Реакции организма каспийских осетровых (Acipenseridae) на загрязнение среды обитания

44

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Реакции организма каспийских осетровых (Acipenseridae) на загрязнение среды обитания

Специальность: 03.03.01 - физиология

Москва - 2013

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Длительный сброс промышленных сточных вод в реки, впадающие в Каспий, смывы с сельхозполей ядохимикатов и удобрений, попадание в воду нефти и нефтепродуктов при её добыче в море и прибрежных районах, во время транспортировки и эксплуатации водного транспорта значительно ухудшили экологическую обстановку в этом регионе. Особенно сильно загрязнялось море в период интенсификации сельского хозяйства и роста промышленности в 70-80-е гг. прошлого века. В конце этого периода уровень загрязнения морских вод достиг критических величин (Ласкорин, Лукьяненко, 1990). С этого времени оно по силе воздействия на рыб не стало уступать природным факторам и вылилось в постоянно действующую, новую силу, негативного характера, что значительно ухудшило условия обитания гидробионтов. В большей степени загрязнение моря сказалось на осетровых, следствием чего стал феномен «расслоения» мышц и ослабление оболочек икры, явление которое ранее не было описано нигде в литературе. К 1987 г. оно достигло массового характера у внешне здоровых рыб. В это же время были зафиксированы и существенные изменения в их физиологическом состоянии. Они выражались в значительных отклонениях функциональных показателей от уровня 60-70-х гг. и структурных нарушениях в печени, жабрах, мышцах и половых железах, выявляемых гистологическими методами, значение и взаимосвязь которых в большинстве случаев было непонятно. Исследования, проводимые в этом направлении, ограничивались констатацией факта влияния поллютантов на те или иные физиолого-биохимические показатели, а целью экспериментов с токсикантами, как правило, было более точное определение ПДК. Практически отсутствовали исследования, показывающие формирование реакции организма гидробионтов на увеличение загрязнения среды их обитания и его механизм. Тем более что развитие промышленности, сельского хозяйства и интенсификация добычи нефти в Волго-Каспийском регионе в будущем может привести к повторению экологической ситуации 80-х годов. Можно полагать, что лишь всесторонний анализ многолетних данных исследования осетровых, полученных при разных уровнях загрязнения водной среды, позволит раскрыть и понять механизмы реакций организма рыб, объяснить изменения в обменных процессах и морфофункциональном состоянии различных тканей и органов.

Цель и основные задачи исследования

Основная цель данной работы состояла в выявлении причинно - следственных связей между действующими негативными факторами внешней среды и изменениями в физиолого-биохимических показателях и гистоморфологических структурах тканей и их адаптационный смысл на основе комплексного физиолого-биохимического и гистологического анализов. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. Показать реакцию организма осетровых рыб и её развитие в условиях антропогенного влияния на экосистему Волго-Каспия.

2. Исследовать изменения физиолого-биохимических показателей отражающих функционирование различных физиологических систем осетровых рыб и степень повреждения структур тканей мышц, жабр и половых желез при колебаниях уровня загрязненности среды обитания.

3. Выявить смысл формирования различного уровня ответных реакций осетровых рыб на воздействие загрязнений.

4. Раскрыть механизм появления структурно-функциональных изменений у осетровых рыб при различных уровнях загрязнения воды.

Научная новизна работы

Впервые на большом фактическом материале в природных условиях показано развитие реакции организма осетровых рыб на загрязнение среды их обитания. Доказано, что в подавляющем большинстве своём они являются различного уровня неспецифичес кими адаптационными реакциями организма. Впервые обоснована степень вовлечённости в адаптационный процесс различных функциональных систем от уровня загрязнения и длительности его действия. Установлены причинно-следственные связи и механизм проявления у осетровых рыб структурных и функциональных нарушений. Приведены доказательства, что явление «расслоения» мышц у осетровых рыб, в условиях загрязнения моря, вызвано тканевой или точнее гепатотоксической гипоксией.

Теоретическое и практическое значение работы

На основе многолетних мониторинговых исследований физиологического состояния осетровых и анализа литературных данных впервые показан механизм отклика физиологических систем на различный уровень интоксикации рыб в природных условиях, и роли свободнорадикального окисления в появлении функциональных и структурных изменений в мышечной ткани и печени. Приведены доказательства, что в природных условиях реакция рыб на токсическое воздействие загрязнения среды обитания проявляется в подавляющем большинстве комплексом адаптивных реакций, уровень которых зависит от полученной дозы, соотношения прооксидантных и антиоксидантных веществ и степени необходимости обеспечения энергией организма в этих условиях.

Практическая значимость работы заключается в использовании результатов и выводов в практической ихтиологии при долгосрочном и краткосрочном прогнозировании возможных выловов рыб промыслом и аквакультуре при оценке физиологического состояния рыб и устранении оксидативного стресса, например, при использовании некачественных кормов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень перекисного окисления липидов в печени и мышцах осетровых рыб, обитающих в море, (при прочих равных условиях) определяется степенью загрязнения воды.

2. Степень ингибирования активности цитохромоксидазы в печени и мышцах, в условиях загрязнения водной среды, обуславливает уровень перекисных процессов, индуцируемых токсикантами.

3. В основе структурно-функциональных изменений, зафиксированных у осетровых рыб, лежат процессы детоксикации, мобилизации энергоресурсов и удовлетворение возросших энергозатрат, динамика соотношения прооксидантных и антиоксидантных веществ, переход в метаболическую депрессию.

4. Реакция организма осетровых рыб на загрязнение водной среды представляет собой комплекс неспецифических адаптивных реакций.

