Методы диагностики болезней рыб

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Департамент научно-технологической политики и образования

ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный аграрный университет»

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

ИХТИОПАТОЛОГИЯ

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНЕЙ РЫБ

Волгоград 2012

ВВЕДЕНИЕ

Для профилактики заразных болезней рыб и предотвращения возможных вспышек заболеваний при каждом подозрении на какое-либо заболевание необходимо проводить всесторонние диагностическое исследование. Для определения диагноза проводят эпизоотологические, клинические, патоморфологические, микробиологические и паразитологические исследования на месте заболевания или в ветеринарных лабораторных специализированных научно-исследовательских институтах.

Поэтому диагностику большинства болезней рыб осуществляют комплексно с применением как общих, так и специальных исследований.

Комплекс диагностических исследований включает:

- ветеринарно-санитарное обследование рыбоводных хозяйств;

-сбор анамнестических (опрос рабочих и специалистов, ведущих постоянный контроль за водоемом, где отмечено заболевание), а также изучение документов о завозе рыбы, организации и проведении лечебно-профилактических мероприятий, сертификатов качества на корма, результатов гидрохимического анализа, и эпизоотологических данных, оценивающих динамику течения болезни по числу заболевших рыб;

- клиническое обследование стада рыб, включающий внешний осмотр больных рыб, наблюдения за их поведением, реакциями на корм и раздражителей;

- патологоанатомическое (посмертное) вскрытие рыб для выявления патологий в морфологии органов и тканей;

- специальные лабораторные методы: паразитологический, бактериологический, вирусологический и микологический;

-физиологический, исследующий функциональные изменения в больном организме с помощью гематологических и биохимических анализов;

-экспериментальный, подтверждающий этиологическую роль возбудителя в биопробе.

Анамнестические и эпизоотологические данные, клинические признаки и патологоанатомические изменения чаще используют для постановки предварительного диагноза, а при некоторых болезнях они имеют решающее значение. Окончательный диагноз чаще ставится после проведения лабораторных исследований.

При подозрении на инфекционные заболевания проводят клинико-анатомические, вирусологические, бактериологические и микологические исследования, ставят биопробу.

При подозрении на инвазионные болезни необходимы клинический осмотр, патологоанатомическое и паразитологическое вскрытия.

При подозрении на отравления и незаразные болезни кроме клинико-анатомических проводят гидрохимические, химико-токсикологические (воды, рыбы, грунта, кормов и др.) исследования, ставят биопробы. При всех болезнях дополнительно проводят гематологические, биохимические, гистологические и другие диагностические исследования.

ТЕМА 1. «ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ХОЗЯЙСТВ И КЛИНИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ СТАДА РЫБ»

Цель занятия: изучить основные этапы эпизоотологического исследования рыбохозяйственных хозяйств и методы клинического обследования рыб.

Задания для практической работы:

1. Заполните ветеринарно-санитарный паспорт рыбоводного хозяйства по прилагаемой форме.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ ПАСПОРТ РЫБОВОДНОГО ХОЗЯЙСТВА

1.1 Характеристика хозяйства (рыбопромыслового водоема)

Тип хозяйства (водоема) и контакт с соседними рыбоводными хозяйствами (водоемами) по водной системе и другие данные____________________________________________________________

Источник водоснабжения________________________________ (река, ключ, атмосферные осадки и т.п.)

Вид выращиваемых в хозяйстве рыб (заселяющих водоем)____________________________________________________________

В том числе сорные____________________________________________________________

Количество и площадь (в га) прудов хозяйства по категориям (водоема)__________________________________________________________

Годовая мощность хозяйства (водоема)__________________________________________________________

(выращивание товарной рыбы (в ц), рыбопосадочного и племенного материала (в шт.)

________________

вылов рыб из промыслового водоема (в ц)

___________________________

Государственный ветеринарный надзор возлагается на________________________________________________________________

наименование учреждения

Ветеринарное обслуживание возлагается на________________________________________________________________

Ф.И.О. ветеринарного специалиста

Дата заполнения паспорта «___»___________200 г.

Главный ветеринарный врач района______________

Руководитель хозяйства_________________________

2. Провести клинический осмотр стада рыб.

1.2 Эпизоотологическое исследование рыбохозяйственных хозяйств

Прежде чем приступить к клиническому осмотру и лабораторным исследованиям, необходимо собрать и проанализировать анамнестические, эпизоотологические данные о водоеме и рыбе. Методом опроса и по имеющейся в хозяйстве ветеринарной отчетности, ветсанпаспорту устанавливают, когда впервые возникла в данном водоеме та или иная болезнь, каково ее происхождение, источники возникновения, предполагаемые способы передачи инфекции, инвазии и пути распространения, течения болезни по сезонам года, по возрастным группам и видам рыб. Необходимо также собрать статистические данные о гибели рыб и экономическом ущербе. Одновременно с этим необходимо обратить внимание на происхождение рыб в данном водоеме: завезены они из других хозяйств, или собственного выращивания, или обе эти группы рыб имеются в данном водоеме. Если рыба была завезена из другого хозяйства или рыбопитомника, то необходимо получить сведения о его эпизоотическом состоянии.

Также необходимо проанализировать материалы по эпизоотическому состоянию обследуемого хозяйства за прошлые годы, а также учесть данные по проведению общих рыбоводно-мелиоративных и ветеринарно-санитарных мероприятий в разные сезоны года.

Одновременно с этим необходимо собрать и проанализировать все рыбоводные данные:

-размер и характер водоема (пруд русловый или пойменный, озеро);

-водоснабжение и проточность;

-наличие рыб в головном водоисточнике, их состояние, численность и т.д.;

-естественная кормовая база-данные о количестве планктона и бентоса;

-характер зарастаемости водоема водной растительностью, а также цветения воды: период цветения, интенсивности и продолжительность его;

-плотность посадки рыб в водоеме, их соотношение по возрастным группам и видам рыб;

-кормление рыб: состав и количество концентрированных кормов;

-удобрение прудов: состав органических и минеральных смесей, способы и сроки внесения удобрений, солевой состав, газовый и термический режимы обследуемого водоема.

