в дальнейшем цвели и некоторые образовывали плоды. Но основная масса оказывалась стерильной, и ее необходимо было колхицинировать для получения семян. При использовании неоплодотворенных семяпочек в качестве эксплантов переключение фаз репродукции останавливалось на глобулярной фазе, при пересадках на регенерационные среды у эксплантов начиналось интенсивное каллусообразование.

Прямое образование соматических эмбриоидов отмечалось и на незрелых зиготических зародышах у некоторых представителей сортотипа Grossum, но без регенерации. У отзывчивых генотипов интенсивно образовывались только кластерные биполярные структуры и отмечался ризогенез.

В целом при очень большом объеме работы выход нужных форм, полученных в культуре пыльников, оказался сравнительно низким. Поэтому следующим обязательным этапом исследований стало уточнение отзывчивости генотипов и факторов, воздействующих на проявление признака.

Генетические и эпигенетические факторы, обуславливающие переключение фаз репродукции

При этом способность к переключению фаз репродукции оказалась генотип зависимой, о чем свидетельствует широкий диапазон изменчивости популяционных показателей C.annuum var. annuum у изучаемых признаков. Из популяций сортотипов Fasciculatum и Grossum выделены генотипы со средней и высокой отзывчивостью к образованию эмбриоидов и способные к регенерации на ростовых средах из микроспор: Добрыня Никитич, Л-48, Л-49, Л-147. Наиболее отзывчивым генотипом со схемой генезиса эмбриоидов спорофит > спорофит оказался представитель Grossum - сорт Толстый барон.

Эпигенетические факторы контроля развития экспланта или доступность генетической информации и реализация ее в онтогенезе оказались сопряженными с критической фазой развития экспланта - одноклеточной или ранней двухклеточной стадией развития, что соответствовало соотношению размеров чашечки к венчику как 1:1. А для гомофазной репродукции со схемой генезиса спорофит > спорофит критической оказалась торпедовидная фаза развития зиготического зародыша. Формирование эмбриоидов на незрелых зародышах зиготического происхождения и в культуре пыльников модулировались также сигналом к переключению (стрессовая обработка или гормональная индукция) и подходящим физиологическим состоянием донора экспланта.

Наследование признака переключения фаз репродукции в культуре in vitro

Анализ родительских форм и потомства показал, что изучаемый признак наследуется, но с выраженными генными взаимодействиями как по схеме генезиса спорофит > спорофит, так и гаметофит > спорофит.

Регрессионно-кластерный анализ определил группировку родительских генотипов по признаку «формирование эмбриоидов на незрелых зиготических зародышах» из пяти кластеров, установив идентичность генов-переключателей у Прометея и Л49 (торпедовидная фаза); у Добрыни Никитича и Колобка (торпедовидная фаза и фаза прогулочной трости); у Л49 (фаза прогулочной трости) и Л48 (торпедовидная фаза).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7. Дендрограмма идентичности гаметофита и спорофита по генам переключателям, нормализованные значения W_r+V_r

Примечание: Var₁ - образование эмбриоидов в культуре пыльников, Var₂ -у зиготического зародыша в фазе торпедовидной,Var₃ - в фазе прогулочной трости.

Регрессионно-кластерный анализ этих же генотипов и C. frutescens со схемой генезиса эмбриоидов гаметофит>спорофит в культуре пыльников, выявил группировку генотипов по признаку «формирование эмбриоидов в культуре пыльников» из четырех кластеров. Анализ продемонстрировал идентичность генов-переключателей у сорта Прометей и C frutescens, у сорта Добрыня Никитич и линии Л49. Сопоставление динамики выраженности признака переключения фаз репродукции in vitro в культуре пыльников и культуре незрелых зиготических зародышей показало идентичность генов-переключателей у гаметофита и спорофита в критических фазах (Рис.7). На более поздней фазе развития спорофита отмечалось переопределение переключателей, т.е. их функционирование - это динамичный процесс, разделенный во времени. Идентичные гены-переключатели фаз репродукции, как у спорофита, так и у гаметофита отмечены у сорта Прометей и линии Л49; у сортов Добрыня Никитич и Колобок. Переключение фаз репродукции in vitro у гаметофита и спорофита в зависимости от генотипа контролировались в динамике четырьмя парами переключателей (Рис.8).