Апробация работы

Основные результаты по теме диссертации были заслушаны и обсуждены на III (Киев, 1976), VI (Паланга, 1985), VII (Кара-Даг, 1989) Всесоюзных конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб, Первом (Ростов Великий, 1987) и Втором (Ярославль, 1990) симпозиумах по экологической биохимии, 7-ом научном совещании по эволюционной физиологии, посвящённой памяти Л.А. Орбели (Ленинград, 1977), Второй всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С-Петербург, 1991), на II (Russia, Moscow-Kostroma, 1993), III (Italy, Piacennza, 1997), VI (China, Wuhan, Hubei provincce, 2009) Международных симпозиумах по осетровым рыбам, на первом конгрессе ихтиологов России (Астрахань, 1997), на двух симпозиумах «Современная экологическая обстановка Волго-Каспийского бассейна и её влияние на осетровых рыб» (Волгоград, 1989; Дубна, 1990), Всероссийских конференциях Нейроэндокринология-95 (С-Петербург, 1995), Нейроэндокринология-2000 (С-Петербург, 2000), Нейроэндокринология-2010 (С-Петербург, 2010), Всесоюзных совещаниях по осетровым рыбам (Астрахань, 1984, 1989,) Международных конференциях: «Осетровые на рубеже XXI века» (Астрахань, 2000) и «Проблемы изучения, сохранения и восстановления водных биологических ресурсов в XXI веке» (Астрахань, 2007), симпозиуме «Экологические и функциональные основы адаптации гидробионтов», посвященного 100-летию со дня рождения профессора Н.Л. Гербильского (Санкт-Петербург, 2000), Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 76 печатных работ, в том числе 15 статей в рецензируемых научных журналах, отнесенных к перечню ВАК.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, 2-х разделов обзора литературы, характеризующих загрязнение низовьев р. Волги и Каспийского моря как новый фактор современной среды обитания осетровых рыб и влияние отдельных групп токсических веществ на физиологические системы организма рыб; четырех глав, посвящённых: материалам, методологии и методам изучения влияния загрязнений на физиологическое состояние осетровых; описанию и анализу реакции организма осетровых на воздействие антропогенных факторов; влиянию степени загрязненности водной среды на физиологические системы; формированию реакций организма осетровых рыб на загрязнение их среды обитания; заключения и выводов. Работа изложена на 418 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками, содержит 44 таблицы. В работе использовано 595 источника, из них 450 отечественных и 145 зарубежных авторов.

Содержание работы

осетровый рыба антропогенный

1. Обзор литературы

1.1. Загрязнение низовьев р. Волги и Каспийского моря как новый фактор современной среды обитания осетровых

В данном разделе изложены материалы исследований отечественных учёных и их коллег из прикаспийских государств по уровню загрязнения Каспия и рек, впадающих в него. Из анализа этих материалов следует, что загрязнение представляло в это время устойчивый негативный фактор.

1.2. Влияние токсикантов на физиологические системы рыб

В разделе представлен анализ исследований отечественных и зарубежных авторов по влиянию отдельных видов токсических веществ (тяжёлые металлы, нефть, пестициды и т.д.) на физиолого-биохимические показатели рыб. Из чего следует, что реакции организма на них неспецифичны и отражают изменения в печени, почках и жабрах. Клинически острое отравление проявляется в форме судорог, потери равновесия, конвульсиях, и т.д., и заканчивается смертельным исходом большинства рыб. Конечным результатом хронического воздействия на рыб токсикантов является истощение, заканчивающееся нарушениями репродуктивной функции.

2. Материалы, методология и методы исследования

В работе обобщены многолетние данные (1980-2003 гг.) изучения физиологического состояния русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii Br.), севрюги (Acipenser stellatus Pall.) и белуги (Huso huso L.) в естественной среде обитания, с привлечением данных ранних исследований и литературных источников. Рыбы, выловленные в море, находились на II СЗГ, т.е. в физиологически спокойном состоянии, в реке - на III или IV СЗГ, на этапе их активного созревания. Отлов осетровых в море производили тралом в течение 30 минут. В реке - отбирались из неводных уловов на экспериментальных тонях «Чкаловская» и «Мужичья», расположенные соответственно в 120 км ниже и 80 км выше г. Астрахани и в нижнем бьефе Волгоградской ГЭС. В общей сложности на разные виды биохимических, гематологических и гистологических анализов использовано 5592 рыбы, из которых 2545 особей русского осетра (1083 экз. - море, 1462 экз. - река), 2156 севрюги (610 экз. - море, 1546 экз. - река) и 891 белуга (531 экз. - море, 360 экз. - река). Изучение реакции организма осетровых на загрязнение, проводили на основе методологического подхода, разработанного автором, в котором изначально были заложены иные задачи, чем ставились ранее (Шульман 1972; Шатуновский 1980; Лукьяненко, 1971), а также были положены в основу биохимического интегрального индекса (БИИ), упрощающего интерпретацию биохимических данных при определении ПДК для рыб (Немова, Высоцкая, 2004). Это изучение реакций различных функциональных систем рыб. При этом такая индикаторная система должна была удовлетворять таким условиям: мгновенно реагировать на антропогенный фактор, т.е. чувствительность и реактивность одних показателей, чтобы уловить первичную реакцию организма на него; отражать последствия этих воздействий на организм (полуконсерватизм других); выражать весь спектр временного (длительность и частоту) воздействия негативных факторов внешней среды и его силы, т.е. коммулятивный эффект третьих.

Исходя из выше перечисленных постулатов, подобран небольшой комплекс показателей, характеризующих работу наиболее важных для рыб физиологических систем, таких как дыхательная, энергетическая, регуляторно-гомеостатическая, защитная и репродуктивная.