1.3 Ветеринарно-санитарное обследование рыбоводных хозяйств

Обследование рыбоводных хозяйств (водоемов) проводят в плановом порядке для контроля выполнения противоэпизоотических мероприятий и вынужденно для установления диагноза при возникновении гибели рыб или подозрении на различные заболевания. В зависимости от целей и объема работ оно может быть полным или неполным.

Плановые обследования рыбоводных хозяйств проводят по полной схеме 2--3 раза в год. Целями таких обследований являются изучение эпизоотической ситуации и разработка ветеринарно-санитарных и профилактических мероприятий, а также контроль их выполнения. Они включают следующие работы:

- проверка планов профилактических, лечебных и оздоровительных мероприятий и правильности их выполнения;

- анализ санитарного состояния прудов, бассейнов, садков, аквариумного хозяйства, кормоцехов и других производственных помещений;

- контроль методического уровня и условий для проведения диагностических исследований в местных лабораториях;

- уточнение эпизоотического состояния и токсикологической ситуации в хозяйстве;

- выборочное проведение необходимых диагностических исследований.

По результатам обследования составляется заключение о ветеринарно-санитарном и эпизоотическом состоянии хозяйства, уточняется комплекс профилактических и оздоровительных мероприятий.

Неполное или вынужденное обследование проводят в случае возникновения заболевания рыб с целью его диагностики и разработки мероприятий по оздоровлению водоемов или хозяйства в целом. При этом основное внимание обращают на обследование неблагополучных водоемов, проведение клинических, патологоанатомических, гидрохимических и других исследований в зависимости от предположительного диагноза, а также анализ документальных данных о перевозках, условиях содержания и кормления рыб, соблюдении рыбоводно-биологических нормативов их выращивания и т. п.

Начинают обследование со сбора анамнестических данных: опроса рыбоводов и обслуживающего персонала о течении болезни и гибели рыб, как она проявлялась, какие возрастные группы рыб болеют, при каких условиях возникло заболевание: метеорологических (паводок, дождь, перепад температуры и т. д.), гидрологических и гидрохимических, рыбоводных (пересадки, сортировка рыб). По данным ветеринарного учета определяют, отмечалось ли подобное заболевание в предыдущие годы, какие диагностические исследования и профилактические мероприятия проводились, каковы их результаты. Изучают схему устройства хозяйства и водоснабжения прудов, определяют вероятные источники загрязнения водоемов.

В дальнейшем проводят обследование водоемов и стада пораженных рыб, которое включает: осмотр прудов (водоемов) и оценку санитарного состояния береговой зоны, зарастаемости ее растительностью, физических свойств воды; проведение клинического осмотра и патологоанатомического вскрытия рыб, учета больных и погибших рыб, определения уровня их заболеваемости; отбор воды и патматериалов для лабораторных исследований.

Клиническое обследование стада рыб

Клинический осмотр проводят выборочно непосредственно в водоеме, при контрольном отлове или посадке рыб в специальные емкости (аквариумы, садки, бассейны и т. п.). Рекомендуется просматривать не менее 100 рыб каждого вида и возраста из каждой зоны, отличающейся по гидрологическому, гидрохимическому и гидробиологическому режиму.

Клинический осмотр рыб, подозрительных по тому или иному заболеванию, начинают с наблюдения за их поведением водоеме или в аквариуме, обращая при этом внимание на характер и координацию движения, частоту дыхательных движений жаберных крышек,реакцию на внешние раздражители (шум, удары сачком, попытку поймать рыбу руками и ряд других).

Регистрируют нарушение поведения рыб: пугливость, угнетение, возбуждение, координацию движения, равновесие в воде.

Следовательно, по поведению рыб в водоеме можно предположительно определить причину неблагополучия и наметить направление дальнейших диагностических исследований.

Внешний осмотр рыб, подозрительных по заболеванию проводят на месте непосредственно при ее вылове или в лаборатории, куда ее доставляют в живом виде. Перед осмотром необходимо определить вид рыбы, ее все, размер и возраст.

Вначале тщательно осматривают кожные покровы и плавники, обращая внимание на количество и качество слизи, изменение окраски, наличие припухлостей, кровоизлияний, язв, рубцов, цист, ерошение чешуи и т. д. Приподнимая жаберные крышки, осматривают жабры. Обращают внимание на окраску, форму, рисунок и степень ослизнения жабр, структуру лепестков, просматривая их с помощью лупы. На губах и слизистой ротовой полости встречаются кровоизлияния, язвы, новообразования. Важно не пропустить изменения на глазах: западания глаз или пучеглазие (экзофтальм), кровоизлияния, помутнение хрусталика и роговицы. Проводят учет больных рыб в абсолютном и процентном выражениях (заболеваемость).

Четкое и подробное описание клинических признаков той или иной болезни является ценным материалом в постановке диагноза болезни, так и в определении направления лабораторных исследований.

ТЕМА 2. «ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ»

Цель занятия: научить правила взятия и пересылки больных рыб и патологического материала для лабораторных исследований.

Задания для практической работы: взять материал от больных для лабораторного исследования и оформить сопроводительную на исследуемый материал.

Больных или подозрительных рыб доставляют в ветеринарную лабораторию живыми. Для исследования берут 10--15 рыб (старшего возраста -- 5) на различных стадиях болезни с явно выраженными клиническими признаками.

Рыб перевозят в молочных бидонах или других емкостях, заполненных на 3/4 объема водой из того же водоема, откуда они взяты, или водой из артезианской скважины.

Летом при длительной транспортировке воду с рыбой постепенно охлаждают до температуры 12--15 °С, добавляя мелкие кусочки льда. Чтобы не вызвать у рыб температурного шока, нальзя допускать перепад температуры воды исходного водоема и транспортной емкости более 5--7 °С.

Если доставить в лабораторию живую рыбу невозможно, для бактериологического исследования берут кусочки органов и тканей рыб, помешают их в стерильную стеклянную посуду с 40%-ным водным раствором глицерина, закрывают пробкой, заливают парафином и направляют с нарочным.

