Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей

Специальность 06.01.05 - селекция и семеноводство

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора сельскохозяйственных наук

Расторгуев Сергей Леонидович

Мичуринск - Наукоград РФ 2008

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийской научно-исследовательский институт генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина» Россельхозакадемии и ФГОУ ВПО «Мичуринский государственный аграрный университет»

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН Савельев Николай Иванович

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Деменко Василий Иванович;

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Палфитов Виктор Федорович;

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский НИИ садоводства им. И.В. Мичурина»

Защита диссертации состоит 17 июня 2008 года в 13.30 на заседании диссертационного совета Д.220.041.01 при Мичуринском государственном аграрном университете по адресу: 393760, Тамбовская область, Мичуринск, ул. Интернациональная, 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МичГАУ

Автореферат разослан ______________________2008г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 220.041.01

кандидат сельскохозяйственных наук Соломатин Н.М.

Общая характеристика работы

Актуальность темы Интенсификация садоводства, направленная на увеличение производства высококачественных плодов и ягод, предъявляет высокие требования к сортовому составу. Наблюдаемое в последнее время изменение климата и ухудшение экологической обстановки указывает на необходимость совершенствования сортимента. Важная роль в этом, а, следовательно, в повышении продуктивности и экономической эффективности плодовых насаждений отводится селекционному улучшению сортов. Попытки улучшить сортимент на основе внутривидовой гибридизации не всегда приводят к желаемым результатам.

В этой связи возрастает роль отдаленной гибридизации. Метод отдаленных скрещиваний позволяет объединить в одном организме наследственные факторы разных видов и родов и на базе этого конструировать новые генотипы с хозяйственно-ценными признаками, более полно удовлетворяющие запросы садоводства.

Одним из ограничивающих факторов при использовании отдаленной гибридизации являются несовместимость скрещиваемых компонентов, полная или приближающаяся к таковой стерильность гибридных растений, что обычно наблюдается при инконгруэнтных скрещиваниях. Различная степень бесплодия создает трудности использования аллополиплоидов в селекционном процессе. Выяснение причин стерильности отдаленных гибридов может быть осуществлено посредством цитологических методов.

Цитологическая оценка нарушений при формировании женской генеративной сферы и анализ прогамной фазы оплодотворения, связанных с функцией размножения растений, позволяет выявить степень стерильности конкретных форм и на основании этого более обосновано подойти к использованию их в селекции, а также наметить пути преодоления этого нежелательного явления. Вместе с тем наши знания по изучению этих вопросов у отдаленных гибридов плодовых культур весьма ограничены, что свидетельствует о актуальности проведения исследований в этом направлении для решения прикладных и методических проблем отдаленной гибридизации.

С другой стороны, ускорению селекционного процесса и повышению его эффективности может способствовать применение в селекции плодовых и ягодных культур (сливы, яблони, земляники, малины) высокотехнологических приемов, базирующихся на культивировании в системе in vitro тканей и органов растений. Важнейшими методами клеточной инженерии в получении нового исходного материала являются: эмбриокультура, индукция сомаклональных вариантов, тканевая селекция на устойчивость к стрессорам, клональное микроразмножение и др.

Принимая во внимание несомненную перспективность практического использования клеточных технологий в селекционном процессе, возникает объективная необходимость в разработке новых, более эффективных приемов культивирования и надежного получения растений - регенерантов из эксплантов различного происхождения. Решение этих задач позволит расширить границы применения методов культуры изолированных соматических тканей в создании генетического разнообразия и ценных для селекции исходных форм плодовых и ягодных растений.

Цель и задачи исследований Цель исследований заключалась в разработке методов цитологического анализа и приемов культивирования изолированных тканей и органов в решении проблемы повышения эффективности отдаленной гибридизации и совершенствования селекционного процесса плодовых и ягодных культур.

Задачи исследований:

- определить уровень плоидности гибридного потомства при инконгруэнтных скрещиваниях, как косвенного показателя степени плодовитости; селекционный гибридизация плодовый ягодный

- провести сравнительный анализ развития женской генеративной сферы аллополиплоидов разного уровня плоидности для выяснения возможности использования в селекции;

- исследовать прогамную фазу оплодотворения при интрогрессивной гибридизации аллополиплоидов;

- усовершенствовать метод эмбриокультуры для повышения эффективности селекционного процесса плодовых растений;

- изучить вопросы индукции и культивирования каллусных культур, а также показать анатомические, ультраструктурные и цитогенетические особенности клеток каллуса;

- разработать и усовершенствовать приемы регенерации некоторых плодовых растений из изолированных тканевых культур (каллусов, листовых эксплантов);

- подобрать составы питательных сред и условия культивирования для повышения морфогенетического потенциала культуры ткани;

- провести тиражирование и укоренение растений - регенерантов, полученных в системе in vitro и усовершенствовать отдельные приемы технологии ускоренного размножения некоторых ягодных культур;

- выявить возможность изменчивости регенерантов и разработать методические вопросы тканевой селекции на устойчивость к солевому стрессу у ягодных растений.

Научная новизна исследований. Результаты исследований позволили расширить знания по биологии цветения и размножения отдаленных гибридов рода Prunus Mill. Выявлена степень стерильности женской генеративной сферы в связи с уровнем плоидности отдаленных гибридов сливы. Установлены сроки формирования зародышевых мешков, что дает возможность определить оптимальный период опыления. Проведена классификация основных структурных изменений в строении и развитии женской генеративной сферы разнохромосомных гибридов. Методом люминесцентной микроскопии выявлена степень совместимости конкретных форм при интрогрессивной гибридизации. Показана целесообразность использования метода культуры зародышей для преодоления в разной степени выраженного бесплодия и повышения выхода сеянцев отдаленных гибридов сливы. Предложен оригинальный способ, позволяющий получать от каждого зародыша яблони по несколько идентичных растений. Методом электронной микроскопии проведено детальное изучение особенностей клеток каллуса и установлен тип морфогенеза in vitro (земляника). Выявлена вариабельность кариотипов каллусных клеток на примере малины. Разработаны и усовершенствованы приемы регенерации в культуре каллусных и листовых тканей земляники и малины. Показано, что морфогенный эффект цитокинина более активно реализуется при взаимодействии с конкретными регуляторами роста ауксиновой природы. Выявлена положительная динамика влияния контрастных температур и увеличения осмотического давления среды на регенерацию и ризогенез побегов. Показана эффективность двухэтапного получения побегов путем последовательного изменения условий культивирования эксплантов. Изучено влияние составов питательных сред, исходных концентраций источников азота, продолжительности периода освещения на коэффициент размножения и затемнения среды на формирование корневой системы регенерантов земляники. Установлена изменчивость регенерантов земляники, полученных в каллусной культуре и разработаны методические вопросы, позволяющие провести скрининг каллусных линий малины резистентных к солевому стрессору.

