Генетическое картирование у ржи Secale Cereale L.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Генетическое картирование у ржи SECALE CEREALE L.

Специальность 03.00.15. - генетика

Войлоков Анатолий Васильевич

Санкт-Петербург 2008

1. Общая характеристика работы

Актуальность исследований. Генетика ржи отстает в своем развитии от генетики родственных видов - пшеницы и ячменя. Причинами этого являются меньшая экономическая важность ржи, как сельскохозяйственной культуры и сложности в экспериментальной работе с рожью, связанные с присущей ей строгой системой гаметофитной несовместимости. На протяжении многих лет интерес исследователей в первую очередь был связан с ролью ржи в улучшении пшеницы и создании тритикале. Рожь является в этих случаях источником генов устойчивости к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям. Интерес ко ржи, как к самостоятельной сельскохозяйственной культуре, в странах основных производителях зерна ржи - России, Германии и Польше в последнее время заметно усилился (Гончаренко, 2006; Boros, 2007; Rode, 2007). Это связано как с уже упомянутыми биологическими особенностями, так и c расширением сферы использования зерна и зеленой массы озимой ржи (Рожь, 1989; Miedaner, 1997). В связи с этой задачей становится актуальной селекция сортов ржи целевого назначения.

В Германии эта задача успешно решается с помощью сортов-гибридов, создание которых по традиционной схеме с использованием ЦМС стало возможным благодаря внедрению автофертильных форм ржи. В России внедрение сортов-гибридов экономически оправдано только в регионах с почвенно-климатическими условиями, обеспечивающими максимальную реализацию потенциала гибридов. Для районов с неблагоприятными условиями среды целесообразно создание спектра сортов-популяций, разного целевого назначения на основе современных районированных, высокоадаптивных сортов ржи и совершенствования методов их селекции. Внедрение автофертильности для улучшения и дифференциации существующих сортов ржи является в связи с этим актуальной задачей. Эта и целый ряд других научных и практических задач может эффективно решаться в настоящее время с помощью генетических маркеров, позволяющих манипулировать участками хромосом, включающими гены, представляющие интерес для исследователя или селекционера. Использование маркеров основано на генетическом картировании и подборе тех из них, которые тесно (абсолютно) сцеплены с интересующим нас геном. Таким образом, генетическое картирование у ржи является актуальной проблемой, на решение которой и были направлены наши исследования.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - картирование генов, маркеров и локусов количественных признаков в геноме ржи и разработка на этой основе новых подходов к решению научных и практических задач, возникающих при работе с этой культурой.

Задачи исследований:

· провести гибридологический анализ автофертильности;

· идентифицировать мутации автофертильности у инбредных линий ржи Петергофской генетической коллекции;

· картировать мутации автофертильности относительно морфологических, биохимических и молекулярных маркеров;

· изучить сцепление между изозимными маркерами хромосом ржи;

· с помощью изозимных локусов установить хромосомную локализацию ряда морфологических маркеров и мейотических генов, а затем картировать их относительно молекулярных маркеров;

· обобщить полученные данные по сцеплению с помощью построения скелетных генетических карт хромосом ржи;

· картировать локусы, отвечающие за морфологические хозяйственно-значимые количественные признаки;

· разработать подход к выявлению и картированию генов ржи, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале;

· развить генетическое изучение мейоза у ржи на основе точной идентификации генотипов по мейотическим мутациям с помощью маркеров;

· обосновать для ржи схему селекции сортов-популяций на основе генетического маркирования мутаций автофертильности.

Научная новизна исследований:

· установлен ген ржи (Т), мутации в котором ведут к автофертильности наряду с мутациями в основных локусах несовместимости S и Z;

· впервые проведено молекулярное картирование локусов S, Z и Т;

· идентифицированы мутации автофертильности у 19 инбредных линий ржи, представляющих 10 источников автофертильности Петергофской генетической коллекции;

· с помощью изозимных и молекулярных маркеров впервые картированы пять морфологических маркеров и три синаптических гена;

· в молекулярные карты генома ржи непосредственно включены 19 биохимических маркеров;

· впервые установлен и локализован в хромосоме 6R мутантный ген ржи, отвечающий за эмбриональную летальность пшенично-ржаных гибридов;

· впервые у ржи проведен маркерный анализ количественных признаков и картированы локусы, контролирующие урожай и его компоненты;

· показано, что локусы количественных признаков (ЛКП), выявленные у ржи, характеризуются с одной стороны множественными эффектами, а с другой зависимостью их проявления от условий среды и генотипического фона.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы имеют значение для частной генетики ржи, сравнительной генетики злаков, селекции ржи и тритикале.

В итоге исследований у ржи идентифицированы новые гены, существенно пополнены генетические карты хромосом, впервые получено представление о числе, эффектах действия и положении в геноме локусов ржи, контролирующих количественные признаки.

Предложен и реализован подход по обнаружению и картированию генов, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале. Предполагается, что подобные гены, с одной стороны, могут отвечать за несовместимость геномов при отдаленной гибридизации, а с другой - обеспечивать стабилизацию структуры и функций генома в ходе эволюции на основе отдаленной гибридизации.

Теоретически обоснована схема селекции сортов-популяций ржи, включающая в себя скрещивание источника автофертильности с растениями улучшаемого сорта, самоопыление полученных гибридов, отбор и переопыление лучших инбредных потомств с последующим устранением мутации автофертильности с помощью тесно сцепленного изозимного маркера и восстановлением вследствие этого перекрёстного опыления и популяционного гетерозиса. Возможность практической реализации схемы подкреплена разработкой соответствующего оборудования (патент РФ №2173453) и получением генетически охарактеризованного материала.

