Совершенствование селекционного процесса плодовых и ягодных растений на основе цитологических методов и культуры изолированных тканей

5.5. Анализ изменчивости растений - регенерантов. Культивирование изолированных соматических групп клеток и регенерация из них целых растений позволяет индуцировать сомаклональную изменчивость, которая основана на спонтанных генетических изменениях, возникающих в выращиваемых in vitro клетках. Проведенная нами оценка изменений в репродуктивных органах растений - регенерантов (количество цветоносов и сформировавшихся ягод на растении) в R₀, R₁, R₂ вегетативном поколениях, полученных из листовых дисков сорта Фейерверк и каллусных культур сорта Урожайная ЦГЛ, позволила получить следующие результаты (табл. 8). Контроль - растения, индуцированные из меристематических верхушек и размноженных в системе in vitro.

У растений, индуцированных из листовых дисков сорта Фейерверк в R_0, коэффициенты вариации анализируемых признаков выше, чем в культуре апексов. При оценке крайних величин признака количества цветоносов или их полного отсутствия на растении, наибольшее значение этого показателя отличалось у опытных растений. Анализ вегетативно размноженных регенерантов R₁ показал, что коэффициент вариации в опыте, в среднем за два года, имел некоторую тенденцию к увеличению (17,6% - 1994-1995г, 15,4% - 1993г). В R₂ у опытных и контрольных растений он находился примерно на одном уровне (15,4% и 12,5% соответственно). Более стабильным в R₁ и R₂ оказался признак количества плодов на растении. Приведенные в таблице 8 данные показывают, что варьирование признаков количества цветоносов и ягод у регенерировавших в каллусной культуре сорта Урожайная ЦГЛ растений, было значительно сильнее, чем у контрольных. Причем это наблюдалось у регенерантов R₁ и R₂ вегетативных поколений. В среднем за 4 года вариабельность количества цветоносов в опыте составила 26,4% и ягод 22,6%, и в контроле соответственно 5,9% и 4,0%. Довольно низкий коэффициент вариации каждого признака в контроле связан с тем, что меристематические верхушки и индуцированные из них растения, генетически наиболее стабильны и организованы. У контрольных растений варьирование анализируемых признаков в среднем за 4 года было незначительным (для количества цветоносов V=5,9% и 8,7%, ягод V=2,1% и 4,0%), что не превышает уровень естественной изменчивости.

Таким образом, проведенный анализ изменчивости репродуктивных органов у растений-регенерантов показал, что варьирование признаков в культуре каллусной ткани проявляется в большей степени, чем в листовой, и видимо, является следствием фенотипического выражения непостоянства ядерного генома клетки. Тот факт, что изменения в растениях имеют генетическую или эпигенетическую природу и сохраняют фенотипическое

Таблица 8

Изменчивость в количестве цветоносов и ягод на растениях-регенерантах, полученных в культуре тканей

проявление при вегетативном размножении, указывает на возможность их использования для оптимизации селекционного процесса земляники.

Глава 6. Регенерация растений in vitro и применение культуры тканей в селекции малины

6.1. Клональное микроразмножение сортов-доноров источников эксплантов. Отбор исходных эксплантов с растений, произрастающих in vitro имеет свои преимущества, т.к. исключается техническая работа по поверхностной стерилизации материала и растительные ткани не повреждаются. Исследователь может проводить эксперименты с тканевыми культурами в течение всего года, независимо от вегетационного периода растений. Исследования показали, что тип почек не оказывает влияние на характер роста и развития эксплантов in vitro. В результате культивирования в пазухах розеток листьев формируются дополнительные почки, из которых развиваются побеги. Процесс пролиферации почек и побегов наиболее интенсивно протекает на среде Андерсона, обогащенной 6-БАП в концентрации 1мг/л (табл. 9).

Таблица 9

Формирование дополнительных побегов в культуре изолированных апексов (среда Андерсона, 6-БАП 1,0 мг/л, 1992 г.)

Количество развившихся микропобегов зависело от числа проведенных субкультивирований. Так, коэффициент размножения сорта Карнавал особенно возрастал в третьем и четвертом пассажах и в среднем достигал 14,7-26,6 побегов. При этом наблюдаются сортовые различия в способности формировать дополнительные побеги. Добавление 0,5мг/л ИМК в среду Андерсона с уменьшенным в 2 раза количеством минеральных солей и содержанием 20г/л глюкозы, обеспечивает наиболее высокий уровень укореняемости побегов-регенерантов. Частота корнеобразования составляет 72-92% и, в основном, зависит от генотипа. Анализ данных свидетельствует о важной роли генотипа, как наиболее значимого фактора при клональном микроразмножении.