Кровь, экссудат и другой жидкий патологический материал доставляют в стерильных запаянных пастеровских пипетках. Для микроскопического исследования эти же материалы посылают в лабораторию в виде мазков и препаратов-отпечатков (кляч-препаратов).

Для обнаружения бактерий исследуют выделения, органы и ткани рыб, а также кровь, экссудат, содержимое абсцессов, опухолей, инфильтратов, выделения из язв, паренхиматозные органы, содержимое кишечника, слизь с жабр и поверхности тела.

Летом бактериологические исследования патологического материала проводят не позднее чем через 2 часа после взятия. В исключительных случаях в лаборатории рыбоводного хозяйства делают бактериологические посевы на мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар.

Для вирусологического исследования берут кусочки пораженных органов и тканей массой не более 3--5 г, замораживают или консервируют в 50%-ном растворе химически чистого глицерина (рН 7,2--7,4) в соотношении 1:5--1:10, помещают в стерильные флаконы, закрывают пробкой и заливают парафином.

Материал для гистологических исследований берут от погибших и вынужденно убитых рыб. Мелких рыб (мальки и сеголетки) после вскрытия брюшной полости фиксируют целиком, а от крупных берут органы или кусочки органов размером 2x3 см и толщиной 0,5-- 1,0 см. Кусочки из пораженных органов и тканей вырезают так, чтобы были захвачены нормальные и измененные участки. Независимо от степени поражения берут кусочки кожи с подлежащей мускулатурой, жабр, печени, почек, селезенки, сердца, кишечника, плавательного пузыря, головного мозга. Кишечник перед фиксацией осторожно вскрывают или делают на нем несколько надрезов, чтобы фиксирующая жидкость проникла в его полость. Головной мозг осторожно извлекают после вскрытия черепной коробки. Подлежащий исследованию материал помещают в широкогорлую стеклянную банку и фиксируют 10%-ным формалином в объеме, в 10 раз превышающем объем взятого материала.

Для гистохимических исследований патологического материала в качестве фиксатора используют жидкость Карнау (спирт абсолютный -- 60 мл, хлороформ -- 30 мл и ледяная уксусная кислота -- 10 мл) или жидкость Буэна (насыщенный раствор пикриновой кислоты -- 75 мл, концентрированный формалин -- 25 мл, ледяная уксусная кислота -- 5 мл). Так как выбор фиксатора зависит от цели дальнейшей обработки материала, на этикетке указывают фиксирующий раствор.

Взятую кровь используют для посева, приготовления мазков, гематологических и биохимических исследований. Цельную кровь стабилизируют гепарином (1000 ЕД/мл) или лимоннокислым натрием. Сыворотку крови получают общепринятым методом, помещают в стерильные запаянные ампулы, а летом консервируют 5%-ным раствором фенола (1--2 капли на 1 мл сыворотки) или тиомерсалом из расчета 10 мг препарата на 10 мл сыворотки. Отобранные жидкие материалы перевозят в термосе со льдом.

Мазки крови для исследования на кровепаразитов, выведения лейкоцитарной формулы готовят обычным способом, высушивают, нумеруют, завертывают каждый в чистую бумагу и направляют в лабораторию.

Для биохимических исследований берут цельную кровь в пробирки, добавляют к ней лимоннокислый или щавелевокислый натрий (на 1 мл 2 мг), раствор гепарина (1000 ЕД/мл), наклеивают этикетку и направляют в ветеринарную лабораторию.

Сыворотку крови для биохимических и серологических исследований получают следующим образом. Кровь собирают в небольшие пробирки и оставляют при комнатной температуре для свертывания. Отделившуюся от кровяного сгустка сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой и отправляют в лабораторию в запаянных ампулах. Сыворотку, предназначенную для серологических исследовваний, консервируют 2%-ной борной кислотой, или 0,05%-ным фенолом (1--2 капли 5%-ного фенола на 1 мл сыворотки), или тиомерсалом 1:10000. Цельную кровь и сыворотку транспортируют в термосе со льдом. Материал должен быть доставлен в течение суток после взятия.

У крупных рыб извлекают пораженные паразитами органы (жабры, кишечник, печень и другие ткани) и помещают в банки с консервирующей жидкостью (70%-ный этиловый спирт или 4%-ный раствор формалина). Паразитические организмы, а также кусочки органов и тканей, где обнаружены паразиты, помещают в пробирки или флаконы с консервирующей жидкостью. При подозрении на протозойные болезни из исследуемого материала делают мазок и сразу опускают его на 15-- 20 мин. в жидкость Шаудина (50 мл насыщенного раствора сулемы и 25 мл абсолютного спирта). Маленькие кусочки тканей и органов, пораженных паразитическими простейшими, фиксируют в указанной смеси 30--120 мин. Затем стекла промывают водой и спиртами возрастающей крепости (50--60--70%) и сохраняют в 70%-ном спирте до исследования. Влажные мазки, кусочки органов и тканей с паразитами можно фиксировать также в жидкости Буэна. Фиксация мазков 1--20 мин., кусочков 1--12 час.

Перед консервированием гельминтов тщательно промывают в физиологическом растворе и выдерживают в нем до гибели паразитов.

Моногенетических сосальщиков (дактилогирусы, гиродакгилюсы и др.) консервируют в 4%-ном растворе формалина или глицерин-желатине (под покровным стеклом). Трематод и мелких цестод кладут на предметные стекла, накрывают покровным стеклом и помещают на несколько часов в бактериологическую чашку с 70%-ным спиртом. Затем при помощи кисточки гельминтов перекладывают в пробирку с 70%-ным спиртом.

Нематод и личиночные стадии цестод консервируют в жидкости Барбагалло (3%-ный раствор формалина на изотоническом растворе поваренной соли: 30 мл формалина, 9 г поваренной соли, 1000 мл дистиллированной воды). Для изготовления постоянных препаратов в канадском бальзаме живых нематод лучше консервировать в 70%-ном горячем спирте.

Крупных ленточных гельминтов после умерщвления в физиологическом растворе помещают в 70%-ный спирт.

При консервировании скребней в 70%-ном спирте осторожно выдавливают хоботок из влагалища путем слабого прессования переднего конца скребней под покровным стеклом.