Результаты работы используются в практикумах и лекционных курсах, а также при выполнении исследовательских работ студентами и аспирантами кафедры генетики и селекции СПбГУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

· автофертильность у ржи является следствием мутаций, по крайней мере, в одном из трех локусов (S, Z и Т), контролирующих реакцию несовместимости;

· генетическое картирование мутантных генов у ржи можно эффективно проводить с использованием изозимных локусов в качестве якорных маркеров;

· скрытые мутации генов ржи, ведущие к несовместимости геномов у пшенично-ржаных гибридов, можно выявлять и картировать с помощью предложенного варианта гибридологического анализа;

· уровень спонтанной мутационной изменчивости у ржи обеспечивает возможность картирования множества локусов количественных признаков у гибридов между двумя неродственными линиями;

· способ селекции сортов-популяций у ржи, основанный на генетическом маркировании мутаций автофертильности, может быть использован для улучшения существующих сортов ржи и их дифференциации на сорта разного целевого назначения.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных конференциях и симпозиумах: IV съезде ВОГиС (Кишинев, 1982), I Всесоюзном совещании по проблемам эволюции (Москва, 1984), V съезде ВОГиС (Москва, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1987), симпозиуме EUCARPIA по селекции ржи (Ленинград, 1988), XIII Конгрессе EUCARPIA (Франция, 1992), I съезде Вавиловского ОГиС (Москва, 1994), IX международной конференции EWAC (Германия, 1995), IV рабочем совещании по кооперации Германия-Россия в области биотехнологии (Санкт-Петербург, 1996), международной конференции «Агробиотехнологии растений и животных» (Киев, 1997), IV международном симпозиуме по тритикале (Канада, 1998), II съезде Вавиловского ОГиС (Санкт-Петербург, 2000), V международном симпозиуме по тритикале (Польша, 2002), международной конференции по отдаленной гибридизации (Москва, 2003), XII международной конференции EWAC (Англия, 2002), международном симпозиуме EUCARPIA по селекции и генетике ржи (Германия, 2006), научно-практической конференции «Озимая рожь: селекция, семеноводство, технологии и переработка» (Саратов, 2006), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006).

Публикации. По материалам исследований опубликовано 54 печатные работы в отечественных и зарубежных изданиях.

2. Содержание работы

2.1 Обзор литературы

В обзоре литературы излагаются данные по изучению генетического контроля автофертильности у ржи в связи с задачей картирования мутаций автофертильности. Приводится характеристика основных типов генетических маркеров - морфологических, биохимических и молекулярных, особое внимание уделяется описанию генетического контроля изоферментов. В историческом плане обсуждаются данные по генетическому картированию у ржи.

2.2 Материалы и методы

Материалы. В качестве растительного материала использовали инбредные автофертильные линии и самонесовместимые образцы ржи Петергофской генетической коллекции, созданной под руководством В.С. Федорова (Смирнов, Соснихина, 1984). Для генетического изучения автофертильности привлекали 19 линий, представляющих десять источников автофертильности, и гибриды с самонесовместимыми формами, полученные на их основе. Картирование морфологических маркеров проводили на основе гибридов F₂, расщепляющихся по одному или нескольким маркерам. Для картирования синаптических мутаций получали гибриды между растениями линий - носителями мутаций и линиями с нормальным мейозом. Гибриды F₂, расщепляющиеся по синаптическим мутациям, отбирали после предварительного скрининга на выщепление стерильных растений. Картирование локусов количественных признаков осуществляли с помощью двух типов картирующих популяций - реципрокных межлинейных гибридов F_2-3 (87 х 105, Минские картирующие популяции (МКП)) и межлинейных гибридов F_2-3, полученных на основе скрещиваний трех неродственных линий - линий 2, 6 и 7 (2х6, 2х7, 6х7, Петергофские картирующие популяции (ПКП)).

Методы. В работе использовали методы генетического анализа качественных и количественных признаков, подробное описание которых приводится в соответствующих разделах диссертации. Часть из этих методов является оригинальной, в частности - проведение гибридологического анализа признаков, проявляющихся как новообразования у пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале.

Изоферментный анализ проводили в соответствии со стандартными, незначительно модифицированными методами (Wehling, 1984). Применяли вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле и изоэлектрическое фокусирование. Для приготовления грубых экстрактов, центрифугирования и электрофореза использовали оригинальное оборудование (патент РФ № 2173453). Данные по молекулярным маркерам получены при осуществлении совместных проектов с IPK (Гатерслебен, Германия) и ИГиЦ НАН Беларуси.

Установление сцепления, анализ моно - и дигибридных расщеплений путем разложения критерия ч² (Wehling,1984), а также расчет частоты рекомбинации на основании метода максимального правдоподобия (Allard, 1956), осуществляли с помощью оригинальной компьютерной программы Recomb (автор - М.И. Рахман). Опубликованные генетические карты построены с использованием программы MAPMAKER/EXP 3.0 (Lander et al., 1987) и MAPMAKER/QTL 1.1 (Paterson et al., 1988). При построении скелетных генетических карт осуществляли верификацию опубликованных карт на основе лицензионной программы MultiPoint 1.2. Анализ локусов количественных признаков у Петергофских картирующих популяций проводили с помощью лицензионной версии MultiQTL 2.5 (MultiQTL Ltd.).

2.3 Результаты и обсуждение

2.3.1 Генетический анализ автофертильности у ржи

Сегрегационный анализ автофертильности. При гибридологическом анализе автофертильности мы использовали два типа скрещиваний, предложенных А.Лундквистом (Lundqvist, 1960) для установления мутаций автофертильности (самосовместимости) в локусах S и Z, контролирующих у ржи реакцию несовместимости, протекающую по гаметофитному типу. Первый тип скрещиваний - это скрещивания самонесовместимых (автостерильных, SS) клонов сорта Волхова и гибридов F₁ между растениями этого сорта и семью автофертильными линиями (линии 2-8), представляющими шесть источников автофертильности. Второй тип скрещиваний - это скрещивания тех же самонесовместимых клонов и межлинейных гибридов, полученных по циклической схеме.