6.2. Индукция и культивирование каллусной ткани, цитогенетические особенности клеток каллуса. Культуральными средами были агаризованные питательные среды по прописи Мурасиге-Скуга или Андерсона. Индукция каллуса более успешно осуществлялась в присутствии 2,4-Д оптимальная концентрация, которой составляла 4,0мг/л. Уровень каллусообразования у сортов: Карнавал, Молинг промис, Новость Кузьмина, Комета составил соответственно - 72%, 84%, 100%, 100%. Не установлено влияние на каллусогенез типа исходного экспланта (листовых дисков и черешков) и стандартных составов используемых питательных сред. Полученная культура каллусной ткани, в основном, светло-желтого или белого цвета и имеет глобулярную средне-плотную консистенцию. Однако на среде с добавлением 6,0мг/л 2,4-Д часто формируется каллус с очень плотной структурой и глянцевой поверхностью, что особенно характерно для сорта Молинг промис. При анатомическом изучении подобной каллусной ткани отмечается заложение элементов ксилемы или флоэмы. Это, видимо, влияет на частоту регенерации побегов этого сорта. Индукция каллусообразования зависит от используемых генотипов. Для эксплантов характерны сортовые различия на присутствие в среде регуляторов роста с ауксиновой активностью или их сочетание с низкими концентрациями цитокинина. При высоких концентрациях может снижаться уровень образования каллуса (за счет формирования корней) и его морфологические показатели.

Цитологический анализ выявил генетическую вариабельность клеток 45-50 суточного каллуса. При анализе клеток были обнаружены кариологические изменения (в норме 2n=14), которые выражались в формировании гаплоидных (n=7), тетраплоидных (4n=28) и анеуплоидных (2n-1=13, 2n+1=15, 2n+2=16) клеток. Одной из причин возникновения аномальных кариотипов, являлось нарушение нормального процесса митоза под действием различных факторов питательной среды. Следовательно, генетическая вариабельность клеток каллуса может привести к получению растений с разным уровнем плоидности, что способствует расширению спектра сомаклональной изменчивости и созданию ценного исходного материала для целей селекции малины. Однако для этого необходимо разработать эффективную систему регенерации растений в каллусной культуре.

6.3. Морфогенез в культуре каллусной ткани. Базовой средой в экспериментах служила агаризованная питательная среда по прописи Андерсона, в некоторых вариантах - среда Мурасиге-Скуга. Наиболее эффективной для индукции морфогенеза в каллусной ткани является среда Андерсона с содержанием различных регуляторов роста в разных концентрациях и сочетаниях, но с преобладанием препаратов цитокининовой природой над ауксиновой. В результате проведенных экспериментов отобраны варианты сред, на которых наблюдалось формирование адвентивных побегов с частотой от 3,3 до 32,3% и этот процесс зависит от исходного генотипа и присутствующих в среде регуляторов роста. Варианты сред, которые обеспечивали наиболее высокий уровень стеблевого организма, представлены в таблице 10.

Для всех изученных генотипов отмечен положительный синергический эффект при совместном добавлении в регенерационную среду 5,0 мг/л или 10,0мг/л 6-БАП и 0,5мг/л ИУК (сорта Карнавал, Комета) или 0,5мг/л 2,4-Д (сорта Новость Кузьмина, Молинг промис). Относительно высокая (15,0мг/л) и низкая концентрация (1,0мг/л) 6-БАП, также его сочетание с ИУК или 2,4-Д не оказывала достаточного стимулирования эффекта регенерации. Присутствие ИМК было малоэффективно. Проявление морфогенетической активности 6-БАП (5,0 и 10,0 мг/л) зависело от взаимодействия с ИУК и 2,4-Д, при котором увеличивалась способность к дифференциации стеблевых почек в культуре недифференцированных клеток каллуса. Экспериментальные данные показали, что изменение основных параметров освещения при культивировании каллуса влияет на частоту стеблевого органогенеза, особенно у сортов с низким морфогенетическим потенциалом (Новость Кузьмина, Молинг промис), у которых этот показатель в варианте с предварительным культивированием в темноте (6 недель) при t=25⁰С повысился примерно в 2 раза (табл. 11). Для всех изученных генотипов отмечен положительный синергический эффект при совместном добавлении в регенерационную среду 5,0 мг/л или 10,0мг/л 6-БАП и 0,5мг/л ИУК (сорта Карнавал, Комета) или 0,5мг/л 2,4-Д (сорта Новость Кузьмина, Молинг промис). Относительно высокая (15,0мг/л) и низкая концентрация (1,0мг/л) 6-БАП, также его сочетание с ИУК или 2,4-Д не оказывала достаточного стимулирования эффекта регенерации. Присутствие ИМК было малоэффективно. Проявление морфогенетической активности 6-БАП (5,0 и 10,0 мг/л) зависело от взаимодействия с ИУК и 2,4-Д, при котором увеличивалась способность к дифференциации стеблевых почек в культуре недифференцированных клеток каллуса.

Таблица 10

Регенерация адвентивных побегов в культуре каллусной ткани (возраст каллуса 100 суток)

Примечание: В таблице указаны варианты с частотой регенерации выше 10%.

Экспериментальные данные показали, что изменение основных параметров освещения при культивировании каллуса влияет на частоту стеблевого органогенеза, особенно у сортов с низким морфогенетическим потенциалом (Новость Кузьмина, Молинг промис), у которых этот показатель в варианте с предварительным культивированием в темноте (6 недель) при t=25⁰С повысился примерно в 2 раза (табл. 11).

Следовательно, повышение частоты регенерации вызвано действием внешнего «раздражителя» (темноты) на клетки, что способствует активации окислительно-восстановительных реакций и метаболических процессов и как следствие заложению адвентивных почек.