Паразитических рачков консервируют в 3%-ном растворе формалина и сразу же переносят для хранения в 70%-ный спирт.

Пиявок фиксируют в 4%-ном растворе формалина. При этом у них сохраняется пигментация, что облегчает диагностику вида.

Патологический материал, предназначенный для бактериологического, паразитологического и других исследований, снабжают этикеткой, где указывают вид и возраст рыбы, название органа, из которого взят материал. Если в одну посуду помешают несколько объектов исследования, этикетку прикрепляют к каждой рыбе или органу или отдельные кусочки органа завязывают вместе с этикеткой в марлю. Этикетки надписывают простым карандашом и опускают в посуду с материалом таким образом, чтобы можно было легко прочесть надпись.

Пробы воды берут в нескольких точках водоема с таким расчетом, чтобы собранные образцы отражали гидрохимическое состояние водоема или загрязненность его отдельного участка (зоны гибели рыб, места впадения ручья или сбросного канала, района интенсивного поверхностного стока и т. д.), а также в незагрязненном участке (выше по течению). В прудах и других проточных емкостях берут пробы на вытоке воды.

Пробы воды (не менее 2 л) отбирают батометром из поверхностных (на глубине 50 см) и придонных слоев в чистые стеклянные или полиэтиленовые бутылки. Перед заполнением посуду ополаскивают 2--3 раза исследуемой водой. В тех случаях, когда время транспортирования пробы составляет более 1 сут, их рекомендуется фиксировать различными консервантами в зависимости от целей исследования. Зимой воду при транспортировании следует утеплять, чтобы исключить ее замерзание.

Пробы грунта (массой 2 кг) берут также из разных зон водоема дночерпателем Экмана или Кирпичникова. Грунт сушат на воздухе и упаковывают в широкогорлые банки или полиэтиленовые мешки (рис. 2).



Рис. 2. Приспособления для взятия проб грунта и планктона: А -- скребок; Б -- дночерпатель; В -- планктонная сетка

Планктон собирают планктонной сеткой, фильтруя такое количество воды, которое необходимо для получения около 50 г живой массы планктона.

Отобранные материалы подробно описывают, этикетируют, упаковывают в водонепроницаемую тару, опечатывают и высылают с нарочным в ветеринарную лабораторию или другое учреждение, где имеются возможности для исследования. В сопроводительном письме сообщают данные обследования водоема, указывают предполагаемый диагноз и какие лабораторные исследования необходимо провести.

ТЕМА 3. «ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЫБ»

Цель занятия: научиться проводить патоморфологическое исследование рыб.

Задание для практической работы: провести патоморфологическое вскрытие исследуемых рыб и дать заключение.

Патологоанатомические вскрытие имеет важное диагностическое значение. Его применяют при диагностике большинства болезней рыб. Вскрытию подвергают свежие трупы (жабры без признаков разложения) и живых рыб с клиническими признаками заболевания. С целью недопущения разноса заразного начала вскрытие рыб проводят в лаборатории или в другом помещении. Запрещается вскрывать рыб на берегу водоема, скармливать вскрытых рыб собакам, кошкам и другим животным. Вскрытых рыб подвергают утилизации или закапывают в землю после обеззараживания их хлорной известью. Живых рыб перед вскрытием обездвиживают разными способами: усыпляют гипнодилом (5--10 мг/л), хлоралгидратом (2,4 г/л), разрушают спинной мозг иглой или разрезом позвоночника в области затылка.

Патологоанатомические вскрытие начинают с наружного осмотра, обращая внимание на те же изменения внешних покровов, плавников, глаз и других органов, что и при клиническом обследовании.

Вскрывают рыб в следующем порядке. Жабры обнажают удалением жаберной крышки ножницами. Отмечают степень ослизнения, изменения их окраски и рисунка, наличие кровоизлияний, очагов некроза, цист паразитов и т. д. Ножницами отрезают 2--3 дуги и просматривают их под лупой. Иногда готовят препараты отдельных лепестков на предметном стекле. Накрыв их покровным стеклом, определяют толщину складок и патологические изменения.

Брюшную полость карповых рыб вскрывают двумя разрезами (рис. 1). Ножницами делают надрез брюшной стенки впереди анального отверстия, вставляют тупой конец ножниц в брюшную полость и делают первый разрез вдоль белой линии до области межчелюстного пространства. Вторым полулунным разрезом, проходящим по уровню боковой линии, отсекают брюшную стенку, обнажая внутренние органы. Разрезы делают осторожно, чтобы не повредить внутренние органы. Вначале осматривают брюшную и сердечную полости, обращая внимание на их содержимое, наличие жидкости (транссудат или экссудат, ее количество, цвет, запах, консистенция) или газа, крупных паразитов, внешний вид внутренних органов. У половозрелых рыб отделяют гонады, отмечая стадию их зрелости, цвет, кровоизлияния, наличие мертвых икринок (белого цвета) и др. Затем, надрезав кишечник в области псевдодиафрагмы и ануса, извлекают комплекс внутренних органов. Осторожно отделяют желудок, кишечник, печень с желчным пузырем и селезенку. ветеринарный рыба патоморфологический орган

После отделения плавательного пузыря обнажают почки, лежащие вдоль позвоночника в виде ленты темно-красного цвета.

При осмотре плавательного пузыря определяют его форму, толщину и прозрачность оболочек, наличие кровоизлияний, пятен гемосидерина, экссудата в полости и т. д.

Состояние паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) оценивают по внешним признакам: размеру, консистенции, цвету, кровенаполнению, наличию кровоизлияний, очагов некроза, рисунку на разрезе и др. Кишечник разрезают вдоль, промывают вводе, просматривают состояние слизистой, учитывают количество гельминтов и др.

При осмотре сердца отмечают его размер, форму, состояние миокарда, степень наполнения полостей кровью и ее свертываемости, наличие сгустков, кровоизлияний.