1		1		1		1		1
2		2		2		2		2
3		3		3		3		3

Прометей Л48 Колобок 49 Добрыня Никитич

Рис.8. Паттерн переключения фаз репродукции в динамике in vitro у овощного перца. Примечание: 1 - микроспоры в культуре пыльников, 2 - спорофит, незрелый зиготический зародыш (торпедовидная фаза), 3 - спорофит, незрелый зиготический зародыш (прогулочная трость)

Рис. 9. Реконструкция взаимосвязей признаков переключения фаз репродукции у овощного перца в онтогенезе. Примечание: образования эмбриоидов Var1- у микрогаметофита в культуре пыльников, Var 2- у зиготического зародыша в фазе торпедовидной и Var 3- в фазе прогулочной трости. Гетерозис по признаку образования эмбриоидов: Var 4 -в культуре пыльников, Var 5 - у зиготического зародыша в фазе торпедовидной.

Сопоставив идентичность доминантных аллелей и эффект гетерозиса по признаку переключения фаз репродукции, реконструировали регуляторные контуры взаимосвязи между изучаемыми признаками и их доминантными аллелями (Рис.9). Анализ графа свидетельствуют о том, что признак «Переключение фаз репродукции» у перца определяется двумя генными цепочками. Первая состоит из идентичных генов-переключателей незрелых микроспор и зиготического зародыша, определяющих эффект гетерозиса по признаку образования эмбриоидов у микроспор. Вторая цепочка представлена этими же генами и эффектом гетерозиса по признаку образования соматических эмбриоидов у торпедовидного зиготического зародыша. Поскольку параметры корреляций между двумя цепочками отрицательные, следовательно, это автономные, но относительно конкурирующие процессы, разделенные во времени. Уточненная схема выраженности признака переключения фаз репродукции и найденные отзывчивые генотипы увеличивают вероятность получения стабильных линий с комплексом ХЦП.

РЕЗУЛЬТАТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРОГРАММЫ ПО СОЗДАНИЮ ГЕНОФОНДА CAPSICUM С КОМПЛЕКСОМ ХЦП

Выделенные источники и доноры признаков с комплексом ХЦП были использованы для создания новых перспективных линий, включенных в конкурсное сортоиспытание.

Таблица 11.

Характеристика сортов и гибридов, созданных в результате генетического мониторинга генофонда Capsicum и внесенных в Государственный реестр Российской Федерации за период 1984 - 2009 гг.

Название сорта, гибрида F1	Длина фенофазы (дни) от всходов до, спелости	Масса плода г	Форма и цвет плода в технической/био-логической спелости	Уро- жай- ность кг/м2	Ус-той- чи-вость к болезням	Химический состав в биологической фазе спелости	Год вне-сения в Ре-естр
						Су-хие ве-щества,%	Общий са-хар,%	Витамин С, мг/ 100 г с.в.	Бета-каротин мг/ 100 г с.в*.
	Тех-нической	Би-ологичес-кой
Ультрараннеспелые букетные сорта
Ермак	95-110	114-128	60-120	Призмов. -конусов. Светло зел/темно красный	3-3,5	Ve	5-6	3,0-3,8	99-175	16,4	1999
Добрыня Никитич	95-110	113-128	80-120	Призмов. -конусов. Желто- зел/крас-ный	3,5-3,7	Ve	5-6	2,9-3,9	125-163	6,7	2000
Среднерослые раннеспелые сорта
Тополин	110-120	130-140	100-150	Кон.-призм/светлозел./ красный	4-10	Мозаи-ка (Cmv)	6-7	2,9-3,4	164-190	14,9	1984
Прометей	118-125	138-140	100-140	Кон.-призм /светлозел./красный	4,9-10	Мозаика, Ve	6-8	3,4-4,6	156-190	32,7	2000
Катюша	100-105	125-135	70-120	Конус-.ый /светлозел./оранж.-желтый	5-9	Ve	7-8	3,5-4,1	190-240	29,3	2003
Раннеспелые гибриды на стерильной основе
Юбилей-ный Семко	98-105	125-135	90-110	Кон.-призм/светлозел./ красный	6-12	Мозаика, Ve	6-7	3,2-3,8	128-180	23,6	1997
Раннеспелые гибриды на стерильной основе с улучшенным биохимическим составом
Витамин	105-110	135-140	60-95	Конус-.ый /светлозел./оранж.-красный	6 -12,5	Мозаика, Ve	7-9	2,5-3,2	250-280	90,2	2006
Примечание: * - в пересчете на сухое вещество