Таблица 11

Реакция каллуса на способность к регенерации при предварительном культивировании в темноте и различной температуре (среда Андерсона с 10,0 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л ИУК)

На повышение регенерации влияет осмотическое давление питательных сред (каллусогенеза и морфогенеза). Повышение давления среды осуществлялось увеличением концентрации глюкозы с 30мг/л (стандарт среды Андерсона) до 60 и 90г/л. Регенерация побегов, в опыте повысилась, особенно этот показатель увеличивался (более чем в 2 раза) на среде с 90г/л глюкозы. Частота регенерации составила 39,1-62,5%, а в контроле - 18,8-25% (рис.4).

Рис. 4 Влияние осмотического давления среды на каллусогенез (питательная среда Андерсона 2,4-Д 4,0 мг/л) и регенерацию адвентивных побегов (питательная среда Андерсона, 6-БАП 10,0 мг/л и ИУК 0,5 мг/л)

Индуцированные в опытах побеги отделяли от каллуса и после тиражирования и получения идентичных копий укореняли на среде Андерсона с добавлением 1,0мг/л 6-БАП (этап размножения) и 0,5 мг/л ИМК (этап ризогенеза). Таким образом, оптимальный подбор гормонального состава, предварительное культивирование в темноте, повышение осмотического давления питательной среды позволяет повысить уровень стеблевого органогенеза в каллусной культуре. Сочетание указанных факторов обеспечивает стабильный выход растений-регенерантов и тем самым повышает эффективность биотехнологических методов в селекционном процессе.

6.4. Регенерация растений непосредственно из исходных эксплантов. Выявлены варианты регенерационных сред, которые вызывали на эксплантах развитие адвентивных побегов. Среди них выделены два варианта с содержанием регуляторов роста, обеспечивших наиболее высокую частоту стеблевого органогенеза: 1) 6-БАП (10,0мг/л)+ИУК (0,5мг/л); 2) 6-БАП (10,0мг/л)+2,4-Д (0,5мг/л). На этих средах регенерировали побеги как из дисков, так и из черешков. Установлена зависимость, заключающаяся в различной реакции и специфических требованиях эксплантов опытных генотипов на введение в состав среды морфогенеза регуляторов роста ауксиновой природы. При культивировании листовых эксплантов сортов Карнавал и Комета развитие побегов лучше происходило под влиянием ИУК, а у сортов Новость Кузьмина, Молинг промис и Кумберленд - 2,4-Д (табл. 12).

Таблица 12

Стеблевой органогенез в культуре листовых дисков и черешков в зависимости от гормонального состава среды и генетических особенностей (1995г.)

Примечание. л - листовые диски; ч - сегменты черешков листьев.

Видимо, это связано с положительным синергическим эффектом конкретного экзогенного ауксина с 6-БАП и морфогенетической реакции генотипа сорта на то или иное сочетание регуляторов роста. При добавлении в регенерационную среду одного 6-БАП в различных концентрациях, в большинстве вариантов сред регенерация понижалась или вообще не происходила. Способность листовых дисков к формированию побегов несколько ниже, чем у листовых черешков. У первого типа эксплантов частота регенерации составляла 15,6-45,7%, а у второго - 18,2-51,1%.

Более полной реализации морфогенетического потенциала способствует двухэтапный прием культивирования листовых дисков и черешков на регенерационной среде, включавший предварительное (подготовительное) выращивание в полной темноте (6 недель и t=25⁰С) с последующим перенесением в стандартные (16 часовой фотопериод и t=25⁰С) условия с интенсивным освещением. Видимо, при нахождении клеток в темноте происходит усиление обменных процессов, увеличения активности нуклеиновых кислот, возрастание синтеза белка, т.е. в клетках протекают процессы, аналогичные таковым при действии стрессовых факторов, что приводит к более активному заложению почек.

Итак, биотехнологический прием получения регенерантов через прямой органогенез имеет важное значение для селекционной практики малины, в частности для размножения в системе in vitro трудноразмножаемых генотипов и, особенно для генетической трансформации и получения трансгенных растений.

6.5. Селекция тканевых культур резистентных к солевому стрессу. Резистентность тканевых линий оценивали по показателю частоты каллусообразования на селективных питательных средах. В таблице 13 представлены результаты исследований по селекции каллусных линий солевыносливых к различным дозам селективного агента с применением прямой (одноступенчатой) селекции.

Таблица 13

Пролиферация колоний каллусных клеток на селективных средах в зависимости от концентрации хлорида натрия (1994-1995 гг.)

Примечание. Каллус сортов Молинг промис и Новость Кузьмина культивировали на селективных средах в течение 4 пассажей, сорта Кумберленд - 5 пассажей.