Вскрывают черепную коробку с помощью четырех разрезов, из которых первым поперечным разрезом отсекают крышку у носовых ямок; два боковых разреза проходят от носовых ямок до затылочной области, а четвертый -- в области затылка. Сначала проводят внешний осмотр оболочки головного мозга, затем его извлекают и характеризуют состояние вещества мозга, его кровенаполнение и др.

При осмотре скелетной мускулатуры обращают внимание на цвет, консистенцию, наличие кровоизлияний, отека, припухлостей, цист паразитов, степень прикрепления к костям.

Патологоанатомические изменения сопоставляют с клиническими симптомами, выявляют характерный комплекс признаков основного заболевания и сопутствующие осложнения (болезни), а также используют их для определения главной и непосредственной причины гибели рыб. В сомнительных случаях данные вскрытия уточняют с помощью гистологического исследования патматериала. Обработку патматериала проводят общими методами гистологической техники. По нашему опыту, кусочки органов рыб лучше заливать в целлоидин-парафин, а жабры, кожу и плавательный пузырь -- в целлоидин. Срезы окрашивают общепринятыми методами.

ТЕМА 4. «ПАРАЗИТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЫБ»

Цель занятия: научится проводить полное и неполное паразитологическое исследование рыб.

Задания для практической работы: Провести неполное паразитологическое исследование разных видов рыб.

При паразитологические исследованиях клиническому осмотру подвергают не менее 100 рыб из каждого пруда, паразитологическому вскрытию -- мальков 25 экз., годовиков 10--15, рыб старших возрастов 5--10 экз.

4.1 Порядок полного паразитологического исследования рыбы

Полное паразитологическое исследование рыб проводят по методикам, разработанным В. А. Догелем, Э. М. Ляйманом, А. П. Маркевичем.

Для полного паразитологического исследования желательно брать еще живую или только что «уснувшую» рыбу (вполне свежую), не помятую, не подсушенную и наименее поврежденную рыболовными орудиями.

Полное паразитологическое исследование производится по установленному плану ,в определенной последовательности изучения поверхности тела и отдельных органов вскрытой рыбы. Сначала рыба измеряется и взвешивается (измерение и взвешивание нужно производить возможно более быстро, следя за тем, чтобы рыба не подсыхала),а затем подвергают клиническому осмотру. Тогда же берется чешу, для определения возраста. Затем производится обследование жабер и ротовой полости. После этого следует приступать к полному паразитологическому вскрытию. Кровь и сердце надлежит исследовать у возможно более свежей рыбы, т. е. мазок крови делается перед наружным осмотром, сердце исследуется после вскрытия рыбы, в первую очередь. Полость тела обследуется как сразу по вскрытии ее, так и по мере просмотра отдельных органов, так как паразиты, находящиеся на поверхности органов, в жировой ткани и брюшине, относятся к полостным паразитам.

Органы и ткани следует осматривать всегда в одной и той же последовательности. Только тогда будет исключена возможность того, что какой-то участок окажется «забытым» и пропущенным. Исходя из топографического расположения органов, большинство ихтиопаразитологов принимает следующую очередность в исследовании: 1) сердце, 2) мочевой пузырь, 3) желчный пузырь, 4) печень, 5) селезенка, 6) жировая ткань, 7) брюшина, 8) кишечник, 9) половые железы, 10) плавательный пузырь, 11) почки, 12) глаза, 13) головной мозг, 14) спинной мозг, 15) мускулатура.

При изоляции отдельных органов друг от друга нужно остерегаться повреждения их стенок, чтобы паразиты из одного органа через порез не могли попасть в другой или быть утерянными. При дальнейшем исследовании следует оберегать как вскрытую рыбу, так и извлеченные из нее органы от подсыхания, для чего их можно покрывать кусками мокрой, фильтровальной или газетной бумаги или ткани.

Для избежания переноса паразитов из одного места в другое и могущей возникнуть путаницы в отношении правильности определения локализации паразитов, во все время вскрытия следует тщательно мыть инструменты и пипетки (особенно тщательно и отдельно промывается снятая резиновая груша пипетки).

Каждый исследуемый орган должен быть внимательно осмотрен снаружи на предмет обнаружения на нем паразитов полости тела (личинок ленточных червей, сосальщиков, круглых червей и скребней), при снятии которых обязательно отмечается, с какого именно органа они сняты. При внутреннем исследовании органа (особенно это относится к кишечнику) все крупные, видимые простым глазом паразиты отбираются пинцетом или иглами и помещаются в чистую воду, затем орган просматривается по частям компрессорным методом под лупой при увеличении X 10 и X 20 для обнаружения мелких паразитов.

Компрессорный метод широко применяется советскими гельминтологами. Он состоит в том, что части органов или тканей или целые органы, если они не велики, а также соскобы со стенок кишечника или его содержимое небольшими частями закладываются между двумя стеклами (желательно размером 6X12 см) толщиной 3--4 мм и при некотором добавлении воды расплющиваются до прозрачности образовавшегося тонкого слоя. При последовательном просмотре стекол под лупой (продвигая стекло слева направо) можно обнаружить даже весьма мелких паразитов. Затем производится подсчет паразитов по систематическим группам и, под контролем глаза, одно стекло постепенно сдвигается с другого. Паразитов снимают с обоих стекол иглой или тонко оттянутой пипеткой и помещают, по группам же, в солонки с водой или с физиологическим раствором. При снятии паразитов следует все время следить, чтобы поверхность стекол не подсыхала.

Для исследования жабер на моногенетических сосальщиков компрессорный метод мало пригоден, так как найти и снять паразитов после сдвигания стекла с раздавленной ткани очень трудно.

4.2 Наружный осмотр рыбы

До начала наружного осмотра рыбы следует точно определить видовую принадлежность исследуемого экземпляра, его размеры (длину, высоту и обхват) и вес. Длина измеряется общая (от конца рыла до конца хвостового плавника) и до конца чешуйчатого покрова штангенциркулем, сантиметровой линейкой или рулеткой. Высота и обхват измеряются в самом широком месте тела.