Практическая значимость исследований. Впервые получено 52 сеянца F₂ отдаленных гибридов, обладающих отдельными ценными признаками разных видов рода Prunus Mill, что способствует расширению генофонда сливы для выполнения селекционных программ. Результаты законченных исследований вошли в: «Методические рекомендации по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-селекционной работе с плодовыми» (Мичуринск, 1987), «Методические рекомендации по применению цитологических методов в плодоводстве» (Москва, ВАСХНИЛ, 1988), «Программу и методику селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (Орел, 1995), рекомендации по «Индукции морфогенеза и тканевой селекции плодовых и ягодных культур» (Мичуринск, 1996). Разработан способ (А.С. №1045862), повышающий точность и упрощающий процедуру определения морозоустойчивости растений яблони. Заложена маточная плантация суперэлитным посадочным материалом перспективных сортов земляники на площади 0,1га (учхоз «Роща» МичГАУ). Результаты методических разработок используются при проведении научно-исследовательских работ в институте орошаемого садоводства им. М.Ф. Сидоренко (г. Меритополь), в учебном процессе МичГАУ.

Положения выносимые на защиту:

- цитоэмбриологические особенности отдаленных гибридов разного уровня плоидности и прогамной фазы оплодотворения при интрогрессивной гибридизации;

- способы повышения выхода сеянцев с использованием культуры изолированных зародышей;

- приемы регенерации растений в системе in vitro (культура изолированных апексов, каллусов, листовых эксплантов);

- изменчивость регенерантов в культуре каллусов и листовых дисков и тканевая селекция на устойчивость к засолению;

- модель использования методов культуры тканей и органов для целей селекции.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы апробированы на Всесоюзных, Всероссийских и Международных научно- практических конференциях и совещаниях в Москве (1981, 1987, 1990, 1995, 2002, 2004, 2004), Мичуринске (1982, 1984, 1985, 1996, 2003, 2007), Минске (1981, 1995), Риге (1981), Мелитополе (1985), Кишинёве (1986), Новосибирске (1988), Ялте (1992), Пущино (1993), Пензе (2000), Белгороде (2000), Новочеркасске (2005), представлены на V и VI съездах ВОГИС (1987, 1992), XVIII и ХХ Мичуринских чтениях (1998, 2000).

Работа была поддержана ГНТП «Приоритетные направления генетики» (1995).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 59 научных работах, в том числе 7 статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 4 методические рекомендации, 1 авторское свидетельство на изобретение.

Объём и структура диссертации. Работа состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций для практической селекции, списка литературы. Диссертация изложена на 346 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 21 рисунка. Список используемой литературы включает 540 источников, из них 246 зарубежных авторов.

Некоторые разделы исследований были выполнены совместно с Шелаботиным Г.П., Никольским Б.В., Денисовым В.Ф., Тюленевым В.М., Нафталиевым П.М., Осиповой Л.В., Туровским И.И., Поляковым С.А., Верзилиным А.В. Особую благодарность автор выражает научному консультанту директору ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, доктору с.-х.наук, профессору, академику РАСХН Савельеву Н.И.

Содержание работы

Введение. Во введение представлено обоснование актуальности работы, приведены основные направления решения научной проблемы, а также научная новизна и практическая значимость полученных результатов исследований.

Глава 1. Перспективы использования цитологических методов и культуры изолированных клеток, тканей и органов в селекционной практике

В главе представлен обзор литературы о значении отдаленной гибридизации, цитологических исследований и методов культуры изолированных тканей и органов в решении ряда проблем повышения эффективности селекционного процесса растений, в том числе плодовых и ягодных культур. Применение цитологических методов в исследованиях по отдаленной гибридизации рассмотрено с позиции их роли в выяснении причин нескрещиваемости исходных форм и степени стерильности отдаленных гибридов. На основе литературных данных отечественных и зарубежных авторов приведена история развития и становления методов клеточных и тканевых культур, их значение для целей селекции, а также обсуждены возможности различных технологий in vitro для создания генетического разнообразия исходных форм.

Глава 2. Объекты и методика проведения исследований

Экспериментальная работа выполнена в период с 1977 по 2006 годы во ВНИИ генетики и селекции плодовых растений им. И.В. Мичурина и в Мичуринском государственном аграрном университете (кафедра биологии растений и селекции плодовых культур).

Объектами исследований служили две группы отдаленных гибридов сливы, полученные доктором сельскохозяйственных наук Г.А. Курсаковым в ЦГЛ им. И.В. Мичурина.

К первой группе изучаемых растений относились отдаленные гибриды, полученные от скрещивания представителя диплоидных видов сорта вишнесливы - Опата (Cerasus beesseyi Bail х Prunus americana Mars), 2n(2х)=16 с тетраплоидным видом - терном (Prunus spinosa L.), 2n(4х)=32. Были изучены гибридные формы: 67-66, 312-67, 337-67, 318-67, 345-67, 340-67, 325-67. Вторая группа отдаленных гибридов была представлена сеянцами, которые получены в результате гибридизации сорта Опата с представителями гексаплоидной сливы домашней (Prunus domestica L.), 2n(6х)=48 - сорта Ренклод Альтана, Ренклод тамбовский. В этой группе изучали гибриды: 405-67, 96-68, 73-66. Контролем служили исходные родительские формы - терн, сорта Опата, Ренклод тамбовский.