Пролиферация клеток каллуса более активно происходит на средах, дополненных NaCl в концентрации 0,25% и 0,5%. В течении четырех-пяти пассажей уровень каллусогенеза, как и масса формирующихся колоний клеток, имеет тенденцию к увеличению. Линии клеток опытных вариантов находились в условиях имитации in vitro солевого стресса свыше 200 суток. Однако способность каллусной культуры к росту у сорта малины черной в условиях 1,0% NaCl сохраняется только в течение двух субкультивирований и полностью подавляется в третьем пассаже. В варианте опыта с добавлением в среду высокой дозы селективного агента (1,5% NaCl) наблюдается резкое снижение жизнеспособности клеток и полное ингибирование процесса новообразования клеточных колоний (сорта Кумберленд, Новость Кузьмина - 2 пассаж, сорт Молинг промис - 3 пассаж).

Таблица 14

Применение ступенчатой селекции для получения каллусных линий сорта Карнавал резистентных к хлориду натрия (среда Андерсона с 4,0 мг/л 2,4-Д, 1996г.)

Примечание^*. Каллус, полученный в 6 пассаже на среде с 1,5% NaCl, культивировали без селективного агента.

Для отбора каллусных линий резистентных к NaCl (1,5%) и сохраняющих способность к росту на селективной среде использовался прием ступенчатой селекции (табл. 14). Цикл последовательных пассажей каллусных культур в селективных условиях составлял 284 суток и состоял из восьми пассажей. В результате культивирования каллусных клеток на среде с постоянно увеличивающейся концентрацией NaCl (0,25%> 0,5%>1,0%>1,5%) отобраны линии, способные к росту в присутствии 1,5% соли (в опыте частота каллусообразования - 65,0%, в контроле - 89,7%). Следовательно, прием ступенчатой селекции позволяет выделить линии устойчивые к критической для пролиферации каллусных клеток малины концентрации солевого стрессора.

Выводы

В результате проведенных исследований разработаны и усовершенствованы цитологические и биотехнологические приемы, способствующие решению проблемы повышения интенсификации селекционного процесса некоторых плодовых культур.

Цитоэмбриологический метод в селекционных исследованиях способствует решению проблемы недостаточной семенной продуктивности отдаленных гибридов сливы разного уровня плоидности на основе исследования полного цикла развития женской генеративной сферы и прогамной фазы оплодотворения. Установлены характерные отклонения от нормы в формировании женских гаметофитов, которые влияют на фертильность семяпочек и плодоношение.

Цитологический анализ кариотипов гибридов инконгруэнтных скрещиваний позволяет дать предварительный прогноз степени плодовитости. При гибридизации диплоидных и тетраплоидных форм сливы формируются аллотриплоиды (2n=3x=24) с геномным составом (х+2х) и полным бесплодием. При скрещивании диплоид х гексаплоид гибриды являются аллотетраплоиды (2n=4x=32), геномный набор хромосом (х+3х).

Установлено, что для аллотриплоидов характерны значительные нарушения в процессах развития женских гаметофитов на всех этапах, что приводит к абортивности семяпочек и массовому опадению цветков (97,0 - 99,0%) и является причиной стерильности женской генеративной сферы и почти полного отсутствия плодоношения (1,3 - 1,7%).

Показано, у аллотетраплоидных гибридов нарушения в формировании женской генеративной сферы выражены в меньшей степени. В период массового цветения в семяпочках гибридов формируется примерно 29,3 - 37,5% морфологически нормальных женских гаметофитов, что свидетельствует о частичной женской стерильности.

Установлена степень совместимости в разных комбинациях скрещивания. Реакция несовместимости скрещиваемых компонентов связана с нарушениями механизма взаимоотношения мужского гаметофита со спорофитом пестика и является следствием проявления гаметофитной системы несовместимости.

Показано, метод эмбриокультуры позволяет эффективно решить проблему преодоления в разной степени выраженного бесплодия отдаленных гибридов сливы. От почти полностью бесплодных и слабоплодовитых гибридов получено 52 растения F₂. Среди которых выявлены формы со сдержанным ростом, высота сеянцев в пятилетнем возрасте не превышала 1 метра. Установлено, что выход жизнеспособных сеянцев прямо зависит от формирования морфологически нормальных женских гаметофитов и степени выполненности введенных в культуру зародышей.

Введение в питательную среду 6-БАП позволяет индуцировать из каждого зародыша яблони по несколько дополнительных побегов и увеличить выход однородных сеянцев. Разработан прием ризогенеза у полученных из зародышей in vitro побегов путем воздействия контрастными температурами. Укоренение увеличивается в 2 раза и более раз.

Показано, для повышения каллусообразующей способности экспланта и улучшения качественных показателей каллуса в среду необходимо вносит 2,4-Д (для малины) или ее сочетанием с ИУК и кинетином в соотношении 2:1:1 (для земляники). Установлено, что морфогенез in vitro у земляники осуществляется по типу адвентивного органогенеза. Показано, что в клетках 45 - 50-дневной каллусной ткани некоторых сортов малины наблюдается вариабельность кариотипов. Возникновение генетически нестабильных клеток составляет около 20% (сорт Карнавал).

10. Установлено, на регенерацию в культуре каллусных и листовых тканей земляники и малины оказывает влияние генетические особенности сорта, гормональный баланс питательной среды (их тип, концентрация, сочетания) и приемы воздействия на экспланты.