В записи протокола вскрытия, кроме названия и порядкового номера исследуемой рыбы, даты исследования, веса и размеров тела, следует также записать пол рыбы и название водоема, откуда она добыта (см. раздел «Регистрация и этикетирование паразитов»). Желательно указать более точно место вылова (у берега, на глубине, в заводи и т. д.). Одновременно берется материал для последующего определения возраста (чешуя или отолиты). Чешуя соскабливается с боковой поверхности в количестве 15--20 крупных чешуек. У рыбы с голой кожей берутся отолиты -- слуховые камешки (их нужно брать после исследования мозга). Чешуя и отолиты тщательно промываются, высушиваются и снабжаются этикеткой с номером исследования и датой.

Для хранения чешуи можно рекомендовать узкие длинные листочки бумаги, скрепленные по узкому краю в книги, чешуя кладется немного левее середины листочка, последний перегибается пополам и закрывается. На оборотной стороне листочка пишутся все данные. Книжечка перехватывается ниткой крест накрест.

Отолиты заворачиваются в отдельные пакетики, также надписанные. Наружный осмотр рыбы лучше всего производить, положив ее в кювету с небольшим количеством воды. Внимательно осматриваются покровы кожи и чешуя, на которой прикрепляются паразитические рачки и пиявки. Плавники у мелких рыб расправляются, оттягиваются от тела и рассматриваются на свет, затем отрезаются и в небольшом количестве воды обследуются в часовом стекле под лупой. На плавниках встречаются пиявки, которые не только отрицательно влияют на рост рыб, но могут вызывать их значительную смертность, паразитические рачки, моногенетические сосальщики, личинки двустворчатых моллюсков -- глохидии. Одним из самых опасных вредителей рыбного хозяйства, в особенности прудового, является накожный паразит карпоед, или карповая вошь Argulus foliaceus, который питается соками и кровью рыбы и вызывает местные воспаления и раны. На изъязвленных местах поселяются возбудители грибковых и бактериальных заболеваний. В толще чешуи и на плавниках рыб Дальнего Востока паразитируют в цистах личинки (метацеркарии) сосальщика Metagonimus yoko-gawai--паразита человека и домашних животных (рис. 6). Иногда на плавниках бывают цисты Bucephalus, хорошо отличимые по черному мочевому пузырю, просвечивающему через цисту. В соскобах слизи с поверхности тела под микроскопом можно обнаружить различных простейших, часто являющихся весьма опасными для рыб. Например жгутиконосец Costia вызывает раздражение и при сильном заражении разрушение (до изъязвления) эпителия. Инфузории Chilodon и Trichodina вызывают образование серо-голубых налетов на коже захватывающих значительную часть поверхности тела и жабер, что приводит рыбу к гибели. Ichtiophtirius образует на теле рыбы белые бугорки величиной с булавочную головку. Черные, различной величины пятна на теле карповых рыб (рис. 5) заключают в себе цисты с личинками сосальщика Neascus cuticola -- паразита подкожной клетчатки («чернильная болезнь»), губительного для молоди рыб.

Иногда встречающиеся молочно-белые нарывы могут заключать в себе
кокцидий, слизистых споровиков («шишечная болезнь» вызывается Myxobolus, Qlugea и др.) или других паразитов.

При наружном осмотре можно увидеть различные язвы, шрамы, опухоли, пятна, налеты. Они должны быть осторожно отпрепарованы и частью исследованы в свежем виде, частью законсервированы для дальнейшего исследования. Из цист слизистых споровиков, кокцидий и из соскобов налетов с поверхности тела изготовляются мазки. На чистое покровное стекло кладется циста споровка или капля соскоба, плотно прикрывается и прижимается сверху другим покровным стеклом такого же размера. После того как циста раздавится между стеклами, одно стекло сдвигается с другого. На каждом из стекол получается по тонкому мазку. Мазок должен быть равномерным и одной толщины на всей площади.

Не давая подсохнуть мазку, покровное стекло опускают мазком вниз на теплую жидкость Шаудина на 15--20 мин. Происходит быстрая коагуляция тканевых элементов, и мазок плотно пристает к стеклу. Промыв мазок в воде и 70°-м спирте, опускают его на 10--15 мин. в слабый раствор йода для отмывки сулемы, затем опять промывают в 70°-м спирте. Мазки сохраняются в 70°-м спирте в стеклянных реактивных цилиндриках, диаметром немного больше, чем покровное стекло. Стекла с мазками одной пробы кладутся друг на друга мазком вниз и отделяются от следующей пробы вырезанными из кальки или пергамента кружками, несколько большими, чем диаметр сосуда, на которых тушью, пишутся основные сведения, как указано.

При перевозке, во избежание трения стекол, между пробкой и верхним стеклом нужно положить слой ваты. Таким же образом изготовляются мазки при дальнейшем исследовании из содержимого мочевого и желчного пузырей и содержимого кишечника для обнаружения кишечных простейших.

Найденных паразитов снимают пинцетом или иглой и по группам помещают в отдельные сосуды (солонки или кристаллизаторы) с водой, снабженные этикеткой, на которой указаны номер исследуемой рыбы, дата исследования, орган локализации и количество паразитов. Если почему-либо невозможно подсчитать и собрать моногенетических сосальщиков с плавников, последние отрезаются и фиксируются 4%-м формалином для последующего исследования.

В течение всего хода исследования необходимо быть очень внимательным и точным в отношении этикетирования, чтобы избежав Путаницы и недоразумений во время отмывки, фиксации и уборки паразитологического материала. Для этого в каждую солонку, куда кладут из того или иного органа паразитов, следует класть временную этикетку (см. раздел «Регистрация и этикетирование паразитов»).

Точный подсчет паразитов каждого вида, обнаруженных в том или ином органе исследуемой рыбы, имеет большое значение для рыбохозяйственной практики, так как паразиты, не приносящие вреда, находясь в малых количествах, становятся опасными и даже гибельными при массовых заражениях. Кроме того, количественные данные могут помочь и при теоретических обобщениях.

Однако для некоторых групп, в частности простейших, точный количественный учет не осуществим. Иногда, в силу тех или иных обстоятельств, бывает трудно учесть и некоторых других паразитов, обнаруженных в большом количестве. В таких случаях приходится обозначать условно: «больше 100», «около 200», «чрезвычайно много» и т. д. (см. раздел «Регистрация и этикетирование паразитов»).