У гибридных растений анализировали завязываемость семян при самоопылении трёх-пяти колосьев. При анализе распределения по завязываемости семян было установлено, что подавляющее большинство растений попадают в одну из двух групп - группу автостерильных растений (SS) с завязываемостью семян меньшей 5 % или в группу автофертильных (SF) растений с завязываемостью семян большей 10 %. Подсчет соотношения растений SF и SS у гибридов первого типа позволяет определить число мутаций автофертильности (sf-мутаций) у инбредной линии. Если линия несет одну мутацию, то у соответствующих гибридов должно наблюдаться расщепление по автофертильности в соотношении 1SF : 1SS. Если линия несет две несцепленные мутации, расщепление по автофертильности будет соответствовать 3SF : 1SS.

Второй тип скрещиваний позволяет установить аллелизм мутаций автофертильности. Если родительские линии несут по одной мутации, то отсутствие расщепления по автофертильности указывает на аллелизм этих мутаций. Расщепление 3SF : 1SS ожидается, если родительские линии мутантны по разным не сцепленным локусам несовместимости (например, S и Z). В нашем исследовании у всех гибридов первого типа (табл. 1) расщепление по автофертильности соответствовало соотношению 1SF:1SS, но не 3SF:1SS.

Таблица 1 Расщепление по автофертильности (SF) в потомствах от скрещиваний автостерильных (SS) клонов с гибридами F1 (SS х SF)

*, **, *** - P<0,05; P<0,01; P<0,001 соответственно

Таким образом, можно заключить, что изученные линии несут по одной мутации автофертильности. Отсутствие расщепления по автофертильности у шести гибридов второго типа (табл. 2) указывает на аллелизм мутаций автофертильности в пределах двух групп линий - одной, включающей линии 5, 6, 7 и 8 и второй, включающей линии 2 и 3. Для всех остальных гибридов наблюдали расщепление в соотношении 3SF : 1SS, что позволило нам сделать вывод о существовании не двух, а трех независимо наследующихся локусов, мутации в которых приводят к автофертильности. Таким образом, линии 5, 6, 7 и 8 мутантны по первому из них, линии 2 и 3 - по второму, а линия 4 - по третьему (Voylokov et al., 1993; Войлоков и др., 1994).

Установление хромосомной локализации и идентификация мутаций автофертильности. Локусы S и Z были локализованы немецкими исследователями в хромосомах 1R и 2R с помощью изозимных маркеров Prx7 (Wricke, Wehling, 1985) и в-Glu (Gertz, Wricke, 1989) соответственно. Локализация локусов несовместимости была основана на селективности оплодотворения, свойственной частично совместимым скрещиваниям самонесовместимых растений (Lundqvist, 1954, 1956). В случае самоопыления гетерозигот по мутации автофертильности также имеет место гаметическая селекция - в оплодотворении участвуют только спермии, переносимые пыльцевыми зернами с мутантными аллелями в локусах несовместимости. Чем ближе аллель маркера расположен к мутации - тем сильнее отклоняется соотношение генотипов по маркеру от менделевского соотношения 3:1 (Смирнов, Соснихина, 1984; Суриков, 1991). Особенно удобны для проведения маркерного анализа маркеры с кодоминантными аллелями. В расщеплении по таким маркерам можно статистически оценить наличие гаметической селекции с помощью разложения критерия ч² (Wehling, 1985). В случае гаметической селекции у одного пола, например, при самоопылении дигетерозиготы SfA₁/SA₂, где Sf - неактивная, а S - любая активная аллель, наблюдается достоверный избыток гомозигот по аллели маркера, полученной от самосовместимого родителя (A₁₁) и недостаток гомозигот по аллели маркера, полученной от самонесовместимого родителя (A₂₂) при сохранении доли гетерозигот (A₁₂), равной 0,5. Частота рекомбинации между локусом несовместимости и кодоминантным маркером определяется как доля гомозигот A₂₂ от общей численности гомозигот (A₁₁ + A₂₂).

Таблица 2 Расщепление по автофертильности в потомствах от скрещивания автостерильных (SS) клонов с межлинейными гибридами

** P<0,001

Для идентификации мутаций автофертильности использовали инбредные семьи F₂ от гибридов между автостерильными растениями сорта Волхова и автофертильными инбредными линиями - 2, 3, 4, 5, 6 и 8 (Fuong et al., 1993; Войлоков и др., 1994). Тесное сцепление локуса S с геном Prx7 в хромосоме 1R позволило легко идентифицировать мутации автофертильности в этом локусе. Расщепление по Prx7 в семи семьях F₂ с участием линий 5, 6 и 8 оказалось близким к соотношению 1A₁₁:1A₁₂, ожидаемому при абсолютном сцеплении мутации и маркера (табл. 3).

Таблица 3 Расщепление по локусам Prx7, в-Glu и AadhNADP у гибридов F₂ от скрещивания автостерильных растений и растений инбредных линий

*** - P <0,001

Поскольку при сегрегационном анализе автофертильности был установлен аллелизм мутаций автофертильности у линий 5, 6, 7 и 8, этот вывод распространяется и на линию 7. Расщепление по Prx7 у гибридов F₂ между автостерильными растениями и автофертильными линиями 2, 3 и 4 соответствует соотношению 1:2:1.

Изозимным маркером второго локуса самонесовместимости Z является ген в-Glu, контролирующий в-глюкозидазу. Установленная частота рекомбинации между этими локусами составляет 14,4 ± 3,3 %; (Gertz, Wricke, 1989). Анализ расщепления по в-Glu у гибридов F₂ с линиями 2, 4 и 5, 6 выявил отклонения ожидаемого типа только у гибрида с линией 4 (табл. 3). Таким образом, можно сделать вывод о наличии у этой линии неактивной аллели локуса Z.