По его результатам сорта-кандидаты были переданы в Государственное сортоиспытание, большинство из которых успешно его прошли и были районированы или допущены к использованию (Табл.11).

Раннеспелые сорта с комплексной устойчивостью к заболеваниям и улучшенным биохимическим составом

Новые сорта из группы ультрараннеспелых букетных Добрыня Никитич и Ермак превосходят стандарт по общему урожаю, крупности плодов, толщине перикарпия, слабой поражаемости вершинной гнилью. Сорт Ермак рекомендован к использованию с 1999 года по шести областям Центрально-Черноземного и шести областям Дальневосточного регионов Российской Федерации, а сорт Добрыня Никитич - для выращивания в частном секторе во всех зонах возделывания культуры РФ.

В группе среднерослых раннеспелых сортов хорошо зарекомендовали себя Тополин, Прометей, Катюша. Сорт Тополин с 1989 г. был районирован в Азербайджанской ССР и пяти областях Казахской ССР, а также в Российской Федерации и остается востребованным производством в течении 20 лет за раннеспелость, выносливость к болезням, высокую товарность. Он рекомендован к выращиванию в открытом грунте в Северо-Кавказском и Дальневосточном регионах, охватывающих 16 краев, областей и республик России. Хорошие результаты показал и новый сорт Катюша. Сохраняя лучшие признаки стандарта: толерантность к болезням, раннеспелость, продуктивность, высокие показатели по качеству плодов, - в дополнение продемонстрировал преимущества по содержанию витамина С в плодах. В новом желтоокрашенном сорте по содержанию в- каротина удалось не только достичь уровня обычных красноплодных сортов, но и превысить его на 30%. Сорт Катюша выращивается с 2003 года в 10 краях и республиках Северо-Кавказкого региона и 7 областях, краях и республиках Восточно-Сибирского региона.

Сорт Прометей превышает стандарт по раннему урожаю за счет более короткой первой вегетационной фазы, в 2-4 раза по содержанию в-каротина, а также и по устойчивости к мозаике. Сорт успешно прошел государственное испытание по Российской Федерации и находится в Реестре сортов и гибридов.

Раннеспелые гибриды на стерильной основе с улучшенным биохимическим составом, толерантные к заболеваниям