Подсчет паразитов, так же как и точный учет места локализации, необходимо проводить и при наружном и при внутреннем паразитологическом обследовании. Паразитов, собранных из разных органов или же относящихся к разным систематическим группам, фиксируют и размещают после фиксации по пробиркам всегда раздельно.

В процессе исследования нужно стремиться к полному сбору всех найденных паразитов.

В ихтиопаразитологической практике принято обозначать порядковый номер исследования двумя цифрами, из которых первая обозначает общий порядковый номер вскрытия, вторая-- порядковый номер определенного вида рыбы. Так, № 121-12 Abramis brama обозначает, что была исследована 121 рыба различных видов, из которых лещей было 12 штук. Номер исследования и название рыбы, так же как и систематическая группа паразитов и орган, где они были найдены, пишутся на лицевой стороне (т. е. обращенной к стеклу пробирки) постоянной этикетки.

4.3 Исследование внутренних органов рыбы

Кровь. При наружном осмотре рыбы местоположение сердца определяется положением узкого мыса брюшной стенки тела между жаберными крышками. Кровь «берут непосредственно из сердца пипеткой Пастера, предварительно очистив от чешуи место ее введения

Для изготовления мазка капля крови на совершенно чистое (обезжиренное) предметное утекло на расстоянии нескольких миллиметров от его узкого правого края. Другое предметное стекло, желательно шлифованное, ставится под острым углом на первое и подводится к капле до соприкосновения с ней. Когда в силу капиллярности кровь растечется по краю шлифованного стекла, последнее двигают влево от капли, и она тонким слоем равномерно распределяется по стеклу.

Мазок высушивается на воздухе (оберегать от пыли и от мух) и фиксируется в цилиндрическом стаканчике метиловым спиртом или равной смесью этилового спирта с эфиром в течение 5 мин. После фиксации стекло вновь высушивают и хранят в сухом месте, завернув в бумагу и снабдив соответствующей этикеткой. Номер исследованной рыбы дополнительно пишется восковым карандашом на обратной стороне стекла. В случае невозможности произвести фиксацию мазка тотчас же после его изготовления, ее можно отложить, но не более, чем на две недели. Окраску мазков рекомендуется производить не позже, чем через 2--2.5 месяца после фиксации.

В крови у рыб паразитируют простейшие -- жгутиконосцы Trypanosotna и Trypatwplasma. Они встречаются главным образом в крови ложной жабры и сосудах почек и при сильном заражении вызывают злокачественную анемию.

Жабры. Жаберный аппарат рыб бывает особенно часто поражен различными паразитами. Для паразитологического исследования снимают жаберную т крышку и ножницами вырезывают жабры одной стороны головы. При этом рыбу следует держать вертикально, головой кверху, иначе кровь зальет жабры, что весьма затруднит дальнейшую обработку. Жаберные дуги с жаберными лепестками отрезают по очереди и рассматривают их в часовом стекле под лупой, перебирая лепестки препаровальными иглами и следя за тем, чтобы они были покрыты водой. Если жабры малы, их просматривают целиком, не разъединяя. Bo время осмотра можно обнаружить белые цисты слизистых споровиков, метацеркарий Bucephalus с просвечивающим изнутри черным выделительным пузырем, Neascus, Metorchis и Ascocotyle достигающих половозрелости в рыбоядных птицах, паразитических рачков.

В основании жаберных дуг попадаются крупные темные цисты Clinostomum cotnplanatum, заканчивающие свое развитие в ротовой полости цапель. В основании жаберных лепестков располагаются цисты Echinostotnidae, хорошо отличимые по крупным светопреломляющим шипам на переднем конце личинки. Паразитов снимают с жабер иглами, тонким пинцетом, тонко оттянутой пипеткой или соскабливают скальпелем и раскладывают по солонкам. Моногенетических сосальщиков, отмыв от слизи, следует перенести пипеткой в солонку с водой, после чего осторожно заменить воду 4°/0-м формалином. Острыми ножницами отрезают от дуги лепестки у их основания и, разбирая их препаровальными иглами, выявляют паразитов, оставшихся незамеченными. Затем на разъединенные лепестки кладут предметное стекло, сдавливают их и рассматривают под малым увеличением микроскопа. Это дает возможность дополнительно обнаружить инфузорий, отдельные споры слизистых споровиков, треугольные яйца паразитов кровеносной системы Sanguinicola и личинок моногенетических сосальщиков.

У акуловых рыб (акулы, скаты), у которых отсутствует жаберная крышка и имеются жаберные мешки, обследование на жаберных паразитов проводится несколько иначе, чем у костистых рыб. У небольших акул и скатов острым ножом следует вырезать ту область тела, где расположены жаберные мешки. После этого ножницами или острым скальпелем вскрывается каждый жаберный мешок, начиная от его наружного отверстия. Жаберные лепестки просматриваются под лупой и бинокуляром, каждый лепесток в отдельности. На жабрах акуловых рыб весьма обычны крупные моногенетические сосальщики из рода Rajonchocotyle и др., а также паразитические веслоногие рачки (род Ommatocoita и др.). У крупных акул вырезать всю область с жаберными мешками затруднительно. У них каждый жаберный мешок вскрываетс в отдельности - ножницами, после чего просматриваются жаберные лепестки.

Жаберные паразиты весьма опасны для рыб, особенно для молоди, и часто вызывают смертельные эпизоотии не только в прудовых хозяйствах, но и в естественных водоемах. На изъязвленных местах обычно поселяется грибок Saprolegnia, и рыба быстро гибнет. Яйца сосальщика Sanguitiicola закупоривают просветы жаберных капилляров, нарушают правильный процесс кровообращения, ткани мертвеют и вслед за этим заражаются гнилостными бактериями. Сильное заражение паразитическими рачками, кроме разрушения жаберной ткани, вызывает у рыбы злокачественное малокровие. Возбудителем известного в рыбных хозяйствах заболевания--дактилогироза, при котором рыба погибает от удушья, является моногенетический сосальщик Dactylogyrus vastator (рис. 9).