В качестве исходных эксплантов в экспериментах, в зависимости от поставленных задач, использовали - меристематические верхушки апикальных и латеральных почек, листовые ткани (листовые диски, черешки) районированных и перспективных сортов земляники, малины и зародыши вышеперечисленных отдаленных гибридов сливы и сортов яблони.

Растениями-донорами для взятия исходных эксплантов служили модельные сорта: земляники - Рубиновый кулон, Фейерверк, Урожайная ЦГЛ, Консервная плотная, Холидей, Селекта, Редготлит, Кама, Мариева Махераух, Зефир, Зенга-Зенгана, Рапелла; малины - Карнавал, Комета, Новость Кузьмина, Молинг промис, Кумберленд; яблони - Антоновка обыкновенная, Грушовка московская, Ренет Черненко, Кандиль Горшкова, Пепин шафранный, сеянец 24-2 от свободного опыления сорта Мекинтош.

Для исследований в работе были использованы методы: искусственной гибридизации, световой, люминесцентной и электронной микроскопии, цитологии и культуры изолированных тканей и органов.

Подсчет числа хромосом проводили по методике в модификации Л.А. Топильской, С.В. Лучниковой, Н.П. Чувашиной (1975). Фертильность и жизнеспособность пыльцы определяли по известным методикам (Рыбин, 1967; Паушева, 1970). Для цитоэмбриологических исследований использовали общепринятые цитологические методики (Паушева, 1970; Чувашина и др., 1976). При исследовании прогамной фазы оплодотворения применяли метод люминесцентной микроскопии согласно методическим рекомендациям, разработанным Y.O.Kho, J. Baer (1968) и модифицированным А.И. Литваком (1978).

В основу методики по культивированию изолированных тканей и органов были положены методические рекомендации Р.Г. Бутенко (1964), А.И. Здруйковской-Рихтер (1974), Н.В. Катаевой, Р.Г. Бутенко (1983).

Извлечение зародышей из гибридных семян сливы проводили на 55-60 день после опыления, а яблони - к началу созревания плодов. Условия культивирования: для зародышей сливы - круглосуточное освещение, t=25±1⁰С; яблони - 16-часовой фотопериод, t=25±2⁰С.

Первичные экспланты (меристематические верхушки, листья) изолировали с растений открытого грунта с последующей стерилизацией. В дальнейшем, в экспериментах по культуре ткани, использовали экспланты, которые брали с опытных растений, предварительно полученных in vitro с помощью клонального микроразмножения.

В качестве источников исходных эксплантов для индукции первичного каллуса применяли листья (листовые диски и черешки). Листовые диски имели диаметр 7-8мм, а сегменты листовых черешков длину 5-7мм. Для индукции каллусной культуры экспланты инкубировали в темноте при t=25±2⁰С. Каллусообразующую способность определяли в процентах, как отношение числа эксплантов, сформировавших каллус к числу введенных (стерильных) в культуру in vitro. Анализ анатомических и ультраструктурных особенностей каллусных клеток проводили с помощью электронного микроскопа Тесла БС-500 (увеличение 5-30 тысяч).

В экспериментах по индукции адвентивных побегов размер кусочков каллусной ткани составлял 0,5-0,8см², листовые диски имели диаметр около 5мм, длина листовых черешков 5-6мм. Листовые диски контактировали с питательной средой как абаксиальной (нижней), так и адаксиальной (верхней) стороной. Регенерационную способность эксплантов оценивали в процентах (число эксплантов, давших побеги, от общего числа стерильных). Основные условия культивирования при индукции морфогенеза - t=23±2⁰С, 16 часовой фотопериод, освещенность 2000-3000 люкс.

В специальных опытах изучали действие контрастных температур и предварительного инкубирования тканевых культур в темноте при различной экспозиции и температуры на стимуляцию морфогенеза и ризогенеза. Для изменения осмотического давления питательных сред добавляли повышенные концентрации глюкозы в количестве 60-90г/л. При изучении влияния затемнения питательной среды на корнеобразование использовали реактив метиленовую синь в концентрации 0,01-0,05%. В опытах по тканевой селекции на солеустойчивость в культуральные среды вводили NaCl в концентрациях 0,25; 0,5; 1,0; 1,5%. При скрининге стрессоустойчивых каллусных линий использовали приемы мягкой, жесткой и ступенчатой селекции (Долгих, 1993).

В экспериментах с тканевыми культурами применяли агаризованные питательные среды, базовую основу которых составляли стандартные прописи сред - Уайта, Мурасиге-Скуга, Андерсона, Ли-Фосарда, Готре (В₅), Хеллера, дополненные регуляторами роста - 6-БАП, кинетином, ИУК, ИМК, НУК, 2,4-Д, ГК₃ в различных концентрациях и сочетаниях.

Изучение гибридных форм проводили согласно методическим рекомендациям ВНИИС им. И.В. Мичурина (1980). Для статистической обработки экспериментальных данных использовали методику, рекомендованную Б.А. Доспеховым (1985). Отдельные положения наших исследований по решению конкретных задач изложены в специальных методических рекомендациях (Мичуринск, 1987, 1996; Москва, ВАСХНИЛ, 1988; Орел, 1995).

Глава 3. Повышение эффективности отдаленной гибридизации на основе цитоэмбриологических методов.

3.1. Уровень плоидности гибридного потомства при инконгруэнтных скрещиваниях представителей рода Prunus Mill. Цитологические исследования позволили определить уровень плоидности гибридных форм, что дает возможность прогнозировать степень фертильности растений.

