Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний науковий центр

Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова УААН

06.01.08 - Виноградарство

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук

Тема:

Система санітарного контролю у виноградних розсадниках України

Мулюкіна Ніна Анатоліївна

Одеса - 2008 р.



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Національному науковому центрі «Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова» УААН

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Патика Володимир Пилипович, інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного, НАНУ, завідувач відділом фітопатогенних мікроорганізмів

доктор сільськогосподарських наук, професор, Якушина Надія Альфонсівна, Національний інститут винограду і вина «Магарач» УААН, вчений секретар, завідувач відділом захисту і фізіології рослин

доктор сільськогосподарських наук, професор, Хреновськов Едуард Іванович, Одеський державний аграрний університет Мінагрополітики, завідувач кафедри виноградарства і виноробства

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного наукового Центру «Інститут виноградарства і виноробства ім.В.Є. Таїрова» за адресою: Одеська обл., смт. Таїрове, вул. 40-річчя Перемоги, 27.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, д.с.-г. н.В.О. Шерер



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Санітарний контроль є важливою складовою сертифікації садивного матеріалу винограду більшості виноградарських країн світу. Він є одним з найефективніших засобів боротьби із системними вірусними, бактеріальними та фітоплазмовими патогенами. Як правило, проти цих хвороб відсутні або є малоефективними хімічні та агротехнічні заходи боротьби.

В Україні методи санітарного контролю почали застосовувати у 80-х роках минулого сторіччя за проведення масштабних робіт з відбору та дослідження клонів в Центрі клонової селекції ІВіВ ім. В.Є. Таїрова.

Протягом останнього десятиріччя виникла потреба в розробці системи санітарного контролю, яка відображує зміни у виноградарстві та виноградному розсадництві України.

Актуальність такої розробки була зумовлена, насамперед, створенням маточних насаджень нових для України категорій (банк клонів, базові та сертифіковані маточники), які є основою виробництва сертифікованого садивного матеріалу винограду.

Виникла потреба вивчення ряду питань щодо тривалого збереження санітарного стану цих насаджень (періодичність та обсяги перевірки, заходи обмеження поширення інфекції, тощо).

Результативні дослідження в галузі вітчизняної генеративної селекції, інтродукція ряду сортів і клонів в Україну з-за кордону та використання їх для розмноження істотно розширили базу для проведення і регламентації робіт з санітарного контролю.

Розробка та впровадження в практику молекулярно-біологічних методів санітарного контролю визначило необхідність оцінки особливостей їх застосування на етапах розмноження, оптимізації цих методів та відбору проб для проведення аналізу.

Певні зміни нормативних документів, що регламентують проведення санітарного контролю у виноградарських країнах світу потребують аналізу і гармонізації з українськими аналогами.

Таким чином, виникла необхідність розробки науково обґрунтованої системи санітарного контролю за виробництва садивного матеріалу у виноградних розсадниках України.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами

Дисертаційна робота виконана згідно з тематичним планом ННЦ „Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова”, в лабораторії вірусології і мікробіології у 1996-2007 рр. за завданнями 4 - „Розробити та застосувати комплекс молекулярно-біологічних та біотехнологічних методів діагностики вірусних і бактеріальних хвороб винограду з метою одержання здорового садивного матеріалу цінних сортів та клонів винограду” (держреєстрація №0198U002660, 1996-2000 рр.), 02.03 - «Розробка заходів боротьби із системними захворюваннями винограду та здійснення постійного фітосанітарного контролю за станом клонів і маточників винограду» (держреєстрація №0104U005517, 2001-2005 рр.), «Розробка та впровадження методів діагностики вірусних хвороб та бактеріального раку на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)» (Програма «Сільськогосподарська біотехнологія», держреєстрація №0104U005521, 2001-2005 рр.), 02а «Розробка технології вирощування вихідного клонового садивного матеріалу винограду в контрольованих умовах» (держреєстрація № 0104U005516, 2001 - 2005 рр.), 38А.03-025 - «Створити систему оцінки і контролю санітарного стану маточних насаджень винограду для вирощування сертифікованого садивного матеріалу» (держреєстрація №0106V003760, 2006-2007 рр.).

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи було теоретично обґрунтувати і розробити науково-методичні основи санітарного контролю для виноградних розсадників України. Для її вирішення було поставлено наступні завдання:

- провести аналіз результатів досліджень та схем санітарного контролю виноградарських країн світу;

- розробити схеми санітарного контролю на всіх технологічних етапах клонової селекції і виробництва сертифікованого садивного матеріалу винограду;

- дослідити санітарний стан виробничих виноградників та маточників різних категорій у відношенні до ураження вірусними і фітоплазмовими хворобами, бактеріальним раком та грибними хворобами багаторічної деревини;

- оцінити особливості симптоматологічного прояву, розповсюдження та ступенів ураження вірусними хворобами і бактеріальним раком в залежності від уражених сортів та регіону проведення досліджень;

- дослідити просторове та часове поширення зазначених вище хвороб в природних умовах, оцінити санітарний стан та ризики ураження базових, сертифікованих маточних насаджень, а також матеріалу первинного розмноження сортів нової селекції вірусними хворобами і бактеріальним раком;

- розробити, оптимізувати та впровадити в практику виноградних розсадників методи експрес-діагностики вірусних хвороб і бактеріального раку винограду;

- розробити систему санітарного контролю для виноградних розсадників України та відобразити її в нормативних та регламентуючих документах;

- розрахувати економічну ефективність виробництва сертифікованого садивного матеріалу.