11. Выявлены различные сортовые реакции и специфические требования тканевых культур на введение в состав регенерационных сред регуляторов роста. Морфогенный эффект 6-БАП и его физиологическое свойство стимулировать регенерацию побегов реализуется при взаимодействии с экзогенными ауксинами.

12. На основе базовых сред Мурасиге - Скуга (для земляники) и Андерсона (для малины) разработаны регенерационные среды с одновременным введением 6-БАП и определенного препарата ауксиновой природы в соотношении 10:1 и 20:1, которые повышали морфогенетический потенциал каллусных и листовых тканей. Установлено положительное влияние контрастных температур и повышенного осмотического давления среды на регенерацию побегов из каллуса.

13. Разработана эффективная двухэтапная схема получения побегов in vitro в тканевых культурах модельных сортов земляники и малины, которая включает предварительное культивирование эксплантов в темноте с последующим помещением их в стандартные условия выращивания, что приводит к увеличению регенерация до 2-х раз (в зависимости от типа экспланта и генотипа сорта).

14. Установлено, уменьшение в среде Мурасиге - Скуга исходной концентрации NH₄NO₃ не оказывает существенного влияния на коэффициент размножения побегов, в то время как снижение содержания KNO₃ ухудшает в 4 раза пролиферацию побегов. При культивировании апексов оптимальным является 16-часовой фотопериод. Затемнение среды на этапе ризогенеза посредством введения красителя метиленовой сини способствует получению растений-регенерантов с хорошо развитой корневой системой.

15. Растения-регенеранты, полученные в каллусной культуре земляники показывают значительную изменчивость репродуктивных органов, а именно количества цветоносов (V=26,4%) и ягод (V=22,4%) на растении, которая сохранялась в R₁ и R₂ вегетативном поколениях в течении 4 лет. В меньшей степени выражено варьирование этих признаков у регенерантов в культуре листовых дисков (для количества цветоносов V = 16,5%, ягод V = 3,9%.

16. Создание в культуре in vitro имитации солевого стресса способствует отбору путем одноступенчатой селекции колоний каллусных клеток малины, пролиферирующих на селективных средах с NaCl (0,25-1,0%). Применение ступенчатой селекции позволяет провести скрининг тканевых линий в условиях критической для роста клеток концентрации солевого стрессора (1,5%).

Рекомендации для практической селекции

1. Для наиболее полной реализации генетического потенциала рода Prunus Mill и создания ценного исходного селекционного материала рекомендуется использовать:

а) аллотетраплоидные формы, формирующие от 29,3 до 37,5% нормальных зародышевых мешков. Опыление следует проводить в первый день цветения, т.к. в этот период женский гаметофит достигает полного развития;

б) аллотриплоидные формы, способные формировать до 3% зародышевых мешков. Опыление необходимо проводить на 2-4 день цветения, увеличивая при этом количество опыляемых цветков до 1-2 тысяч штук и число вовлекаемых в гибридизацию форм.

2. Для повышения результативности скрещиваний с участием отдаленных гибридов сливы разной степени фертильности, рекомендуется использовать метод эмбриокультуры. При работе с культурой зародышей руководствоваться разработанными «Методическими рекомендациями по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-селекционных работах с плодовыми», раздел «Применение культуры зародышей для повышения эффективности отдаленной гибридизации» (Мичуринск, 1987).

3. Рекомендуется культивировать изолированные зародыши яблони на среде Мурасиге-Скуга дополненной 6-БАП (1,0-4,0 мг/л) в целях тиражирования и сохранения ценных генотипов.

4. При проведении экспериментов с культурой ткани предлагается использовать разработанные нами методические рекомендации «Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур», раздел «Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины» (Мичуринск, 1996).

5. Индукцию адвентивного органогенеза в культуре изолированных каллусных тканей, листовых дисков и черешков следует проводить по схеме: I этап - культивирование эксплантов без освещения в течение 3 недель (земляника) и 6 недель (малина) при t=23±2 ⁰С; II этап - культивирование эксплантов в стандартных условиях при t=23±2 ⁰С и 16-часовом фотопериоде.

6. Для получения растений-регенерантов земляники с хорошо развитой корневой системой рекомендуется прием затемнения среды ризогенеза, содержащей 1,0 мг/л, за счет добавления нейтрального красителя метиленовой сини в концентрации 0,01 - 0,05%.

7. Селекцию каллусных линий малины, устойчивых к высоким концентрациям солевого стрессора, следует осуществлять на среде с постоянно увеличивающейся дозой NaCl (0,25 0,5 1,0 1,5%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Курсаков, Г.А. Некоторые результаты цитологического изучения отдаленных гибридов сливы / Г.А. Курсаков, Н.П. Романова, С.Л. Расторгуев, Г.С. Смирнова // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. 1978. Вып. 31. С. 3-6.

2. Курсаков, Г.А. Особенности формирования женского гаметофита у отдаленных гибридов сливы / Г.А. Курсаков, Н.П. Романова, С.Л. Расторгуев // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. 1980. Вып. 34. С. 3-9.

3. Курсаков, Г.А. Цитоэмбриологическое изучение отдаленных гибридов сливы в связи с использованием их в селекции / Г.А. Курсаков, С.Л. Расторгуев // Наука - производству: Тез. докл. науч. конф. М., 1981. С. 7-8.