О состоянии дыхательной функции судили, по морфофункциональному состоянию жабр, содержанию в крови эритроцитов и гемоглобина и дополнительно - по соответствию сформированности фракционного состава гемоглобина этапам онтогенеза. Заключительные компоненты дыхательной системы представляют клеточное дыхание, тесно связанное с получением энергии, т.е. энергетической функцией организма. В качестве индикаторов состояния этой системы у осетровых рыб, исследовались ключевые ферменты аэробного - цитохромоксидаза и анаэробного - лактатдегидрогеназа, обменов.

В условиях действия возмущающих факторов среды не обойтись без исследований регуляторно-гомеостатической функции. Из большого комплекса регулирующих механизмов, поддерживающих гомеостаз, мы ограничились исследованием показателей метаболизма, изучая в крови концентрации белка, в-липопротеидов, холестерина, общих липидов и в ряде случаев фосфолипидов, а также содержание в печени гликогена. Дополнительно исследовали содержание в мышцах водорастворимого белка и его фракционный состав. Также в рамках этой системы изучался уровень перекисного окисления липидов, который в нормальных условиях представляет собой обычный метаболический процесс, протекающий практически во всех тканях организма.

В системе механизмов поддерживающих гомеостаз особую роль играет защитная функция. Она многоступенчата и иерархически сложна. Поэтому мы ограничились исследованием лишь двух интегральных показателей, характеризующих состояние иммунитета и антиоксидантной защиты - общей антиоксидантной активности, и уровню вторичного иммунодефицита (индекса ингибирования антител). Дополнительно изучались факторы клеточного иммунитета: количественный состав лейкоцитов и соотношение их форм.

Кроме того, исследовалось морфофункциональное состояние половых желёз, печени и мышц.

Как базис относительно «нормального» состояния организма осетровых рыб взяты данные по физиолого-биохимическому интерьеру исследуемых видов, полученные в 60-70-х гг. при относительно благополучной среде.

Физиолого-биохимические методы исследования сыворотки крови

В сыворотке крови исследовали содержание общего белка, общих липидов, в-липопротеидов, холестерина, фосфолипидов. Величину общего белка определяли рефрактометрически (Филиппович и др., 1982); общие липиды - колориметрическим методом (Zollner N., Kirsch K., 1962); в-липопротеиды - по Бурштейну и Самай (Тодоров, 1963); общий холестерин - прямым методом по Ильку (Меньшиков, 1987), фосфолипиды - по Колбу и Камышникову (1976).

Гематологические методы исследования крови

В крови определяли содержание общего гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов, а также лейкоцитарную формулу. Подсчет форменных элементов крови проводился в счетной камере Горяева. Дифференцировка форменных элементов осуществлялась по Н.Т. Ивановой (1983). Индекс сдвига лейкоцитов (ИСЛ) - по методу Н.И. Яблучанского (1983) в модификации А.Д. Сухопаровой (1986). Содержание в крови гемоглобина (Hb) изучали унифицированным цианметгемоглобиновым фотометрическим методом (Кушаковский, 1968).

Физиолого-биохимические методы исследования тканей

В печени и мышцах определяли активность цитохромоксидазы и лактатдегидрогеназы, скорость аскорбатзависимого и спонтанного перекисного окисления липидов, содержание малонового диальдегида, а также общую антиоксидантную активность. Кроме того, в печени - содержание гликогена, в мышцах - водорастворимого белка. Гомогенаты тканей, готовили по стандартной методике в гомогенизаторе Поттера. Активность ЦО определяли по Гумидову и Сорокиной (1967), ЛДГ - по скорости окисления лактата в пируват (Методы биологии развития…, 1974), скорости ПОЛ по реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (Строев, Макарова, 1986), уровень АОА - по величине торможения переокисления липидов в модельной системе по методу Клебанова и др. (1988). Для определения гликогена в тканях его осаждали и очищали по Бренду (Brandt, 1966), анализ заканчивали реакцией с антроновым реактивом (Seift et al., 1950). Содержание водорастворимого белка, в экстракте ткани, спектрофотометрически по методу Варбурга и Христиана (Методы биологии развития…, 1974). Мышечные белки и гемоглобин разделяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (Маурер, 1971).

Иммунологические методы

Для оценки состояния иммунной системы рыб использован метод определения уровня вторичного иммунодефицита у животных, предложенный А.М. Земсковым и Н.В. Журавлевой (1977) и усовершенствованный А.А. Шепелевым и А.В. Колодиной (1989) и модифицированный нами применительно к рыбам (Переварюха, 2005).

Гистологические методы исследования жабр, печени, мышц и ооцитов

Для исследования морфофункционального состояния мышц, печени, жабр и ооцитов использовались классические гистологические методы световой микроскопии (Ромейс, 1953; Меркулов, 1969). Отклонения от нормы гонадо- и гаметогенеза оценивали по Т.И. Фалеевой (1965), Н.Н. Шевелевой и А.А. Романову (1989). Состояние жаберного эпителия - по пятибалльной шкале, в основе которой шкала Л.А. Лесникова и И.Д. Чинаревой (1987).

Статистическая обработка

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере с применением стандартных статистических методов: t-критерия Стъюдента, кластерного анализа, вычислением регрессионных уравнений, с помощью пакетов программ Microsoft Excel, Stadia, Statistica 6.

3. Реакции организма осетровых на воздействие антропогенных факторов в р. Волге и Каспийском море

Первые признаки влияния антропогенныой нагрузки на осетровых рыб появились сразу же после зарегулирования р. Волги плотинами ГЭС, в форме массовой резорбции ооцитов не завершивших трофоплазматический рост, из-за отсутствия условий для икрометания (Баранникова, 1967, 1975; Песериди, 1966). Провоцировало этот процесс и изменение условий зимовки и гидротермического режима (Трусов, 1963; Алтуфьев и др., 1980; Лукьяненко и др., 1990). Во всех случаях нарушения функции половых желез возникали в условиях действия неблагоприятных факторов.