+диплоид > тетраплоид + диплоид > гексаплоид	а б в а б в

Рис. 1 Формообразование при инконгруэнтных скрещиваниях сливы: а - исходные формы, б - гаметы; в - гибрид (F1)

Проведенный подсчет числа хромосом у аллополиплоидов сливы показал, что отдаленные гибриды сливы, полученные от инкогруэнтного скрещивания 2х х 4х, имели в соматических клетках 2n(3х)=24 хромосомы и являются триплоидами. Происхождение аллотриплоидов объясняется слиянием нормально редуцированных женской гаметы диплоида х=8 с мужской гаметой тетраплоида х=16 (рис.1). Гибриды этой группы характеризуются несбалансированным геномным составом (х+2х), вследствие чего неполная конъюгация хромосом, приводит к формированию массы функционально неполноценных женских гамет и почти полному бесплодию (завязываемость плодов 1,3-1,7%). Гибридные формы сливы (2х х 6х) являются аллотетраплоидами с числом хромосом 2n(4х)=32. В данном случае имело место объединение редуцированных гамет сорта Опата (х=8) и сливы домашней (х=24). Вторая группа гибридных растений характеризуется сбалансированным набором хромосом (х+3х), генотип которых состоит из четного числа геномов. Вероятно, что у отдаленных гибридов этой группы скрещивания формироваться жизнеспособные гаметы ввиду склонности хромосом рода Prunus Mill к автоаутосиндезу. Поэтому аллотетраплоиды обладают пониженной плодовитостью и формируют до 14,1% плодов. Следовательно, отмечается связь между уровнем плоидности аллополиплоидов и их способностью к плодоношению.

3.2 и 3.3. Сравнительная оценка развития женской генеративной сферы аллополиплоидов сливы (диплоид х тетраплоид, диплоид х гексаплоид) и их исходных форм. Степень семенной продуктивности определяется состоянием женской генеративной сферы растений. Анализ состояния зародышевых мешков в момент наступления цветения и сроки завершения их формирования позволяют определить наиболее оптимальный период опыления гибридных форм, что способствует повышению эффективности селекционного процесса. Заложение и развитие морфологически нормальных семяпочек у отдаленных гибридов происходит однотипно. Однако были установлены аномалии в их развитии и строении, которые заключались в следующем: одновременное заложение в полости завязи семяпочки и одного или двух пыльников, развитие под общими наружным и внутренним интегументами двух или трех нуцеллусов (последнее нарушение у аллотетраплоида 73-66 достигает примерно 10%) и ряд других. У аллотриплоидов в среднем, примерно у 25% семяпочек, в нуцеллусе отсутствует заложение клеток археспория или происходит их ранняя дегенерация до мейоза. В результате этого семяпочки уже на ранних этапах становятся стерильными.

После завершения мейоза материнских клеток макроспор, на этапе формирования тетрад, наблюдается их полная дегенерация. Семяпочки, в которых происходят структуры изменения тетрад макроспор, со временем становятся абортивными и отмирают. Гибель всех четырех макроспор тетрады, по нашему мнению, связана с аномалиями в процессе мейоза, степень которых зависит от уровня плоидности гибридных форм.

Рис 2 Сроки прохождения эмбриологических стадий в развитии зародышевых мешков у отдаленных гибридов сливы и родительских форм

В нашем случае, конъюгация хромосом в профазе редукционного деления мейоза у аллотетраплоидов предположительно протекает по типу полного автоаутосиндеза, где из трех геномов хромосом сливы домашней два конъюгируют между собой автосиндетически, а хромосомы генома сорта Опата с одним геномом сливы домашней - аутосиндетически. Такой тип конъюгации хромосом обеспечивает образование большего числа функционально полноценных макроспор и развивающихся из них женских гаметофитов.

При изучении формирования зародышевых мешков было установлено ряд аномалий, которые снижали их жизнеспособность, что в дальнейшем влияло на процесс оплодотворения. К наиболее выраженным нарушениям можно отнести: отсутствие полярности и нормальной функциональной дифференциации ядер зародышевого мешка, дегенерацию отдельных элементов и зародышевых мешков в целом на разных стадиях развития и др. При этом для триплоидов характерна одновременная дегенерация большинства восьмиядерных зародышевых мешков, а также и семяпочек, в которых они закладывались. Это приводит к массовому опадению цветков, примерно на 97-99%. Кроме того, темпы прохождения эмбриологических стадий в развитии женских гаметофитов аллотриплоидов в значительной степени замедлены и отстают от общего развития цветков на дереве (рис. 2).

Полностью сформированные женские гаметофиты у триплоидов образуются в небольшом количестве (примерно 1-3%) и наблюдаются на 7-8 день цветения. Выявленные нарушения являлись причиной стерильности женской генеративной сферы и почти полного отсутствия плодоношения. У тетраплоидов нарушения в формировании женской генеративной сферы выражены в меньшей степени и в день массового цветения в семяпочках образовывалось 29,3-37,5% морфологически нормальных зародышевых мешков, что может быть свидетельством частичной стерильности и возможности получения большего количества жизнеспособных семян. Таким образом, потенциальная способность аллотриплоидов формировать отдельные морфологически нормальные зародышевые мешки указывает на возможность вовлечения их в селекционный процесс, но со значительным увеличением объема гибридизационных работ. Аллотетраплоидные гибриды представляют несомненный интерес с точки зрения использования в дальнейших скрещиваниях и, в частности, для селекции на тетраплоидном уровне. Для успешного развития работ по отдаленной гибридизации плодовых растений, а также выяснения причин стерильности аллополиплоидов, обладающих отдельными ценными признаками и возможностью использования их в селекции, нужна всесторонняя цитологическая характеристика наиболее ценных форм.