Для установления хромосомной локализации третьей мутации автофертильности, свойственной близкородственным линиям 2 и 3, был проведен анализ расщеплений по дополнительным изозимным маркерам хромосом ржи. Отклонения ожидаемого типа были обнаружены только для кластера эстеразных генов Est6/9 и гену AadhNADP, контролирующему NADP-зависимую дегидрогеназу ароматических спиртов, принадлежащих хромосоме 5R. Наиболее показательно расщепление по AadhNADP, говорящее о тесном сцеплении этого гена с мутацией автофертильности (табл. 3). Таким образом, нами был обнаружен и локализован в хромосоме 5R третий локус, контролирующий самонесовместимость у ржи. В масштабных мутационных экспериментах у канареечника (Phalaris coerulescens Desf.) также был обнаружен третий локус самонесовместимости (T), помимо двух мультиаллельных локусов S и Z, установленных у этого вида ранее (Hayman, Richter, 1988). Учитывая систематическую близость ржи, канареечника и других самонесовместимых видов семейства Poaceae, можно думать, что третий локус самонесовместимости входит в общую для этих видов систему генетического контроля внутривидовой несовместимости наряду с локусами S и Z.

Маркерный анализ с привлечением дополнительных источников автофертильности. Успешная идентификация мутаций автофертильности у семи линий позволила перейти к целенаправленной идентификации мутаций из других источников. Работа строилась на анализе расщеплений по изозимным маркерам локусов S, Z и T. Итоги этой работы представлены в табл. 4. Таким образом, мутации автофертильности были идентифицированы у 19 линий, представляющих десять основных источников автофертильности Петергофской генетической коллекции (Егорова, Войлоков, 1998 а, б). Пользуясь объединенными данными, нами была рассчитана частота рекомбинации между локусами несовместимости и маркерами, значения которой составили для S и Prx7 - 1,7 ± 0,8 %, для Z и в-Glu - 21,9 ± 2,2 % и для T и AadhNADP - 2,7 ± 1,2 %.

Таблица 4 Характеристика инбредных линий ржи по мутациям автофертильности

Картирование мутаций автофертильности с помощью молекулярных маркеров. Сцепление мутаций автофертильности с изозимными локусами с известной хромосомной локализацией значительно облегчило картирование этих мутаций с помощью RFLP-маркеров. Анализ проводили с помощью трех картирующих популяций, полученных путем скрещивания самонесовместимых растений сорта Волхова с инбредными линиями 6 (Sf), 454 (Zf) и 2 (Tf) и самоопыления отдельных растений F₁. Помимо RFLP-маркеров, принадлежащих хромосомам 1R, 2R и 5R, использовали изозимные локусы Prx7, Lap1 (1R), AadhNADP, Est2, Est6/9 (5R), а также морфологический маркер локуса Z - мутацию безлигульности el (2R). Анализ строился на сравнении порядка расположения маркеров на картах, построенных с помощью алгоритмов многолокусного картирования (Lander et al., 1987), и порядка, установленного на основе учета степени отклонения от соотношения 1:2:1 вследствие селективного действия мутации автофертильности (Voylokov et al., 1997). Для всех трех локусов обнаружены молекулярные маркеры, тесно сцепленные с sf-мутациями. В случае локуса S это два маркера Xpsr634 и Xiag249, помимо изозимного локуса Prx7; в расщеплении по всем трем маркерам рекомбинантный класс отсутствует. Такая же ситуация обнаружена и в расщеплении по локусу Xbcd266 из хромосомы 2R, несущей локус Z; среди 73 растений F₂ нет ни одной гомозиготы по аллели маркера, полученной от самонесовместимого родителя. Косегрегирующие локусы Xpsr120a и Xpsr360 сцеплены с локусом T (5R) сильнее, чем изозимный маркер AadhNADP .

2.3.2 Построение генетических карт хромосом ржи

Анализ сцепления изозимных локусов. На протяжении длительного времени у ржи и других объектов изозимные локусы рассматривались в качестве самостоятельного типа маркеров, с помощью которых предпринимали попытки построения генетических карт и проводили картирование отдельных генов (Войлоков, 1978; Левитес, 1986; Wehling, 1986).

Рис.1 Установленный порядок изозимных локусов в хромосомах ржи. Генетические расстояния (r) между маркерами указаны в процентах, пунктиром соединены независимо наследующиеся маркеры. В случае гетерогенности по частоте рекомбинации у разных гибридов через дефис указаны минимальное и максимальное значение r.

В наших исследованиях мы использовали свыше 30 полиморфных биохимических маркеров, для 24 из них («листовых» изозимных маркеров) получены и проанализированы данные по сцеплению большинства возможных пар маркеров у нескольких гибридов F₂. Это позволило установить гетерогенность гибридов по частоте рекомбинации для некоторых пар маркеров. Выявленные различия для некоторых из пар достигают трехкратных.

Всего было обнаружено 29 случаев сцепления изозимных локусов, что позволило установить три группы сцепления, относящиеся к хромосомам 1R, 5R, и 6R, а также обнаружить сцепление отдельных пар маркеров в хромосомах 2R, 3R и 7R (рис.1).

Картирование генов, контролирующих морфологические признаки. При генетическом картировании морфологических и мейотических генов мы использовали один и тот же подход. Вначале устанавливали сцепление генов с изозимными локусами, а затем проводили детальное картирование выделенного участка хромосомы с помощью молекулярных маркеров. Сцепление с одним или несколькими изозимными маркерами было установлено для следующих генов, контролирующих морфологические признаки: el (отсутствие лигулы), Vs (фиолетовые семена), ln (светлые узлы), w, wa1 (отсутствие воска на междоузлиях и листьях), np, ct2 (карликовость), Hs (опушение влагалищ листьев), Ddw (доминантная короткостебельность), cb (коричневая солома), mn (многоузлость), vi (отсутствие антоциана), mp (дополнительные пестики вместо тычинок).

Для шести генов (ln, w, np, cb, mn, mp) была впервые установлена их хромосомная локализация через сцепление с изозимными маркерами. Использование высокополиморфных RFLP-маркеров позволило построить генетические карты, включающие сцепленные морфологические маркеры и изозимные локусы, на основе тех гибридов, для которых был установлен факт сцепления. Таким образом, были построены фрагменты генетических карт хромосом 4R, 6R и 7R. Для всех изученных гибридов был обнаружен полиморфизм по RFLP-маркерам, достаточный для построения групп сцепления, включающих помимо изозимных и морфологических по 5-10 молекулярных маркеров (рис. 2).