Схожей оказалась и первоначальная реакция осетровых рыб в начале 80-х годов, на загрязнение Каспия и рек в него впадающих. У 20% самок севрюги и русского осетра уже в начале нерестового пути в реке были выявлены нарушения функции половых желез (Алтуфьев и др., 1984). Патологические изменения в половых клетках на II СЗГ отмечались и у рыб, нагуливающихся в море, а у самок русского осетра - задержка развития половых желёз (Романов и др., 1990,2001). У белуги - снижение темпов формирования фракционного состава гемоглобина, из-за тормозящего эффекта развития биохимических систем, возникающего в неблагоприятных условиях (Гераскин, 1972). У самок русского осетра и севрюги, мигрирующих на нерест, были обнаружены функциональные нарушения (Geraskin, 1995; Гераскин и др., 2001). У осетра - снижение содержания в печени гликогена в 1,8 раза (р<0,001), в крови холестерина в 1,5 раза (р<0,001). У севрюги они были более выраженными и проявлялись в начале нерестового пути наличием признаков физиологического истощения: низким содержанием в крови в-липопротеидов (1,58±0,29 г/л) и белка (19,0±2,0 г/л), а также нарушениями вителлогенеза (Гераскин и др., 1984). Икра у таких самок, хотя и овулировала, но не оплодотворялась, либо давала не жизнеспособных личинок. У севрюг, нагуливающихся в море, отмечалось увеличение, в сравнении с 60-70 гг., в крови содержания общих липидов у самцов в 1,2, у самок в 1,4 раза (р<0,001), а также холестерина на 18% (р<0,05).

Наиболее сильное влияние загрязнения моря сказалось на осетровых в конце 80-х годов, когда у части рыб появился феномен «расслоения» мышц и ослабления оболочек икры, которые явились результатом токсикоза (Лукьяненко, 1990) и, в частности, тканевой или точнее гепатотоксической гипоксии (Гераскин, 1989). Пик наибольших изменений функционального характера и разнообразия и глубины нарушений в морфофункциональном состоянии тканей мышц, печени и гонад пришёлся на 1987-1989 гг. У русского осетра эти изменения показаны в таблице 1. Вначале (1987 г.) трансформировались показатели, которые свидетельствовали об экстренном увеличении потребления энергии, как за счет аэробной, так и анаэробной составляющих, с увеличением потребления кислорода. Дальнейшие изменения (1988-1989 гг.) связаны с углублением трансформации обмена веществ и нарушением минерального обмена. Увеличение в крови русского осетра на 20-25% (1988 г.) содержания натрия (p<0,05) с последующим его снижением (8,5-9,4%), и подъём уровня кальция в 1,5-2,2 раза от величин 70-х годов (Наточин и др., 1975, 1995). В это же период отмечаются существенные изменения в морфологическом составе крови (табл. 2). При этом отмечалась нестабильность функционирования интерреналовой железы: вначале повышение активности, с интенсивным синтезом кортизола (12,15±1,8 нг/мл), затем - напряжение и истощение, при снижении поступления в кровь кортизола до 2,3±0,7 нг/мл (Баранникова и др., 1989, 1990; Баранникова, 1992). В это время уменьшается секреция в кровь половых стероидных гормонов примерно в 3 раза (1989 г.). Выявленное снижение биохимических и гематологических параметров крови в дальнейшем (1990 г.) сменилось тенденцией к нормализации, однако в отношении интерреналовой железы и кортизола такого не отмечалось.

Таблица 1. Характеристика физиолого-биохимических показателей крови русского осетра (+> I-II, II) в морской период жизни (лето)

* Норма: Шелухин, 1974; Субботкин, 1979; Лукьяненко, Гераскин, 1966; Сухопарова, Сухенко, 1986. Жирным шрифтом выделены статистически значимые отклонения от относительной нормы.

Таблица 2. Лейкоцитарная формула крови русского осетра (%)

Примечание: Миелобл. - миелобласты, пат. - патологические, Эоз - эозинофилы, Лимф. - лимфоциты, ИСЛ - индекс сдвига лейкоцитов. * Норма: Сухопарова, Сухенко, 1986

Сходные изменения были зарегистрированы и у других видов осетровых - севрюги и белуги, но с присущими для этих видов особенностями.

Изменения в физиологическом состоянии осетровых в море отразились и на производителях, мигрирующих на нерест. Они проявились в усилении имевшихся изменений в биохимических показателях и появлением новых, ранее не встречавшихся. Практически все исследуемые показатели претерпели изменения в ту или иную сторону, в сравнении с 60-70-ми годами прошлого века, что можно видеть на примере самок русского осетра (рис. 1).

Рис. 1. Межгодовая изменчивость физиолого-биохимических показателей у самок русского осетра