3.4 и 3.5. Анализ прогамной фазы оплодотворения аллополиплоидов сливы (диплоид х тетраплоид, диплоид х гексаплоид) при интрогрессивной гибридизации. Анализ прогамной фазы показал несовместимость комбинаций скрещивания триплоид х диплоид, тетраплоид х диплоид, которая выражалась в остановке роста мужских гаметофитов. Реакция несовместимости мужского гаметофита со спорофитом пестика проявлялась уже на рыльце и заключалась в замедленном темпе прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок, их извилистости и спиралевидном закручивании, отложении большого числа каллозных пробок, расположенных на небольшом расстоянии друг от друга. Остановку роста пыльцевых трубок наблюдалась в средней части столбика на 2 день после опыления триплоидов, а у тетраплоидов на 4 день. Это явилось одной из причин отсутствия образования плодов в данных комбинациях скрещивания. Укорачивание столбика пестика гибридных форм, как прием преодоления барьера несовместимости, не дал положительного результата. Реакция несовместимости компонентов в анализируемых комбинациях скрещивания, вероятно, является следствием проявления гаметофитной системы несовместимости. При совместимых комбинациях скрещивания отдаленных гибридов F₁ (триплоид х терн, триплоид х Опата + терн, тетраплоид х слива домашняя, тетраплоид х Опата + слива домашняя, тетраплоид х терн) рост и развитие определенного количества пыльцевых трубок в тканях пестика несколько замедлен, но происходит без явно выраженных морфологических нарушений, что приводит к проникновению некоторых из них в семяпочку на 5-7 день с момента опыления (в зависимости от комбинации скрещивания). В результате процесса двойного оплодотворения происходит развитие семян и образование плодов, на что указывают данные учета завязываемости плодов. Так, при гибридизации аллотриплоида 340-67 с терном завязалось 1,7% плодов, при скрещивании аллотетраплоидов 73-66 с сортом Ренклод Альтана и терном, 96-68 с сортом Ренклод тамбовский и терном соответственно: 2,2%, 3,8%, 14,1%, 10,2%. Следовательно, прогамная фаза является важным этапом в познании причин нарушений полового размножения аллополиплоидов, поскольку от неё зависит успех оплодотворения и дальнейшее формирование семян, что в конечном итоге характеризует результативность отдаленной гибридизации.

Глава 4. Метод эмбриокультуры в повышении эффективности селекционного процесса некоторых плодовых растений.

4.1. Культура изолированных зародышей в получении сеянцев отдаленных гибридов сливы разной степени стерильности. Полученные экспериментальные данные по цитоэмбриологическим особенностям аллополиплоидов служили основанием для применения культуры изолированных зародышей в решении проблемы преодоления стерильности этих форм.

Установлено, что гибридные проростки развивались не из всех изолированных зародышей. На формирование проростков оказывала определенное влияние степень выполненности (развития) зародышей перед введением in vitro. Из зародышей, хорошо развитых и полностью сформированных (5 и 4 балла), были получены сеянцы, имевшие более высокие ростовые показатели (длина главного корня, высота стебля, количество листочков) по сравнению с зародышами менее выполненными. Особенно это хорошо прослеживается в группе скрещиваний аллотетраплоида 96-68 (табл.1). Наряду с нормальным формированием проростков наблюдаются различные нарушения морфофизиологических процессов развития зародышей. Выявленные аномалии, могли быть следствием проявления генетической отдаленности компонентов скрещивания и приводили к гибели растений на всех этапах их выращивания. Но даже такие слабожизнеспособные растения удалось вырастить с помощью эмбриокультуры. Весной в грунт были высажены вполне сформированные сеянцы, что дает преимущества перед посевом стратифицированными семенами. Следовательно, представленные экспериментальные данные подтверждают большие возможности и эффективности метода эмбриокультуры для преодоления в разной степени выраженной стерильности отдаленных гибридов. В результате разработки методических вопросов применения культуры зародышей получено 52 гибридных растения F₂, которые представляют интерес для селекции (табл.2.). Наибольший выход сеянцев отмечен от гибридной формы 96-68, что можно объяснить формированием большего процента морфологически нормальных женских гаметофитов (37,5%).

Таблица 1

Влияние состояния (развитие) зародышей межвидовых гибридов сливы на рост и развитие проростков в культуре in vitro (1981-1982гг)

Вариант	Происхождение зародышей	Количество зародышей	Получено проростков, шт.	Средняя длина (высота), мм	Среднее количество листьев, шт.
·		балл	шт.		главного корня	стебля
1 2 3	96-68 х Ренклод тамбовский	5 4 3	14 12 8	13 10 6	48,5 39,5 34,0	71,5 53,5 46,6	5,9 5,4 4,5
4 5	96-68 х (Опата + Ренклод тамбовский)	5 3	6 1	6 1	13,3 45,0	59,8 40,0	5,7 4,0
6 7 8 9	96-68 х терн	5 4 3 2	13 3 2 1	13 3 2 -	76,5 51,6 45,0 -	57,7 56,6 50,0 -	6,8 6,0 5,0 -
10	73-66 х Ренклод Альтана	4	1	1	55,0	60,0	4,0
11	73-66 х Опата + Ренклод Альтана	4	1	1	60,0	70,0	5,0
12	73-66 х терн	5	2	2	15,0	75,0	7,0
13	340-67 х терн	5	2	2	12,5	20,0	2,5

Примечание. Достоверные различия: по корню - между 1и 4, 2 и 3 (НСР₀₅ =16,01), 1 и 3 (НСР₀₅ = 12,72), 1 и 12, 6 и 12, 1 и 13, 6 и 13 (НСР₀₅ = 24,64) вариантами; по стеблю между 4,3 (НСР₀₅ = 32,58), 12 и 13 (НСР₀₅ = 39,91), 1 и 13, 6 и 13 (НСР₀₅ =30,13 вариантами; по листьям - между 1 и 6 (НСР₀₅ = 0,83 ), 1 и 13, 6 и 13 (НСР₀₅ = 1,61), 4 и 6 (НСР₀₅ = 1,05), 4 и 13 (НСР₀₅ = 1,74), 12 и 13 (НСР₀₅ = 2,13) вариантами.

Нарушение сбалансированности систем, контролирующих нормальное развитие отдаленных гибридов, может привести к нарушениям в мейозе при расхождении хромосом в анафазе и образованию гамет с разным уровнем плоидности. Поэтому мы вправе предположить, что триплоиды и тетраплоиды могут формировать женские гаметы разных типов (рис.2).