Картирование мейотических генов. В соответствии с выбранной схемой картирования в пяти специально созданных картирующих популяциях был проведен анализ сцепления синаптических генов (sy1, sy9 и sy19) с изозимными маркерами. В каждой из популяций было обнаружено сцепление генов с определенными изозимными локусами. Вследствие тесного сцепления у двух гибридов F₂ с общей численностью 160 растений не было обнаружено рекомбинации между мутацией sy1 и локусом Got2 (7R). Частота рекомбинации между sy9 и Sod2 (2R) составила в одной гибридной популяции 20,1 ± 4,5 %, а в другой - 7,4 ± 2,5 %. Мутация sy19 оказалась сцепленной с изозимным маркером хромосомы 7R - локусом Acph1 (r=3,4 ± 2,2 %). Для молекулярного картирования участков хромосом, включающих синаптические гены, использовали SSR-маркеры (микросателлитные локусы). Полиморфизм маркеров этого типа оказался достаточным для картирования всех трех генов. Для генов sy1 и sy9 было найдено по два микросателлитных локуса, косегрегирующих с этими генами, это маркеры Xgwm132, Xscm43 для sy9 (2R) и маркеры Xrems1135, Xrems1188 для sy1 (7R). Третий синаптический ген sy19, как и ген sy1, был локализован в хромосоме 7R, что могло бы, в случае отсутствия генетических карт, поставить вопрос об их аллелизме. Однако положение sy1 и sy19 на генетических картах исключает аллелизм этих мутаций.

Рис.2. Генетические карты участков хромосом ржи, включающие молекулярные (Х), биохимические (Sod2, Got1, Lap2, Aco1, Acph2/3, Got2, Acph1), морфологические (w, np, cb, mp, wa1) маркеры и синаптические (sy1, sy9, sy19) гены. Генетические расстояния указаны в сантиморганах (Kosambi, 1944).

Генетическое расстояние между Xrems1135 и Xrems1188, маркерами мутации sy1, и мутацией sy19 составляет 16,5 сМ и 15,1 сМ соответственно (рис 2). Таким образом, можно говорить о сцеплении, но не об аллелизме мутаций sy1 и sy19. Обнаружение маркеров, тесно сцепленных с генами sy1 и sy9, позволило нам разработать схему выделения двойных мутантов по этим генам.

Построение обобщающих генетических карт на основе RFLP-маркеров. В настоящее время обобщающие генетические карты многих видов растений создают на основе одного гибрида, расщепляющегося по большому числу маркеров. В качестве таких «скелетных» маркеров выступают молекулярные маркеры, отбираемые на основании высокого полиморфизма, относительно равномерного распределения по длине хромосом и однозначной идентификации. Наполнение интервалов дополнительными маркерами производят на основании сцепления скелетных маркеров, как фланговых, с маркерами и генами, изученными у других гибридов.

Для построения скелетных карт мы использовали данные для одного из двух реципрокных гибридов F₂, полученных при скрещивании линий 87 и 105 (Korzun et al., 2001). Гибридная популяция включала 153 растения, генотипированных по 139 RFLP-маркерам, 19 биохимическим и двум морфологическим маркерам. Верификация опубликованных карт осуществлялась с помощью программы MultiPoint v.1.2. Проверка показала, что опубликованный порядок маркеров для большинства хромосом является наиболее вероятным. Однако в ряде случаев алгоритмы программы MultiPoint (Meister et al., 2005) позволили нам выявить маркеры с негативным влиянием на стабильность последовательности маркеров и улучшить качество карт путем устранения «плохих» маркеров. Построенные скелетные карты характеризуются высокой стабильностью порядка маркеров и минимальной длиной для всех семи хромосом. Маркеры, которые были удалены при верификации карт, отнесены с соблюдением правила минимальной длины карт к их наиболее вероятному местоположению (интервалу). Эти маркеры названы нами ассоциированными. В качестве ассоциированных маркеров на обобщающих картах указаны маркеры и гены, картированные нами в других экспериментах. Включение дополнительных маркеров проводилось при наличии общих фланговых маркеров на скелетной карте и фрагменте карт, построенных для специальных целей.

2.3.3 Картирование локусов количественных признаков

Картирование локусов количественных признаков с помощью МКП. Наиболее важные хозяйственно-ценные признаки культурных растений относятся к категории количественных. Маркерный анализ локусов количественных признаков (ЛКП, quantitative trait loci-QTL) позволяет выявлять ЛКП, определять их эффекты и картировать на генетических картах (Серебровский, 1970; Король и др., 1990). Сложность проведения анализа ЛКП у озимой ржи, связана в первую очередь с длительным жизненным циклом, в течение которого растения в поле подвергаются влиянию резко меняющихся условий среды, переносят заболевания и повреждаются насекомыми. Все это значительно увеличивает ненаследственную изменчивость, в которой могут «потонуть» генетически контролируемые различия.

Одной из наших задач было установить саму возможность проведения экспериментов по картированию ЛКП у озимой ржи. С целью уменьшения модификационной изменчивости использовали семьи F₃, полученные от самоопыления растений из разных картирующих популяций F₂. Для расчетов использовали средние арифметические значения признаков, измеренных у шести растений каждой семьи. Семьи в пределах делянок располагали случайным образом. Первые данные по анализу ЛКП, полученные нами в предварительных экспериментах (Bхrner et al.,1999) показали, что картирование ЛКП у ржи является реальной задачей. В популяции, расщепляющейся по гену доминантной короткостебельности (Ddw), в прицентромерном районе плеча 5RL между маркерами AadhNADP и Xwg1026 был картирован не полностью доминантный локус, отвечающий за два тесно скоррелированных признака - длину колоса и число колосков в нем. В дистальном участке этого же плеча локализован ген Ddw, эффекты которого на длину стебля также были обнаружены при проведении маркерного анализа. Более масштабные эксперименты были проведены с потомствами F₃, полученными на основе Минской картирующей популяции. Эксперименты проводили в трех вариантах условий выращивания растений - в полевых условиях в Гатерслебене (Германия) и в Старом Петергофе, а также в теплице после предварительной яровизации растений. Эта популяция также расщеплялась по гену Ddw, поэтому значительную часть выявленных ЛКП (10 из 21) можно отнести за счет плейотропных эффектов этого гена. Дополнительный локус с плейотропным эффектом на компоненты урожайности был обнаружен в прицентромерном районе хромосомы 2R. Остальные локусы со специфическими эффектами отнесены к хромосомам 1R, 2R, 4R, 6R и 7R. Как и в большинстве исследований по картированию ЛКП, эффект выявленных локусов обнаружен не для всех условий выращивания растений (Bхrner et al., 2000).