Стерильные материнские линии с ГМС создавали рекуррентной селекцией, чередуя индивидуальные отборы с многократным беккроссированием (Рис.10). Для этого пирамидировали лучшие селекционные линии с комплексом ХЦП генами устойчивости к вертициллезному увяданию с одновременным проведением отбора по устойчивости к болезням на провокационном фоне и генами стерильности ms-3 и ms-8 в зимне-весеннем обороте в стеклянных и в пленочных необогреваемых теплицах. В результате проведенной работы были получены стерильные материнские линии с традиционной формой и окраской плодов, толерантностью к вертициллезному увяданию. Предварительное изучение комбинационной способности в топкроссе выявило преимущество по показателям СКС линии 5/92. Ее фертильный аналог при использовании в качестве отцовской формы характеризовался и высокой ОКС. Данная линия в отличие от других потенциально проявляет гетерозис за счет доминантных и плейотропных эффектов полигенов раннеспелости и крупности плодов. Многолетнее изучение гибридов на стерильной основе выявило преимущество гибридной комбинации Л5/92 х Т-119/8 по комплексу ХЦП. Плоды гибрида имеют привлекательный вид и высоко оцениваются потребителем за конкурентоспособность на рынке. Гибрид относительно хорошо сохраняет завязь в неблагоприятных условиях. Данный гибрид F₁ под названием Юбилейный Семко (Табл.11) с 1997 г. включен в Реестр сортов по России и Белоруссии, и особенно хорошо себя зарекомендовал по Ростовской и Астраханской областям, Краснодарскому краю и в республиках Закавказья. Гибрид ценится за раннеспелость, высокую урожайность при упрощенной технологии выращивания, выносливость к болезням, отличные вкусовые качества, привлекательный внешний вид.

В связи с потребностями рынка к качеству продукции, ориентированной на функциональный продукт, были созданы новые высококаротиновые родительские линии на стерильной основе методом рекуррентной селекции на основе линии 5/92. Материнская форма с геном стерильности и высокого каротина представляет собой популяцию по двум рецессивным генам, которая поддерживается в гетерозиготном состоянии с наиболее выраженным комплексом необходимых ХЦП. В качестве отцовских линий были использованы формы из высококаротинового питомника, дополняющие материнские, с комплексом ХЦП. Проведенный анализ ОКС и СКС использованных ms-линий и линий-опылителей показал, что высокий урожай коррелирует в основном с высокими показателями СКС, что совпадает с ранее полученными данными по гибриду Юбилейный Семко, а высокое содержание в-каротина - как с ОКС, так и с СКС.

Используя новые линии с генами ms и bc методом топкросса, был получен ряд гибридов F₁. Лучшим из них по комплексу признаков оказался гибрид Витамин F₁ Л61/1 х Л29, который по содержанию в-каротина в 2,5 - 3 раза превосходит стандарт (Табл.11). Гибрид включен в Госреестр России по Северокавказскому региону с 2007 года для выращивания в открытом грунте и под пленочными укрытиями.

Особенности семеноводства гибридов и материнских форм на стерильной основе и стабилизация проявления признака семенной продуктивности при неблагоприятных условиях

Привлечение стерильной линии при производстве гибридного перца значительно повышает рентабельность семеноводства культуры (Табл. 12). Проведенные исследования со стерильной линией 5/92 уточнили эффективность ее семеноводства в зависимости от способа опыления при произвольном размещении её фертильных аналогов. Если не планируется использовать ручной труд для опыления, можно организовать семеноводство с пчелоопылением. При этом выход семян материнской линии, используя только пчел по сравнению с ручным контрольным опылением в 5,5 раза ниже, а в комбинации «однократное ручное опыление + пчелоопыление» в 2,9 раза ниже контрольного и составляет чуть менее 1,5 кг с 500м². Данного количества семян материнской линии хватает на два года посева для получения в год по 1ц гибридных семян. Рентабельность производства семян материнской линии кроме того увеличивается на 10% при облучении пыльцы низкоинтенсивным излучением с длиной волны л = 630 нм. В случае производства семян гибрида при отработанной схеме посадки материнской и отцовской форм 3:1 опыление пчелами дает очень низкий выход гибридных семян и составляет всего 11% от контрольного варианта. При сочетании же ручного опыления с пчелоопылением получается только половина возможного количества гибридных семян в сравнении с контролем. Таким образом, использование пчел в качестве опылителей целесообразно только в случае семеноводства материнской линии, а при гибридном производстве является неоправданным.

Таблица 12

Экономическая эффективность семеноводства гибрида F₁ Юбилейный Семко в зависимости от используемой материнской формы, (необогреваемая пленочная теплица), 2000г.