Также как и в море, у русского осетра, выловленного в дельте и под плотиной Волгоградской ГЭС, обнаружены аналогичные изменения в ионном составе крови: увеличение содержания кальция более чем в два раза у рыб, выловленных в дельте и в 1,6 раза под плотиной Волгоградской ГЭС (Кузьмина и др., 1992). Изменения в обмене веществ и минерального обмена сопровождались существенными колебаниями концентраций в крови кортикостероидных гормонов (Баранникова и др., 1989, 1990; Баранникова, 1992). Наиболее высокие концентрации в крови кортизола отмечались в весенние месяцы 1988 г., как у самок (48-40 нг/мл), так и у самцов (78-57 нг/мл) со снижением к июню до 16 нм/мл у тех и других. В дальнейшем имеет место относительная стабилизация его уровня с колебаниями в пределах 15-29 нг/мл. Примерно такая же динамика зафиксирована и в отношении половых гормонов прогестерона и тестостерона у самок и самцов. Похожая динамика отмечена и у эстрадиола. Негативным образом отразилось загрязнение среды обитания и на гематологических показателях производителей русского осетра, мигрирующего на нерест. Характер и направленность зафиксированных изменений (p<0,01) были схожими с таковыми в морской период жизни этих рыб с некоторым усилением. Наиболее рельефно они смотрелись у ослабленных производителей, подошедших к плотине Волгоградской ГЭС: СОЭ возрастало в 2 раза, при снижении в крови количества эритроцитов на 30%, в 1,6 раза лейкоцитов и 1,4 содержания гемоглобина, с трансформацией лейкоцитарной формулы. При этом индекс сдвига лейкоцитов возрастал в 4,6-5 раз от величин отмечаемых ранее. У самцов изменения гематологических параметров крови практически не отличались от самок. Не остаются неизменными в этих условиях и функциональные свойства гемоглобина: сродство гемоглобина к кислороду увеличивается в 1,3, а величина эффекта Бора 3,3 раза (Камшилов, 1990). В красной крови, наряду с увеличением гемолиза эритроцитов, наблюдается усиление кроветворения. Пониженная устойчивость эритроцитов к гемолизу, подтверждается и данными по осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) крови русского осетра (Васильев, 1990). Она в 1988 и 1989 гг. была в 1,7-1,6 раза меньше, чем в 60-х годах.

У севрюги и белуги развитие реакции на загрязнение водной среды принципиально не отличалось от таковой осетра, хотя имели свои особенности.

Трансформации в обмене веществ, гормональном статусе и в целом в физиологическом состоянии повлияли на состояние половых желез осетровых рыб, в которых, выявленные в конце 80-х годов изменения, были настолько существенны, что привели к нарушению половой функции (Гераскин и др., 2001). Это не только большое разнообразие выявляемых патологий с появлением качественно новых форм, но и достаточно высокая частота встречаемости таких рыб. В море у рыб II СЗГ были обнаружены: гермафродитизм, интерсексуальность, опухоли, кисты и другие новообразования, отмечались сильные воспалительные процессы. В половых клетках изменения выявлялись, начиная с ооцитов протоплазматического роста. При переходе к вителлогенезу (II-III СЗГ) возрастает как частота встречаемости рыб с патологиями гамето- и гонадогенеза, так их разнообразие и степень.

Кроме того, морфофункциональные нарушения встречались в печени, почках, селезенке, сердце, скелетных мышцах. Наиболее значительными они были в неблагоприятные, с экологических позиций, годы (1988-1989). В печени отмечено повышенное содержание липидов и липофусцина, белковая и жировая дистрофия, нарушения пигментного обмена, сосудистые патологии, хроническая воспалительная инфильтрация паренхимы, некробиоз гепатоцитов, цирротические явления. А в структуре её ткани обнаружены включения: мышц, половых желёз и ооцитов, селезёнки и даже участки с разными типами (до 4) тканей. В почках имело место явление белковой дистрофии и хронического межуточного нефрита, в селезенке - в основном сосудистые нарушения. В сердце нарушения проявлялись изменениями в волокнах и гиперемией кровеносных сосудов, имелись также очаги некроза (Евгеньева, 2000). Наиболее явный характер носили изменения в поперечнополосатой мышечной ткани (ППТМ). Выявлялись участки с нормальным строением ППТМ, слабо, умеренно и сильно выраженными изменениями этой ткани. На последних этапах развития этого процесса зафиксировано также снижение активности АТФ-азы вплоть до полного исчезновения. При далеко зашедшем патологическом процессе в ультраструктуре мышц наблюдалось снижение количества рибосом, исчезновение структуры аппарата Гольджи, полная деструкция митохондрий, фрагментация и набухание саркоплазматического ретикулума, изменение формы ядра (Басурманова, 1994). Конечной стадией разрушения мышечного волокна был полный лизис миофибрилл внутри волокна и разрушение сарколеммы. Впоследствии некротизированная мышечная ткань замещалась жировой или соединительной.

Морфологические изменения в мышцах сопровождались трансформацией их белкового состава проявлявшегося снижением количества выявляемых компонентов и изменением соотношения белковых фракций с большой, средней и низкой молекулярной массой (табл. 3). Наиболее существенные изменения зафиксированы в белковом спектре мышц, имеющих высокую степень морфологических нарушений (Гераскин и др., 1990). По мере углубления мышечной патологии у осетра наблюдается нарастание белкового дефицита, снижение в крови холестерина, с тенденцией понижения у рыб старше 11 лет кортизола, при резко выраженной гиперкальцемии (Кузьмина и др., 1992; Наточин и др., 1995). У рыб с высокой степенью патологии мышц, выявлено также уменьшение (p<0,05) активности ЦО в печени более чем вдвое и увеличение в мышечной ткани в 2,6 раза, при почти неизменном уровне активности ЛДГ и СДГ. Активность ЛДГ в крови (67±11 мкмоль/мин·л) у таких рыб была в два раза выше, чем у особей с нормальными мышцами (35±5 мкмоль/мин·л). На уровне тенденции (на 20%) отмечено снижение активности АОА в печени, у рыб с нарушениями морфологической структуры мышц, что является результатом высокой интенсивности ПОЛ.

Таблица 3. Фракционный состав водорастворимых белков белых мышц русского осетра (морской период жизни) с разной степенью морфологических нарушений

Примечание: в числителе количество компонентов, в скобках их размах колебаний, в знаменателе относительное содержание фракции в общем содержании белков мышц

У севрюги чёткой связи между биохимическими показателями рыб и глубиной морфологических изменений в мышцах не прослеживалось, за исключением активности ЦО и АОА в печени. Причины таких различий кроятся в видовой специфике развития по времени и степени выраженности реакций организма севрюги в ответ на действие возмущающих факторов среды.