Картирование локусов количественных признаков с помощью ПКП. Расщепление по гену Ddw с сильными множественными эффектами могло маскировать проявление ЛКП, влияющих на те же признаки, но обладающими меньшими эффектами. Это влияние можно устранить путем проведения множественного интервального картирования, при котором последовательно выявляются наиболее сильные ЛКП, а затем их эффект снимается при анализе эффектов других хромосом (Kao et al., 1999). Однако использованная нами программа MAPMAKER/QTL1.1 (Paterson et al, 1988) не позволяла провести такой анализ. С другой стороны, для выявления изменчивости по ЛКП было интересно привлечь дополнительный генетический материал. С этой целью нами были получены гибриды между тремя неродственными линиями Петергофской генетической коллекции - линиями 2, 6 и 7, выделенными путем прямого инбридинга из сортов Steel (линия 6) и Вятка (линии 2 и 7). Диаллельность скрещиваний открывала и дополнительные возможности - эффекты ЛКП, обнаруженные у одного гибрида F_2-3 можно было проверить при анализе двух других гибридов. Так, в случае обнаружения ЛКП у одного из трех гибридов тот же ЛКП мог быть обнаружен еще у одного из гибридов (ситуация двух аллелей ЛКП) или у всех трех (ситуация трех аллелей ЛКП). Подобный прогноз мог быть сделан и в отношении эффектов аллелей этих генов. Очевидно, что такое предсказание могло сбыться только в случае отсутствия влияния генотипического фона гибридов на выявляемость и эффекты ЛКП, а также при условии близости гибридов по статистическим показателям, главным из которых является одинаковая плотность генетических карт в анализируемом участке хромосомы. Разрешающую способность анализа должно было повысить и использование программы MultiQTL v.2.5, в которую заложен очень большой выбор возможностей.

Для проведения анализа ЛКП была осуществлена верификация ранее опубликованных генетических карт (Khlestkina et al., 2004) с включением в эти карты дополнительных молекулярных маркеров. С помощью программы MultiPoint v.1.2 для каждого из трех гибридов были построены скелетные генетические карты всех хромосом ржи. Порядок общих маркеров на этих картах совпадает, в целом построенные карты характеризуются высокой стабильностью установленного порядка маркеров. Анализировали урожай с растения, продуктивную кустистость, массу тысячи зерен, среднее число зерен на продуктивный колос, а также высоту главного стебля, длину его последнего междоузлия, массу соломы и число колосков в главном колосе.

В результате проведения анализа у трех межлинейных гибридов с минимальной значимостью (Р) на «хромосомном» уровне, равной 0,013 обнаружено 59 локусов, контролирующих какой-либо из указанных признаков. Из этих 59 предполагаемых ЛКП 49 локусов обнаружены при Р ? 0,001. Однако для 10 ЛКП, обнаруженных при Р > 0,001, надежно выявлены «аллельные» ЛКП у других гибридов или ЛКП с предполагаемым плейотропным эффектом у того же гибрида. Обнаруженные локусы распределены по хромосомам следующим образом: в хромосоме 1R - 4, в хромосоме 2R - 4, в хромосоме 3R - 11, в хромосоме 4R - 6, в хромосоме 5R - 14, в хромосоме 6R - 8, в хромосоме 7R - 12 локусов. Очевидно, что некоторые из этих ЛКП являются «аллельными». Эффекты предположительно «аллельных» ЛКП в ряде случаев не соответствуют фазе сцепления с маркерами вследствие возможных эпистатических взаимодействий (влияния генотипического фона). Поэтому соответствие ЛКП у разных гибридов устанавливали только на основании сходства в их положении на генетических картах. Согласно этому критерию, одинаковые ЛКП выявлены у трех гибридов в четырех случаях, у двух гибридов - в девяти случаях, а остальные 29 ЛКП выявлены только у какого-либо одного из гибридов. Таким образом, число предположительно неаллельных ЛКП, отвечающих за отдельные признаки составляет 42. Данные, полученные нами, свидетельствуют также о наличии в геноме ржи участков с множественными эффектами. Если исходить из возможной плейотропии выявленных ЛКП, то число «истинных» ЛКП должно быть меньше 42. Особый интерес с точки зрения разрешения традиционной для анализа ЛКП альтернативы кластеризация - плейотропия ЛКП вызывает «трехаллельный» локус в хромосоме 7R, затрагивающий изменчивость шести из восьми изученных признаков.

Важное значение для возможного использования анализа ЛКП в селекции ржи, например, при создании инбредных линий и для предсказания гетерозиса имеют доля влияния ЛКП на изменчивость изучаемого признака (proportion of explained variance, PEV) и характеристика главных эффектов. Если принять условное разделение ЛКП на минорные (PEV < 10%), промежуточные по силе (PEV в диапазоне 10-25%) и главные (PEV > 25%), то в нашем случае численность таких ЛКП составляет 9, 30 и 20 локусов соответственно. По эффектам действия получено следующее распределение ЛКП: 18 полностью аддитивных локусов, 20 локусов с полным доминированием плюс-аллели, 5 локусов с полным доминированием минус-аллели, 4 локуса со сверхдоминантным эффектом. Наконец, эффект 12 локусов сводится к незначимому аддитивному действию аллелей и достоверному эффекту в гетерозиготе.