Таблица 2

Результаты использования метода эмбриокультуры при получении сеянцев F₂ отдаленных гибридов

Показатель	Происхождение зародышей
	триплоид х тетраплоид	тетраплоид х гексаплоид	тетраплоид х (диплоид + гексаплоид)	тетраплоид х тетраплоид
Средняя оценка развития зародышей, балл	5,0	4,2	4,6	4,5
Посеяно зародышей, шт.	2	35	8	21
Развились в проростки, шт. %	2 100	30 85,7	8 100	20 95,2
Высажено сеянцев в грунт, шт. %	1 50	27 77,1	7 87,5	17 81,0

Первая группа гибридов - х=8, 2х=16, 3х=24, вторая - х=8, 2х=16, 3х=24, 4х=32. При гибридизации триплоидов (F₁) с терном в результате свободного комбинирования возможных типов гамет можно ожидать появление следующих классов потомства (F₂): 3х=24, 4х=32, 5х=40. В комбинации скрещивания 4х (F₁) х 6х: 4х=32, 5х=40, 6х=48, 7х=56. При опылении 4х (F₁) х 4х, могут сформироваться гибридные организмы, имеющие кариотип: 3х=24, 4х=32, 5х=40, 6х=48. Вполне возможно появление анеуплоидных форм (моносомиков, нуллисомиков, трисомиков).

Исследования показали, что сеянцы F₂ от скрещивания 4х (96-68) х 6х, 4х (96-68) х (2х+6х) и 4х х 4х характеризуются низкой степенью подмерзания (0-1 балл). Вместе с тем, в гибридной семье 4х х 4х одиночные растения имели 4-5 баллов подмерзания, несмотря на то (по литературным данным), что терн обладает высокой зимостойкостью и передает этот признак гибридам. Очевидно, при отдаленной гибридизации формируется широкий спектр форм по наследованию определенного признака. Исследованиями установлено, что у некоторых гибридных растений (F₂) отмечали ограниченную силу роста. Причем, различия в силе роста между отдельными сеянцами в пределах гибридной семьи наблюдали уже по мере их роста в вазонах с почвой. По-нашему мнению, это связано с тем, что одним из компонентов скрещивания при получении F₁ и F₂ являлись слаборослые формы - сорт вишнесливы Опата и терн, которые могли передать сеянцам гены, контролирующие этот признак.



Размещено на http://www.allbest.ru/

триплоид (F₁) тетраплоид (терн)

Размещено на http://www.allbest.ru/

гетраплоид (F₁) гексаплоид (слива домашняя)

Размещено на http://www.allbest.ru/

тетраплоид (F₁) тетраплоид (терн)

Рис. 3 Формообразование в комбинациях скрещивания с участием гибридов сливы (F₁): а - исходные формы; б - гаметы; в - гибрид (F₂). Х-основное число хромосом рода Prunus Mill равно 8

Так, в гибридных семьях 4х (96-68) х 6х и 4х (96-68) х (2х+6х) выделены формы с естественным сдержанным ростом, высота которых в пятилетнем возрасте не превышала 1 м.

4.2. Влияние физиологически активных веществ на развитие зародышей яблони в культуре in vitro. Исследованиями установлено, что введение в питательную среду экзогенных результатов роста оказывало положительное влияние на формирование проростков. В ряде вариантов опыта наблюдалось развитие из каждого зародыша нескольких побегов (табл.3).

Таблица 3

Влияние экзогенных регуляторов роста на развитие изолированных зародышей (среда Мурасиге-Скуга)

Происхождение зародышей (сорт)	Концентрация фитогормонов, мг/л	Число зародышей в опыте, шт.	Развились в проростки, шт.	Всего сформировалось побегов, шт.	Среднее число побегов из зародыша, шт.
Ренет Черненко	0 (контроль)	20	2	2	1,0
	БАП 1,0	16	10	26	2,6
	БАП 2,0	22	12	76	6,3
	БАП 4,0	37	11	79	7,2
	БАП 1,6 + ГК 0,5 + ИМК 0,1	20	7	7	1,0
НСР05					3,0
Кандиль Горшкова	0 (контроль)	40	5	5	1,0
	БАП 1,0	44	24	48	2,0
	БАП 2,0	41	23	64	2,8
	БАП 3,0	41	13	89	6,8
	БАП 4,0	41	7	20	2,9
	БАП 1,6 + ГК 0,5 + ИМК 0,1	40	28	28	1,0
НСР05					1,28
Пепин шафранный	0 (контроль)	40	3	3	1,0
	БАП 1,0	36	8	17	2,1
	БАП 2,0	30	6	6	1,0
	БАП 3,0	36	14	38	2,7
	БАП 1,6 + ГК 0,5 + ИМК 0,1	15	5	5	1,0
НСР05					0,93
Антоновка обыкновенная	0 (контроль)	35	4	4	1,0
	БАП 1,0	36	8	26	3,3
	БАП 2,0	30	5	5	1,0
	БАП 3,0	34	6	30	5,0
	БАП 1,6 + ГК 0,5 + ИМК 0,1	30	8	8	1,0
НСР05					1,26
Грушовка московская	0 (контроль)	30	0	0	0
	БАП 1,0	28	8	21	2,6
	БАП 2,0	33	7	16	2,3
	БАП 3,0	31	9	28	3,1
	БАП 1,6 + ГК 0,5 + ИМК 0,1	22	6	6	1,0
НСР05					1,21

Способность зародышей к пролиферации дополнительных побегов отмечалась при добавлении в питательную среду 6-БАП, что связано с её физиологическим эффектом снимать апикальное доминирование верхушечной почки в растении. Воздействуя на верхушечную почку зародыша, 6-БАП вызывает дифференциацию пазушных почек, их пробуждение и активацию роста в побеги. Зародыши по-разному реагировали на присутствие в среде цитокинина. При этом эффект действия зависел от его концентрации, комбинации с другими регуляторами роста генотипических особенностей. Менее интенсивно протекал процесс активации прорастания пазушных почек и развитие побегов у зародышей культивируемых на других испытанных вариантов сред и в основном при сочетании 6-БАП с ИУК или ИМК. Эти варианты были на уровне контроля.

Контроль ризогенеза у побегов осуществляли введением в питательную среду ИМК (1,0-5,0мг/л). На этапе укоренения более эффективным оказалось добавление 5,0мг/л ИМК. Частота формирования придаточных корней составила 21,7-47,8%. Для стимулирования корнеобразования нами изучено влияние на этот процесс контрастных температурных факторов, путем воздействия на побеги, находящиеся на питательной среде ризогенеза с ИМК (1,0мг/л). В результате отмечена определенная тенденция одноразового и двухразового воздействия контрастными температурами на увеличение укореняемости побегов. Разработанный прием контроля ризогенеза довольно прост, не требует дорогостоящего оборудования и экономит регуляторы роста группы ауксинов. Следовательно, прорастание пазушных почек у зародышей и развитие дополнительных побегов может быть вызвано введением в среду препарата из группы цитокининов (6-БАП 1,0-4,0мг/л), что способствует тиражированию побегов, увеличению выхода однородных сеянцев и сохранению ценных генотипов, в частности при проведении работ по отдаленной гибридизации.