Показатели	Гибрид F1 Юбилейный Семко, полученный на основе линий
	фертильной - St	стерильной
Количество опыленных бутонов за рабочий день, среднее, шт.	400	1250
Завязываемость, %	47	80
Количество получаемых семян г/м2, среднее	12	21
Площадь участка гибридизации, м2	500	500
Получено семян, кг	6,0	10,5
Всего затрат У.Е./500м2	1350	1450
Себестоимость 1кг семян У.Е.	225	138
Выручка от реализации семян, У.Е.	2100	3675
Чистая прибыль в У.Е.	750	2225
Рентабельность, %	35,7	60,5

1 У.Е= 1$ (США).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе генетического мониторинга Capsicum проведена селекционно-генетическая характеристика генофонда перца, выделены источники и доноры ХЦП и разработаны методы для ускорения селекционного процесса. Их эффективность, доступность и надежность апробированы при создании новых сортов и гибридов, что позволяет рекомендовать их для использования в селекционной практике при создании нового исходного материала с заданными параметрами.

1) Результаты проведенных исследований показали эффективность генетического мониторинга генофонда Capsicum, выявляющего идентифицированные источники и доноры ХЦП: болезнеустойчивости, раннеспелости, высокого содержания в - каротина и витамина С, способности к переключению фаз репродукции в условиях in vitro, а также комплекса признаков, обусловливающих повышенную продуктивность.

2) Генетический мониторинг генофонда Capsicum показал организацию полигенов и блоков генов ХЦП в виде генных сетей, функционирующих в соответствии с теорией эколого-генетического контроля количественных признаков, причем смена условий выращивания адекватно переопределяет структуру связей ХЦП, как за счет координированного изменения эффектов аллелей, так и путем переполюсовки взаимосвязей.

3) Предложена методика регрессионно-кластерного изучения количественных признаков растений, включая материнский эффект и эпистатические генные взаимодействия.

4) Разработан подход для сравнительной эколого-генетической идентификации генотипов согласно их норме реакции с визуализацией структуры взаимосвязей важнейших ХЦП.

5) Информация о лимитирующих факторах среды, норме реакции признаков, составе ГС, определяющей признак, и эффекта переопределения доминантных аллелей ХЦП позволяет моделировать конечную функцию - формирование признака в моделируемом пространстве.

6) Представлен подход по стабилизации выраженности ХЦП электромагнитным излучением с длиной волны 630нм и энергией 6,85 Дж в условиях воздействия биотических и абиотических стрессоров, облучая микрогаметофит и спорофит чувствительных генотипов.

7) Уточнена система методов оценки проявления, варьирования и наследования, важнейших ХЦП по микрогаметофиту и по спорофиту в динамике, обеспечивающая их достоверную идентификацию.

8) Создано в соавторстве методом рекуррентной селекции пять раннеспелых сортов, а также два гибрида на стерильной основе для выращивания в пленочных теплицах и открытом грунте в результате практического осуществления генетической программы по созданию и использованию доноров с комплексом ХЦП. Сорта и гибриды включены в Государственный реестр по Российской Федерации и Республике Беларусь с допуском к использованию. По ряду из них получены патенты.

9) Отработана технология выращивания гибридных семян новых гибридов, позволяющая в производственных условиях получать 10 - 35 г/м² урожая семян в зависимости от возможностей хозяйства.

Рекомендации по совершенствованию селекции перца и внедрению новых сортов и гибридов

1. Применять в селекционной практике регрессионно - кластерный анализ для оценки и идентификации генотипов с комплексом ХЦП. Использовать визуализированные результаты идентификации генотипов для целенаправленного подбора пар для скрещивания и моделирования конечной функции - формирования признака в моделируемом пространстве.

2. Для создания раннеспелых сортов овощного перца с комплексом ХЦП использовать в качестве доноров генотипы с укороченными фенофазами: Л-3/98, Л-5/98, Винни-Пух, Венти, Тополин и другие, толерантные к болезням с высокой продуктивностью и хорошим качеством плодов.