У белуги просматривалось некоторое углубление функциональных сдвигов у особей с дегенеративными изменениями мышечной ткани, как на уровне тенденций, так и подтверждаемые статистически.

Такое развитие реакции организма осетровых рыб на токсическое воздействие окружающей среды можно оценить как острый токсикоз - результат существенного повышения содержания в воде Северного Каспия нефтепродуктов, пестицидов и фенолов (Попова и др., 1992; Мумжу и др., 1989; Ежегодник … за 1990 г.). При его снижении в 1990 г., наблюдается уменьшение уровня функциональных и гистоморфологических изменений.

4. Влияние различных уровней загрязнения Каспийского моря на физиологические системы осетровых рыб

Введение в комплекс показателей, характеризующих физиологическое состояние осетровых, изучение процессов ПОЛ, выявило их значительную изменчивость, которая проявляла определённую зависимость от содержания в морской воде нефтепродуктов, что видно на примере русского осетра (рис. 2).

ХОП мкг/л Х 10 Zn, Cu, Pb - левая; Сd, Mn -правая шкала

Рис. 2. Межгодовая динамика интенсивности АсПОЛ и СпПОЛ, содержания МДА в печени и мышцах русского осетра и загрязнения моря (по данным лаборатории водных проблем и токсикологии КаспНИРХ) органическими поллютантами и некоторыми металлами

Другая закономерность, связана с сезонными колебаниями содержания в воде нефтяных углеводородов - преимущественным снижением их содержания от летнего максимума к осени (Глумов, 2001), которая отражалась и на сезонной динамике ПОЛ (табл. 4). Интенсификация ПОЛ в печени и мышцах летом зафиксирована у всех исследованных видов осетровых. Она обусловлена выносом токсических веществ паводковыми водами в море и увеличением температуры воды. Считается (Глумов, 2001), что основной объём (около 90%) загрязняющих веществ в Северный Каспий поступает с речным стоком, при сохранении примерного соотношения загрязняющих веществ.

Таблица 4. Параметры перекисного окисления липидов (М±m) мышц и печени русского осетра в разные сезоны года за исследуемый период (1993-2003 гг.)

Зависимость параметров ПОЛ русского осетра от уровня общего загрязнения вод Северного Каспия демонстрирует и регрессионный анализ. Коэффициент множественной корреляции в этом случае очень высок: от 0,84 до 1,00. Однако достоверными являются лишь регрессионные линейные уравнения зависимости скорости СпПОЛ (У₁) в мышечной ткани и накопление в ней МДА (У₂) от концентраций в воде исследованных токсикантов: У₁ = - 0,20Х₁ + 1,37Х₂ + 0,416Х₃ - 0,35Х₄ + 0,44Х₅ - 0,88Х₆ + 0,21Х₇ + 1,05Х₈ + 0,249Х₉ - 31,59; У₂ = - 0,29Х₁ + 1,49Х₂ + 044Х₃ - 0,31Х₄ + 0,088Х₅ - 0,98Х₆ + 0,26Х₇ + 1,07Х₈ + 0,28Х₉ -7,64 соответственно, где Х₁ - нефтеуглеводороды; Х₂ - фенолы; Х₃ - СПАВ; Х₄ - ХОП; Х₅ - Zn; Х₆ - Cu; Х₇ - Pb; Х₈ - Cd; Х₉ - Mn. В этом случае коэффициент множественной корреляции достигает 1,00, показывая прямую линейную зависимость этих параметров ПОЛ от уровня общего загрязнения водной среды. Более детальный анализ выявил достоверную корреляционную связь ПОЛ с содержанием в воде нефтеуглеводородов, фенолов, а также меди и кадмия при высоких коэффициентах корреляции: от 0,61 до 0,84. В случае множественной регрессии, коэффициент корреляции уровня ПОЛ с этим поллютантам достигает 0,84. Из этого следует, что основу негативного влияния загрязнений на русского осетра составляют нефтеуглеводороды, фенолы и кадмий, а также, в некоторой степени, медь.

Анализ в этом отношении параметров ПОЛ двух других видов осетровых дал результаты, свидетельствующие о видовых особенностях реакции этих рыб на загрязнение среды обитания. Однако и в этом случае во всех вариантах регрессионного анализа, достоверно отражающих влияние компонентного состава загрязнения, на первом месте присутствуют нефтеуглеводороды и лишь как дополнение к ним тяжелые металлы и один или два вещества органического происхождения. То есть уровень ПОЛ у осетровых рыб обуславливают не отдельные поллютанты, а их комплекс, индуцируя состояние окислительного стресса. Во всех вариантах множественной регрессии ведущим элементом модели являются нефтеуглеводороды, затем фенолы, а потом тяжёлые металлы. Видовые особенности выражаются в проявлениях связи между параметрами ПОЛ и отдельными видами токсикантов или их сочетанием. Среди тяжёлых металлов выделяется кадмий, который, видимо, в сочетании с нефтеуглеводородами и фенолами увеличивает токсичность последних.

Реагирует на изменения загрязнения морских вод и энергетическая система осетровых. Её ответ проявляется изменениями активностей ключевых ферментов аэробного и анаэробного пути получения энергии в печени и мышцах - цитохромоксидазы (ЦО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Из-за того, что активность этих ферментов определялась летом, то и уровень загрязнения в сравнительном анализе использовался за это время года. А он, как показано выше, зависит от объёма паводка. При больших паводках активность ЦО в печени снижалась, низких - увеличивалась (рис. 3). Другим доказательством влияния поллютантов на активность ЦО в печени является её уменьшение у особей осетра, выловленных в районах прямого действия волжского стока, более чем вдвое (р<0,05), в сравнении с рыбами, из других участков моря. Кроме того, изменяется также соотношение активностей ЦО в печени и мышцах (рис. 3). Если оно меньше единицы, то можно говорить о нарушении в распределении функциональных приоритетов ферментных систем, регулирующих аэробные и анаэробные процессы в энергетическом обмене печени и белых мышцах. Печени свойственна высокая активность ферментов аэробного обмена, а белым мышцам - анаэробного гликолиза (Щепкин, Эмеретли, 1985; Эмеретли, 1985; Иванов, 2003). При этом прослеживается видовая специфичность ответной реакции этого фермента в печени и мышцах на уровень загрязнений, вносимых паводковыми водами в Северный Каспий. У русского осетра она более замедлена, в сравнении с севрюгой и белугой.