Глава 5. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции земляники.

Для селекционных целей рекомендуется следующая схема использования тканевых культур:

1. Индукция и культивирование каллусной ткани из эксплантов различного происхождения.

2. Морфогенез адвентивных побегов из каллуса.

3. Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных эксплантов.

4. Тиражирование и укоренение побегов-регенерантов в условиях in vitro.

5. Перенос пробирочных растений в почвенный субстрат и адаптация к новым условиям произрастания.

6. Выращивание растений-регенерантов в открытом грунте, их анализ и отбор ценных в селекционном отношении форм.

5.1. Индукция и культивирование каллусной ткани, анатомические и ультраструктурные особенности клеток каллуса. В результате проведенных экспериментов были получены линии каллусных культур на средах с широким диапазоном гормонального состава. Установлено, что для индукции каллуса в достаточном количестве и улучшения его морфологических показателей использования сред с 2,4-Д в соответствующей концентрации (1,0 - 2,0 мг/л) или её сочетание с ИУК и кинетином (2:1:1) является более эффективным. Для меристематических клеток каллуса характерно наличие в центре активно увеличенного в размере ядра, фибриллярной структуры ядрышек, мелких вакуолей и электронно-плотной цитоплазмы. В каллусных тканях морфогенез осуществлялся по типу стеблевого (адвентивного) органогенеза.

5.2. Морфегенез адвентивного морфогенеза из каллуса. У растений, полученных из каллусных культур, возрастает вероятность появления генетических изменений на уровне качественных и количественных признаков (сомаклональная изменчивость), что имеет принципиально важное значение для селекционных исследований с привлечением тканевых технологий. Однако при этом возникает немало трудностей и главная из них - проблема индукции морфогенеза при регенерации. Гормональный баланс питательной среды является ключевым фактором, способствующим реализации морфогенетического потенциала тканей к регенерации. В качестве индукторов стеблевого органогенеза применяли регуляторы роста цитокининовой и ауксиновой природы в различных концентрациях и сочетаниях. Отобранные варианты питательных сред, на которых происходило лучшее развитие побегов показали, что наибольшая частота регенерации характерна для вариантов с включением 5,0 и 10,0мг/л 6-БАП в сочетании с 0,5мг/л ИМК (сорт Урожайная ЦГЛ) или ИУК (сорт Фейерверк). Менее интенсивно при этом сочетании регуляторов роста протекает процесс регенерации у сорта Рубиновый кулон (частота регенерации менее 5%), но замена ИМК и ИУК на 2,4-Д (0,5мг/л) повышает морфогенетическую способность каллуса до 53,6%. Установлено, что существенное влияние на регенерацию из каллуса оказывает сортовая специфика исходного экспланта, но при обязательном присутствии в среде 6-БАП.

Таблица 4

Стеблевой органогенез в культуре каллусных тканей 4-5 пассажей (регенерационная среда по прописи Мурасиге-Скуга, в среднем за 1991-1992гг.)

Вариант среды с регуляторами роста, мг/л	Фейерверк	Урожайная ЦГЛ
	% регенерации	поб./экспл., шт.	% регенерации	поб./экспл., шт.
6-БАП 2,0 +2,4-Д 0,1	47,8	2,9	29,2	2,3
6-БАП 5,0 + ИМК 0,5	60,0	2,3	64,0	2,1
6-БАП 10 + ИУК 0,5	56,5	2,5	35,7	1,3

Варианты сред с установленным оптимальным составом экзогенных регуляторов роста показали положительные результаты по получению адвентивных побегов из каллуса, возраст которого составлял 140-160 суток (4-5 пассаж), (с ростом числа пассажей снижается регенерационная способность) (табл.4).

В процессе работы были модифицированы стандартные условия культивирования тканей за счет использования предварительного выращивания каллусных культур на регенерационной среде в темноте при экспозиции 3 недели и t=23±2 ⁰С (табл.5).

Таблица 5

Реакция каллуса на способность к регенерации при предварительном культивировании в темноте (среда Мурасиге - Скуга, 6-БАП 5,0мг/л + ИМК 0,5мг/л, в среднем за 1991-1993гг.)

Сорт	t=23±2 0C, 16-ч фотопериод (контроль)	t=23±2 0C, темнота 3 недели	НСР05
	% регенерации	поб./экспл., шт.	% регенерации	поб./экспл., шт.
Урожайная ЦГЛ	60,0±8,9	2,1	80,0±7,3	3,6	0,77
Фейерверк	57,1±9,0	2,3	76,9±7,8	3,9	1,07
Холидей	26,6±8,1	1,8	40,0±8,9	2,5	0,8
Консервная плотная	46,7±9,1	1,4	55,2±9,1	1,9	0,48

Представленные в таблице 5 данные показывают, что изменение основных параметров светового режима влияло на стеблевой органогенез и этот прием является достаточно эффективным, позволяющий повысить частоту регенерации до 80% (сорт Урожайная ЦГЛ), а у трудноразмножаемого генотипа до 40% (сорт Холидей). Установлено, что при двухразовом воздействии контрастных температур морфогенетический потенциал каллусов увеличивается в 1,5 - 2 раза. Считаем, что разработанные методические подходы повышения регенерации в каллусных тканях могут быть использованы для других представителей вида F. ananassa Duch с целью повышения эффективности и направленности селекционного процесса земляники.