4. Расторгуев, С.Л. Изучение совместимости при беккроссе аллотриплоидов сливы / С.Л.Расторгуев // Биологические аспекты изучения и рационального использования животного и растительного мира: Тез. докл. конф. Рига, 1981. С. 80-81.

5. Расторгуев, С.Л. Исследование опыления аллотетраплоидов сливы методом люминесцентной микроскопии / С.Л.Расторгуев // Пути интенсификации картофелеводства, плодоводства и овощеводства: Тез. докл. науч.-практ. конф. Минск, 1981. С. 16-17.

6. Курсаков, Г.А. Исследования особенностей роста пыльцевых трубок при отдаленной гибридизации косточковых растений методом люминесцентной микроскопии / Г.А. Курсаков, Н.П. Романова, С.Л. Расторгуев, Г.Г. Никифорова // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. 1982. Вып. 39. С. 3-8.

7. Расторгуев, С.Л. Использование метода люминесцентной микроскопии при отдаленной гибридизации сливы / С.Л.Расторгуев // Проблемы повышения эффективности современного садоводства: Краткие тез. докл. III Всес. науч. конф. молодых ученых. Мичуринск: ВНИИС им. И.В.Мичурина, 1982. С. 161-162.

8. Денисов, В.Ф. Способ определения морозоустойчивости растений яблони / В.Ф. Денисов, Б.В. Никольский, С.Л. Расторгуев // А.С. № 1045862, 1983.

9. Дубовицкая, Л.А. Культура изолированных зародышей в связи с отдаленной гибридизацией косточковых плодовых растений / Л.А. Дубовицкая, С.Л. Расторгуев // Генетические особенности и практические результаты отдаленной гибридизации плодовых растений: Тр. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. Мичуринск, 1984. С. 74-81.

10. Расторгуев, С.Л. Цитоэмбриологические особенности аллополиплоидов сливы / С.Л.Расторгуев, Н.М. Туровцева // Наука - сельскому хозяйству: Тез. докл. науч. конф. молодых ученых. Мичуринск, 1985. С. 25-26.

11. Расторгуев, С.Л. Усовершенствование устройства для просмотра и фотографирования цитологических препаратов в люминесцентном свете / С.Л.Расторгуев, Б.В.Никольский // Информ. листок, № 186-85. Тамбов, ЦНТИ, 1985. 4 с.

12. Шелаботин, Г.П. Устройство для обработки предметных стекол хромовой смесью / Г.П. Шелаботин, Б.В.Никольский, С.Л.Расторгуев // Информ. листок, № 204-85. Тамбов, ЦНТИ, 1985. 4 с.

13. Расторгуев, С.Л. К вопросу о микроклональном размножении ценных генотипов земляники / С.Л. Расторгуев // Интенсификация садоводства - составная часть Продовольственной программы СССР: Тез. докл. науч. конф. Мелитополь, 1985. С. 11-12.

14. Курсаков, Г.А. Цитоэмбриологические особенности и применение искусственной культуры зародышей при отдаленной гибридизации плодовых растений / Г.А. Курсаков, Л.А. Дубовицкая, С.Л. Расторгуев // Гаметогенез, оплодотворение и эмбриогенез семенных растений, папоротников и мхов: Тез. докл. IX Всес. совещ. по эмбриологии растений. Кишинев: Штиинца, 1986. С. 222.

15. Тюленев, В.М. Микроклональное размножение земляники в искусственной культуре / В.М.Тюленев, Л.В.Осипова, С.Л.Расторгуев // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. 1986. Вып. 43. С. 27-31.

16. Тюленев, В.М. Биотехнологические методы в селекции плодовых растений // В.М.Тюленев, П.М. Нафталиев, Л.В. Осипова, С.Л. Расторгуев, Н.В. Жукова, Н.Р. Гребешова // V съезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова: Тез. докл. М., 1987. Т.4. Ч.4. С. 251.

17. Шелаботин, Г.П. Устройство, повышающее качество цитологических препаратов и производительности при их приготовлении / Г.П. Шелаботин, Б.В. Никольский, С.Л. Расторгуев // Научные достижения - производству: Тез. докл. науч. конф. М., 1987. С. 71-72.

18. Тюленев, В.М. Быстрый способ размножения земляники / В.М.Тюленев, Л.В. Осипова, С.Л. Расторгуев // Информ. листок, № 264-87. Тамбов, ЦНТИ, 1987. 4 с.

19. Курсаков, Г.А. Применение культуры зародышей для повышения эффективности отдаленной гибридизации / Г.А. Курсаков, Л.А. Дубовицкая, С.Л. Расторгуев, О.С. Мячина // Методические рекомендации по применению искусственной культуры тканей и органов в генетико-селекционных работах с плодовыми. Мичуринск, 1987. С. 12-16.

20. Тюленев, В.М. Клональное микроразмножение ценных генотипов плодовых культур / В.М.Тюленев, Л.В. Осипова, П.М. Нафталиев, С.Л. Расторгуев // Биология культивируемых клеток и биотехнология: Тез. междунар. совещ. Новосибирск, 1988. С. 320.