2.3.4 Использование генетических маркеров для решения некоторых задач генетики и селекции ржи

Обнаружение и картирование генов ржи, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале. Многочисленные формы и сорта гексаплоидных тритикале несут сбалансированный набор генов (аллелей) пшеницы и ржи, отобранных в ходе длительной селекции. Эти гены ответственны за стабилизацию генома тритикале и положительные качества тритикале, как сельскохозяйственной культуры. Однако, при скрещивании пшеницы и ржи, а также при изучении первичных тритикале, описаны многочисленные случаи отклонений от нормального развития, проявления аномальных признаков и нестабильность родительских геномов (Ригин, Орлова, 1977; Muntzing, 1976; Oettler, 1998). Подобные проявления взаимодействия геномов можно отнести к несовместимости или инконгруентности геномов (Карпеченко, 1935), которая в ряде случаев имеет простую генетическую интерпретацию. Летальность и стерильность у отдаленных гибридов Ф.Г. Добжанский (Dobzhansky, 1937) и Г. Меллер (Muller, 1942) объясняли существованием комплементарных генов, свойственных родительским видам. Нами была поставлена задача систематического поиска, сегрегационного анализа и картирования генов пшеницы и ржи, комплементарным взаимодействием которых можно объяснить проявление аномальных признаков в F₁, а также функциональную и структурную нестабильность геномов у амфидиплоидов (Voylokov, Tikhenko, 1998; 2002).

Согласно предложенному подходу на первом этапе проводятся скрещивания пшеницы «стандартного генотипа» Chinese spring с возможно большим набором инбредных линий ржи. Цель этого этапа - обнаружение различий в проявлении признаков у разных гибридов и первичных тритикале, которые можно объяснить существованием «скрытых» мутаций у линий ржи. Проведение сегрегационного анализа выявленных различий иллюстрирует наше исследование эмбриональной летальности - признака, анализ которого можно провести только с использованием предложенного подхода. Нежизнеспособные семена были обнаружены в скрещиваниях мягкой пшеницы Ch. spring с четырьмя линиями, три из которых являются родственными.

Согласно предложенной схеме гибридологического анализа одну из линий, дающую нежизнеспособные семена в скрещиваниях с пшеницей (линия 2), скрещивали с линиями 6 и 7, дающими нормальные жизнеспособные семена. Затем пыльцу отдельных межлинейных гибридов F₁ использовали для опыления кастрированных колосьев пшеницы. Полученные семена проращивали, и подсчитывали соотношение семян с жизнеспособными и нежизнеспособными зародышами. Во всех комбинациях скрещивания это соотношение соответствовало 1:1 (в сумме - 1016:1044; ч²_1:1=0,38) - соотношению, ожидаемому для гаметического расщепления генов ржи. Обнаруженный ген получил обозначение Eml (Embryo lethality), заглавная

буква в этом символе соответствует, условно, мутантной аллели, строчное написание eml обозначает аллель дикого типа, свойственную большинству изученных линий ржи. Для локализации гена Eml в геноме ржи использовали поколения F₂ и F₅ межлинейного гибрида 2 х 7, который служит нам основой для создания рекомбинантных инбредных линий (РИЛ). С целью продолжения гибридологического анализа эмбриональной летальности по одному растению каждой линии скрещивали с пшеницей Chinese spring и проводили посемейный учет прорастания семян пшенично-ржаных гибридов. На основании этого анализа семьи были разбиты на две группы. Первую группу составили семьи, в которых жизнеспособные зерновки отсутствовали полностью. Во вторую группу вошли семьи, в которых жизнеспособные зерновки составляли около половины и более (Тихенко и др., 2005). Первую группу интерпретировали, как потомство гомозигот по Eml, вторую - как потомство гетерозигот Eml/eml и гомозигот eml/eml, теоретическое соотношение этих генотипов в F₅ составляет 15:2:15, соответственно, или 15:17 при объединении гетеро- и гомозигот по eml.

Наблюдаемое соотношение семей (33:42) полностью соответствует (ч²=0,26) этому варианту моногибридного расщепления у РИЛ.

Растения F₅, использованные нами для скрещивания с пшеницей, берут свое начало от гибридов F₂, охарактеризованных по молекулярным маркерам всех хромосом ржи. Это позволило нам предложить и осуществить схему локализации мутации Eml в геноме ржи. Особенность этой схемы состоит в том, что генотипирование по маркерам проводилось в F₂, а учет расщепления по гену Eml - в F₅.

Для установления сцепления рассматривали расщепления по маркерам у растений F₂ - прародителей растений F₅, участвовавших в скрещиваниях с пшеницей, в пределах двух выделенных групп РИЛ - Eml/Eml и eml/-. Данные, говорящие о сцеплении этой мутации с маркерами, были получены для хромосомы 6R. В таблице 5 приведены соотношения генотипов в F₂ для шести маркеров хромосомы 6R в пределах класса гомозигот Eml/Eml и класса, объединяющего гомо- и гетерозиготы по eml. Порядок маркеров в таблице сверху вниз соответствует их линейному расположению в хромосоме, в направлении от короткого к длинному плечу. Для первых двух маркеров - Xpsr160 и Xpsr915 - расщепление в F₂ совпадает с соотношением 1:2:1, как в пределах выделенных групп, так и в целом для F₂. Для двух косегрегирующих маркеров Xgwm1103 и Xgwm732 ситуация иная, близкая к ожидаемой в случае достаточно тесного сцепления этих маркеров с мутацией. Соотношение генотипов по маркеру в выделенных группах асимметрично. Среди гомозигот Eml/Eml преобладают гомозиготы по аллели маркера, свойственной линии 2, по сравнению с гомозиготами от линии 7 (8 против 1 в случае Xgwm732). Напротив, среди гомо- и гетерозигот по аллели eml значительно чаще (13 против 1 для обоих маркеров) встречаются гомозиготы по аллели от линии 7, чем от линии 2.