Рис. 3. Межгодовая динамика активности ЦО в печени (а) и соотношение (б) её активностей в печени и мышцах у русского осетра в летний период при различных объёмах паводка

Переходя к анализу динамик активности ЛДГ в печени и мышцах у осетровых рыб, необходимо отметить определённую их противофазность по отношению к динамике величины паводка (рис. 4) с проявлением видовой специфичности. У русского осетра такая закономерность проявлялась в большей степени в активности ЛДГ печени, но лишь до 2000 г., после которого характер динамики изменился. Однако, несмотря на видовые особенности, у всех исследованных видов осетровых выявляются общие закономерности. Успешное функционирование энергетической системы, зависит также и от работы дыхательной системы. Органом извлечения кислорода из водной среды у взрослых рыб являются жабры. Они чутко реагирует на присутствие в воде токсикантов. Гистологические исследования состояния жаберного эпителия у осетровых рыб, выловленных в море, выявили наличие различных форм нарушений, затрагивающих все отделы жаберного эпителия, независимо от пола, стадии зрелости и видовой принадлежности. При существенном увеличении как в 1996 г., содержания в морских водах меди, свинца и марганца, а также углеводородов, резко, до 51% выросла встречаемость рыб с тяжёлыми изменениями в жабрах при примерно 30% встречаемости в другие годы. Сильно повреждают жабры ионы цинка, который обладает синергическим действием в смеси с медью (Метелёв и др., 1971). Увеличение концентраций цинка и меди к 1999 г. также сказалось на состоянии жаберного эпителия - у 40% рыб изменения носили существенный характер. Кроме того, респираторный эпителий большинства рыб был разрыхлён, отмечалось его набухание и гиперплазия. В то время как до 1998 г., осетровым в море было характерно лишь разрастание эпителия филамента.

Рис. 4. Межгодовая динамика активности ЛДГ печени и мышц русского осетра в летний период при различных объёмах паводка

Таким образом, ведущим фактором в повреждении жабр выступает медь, токсичность которой может усиливаться цинком (синергический эффект), а так же совместным действием других металлов.

Другой компонент дыхательной системы рыб - гемоглобин, реагирует на загрязнение среды увеличением или снижением своего содержания в крови. У русского осетра оно синхронно следует за уровнем основных загрязнителей морских вод. У севрюги - в основном проявляется обратная зависимость. Такие различия связаны с разной стратегией адаптации организма осетра и севрюги и их этапностью к действию поллютантов. У осетра - повышением потребностей в окислительных процессах, у севрюги их торможением, наступающим в поздних фазах токсикоза. У белуги, картина реагирования гемоглобиновой системы схожа с таковой у севрюги, но с заметной инерционностью процессов.

Отклик регуляторно-гомеостатической функции на воздействие поллютантов рассматривался в свете изменений метаболизма, как регуляторно-компенсационных реакций. На воздействие чрезвычайных раздражителей, одним из первых реагирует углеводный обмен, который может быстро удовлетворить повышенные на этот момент потребности печени в энергии, что предусматривает расход гликогена. В иных случаях, когда гликоген не расходуется, как в 1991-1992 и 2000-2003 гг., организм рыб переходит на другую стратегию адаптации к действующим чрезвычайным факторам среды, используя в качестве энергетического субстрата другие вещества.

В качестве активного участника адаптационных процессов рассматривался также холестерин - основа стероидных гормонов, являющихся регуляторами обмена веществ в клетках. Содержание в крови холестерина реагирует на межгодовые изменения уровня поллютантов разнонаправленными по отношению к ним колебаниями, что наиболее выражено у русского осетра и севрюги. У белуги увеличение загрязнения каспийских вод не влекло за собой существенного снижения в крови холестерина, а сама динамика в гораздо большей степени, чем у осетра и севрюги, имела синхронность в отношении колебаний уровня загрязнения.

Бета-липопротеиды, представляющие собой транспортную форму липидов, переносят преимущественно холестерин и фосфолипиды. Севрюга, как наиболее реактивный вид, реагирует на повышенную загрязнённость вначале постепенным повышением содержания в-липопротеидов в крови, а затем резким снижением с поддержанием этого небольшого уровня в последующие годы. Те же процессы имеют место и у осетра, но без срывов на более низкий уровень. Белуга занимает промежуточное положение с чётко обозначенной реакцией изменения в-липопротеидов на динамику загрязнённости морских вод нефтеуглеводородами и фенолами.