21. Методические рекомендации по применению цитологических методов в плодоводстве / Н.П. Романова, Г.П. Шелаботин, В.Г. Леонченко, Н.П. Ханина, Б.В. Никольский, С.Л. Расторгуев, И.И. Туровский. М.: ВАСХНИЛ, 1988. 52 с.

22. Тюленев, В.М. Способ укоренения побегов яблони / В.М.Тюленев, П.М. Нафталиев, Л.В. Осипова, С.Л. Расторгуев // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. 1990. Вып. 48. С. 34-36.

23. Расторгуев, С.Л. Влияние физиологически-активных веществ на развитие изолированных зародышей яблони / С.Л. Расторгуев // Достижения науки - в практику: Краткие тез. докл. науч. конф. М., 1990. С. 110-111.

24. Расторгуев, С.Л. Способ регенерации из изолированных тканей земляники / С.Л. Расторгуев, В.М.Тюленев // Информ. листок, № 120-91. Тамбов, ЦНТИ, 1991. 3 с.

25. Тюленев, В.М. Получение растений-регенерантов из изолированных тканей земляники / В.М. Тюленев, С.Л. Расторгуев, И.И. Туровский // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. 1991. Вып. 50. С. 21-27.

26. Курсаков, Г.А. Изучение прогамной фазы при отдаленных скрещиваниях сливы методом люминесцентной микроскопии / Г.А. Курсаков, Л.А. Дубовицкая, С.Л. Расторгуев // // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В.Мичурина. 1992. Вып. 51. С. 15-20.

27. Тюленев, В.М. Усиление генетической изменчивости плодовых и ягодных растений в искусственной культуре / В.М.Тюленев, Л.В.Осипова, С.Л.Расторгуев // Управление генетической изменчивостью с.-х. растений: Тез. докл. междунар. совещ. Ялта, 1992. С. 100-101.

28. Тюленев, В.М. Регенерация растений из изолированных тканей плодовых и ягодных культур / В.М.Тюленев, Л.В.Осипова, С.Л.Расторгуев // VI съезд ВОГИС им. Н.И.Вавилова: Тез. докл. Минск, 1992. Ч.2. С. 156.

29. Тюленев, В.М. Регенерация растений из изолированных соматических тканей плодовых культур / В.М.Тюленев, Л.В.Осипова, С.Л.Расторгуев // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Российского симпозиума. Пущино, 1993. С. 173.

30. Tyulenev, V.M. Plant regeneration from isolated somatic tissues of fruit crops / V.M. Tyulenev, L.V. Osipova, S.L. Rastorguev // Trends in plant biotechnology: Abstracts second symposium. Pushcino, 1993. P. 409.

31. Тюленев, В.М. Индукция морфогенеза в тканевых культурах плодовых и ягодных растений / В.М.Тюленев, Л.В.Осипова, С.Л.Расторгуев // Генетика. 1994. Т. 30. С. 160.

32. Будаговский, А.В. Усиление морфогенетической потенции и индуцированной иммунной реакции соматических тканей растений в культуре in vitro под действием низкоинтенсивного когерентного излучения лазеров / А.В.Будаговский, В.М.Тюленев, С.Л.Расторгуев // Механизм действия сверхмалых доз: Тез. докл. II Междунар. симпозиума. М., 1995. С. 143-144.

33. Тюленев, В.М. Регенерация растений из изолированных соматических тканей и анализ сомаклональной изменчивости земляники / В.М. Тюленев, С.Л. Расторгуев // Бюл. науч. информ. ВНИИГиСПР им. И.В.Мичурина. 1995. Вып. 52. С. 55-56.

34. Биотехнология в селекции / Е.Н. Джигадло, М.И. Джигадло, В.М.Тюленев, Г.А. Курсаков, О.С. Жуков, Л.В. Осипова, С.Л. Расторгуев, Л.А. Дубовицкая, Г.С. Смирнова, О.Я. Олейникова // Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур. Орел: ВНИИСПК, 1995. С. 111-131.

35. Тюленев, В.М. Применение биотехнологических методов в плодоводстве / В.М. Тюленев, Л.В. Осипова, С.Л. Расторгуев, Н.В. Соловых // Современные проблемы плодоводства: Тез. докл. науч. конф. Самохваловичи, 1995. С. 17.

36. Соловых, Н.В. Применение тканевых культур в селекции плодовых растений / Н.В.Соловых, С.Л.Расторгуев // Молодые ученые - садоводству России: Тез. докл. Всерос. совещ. М., 1995. С. 9-12.

37. Расторгуев, С.Л. Регенерация растений из изолированных соматических тканей земляники и малины / С.Л. Расторгуев // Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур (Методические рекомендации). Мичуринск, 1996. С. 40-61.

38. Расторгуев, С.Л. Использование изолированных тканевых культур в селекции малины / С.Л. Расторгуев // Сельскохозяйственное производство и высшая школа на переломном этапе реформирования: Мат. обл. науч.-практ. конф. Мичуринск, 1996. Сб.2. Плодоводство. Ч.2. С. 35-36.

39. Расторгуев, С.Л. Разработка способов индукции растений-регенерантов земляники и малины в культуре тканей / С.Л. Расторгуев // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Докл. и сообщ. XVIII Мичуринских чтений. Мичуринск, 1998. С. 49-52.