Таблица 5 Тест на сцепление мутации Eml с молекулярными маркерами хромосомы 6R

Примечание. * - P<0,05, *** - P<0,001. В скобках указаны значения критерия ч², оценивающие гетерогенность расщеплений по маркерам между группами eml/- и Eml/Eml

Отклонение от соотношения 1:2:1 достоверно только для группы eml/-, что может быть вызвано статистической причиной - большей численностью этой группы растений. Возможно, что лучшим статистическим критерием для установления сцепления является не критерий соответствия соотношению 1:2:1 в выделенных группах растений F₅, а критерий, оценивающий гетерогенность расщеплений между группами. Действительно, этот критерий направлен на оценку асимметрии в соотношении генотипических классов, вне зависимости от соблюдения менделевского расщепления, которое изначально для всех растений F₂ может не соответствовать теоретически ожидаемому соотношению 1:2:1. Расчет критерия ч², как критерия однородности выборок, показал высокий уровень неоднородности расщеплений (эти значения ч² приведены в таблице в скобках). Более того, для двух маркеров - Xpsr1203 и XXpsr687, слабо сцепленных с Xgwm1103 (Xgwm732), также установлена гетерогенность расщеплений в группах F₅, которая выглядит как тенденция при анализе соответствия 1:2:1 в каждой группе и не приводит к отклонению от этого соотношения.

Таким образом, на примере мутации Eml нами показана эффективность предложенной схемы гибридологического анализа по выявлению и картированию «скрытых» мутаций у ржи. Эта схема в ее реципрокном варианте может быть использована и для пшеницы. В итоге таких исследований можно составить представление о наличии комплементарных генов в геномах обоих видов, роли таких генов в эволюции злаков, их значения в селекции амфидиплоидов и механизмах межгеномного взаимодействия у отдаленных гибридов.

Изучение мейоза у ржи с помощью генетических маркеров. Одной из задач наших исследований являлось картирование мейотических мутаций с помощью изозимных и молекулярных маркеров, и разработка подходов, позволяющих на этой основе повысить эффективность генетического изучения мейоза у ржи. Картированные нами синаптические мутации характеризуются количественно - средним числом унивалентов на материнскую клетку пыльцы (МКП) и распределением МКП по числу унивалентов. Как и большинство мейотических мутаций они характеризуются полной или частичной стерильностью в гомозиготном состоянии. Все это затрудняет генетическое и молекулярно-биологическое изучение синаптических мутантов.

Обнаружение маркеров, косегрегирующих с синаптическими мутациями, может служить предпосылкой для тонкого картирования и последующих клонирования и секвенирования генов-кандидатов. Точная идентификация генотипов по мейотическим мутациям с помощью маркеров открывает и дополнительные возможности в изучении мейоза у ржи. Основой для такого изучения могут быть потомства от самоопыления отдельных растений картирующих популяций - семьи F₃. В ходе картирования каждое растение F₂ было описано как гомо- или гетерозигота по маркерам анализируемой мутации. Это позволяет точно идентифицировать генотипы по мутации в потомстве гетерозигот. В семьях F₃ с помощью маркеров легко выделить нужные генотипы и использовать их для изучения мейоза или для проведения скрещиваний. Так, путем отбора и переопыления гетерозигот по маркерам можно поддерживать мутации в гетерозиготном состоянии, избегая влияния инбредной депрессии и не проводя микроскопического анализа. При использовании маркеров значительно повышается эффективность функционального теста на аллелизм, так как в тест необходимо вовлекать только мутации, для которых установлена сходная хромосомная локализация. Можно эффективно сочетать мутации в компаунде и выделять двойные мутанты в случае независимо наследующихся и слабо сцепленных мутаций. Полученный материал может быть использован на любой стадии мейоза для изучения взаимодействия мутаций в компаунде и у двойных мутантов с помощью световой и электронной микроскопии, а также с помощью методов молекулярной цитогенетики.

Самостоятельный, популяционно-функциональный аспект возникает при изучении возможного влияния гетерозиготного состояния по синаптическим мутациям на сегрегацию гомологичных хромосом, рекомбинацию маркеров из разных хромосом (эффект псевдосцепления), индукцию транслокаций, частоту кроссинговера и хромосомную интерференцию. Важность этого аспекта вытекает из того факта, что около трети растений сортов ржи являются гетерозиготами по мей-мутациям (Соснихина и др., 1994). Литературные (Жученко, Король, 1985), как и наши предварительные данные, говорят о влиянии некоторых синаптических мутаций в гетерозиготе на рекомбинацию генов. Таким образом, гетерозиготность по мей-мутациям может быть функционально значимой, и может существенно влиять на процессы, связанные с рекомбинацией генов и хромосом в популяциях ржи.

Рис. 3. Схема выделения двойных мутантов по мутациям sy1 и sy9 с помощью маркерных локусов. Нормальные аллели синаптических генов sy1 и sy9 обозначены знаком “+”. Маркерные аллели мутаций обозначены цифрой 2, заключенной в скобки, маркеры нормальных аллелей - цифрой 1. Участки хромосом, несущие мутацию и соответствующую маркерную аллель (2) выделены темным прямоугольником, гомологичные участки - светлым прямоугольником, кружки - центромеры.

Обнаружение маркеров, абсолютно сцепленных с синаптическими мутациями sy1 и sy9, позволило нам предложить и начать осуществлять схему выделения двойных гомозигот по этим мутациям (рис. 3).

Внедрение индивидуального отбора в селекцию ржи на основе генетического маркирования мутаций автофертильности. Успехи селекции cортов-гибридов, достигнутые в Германии, отодвинули на второй план совершенствование методов селекции сортов-популяций. На наш взгляд сорта-популяции не исчерпали своего потенциала, и при внедрении в схемы их улучшения индивидуального отбора (оценки и отбора потомств от самоопыления) могут стать в России альтернативой сортам-гибридам, требующим создания дорогостоящей, высокотехнологичной базы. Основой для внедрения схем селекции, включающих однократное самоопыление, могут служить современные, высокоадаптивные сорта ржи, созданные и районированные во многих регионах России. Главной задачей таких схем должно быть использование высокой эффективности индивидуального отбора для повышения частоты благоприятных аллелей при минимизации негативных эффектов инбридинга и генотипа донора автофертильности.