Обычно в полевых условиях, за недостатком времени, исследуется лишь одна половина жаберного аппарата. Вторая половина фиксируется 4%-м формалином и с этикеткой укладывается либо в пробирку, если позволяют ее размеры, либо заворачивается в марлевую салфеточку, обвязывается ниткой и опускается в материальную банку с 4%-м формалином.

В крайних случаях, при обнаружении очень большого числа паразитов того или иного вида и недостатке времени для сбора, учитывая, что вторая половина жабер будет исследована дополнительно, можно собрать не всех паразитов, а 2--3 десятка для фиксации, остальных же только - подсчитать.

Фиксированных моногенетических сосальщиков, ввиду их малых размеров, рекомендуется не сохранять в пробирках, а сразу же заделывать в глицерин-желатиновые препараты. Червя помещают на предметное стекло в маленькой капле формалина, затем сверху иглой или скальпелем кладут небольшой кусочек глицерин-желатина. Стекло слегка нагревается на спиртовке до расплавления глицерин-желатина и затем покрывается покровным стеклом. Края последнего впоследствии рекомендуется обвести канифольной замазкой (это можно сделать и через несколько месяцев). Препараты в глицерин-желатине сохраняются очень долго. Препарат снабжается двумя этикетками, которые приклеиваются на оба конца покровного стекла.На одной из них пишется название паразита, на другой номер вскрытия, название рыбы и орган, дата вскрытия, географическое место исследования и фамилия сборщика.

Ротовая полость. В ротовой полости, которую исследуют вслед за жабрами, (например Salmincola), моногенетические сосальщиками. (например Nitzschia sturionis, рис. 10), цисты Neascus cuticolau других сосальщиков. У щук и некоторых других хищных рыб иногда встречается выползающий из желудка в ротовую полость, после смерти рыбы, крупный сосальщик Azygia lucii. Рачков следует снимать осторожно, чтобы не оторвать орган прикрепления.

Полость тела. В полости тела рыб, на серозных покровах ее, на поверхности органов, в жировой ткани и брюшине встречаются главным образом личинки паразитических червей, достигающие половозрелости в кишечнике других рыб, птиц или млекопитающих.

Здесь можно найти мелкие овальные цисты с личинками сосальщика Tetracotyle (например Т. variegata, вызывающий массовую гибель рыб, Т. регсае и др.). Весьма интересным паразитом является цестодария Amphilina из полости тела осетровых рыб, достигающая там половозре-лости. Это широкие листовидные черви длиной от 3 до 50 мм, желтоватого цвета. Особенно часты они у молодых рыб.



Рис. 11. Лещ, пораженный ремнецами. (По Маркевичу).

В карповых и некоторых других рыбах встречаются различные ремнецы (Ligula, Digrammd), достигающие больших размеров. В случае сильного заражения брюхо рыбы сильно вздувается и даже прорывается (рис. 11). Ремнецы часто вызывают воспаление брюшины, водянку и являются причиной массовой гибели рыб. В колюшках обычен Schisto-cephalus. Плероцеркоиды широкого лентеца Diphyllobothriam Шит, паразита человека и домашних животных, живут в полости, на поверхности органов и в мышцах различных хищных рыб (щука, окунь, ерш и др.). Это личинки молочно-белого цвета, 1--3 см длины, 2--3 мм ширины. В лососевых рыбах встречаются личинки Eubothrium, n полости многих морских рыб -- Scolex polymorphtis и личинки рода Tetrarkynchus, легко отличающиеся по наличию четырех шиповатых длинных хоботков, покрытых крючками и ввернутых внутрь тела. В полости тела и на мезентерии некоторых карповых рыб встречаются грушевидные ци-сты Cysticercus dilepidis и Triaeno- nophoms noduiosus. в соединительнотканных цистах (рис. 12).

На внутренней стороне стенок тела и наружной поверхности кишечника, на брыжейке налима, бычков, миног, сельдей и других рыб капсулируются личинки скребней Согупоsoma. Часты в полости тела личинки круглых червей Rhaphidascaris и Contracoecam, например С. siluri gla-nidis у хищных рыб. У сомов, стерлядей, осетров и сазанов в полости тела встречаются темные дисковидные капсулы Agamospirura. Во взрослом состоянии в полости тела живут Philometra sanguineum. Встречаясь иногда сотнями у различных рыб (карась, лещ, сырть, плотва, густера, колюшка), они образуют клубки кроваво-красного цвета и вызывают воспаление стенок полости тела. У морских рыб очень обычен Anisakis.

Внутренние органы. Сердце вынимают вместе с крупными сосудами и кладут в глубокое часовое стекло или солонку с физиологическим раствором. Если сердце исследуется сразу после наружного осмотра, перед вскрытием жабер, что желательно, то острыми ножницами вскрывают околосердечную полость и вырезают сердце. Затем осматри вают его снаружи и вскрывают, стенки сердца, как и другие органы, исследуются компрессорным способом. Образующийся в физиологическом растворе осадок исследуется под микроскопом. Здесь можно обнаружить половозрелую стадию кровяных сосальщиков Sanguinicola и Janickia, которые встречаются* главным образом в артериальной луковице, брюшной аорте и приносящих жаберных артериях. Яйца этих червей закупоривают капилляры жаберных лепестков и нарушают кровообращение.

Известно нахождение в артериальной системе щуки круглых червей Filaria obturans. Воспаление околосердечной сумки, сильную деформацию частей сердца и обесцвечивание его вызывают слизистый споровик Myxobolus cardis у усачей и Myxobolus dogieli у карпа.

При сильном заражении из желудка ео все стороны выступают беловатые колбасовидные мешки --* цисты этого паразита.

Мочевой пузырь вырезается у самого основания, разрывается иглами на стекле и исследуется отдельно. Здесь встречаются инфузории Tricliodina, слизистые споровики Myxidium (обычны у щуки), пронизывающие ткань бесформенными желтоватыми массами, сосальщики рода Phyllodistomum, вызывающие воспаление стенок органа. В мочевом пузыре зубатки обычен сосальщик Lepidophyllum.