3. Для создания разнообразных по цвету и форме перикарпия раннеспелых материнских форм на стерильной основе с генами ядерной мужской стерильности, использовать метод рекуррентной селекции.

4. Для получения 3-х, 4-х поколений в год и экспресс оценки раннеспелости использовать эмбриокультуру в комбинации с выращиванием полученных растений в защищенном грунте.

5. Для повышения рентабельности семеноводства раннеспелой материнской формы в стрессовых условиях (высокая температура) применять облучение пыльцы перед опылением красным светом с длиной волны л=630-660 nm и энергией 6,85 Дж.

6. Создание сортов и гибридов с комплексной толерантностью к болезням проводить на провокационных фонах по возбудителям увядания, мозаики и грибных гнилей. Использовать в качестве доноров раннеспелости и комплексной толерантности к болезням сорта Добрыня Никитич, Катюша, Тополин, Венти, Ермак, а в случае появления новых рас и штаммов возбудителей - резервный фонд источников устойчивости. Для ускорения скринирования генотипов на устойчивость к вертициллезному увяданию применять методику оценки исходного материала овощного перца по микрогаметофиту и ранним фазам спорофита в условиях in vitro.

7. Селекцию на качество и улучшение биохимического состава плодов перца вести с использованием доноров с комплексом ХЦП: Л-49, Л-29, Т-119/8, сорт Прометей и др. Учитывать в программе селекции на улучшенный биохимический состав и окраску перикарпия выявленные взаимодействия генов bc и y, дифференцированную жизнеспособность гамет с этими генами, наличие цис-транс-эффекта, обуславливающего нестабильное наследование окраски в потомстве рецессивных форм.

8. Для создания раннеспелых материнских линий с комплексом ХЦП насыщать лучшие линии генами мужской стерильности и высокого содержания в-каротина. Для ускоренного получения линейного материала использовать культуру пыльников и доноры признака образования эмбриоидов: Добрыня Никитич, Л-49, Прометей, Колобок. Вести селекцию гибридов F₁ на основе новых стерильных линий, учитывая их комбинационную способность.

9. Использовать для организации гибридного семеноводства перца уточненную технологию выращивания, обеспечивающую получение урожая семян 10--35 г с 1м².

1. Выращивать раннеспелые высокоурожайные сорта и гибриды: Ермак, Добрыня Никитич, Катюша, Тополин, Юбилейный Семко, обеспечивающие урожайность в зависимости от зон и условий выращивания от 2 до 10 кг/м².

2. Выращивать сорт Прометей и гибрид Витамин предназначенные для функционального питания, с повышенным содержанием антиоксидантов: в-каротина и витамина С, благотворно влияющих на здоровье человека.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балашова Н.Н., Король М.М., Тимина О.О., Рущук В.С. Генетические основы селекции овощных культур на устойчивость к ВТМ. - Кишинев: Штиинца,1983. - 114с.

2. Тимина О.О. Использование культуры in vitro в селекции на иммунитет к болезням. Рук. Деп в Молд.НИТМ З.Р. 0627, 1988, -54 с. №1032-М, Р.Ж.Защита сельскохозяйственных растений от вредителей и болезней №4, 1989.

3. Salyaev R.K., Dudareva L.V., Vigovsky Y.N., Malov A.N., Malov S.N., Bogdan L.V., Neupokoeva A.V., Feshchenko V.S., Timina O.O. Effect of electromagnetic field spatial structure on the efficiency of laser biostimulation// Laser Physics. 2003, vol.13, 4. P.827-838.

4. Тимина О.О., Цикалюк Р.А., Орлов П.А. Наследование и экспрессия способности к индукции соматического эмбриоидогенеза in vitro в онтогенезе растений перца сладкого// Сельскохозяйственная биология. - 2005, №3. -С.61-71.

5. Тимина О.О., Рябова А.С. Об идентификации ключевых аллелей хозяйственно-ценных признаков у овощного перца Capsicum annuum L. регрессионно-кластерным анализом// Сельскохозяйственная биология. - 2010, №1. -С.40-50.