40. Расторгуев, С.Л. Использование биотехнологических методов при отдаленной гибридизации сливы / С.Л. Расторгуев // Проблемы и перспективы отдаленной гибридизации плодовых и ягодных культур: Тез. докл. и сообщ. ХХ Мичуринских чтений. Мичуринск, 2000. С. 43.

41. Поляков, С.А. Особенности клонального микроразмножения сортов земляники / С.А. Поляков, А.В. Верзилин, С.Л. Расторгуев // Проблемы с.-х. производства в изменяющихся экономических и экологических условиях ХХI века: Мат. междунар. науч.-практ. конф. Пенза, 2000. С. 18-20.

42. Расторгуев, С.Л. Применение биотехнологических методов в селекции плодовых культур / С.Л. Расторгуев // Проблемы с.-х. производства на современном этапе и пути их решения: Тез. докл. IV междунар. науч.-практ. конф. Белгород, 2000. С. 33-34.

43. Расторгуев, С.Л. Клеточные технологии в селекции плодовых и ягодных культур / С.Л. Расторгуев // Вестник МичГАУ. Мичуринск, 2001. Т.1. № 1. Серия: плодоводство, цветоводство, овощеводство. С. 99-103.

44. Поляков, С.А. Биологические особенности перспективных сортов земляники при ускоренном размножении / С.А. Поляков, А.В. Верзилин, С.Л. Расторгуев, Ю.Н. Приходько // Научное обеспечение современных технологий производства плодов и ягод в России и странах СНГ. М., 2002. С. 78-81.

45. Поляков, С.А. Адаптация растений-регенерантов земляники к нестерильным условиям / С.А. Поляков, С.Л. Расторгуев, А.В. Верзилин // Повышение эффективности садоводства в современных условиях: Мат. Всерос. науч.-практ. конф. Мичуринск-Наукоград РФ, 2003. Т.2. С. 335-339.

46. Расторгуев, С.Л. Технологии in vitro в селекции плодовых культур / С.Л. Расторгуев, В.М.Тюленев // Мобилизация адаптационного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды: Междунар. науч.-практ. конф. М., 2004. С. 110-113.

47. Тюленев, В.М. Система современного использования стрессоров и антистрессоров в тканевой селекции плодовых и ягодных культур / В.М. Тюленев, Н.В. Соловых, А.Н. Перегоедов, Д.Г. Шорников, С.Л. Расторгуев // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Мат. III междунар. науч. конф. М., 2004. С. 92.95.

48. Поляков, А.С. Биологические особенности перспективных сортов земляники на этапах ризогенеза и адаптации / С.А.Поляков, А.В.Верзилин, С.Л.Расторгуев // Вестник МичГАУ. Мичуринск-Наукоград РФ, 2004. Т. 2. № 2. Серия: плодоводство, цветоводство, овощеводство. С. 106-108.

49. Расторгуев, С.Л. Возможности адвентивного органогенеза из соматических тканей малины / С.Л. Расторгуев // Современные достижения биотехнологии в виноградарстве и других отраслях с.-х.: Мат. конф. Новочеркасск, 2005. С. 116-121.

50. Расторгуев, С.Л. Регенерация растений и применение культуры тканей в селекции земляники / С.Л. Расторгуев, В.М. Тюленев // Аграрная наука. 2005. № 12. С. 16-19.

51. Расторгуев, С.Л. Метод эмбриокультуры в селекционной работе с аллополиплоидами сливы / С.Л. Расторгуев // Садоводство и виноградарство. 2006. № 2. С. 13-15.

52. Расторгуев, С.Л. Индукция морфогенеза в культуре каллусной ткани малины / С.Л. Расторгуев // Вестник РАСХН. 2006. № 6. С. 41-43.

53. Расторгуев, С.Л. Применение биотехнологических приемов для создания новых форм ягодных растений / С.Л. Расторгуев // Вестник МичГАУ. Мичуринск-Наукоград РФ, 2006. № 1. С. 53-57.

54. Расторгуев, С.Л. Селекция тканевых культур малины устойчивых к солевому стрессу / С.Л. Расторгуев // Вестник МичГАУ. Мичуринск-Наукоград РФ, 2006. № 2. С. 55-58

55. Расторгуев, С.Л. Размножение растений малины в условиях in vitro / С.Л. Расторгуев // Аграрная наука. 2007. № 3. С. 21-24.

56. Расторгуев, С.Л. Скрининг резистентных к хлориду натрия тканевых линий малины / С.Л. Расторгуев // Агро XXI. 2007. № 4-6. С. 38-39.

57. Расторгуев, С.Л. Оптимизация приемов регенерации из каллусных культур малины / С.Л. Расторгуев // Перспективы селекции яблони и других культур для промышленных насаждений: Мат. Всерос. науч.-практ. конф. Мичуринск-Наукоград РФ, 2.

58. Расторгуев, С.Л. Регенерация растений в культуре изолированных зародышей яблони/ С.Л. Расторгуев//Садоводство и виноградарство. 2008. №2.

Размещено на Allbest.ru