5.3. Регенерация придаточных побегов непосредственно из исходных эксплантов. Установлено, что листовые диски способны регенерировать побеги на средах с различными добавками регуляторов роста разной частотой. Было выделены варианты сред, которые обеспечивали, больший процент заложения и развития побегов. Физиологическое свойство 6-БАП вызывать заложение почек на листовых дисках более ярко проявлялась при взаимодействии 2,4 - Д или ИУК в соотношении 20:1. Отмечена зависимость частоты регенерации от соотношения цитокинин: ауксин в среде. По мере уменьшения разницы в соотношении снижался показатель потенции к регенерации. Регенерационная способность зависела от генотипических особенностей сорта. Ориентация листовых дисков на поверхности среды (адаксиальной или абаксиальной поверхностью) не оказывает существенного влияния на индукцию адвентивных побегов.

Световой режим культивирования является важным внешним фактором, который оказывает влияние на процесс регенерации. Изменения стандартных условий культивирования за счет введения этапа предварительного содержания листовых дисков в темноте позволяет увеличить частоту регенерации (табл.6).

Следовательно, разработанные приемы по стимуляции адвентивного органогенеза (с учетом влияния генотипа, гормонального состава, физических условий культивирования, ориентации экспланта) позволяет повысить регенерационную способность листовых эксплантов до 40-75%, а также среднее число побегов на эксплантов (2,5-5,7 шт.).

Таблица 6

Влияние предварительного культивирования листовых дисков в темноте на регенерацию (среда Мурасиге - Скуга)

Сорт	16 часовой фотопериод, t=23±20С (контроль)	Темнота 3 недели, t=23±20С
	% регенерации	поб./экспл., шт	% регенерации	поб./экспл., шт
Фейерверк	37,8	2,5	75,0	5,7
Урожайная ЦГЛ	31,8	2,1	63,0	5,2
Рубиновый кулон	20,8	1,9	42,6	2,8
Консервная плотная	23,3	2,3	42,9	2,5
Холидей	19,5	2,1	40,0	2,6

Примечание. Листовые диски сорта Холидей культивировали на среде с 6-БАП (10 мг/л) +ИУК (0,5 мг/л), сортов отечественной селекции - с 6-БАП (10 мг/л) + 2,4-Д (0,5 мг/л).

5.4. Тиражирование и укоренение побегов, полученных в культуре каллусных и листовых тканей. Применяя отработанные приемы, размножения в системе in vitro были получены идентичные копии в количестве, необходимом для исследований. Коэффициент размножения на среде Мурасиге-Скуга с 6-БАП 1,0мг/л составлял в зависимости от сорта 4,7-8,3 шт. В качестве индуктора ризогенеза предпочтительнее использовать ИМК 0,5мг/л. Всего было получено 4423 растения, из них: сорта Фейерверк - 2048 шт., сорта Урожайная ЦГЛ - 1171 шт., сорта Рубиновый кулон - 727 шт., сорта Консервная плотная - 232 шт., сорта Холидей - 245 шт.

Оптимизированы отдельные элементов технологии ускоренного размножения in vitro перспективных сортов земляники. Так, установлена реакция генотипов на состав компонентов индукционной среды при пролиферации пазушных почек. Для этого использовали варианты сред по прописям: Мурасиге-Скуга, Ѕ Мурасиге-Скуга, Андерсона, Ли-Фасарда, Готре, Хеллера. При крупномасштабном производстве посадочного материала вполне пригодна среда Мурасиге-Скуга. Способность к развитию дополнительных побегов апексами зависела от концентрации в среде форм азота (табл.7). Снижение исходной концентрации NH₄ NO₃ в 2-8 раз не влияет на коэффициент размножения и соответствует контролю. Уменьшение содержания KNO₃ существенно снижает пролиферацию побегов. Полученные данные можно рекомедовать для практической работы.

Таблица 7

Влияние концентрации различных форм азота на рост и развитие пазушных побегов сорта Мариева Махераух (среда Мурасиге-Скуга, 6-БАП 1 мг/л, 1 пассаж, 2000-2001 гг.)

№ опыта	Азотные соединения, мг/л	Количество побегов, шт.	Длина побегов, см	Количество листьев, шт.
I	NH4NO3 1650 (контроль)	4,3	3,5	12,2
	825	4,3	3,2	12,2
	412,5	3,9	3,2	12,1
	206,25	3,8	3,2	10,3
II	KNO3 1900 (контроль)	5,5	2,8	-
	950	2,0	2,1	-
	475	1,7	1,8	-
	237,5	1,3	1,6	-
	НСР05	1,3	0,8

Примечание. 1 опыт - уменьшена концентрация только NH₄NO₃, 2 опыт - только KNO_3.

Большое значение для культивируемых верхушек побегов играет продолжительность светового дня. При продолжительности фотопериода 16 часов, коэффициент размножения выше, чем при 8 и 12-часовом световом дне. Проведенное изучение методических вопросов, направленных на повышение показателей развития корневой системы (длина и количество корней), путем затемнения питательной среды ризогенеза нейтральным веществом - метиленовой синью показало, что лучшие результаты наблюдались у всех генотипов при использовании в концентрации 0,05%.

У растений, сформированных in vitro следует адаптировать к росту в полевых условиях, как корневую систему, так и надземную часть. Эти мероприятия следует проводить в теплицах, что снижает трудоемкость процесса и сокращает сроки получения полноценной рассады, способной к росту in vitro. Размещать растения в теплице рекомендуется при схеме 7 х 7см. Улучшение качества тумана в теплице можно достичь за счет уменьшения диаметра отверстия распылителя до 0,7мм и повышения давления в системе до 4 атм. Эти приемы позволили повысить выход адаптированных растений из теплицы до 85-90%.

Оценка экономической эффективности выращивания рассады земляники с использованием клонального микроразмножения свидетельствует о высокой доходности (в ценах 2003г.). Выход рассады с 1 га маточника увеличился по сравнению с обычной технологией на 355 тыс.шт. или на 98,6%. Полные затраты на 1 га возросли в 2,8 раза, а денежная выручка в 4 раза. В связи с тем, что темпы роста выручки выше, чем темпы роста затрат прибыль с 1 га маточных насаждений увеличилась в 5,2 раза и составила 1361,9 тыс.руб. при уровне рентабельности 173,9%. По сравнению с обычной технологией выращивания рассады прибыль на 1 руб.затрат выросла на 81 коп. или 87,2%.