Реакция белкового обмена осетровых на изменения уровня загрязнений в водной среде рассматривалась исходя из трёх показателей: содержания общего белка в крови, водорастворимого белка мышц и коэффициента, характеризующего уровень повреждения мышечных волокон, рассчитываемого как соотношение активностей ЛДГ в сыворотке крови и мышцах. Она представляет собой достаточно сложные взаимоотношения между деградацией мышечных волокон, белками мышц и крови и метаболической активностью печени. Прямой связи между межгодовыми изменениями уровня загрязнённости морских вод и содержанием в крови белков у русского осетра не прослеживается (рис. 5). Однако существенное повышение суммарного НУ+фенолы загрязнения как 1992 и 1998 гг. (10-12 ПДК) влечёт за собой снижение содержания белков в крови, как и длительный по времени (1994-1996 гг.) повышенный (6-8 ПДК) их уровень. При этом просматривается сопряжённость между уровнем водорастворимых белков мышц и содержанием в крови белков: увеличение первых сопровождается повышением вторых, при росте коэффициент лизиса, свидетельствующего об усилении разрушения мышечных волокон. По-другому реагирует белковая система рыб во второй половине периода исследований. У севрюги реакция на увеличение уровня загрязнённости морской воды нефтеуглеводородами и фенолами проявляется уменьшением содержания белка в крови, при не чётко выраженной реакции водорастворимых белков и коэффициента лизиса мышечных волокон. У белуги просматривается тенденция повышения содержания белков в крови при увеличении загрязнённости морских вод этими поллютантами и сопряжённости межгодовых изменений коэффициента лизиса мышечных волокон и водорастворимого белка в пределах всего исследованного периода. Такая неоднозначность отклика белкового обмена на изменения воздействий на организм основных загрязняющих веществ диктуется различиями стратегий адаптационных возможностей исследуемых видов рыб и связана с особенностями этих воздействий (длительность, интенсивность) как в предшествующие годы, так и в анализируемый период.

Рис. 5. Межгодовая динамика содержания в крови русского осетра общего сывороточного белка (ОСБ), водорастворимого белка мышц и коэффициента лизиса мышечных волокон

Из систем организма рыб, осуществляющих защитные функции, исследовались две: антиоксидантная и иммунная. У всех исследованных видов осетровых рыб АОА в общих чертах соответствовала межгодовым колебаниям интенсивности ПОЛ в мышцах и печени и динамике уровня загрязнения морских вод. Однако в ряде случаев имело место несовпадение подъёма АОА и увеличения ПОЛ в этих тканях. В целом отмечается некоторое угнетение АОА при интенсивном и длительном воздействии на организм рыб поллютантов.

Другая система, выполняющая защитные функции, представлена иммунитетом. Исследование ЕИФ, характеризующего состояние иммунного статуса выявило у осетровых рыб наличие вторичного иммунодефицита: наибольший - у севрюги, наименьший - у белуги. Русский осётр занимал в этом отношении промежуточное положение. Несмотря на некоторые различия, у всех видов он оценивался как умеренный.

Таким образом, функционирование рассмотренных физиологических систем трансформируется в зависимости от силы и длительности воздействия и участия их в адаптационно-компенсационных процессах.

5. Формирование реакций организма осетровых рыб на загрязнение их среды обитания

В природной среде трудно зафиксировать не только начальные стадии интоксикационного процесса, но и его развитие. Однако, наряду с тщательным анализом данных, применение математических методов дает такую возможность. Детальный анализ исследованных показателей у осетровых рыб позволил выявить четыре периода, имеющих свои особенности отклика организма на загрязнение водной среды (табл. 5). Хотя, в целом, они

Таблица 5. Периоды в исследовании осетровых рыб, различающиеся ответными реакциями на воздействие загрязнений вод Каспийского моря

укладывались в концепцию общих неспецифических адаптационных реакций организма (НАРО) животных (Гаркави и др., 1990). Кроме того, с помощью кластерного анализа у русского осетра были выявлены 12 групп рыб, отражающих последовательность реакции организма на разные уровни и длительность воздействия поллютантов, среди которых особи, не испытывающие воздействие загрязнения. У них низкие величины параметров ПОЛ, на фоне высокой АОА, сдерживающий этот процесс в рамках физиологической целесообразности. Активности ЦО и ЛДГ сбалансированы и соответствовали особенностям функционирования энергетической системы печени и мышц, при достаточно высокой их активности. Ответ на невысокий уровень раздражающего фактора соответствовал различным фазам реакции спокойной (первичной) активации по классификации НАРО: рост антиоксидантной активности в печени и мышцах, усиление использования гликогена печени на энергетические нужды, при главенствующей роли аэробного обмена. Такие изменения у рыб можно расценивать как небольшая стимуляция обменных процессов, переходящая затем, в более выраженные изменения. Более высокий их уровень вызывал по классификации НАРО - реакции повышенной активации, проявившейся мобилизацией всех ресурсов организма (повышение Хл, Hb, ЦО, ЛДГ, снижение Гл печени, ОБ крови и ВРБ мышц). На увеличение длительности такой силы воздействия организм реагирует небольшим повышением АОА, большим снижением энергетического обмена в печени, в сравнении с мышцами, с уменьшением поступления кислорода и интенсивном использовании гликогена печени. Ответ физиологических систем осетра на дальнейший рост загрязнения моря проявляется как стресс-реакция, которая развивается в том же направлении, как и при меньших уровнях загрязнения. Стратегия организма в этот момент направлена на получение энергии любым путём, в короткие сроки из всех возможных источников: углеводов, белков, липидов и представляет собой реакцию тревоги, переходящая в стадию резистентности, а затем, в классическом представлении, истощения. Однако в природных условиях организм осетровых переключался на минимизацию метаболизма, о чём свидетельствует обеспечение энергией в основном анаэробным путём. При этом отмечается восстановление уровня гликогена в печени и высокий уровень ВРБ в мышцах, что в совокупности с тенденцией к нормализации показателей крови, дает основание говорить не об истощении, а о переходе в гипометаболическое состояние. У рыб, испытывающих сильный и сверхсильный стресс, очень высокие показатели ПОЛ, при низкой АОА, с мобилизацией срочного получения из всех источников и разными путями энергии, которая в большей степени генерировалась в мышцах, а не в печени. Описанные выше основные адаптивные реакции организма осетровых, нашли свое отражение в схеме (рис. 6), которая представляет предполагаемый механизм первой фазы НАРО на загрязнение водной среды - процесс срочного получения энергии, при балансе ПОЛ и АОА.