6. Тимина О.О., Рябова А.С. Закономерности проявления гетерозиса у овощного перца Capsicum annuum L. в зависимости от степени идентичности ключевых аллелей хозяйственно-ценных признаков. Сельскохозяйственная биология, 2011, №1. -С.66-75.

7. Тимина О.О., Митин В.А.. Использование токсического метаболита Verticillim dahliae Kleb для оценки устойчивости овощного перца к вертициллезному увяданию. Вестник защиты растений, 2011, №2. -С.67-71.

8. Тимина О.О., Тимин О.Ю., Федоров С.К. Норма реакции признака высокое содержание в-каротина в генофонде Capsicum annuum var.annuum L. в связи с селекцией на качество. Сельскохозяйственная биология, 2011, №5. -С.69-75.

9. Тимина О.О., Уралец Л.И., Рябова А.С. Использование эмбриокультуры в селекции Capsicum annuum var. annuum L. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 2011, №9-10. - С. 36 - 44.

10. Тимина О.О., Тимин О.Ю., Федоров С.К., Томлекова Н. Наследование окраски перикарпия и содержание в-каротина у овощного перца. Вавиловский журнал генетики и селекции, 2011, т. 15, № 3. - С.540-549.

11. Тимина О.О., Тимин О.Ю. Авторское свидетельство № 42540 на сорт сладкого перца “Витамин” / 2006

12. Тимина О.О., Тимин О.Ю. Авторское свидетельство № 37487 на сорт сладкого перца “Катюша”/ 2003

13. Тимина О.О., Тимин О.Ю., Войняк О.В. Авторское свидетельство № 32259 на сорт сладкого перца “Прометей”/ 2000

14. Тимина О.О., Тимин О.Ю. 2000. Авторское свидетельство № 33271 на сорт сладкого перца “Добрыня Никитич”/ 2000

15. Тимина О.О., Ильенко Т.С. 1999. Авторское свидетельство № 30022 на сорт сладкого перца “Ермак”/ 1999.

16. Тимина О.О. Свидетельство селекционера № 0001282 на сорт перца сладкого «Юбилейный Семко» / 1998.

17. Тимина О.О. 1997. Авторское свидетельство № 29969 на сорт сладкого перца “Юбилейный Семко» /1997.

18. Тимина О.О., Ильенко Т.С., Кику В.Н. Авторское свидетельство № 5212 на сорт перца сладкого “Тополин”/1989г.

19. Патент № 0040 от 18.12.97 на селекционное достижение Перец сладкий Юбилейный Семко. Автор: Тимина О.О. // Официальный бюллетень, 1997. № 10. С. 723.

20. Патент № 0477 от 17.12.99 на селекционное достижение Перец сладкий Ермак. Авторы: Ильенко Т.С., Тимина О.О. //Официальный бюллетень, 1999. № 4. С. 280.

21. Патент № 3060 от 24.03.2006 на селекционное достижение Перец Сладкий Витамин. Авторы: Тимин О.Ю., Тимина О.О. // Официальный бюллетень, 2006. № 5(115). С 353.

22. Тимина О.О. Поражаемость сортов перца мозаикой// Защита растений. - 1978, 7, -С.38.

23. Тимина О.О. Фитопатологическая характеристика перца (Capsicum L.)// Известия АН МССР, серия биологических и химических наук. - 1980, №3, -С.45-50.

24. Балашова Н.Н., Король М.М., Тимина О.О., Балашова И.Т. Об использовании в селекции томата линий с генами Tm-1, Tm-2, Tm-2² в связи с явлением некрозообразования// Известия АН МССР, серия биологических и химических наук. - 1980, №5, -С.30-34.

25. Тимина О.О., Балашова Н.Н. Генетика устойчивости перца к комплексу ВТМ+Х-вирус картофеля// Известия АН МССР, серия биологических и химических наук. - 1982, №1, -С.22-23.