Об'єкт дослідження: Виноград (Vitis vinifera L.), вірусні хвороби винограду та їх збудники: коротковузля (grapevine fanleaf virus), вірус мозаїки резухи (arabis mosaic virus), скручування листя (grapevine leafroll viruses 1, 2, 3), борознистість деревини (grapevine virus A), мармуровість винограду (grapevine fleck virus), бактеріальний рак (Agrobacterium tumefaciеns Conn), фітоплазмові хвороби винограду, хвороби багаторічної деревини винограду, викликані грибною інфекцією - еска, ескоріоз, еутипоз.

Предмет дослідження: Схеми санітарного контролю винограду, симптоми вірусних хвороб та бактеріального раку, методи діагностики вірусних хвороб і бактеріального раку винограду, санітарний стан промислових виноградників, санітарний стан маточних насаджень селекційних категорій, санітарний стан клонів винограду та сортів нової селекції, поширення вірусних хвороб і бактеріального раку винограду

Методи дослідження: У роботі використано методи: мікробіологічні - виділення агробактерій на напівселективних поживних середовищах; індикаторні - встановлення патогенності агробактерій на тест-рослинах; серологічні - виявлення та ідентифікація збудників вірусних хвороб винограду методом імуноферментного аналізу (ІФА); молекулярно-біологічні - встановлення патогенності агробактерій методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), виявлення вірусів винограду методом аналізу дволанцюгової РНК (длРНК) та молекулярної гібридизації з длРНК-зондами; фітопатологічні - визначення прояву та поширення вірусних і фітоплазмових хвороб та бактеріального раку; польові - маршрутні обстеження промислових виноградників на ураженість хворобами, візуальний санітарний контроль маточних насаджень на відсутність ураження хворобами; математико-статистичні - кореляційний аналіз, оцінка вірогідності різниці за допомогою t-крітерія та F-крітерія.

Наукова новизна одержаних результатів.У дисертаційній роботі теоретично обґрунтовано і розроблено науково-методичні основи санітарного контролю за виробництва сертифікованого садивного матеріалу винограду в Україні. Система накладається на етапи технології виробництва селекційних категорій садивного матеріалу винограду, розроблену спеціалістами Центру клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова».

Система вперше в Україні поєднує та включає такі елементи, як:

організаційні - мережа розсадників Центру клонової селекції та організацій, які здійснюють державний контроль та науковий супровід діяльності розсадників;

інформаційні - бази даних патогенів, поширених в Україні, які входять в систему санітарного контролю, бази стандартизованих або метрологічно атестованих методик відбору проб та діагностики латентного ураження ними, бази маточних насаджень у розсадниках, бази даних нормативної документації;

ідентифікаційні - поєднання санітарного контролю з ампелографічним та молекулярно-генетичним контролем;

технологічні - категорії насаджень на клоновій основі - клонодослідні ділянки, банк клонів, базові та сертифіковані маточники; категорії насаджень на генеративній основі - селекційний розсадник, ділянки конкурсного випробування, маточники первинного розмноження.

Методами візуального санітарного контролю та лабораторної діагностики в динаміці вперше оцінено санітарний стан банку вітчизняних клонів, базових і сертифікованих маточників у семи виноградних розсадниках, як бази виробництва садивного матеріалу селекційних категорій в Україні.

Встановлено особливості та швидкість природного поширення коротковузля, скручування листя і бактеріального раку в умовах різних регіонів України. На основі отриманих даних оцінено ризики ураження маточних насаджень селекційних категорій, що дозволило диференціювати періодичність та обсяги тестування на латентне ураження вірусами і бактеріальним раком.

Вперше із застосуванням методів математичної статистики проведено порівняння санітарного стану виробничих виноградників та маточних насаджень категорії «стандартні», а також оцінено вплив бактеріального раку і грибних хвороб багаторічної деревини на зрідженість виноградних насаджень. Одержані дані демонструють ефективність заходів санітарного контролю у виноградному розсадництві.

Оптимізовано та стандартизовано спосіб відбору точкових проб і складання середньої проби за виявлення вірусів винограду для методичного забезпечення системи санітарного контролю.

Вперше розроблено метод експрес-детекції вірусної інфекції на основі молекулярної гібридизації з нерадіоактивно міченими длРНК-зондами для неспецифічного попереднього скринінгу на наявність вірусної інфекції. Метод використано для тестування кущів клонів на відсутність вірусної інфекції.

Вперше в систему санітарного контролю для розсадників Центру клонової селекції впроваджено ПЛР-діагностику бактеріального раку.

Вперше розроблено нормативні документи для контролю санітарного стану маточних насаджень винограду, в тому числі ряд національних стандартів України та ряд положень і інструкцій.

Практичне значення одержаних результатів. Сільськогосподарському виробництву рекомендовано систему санітарного контролю за виробництва садивного матеріалу селекційних категорій та нормативні документи, які регламентують її застосування у виноградному розсадництві України. Систему впроваджено у виробничу практику семи виноградних розсадників Центру клонової селекції, а саме:

Одеська область: ВАТ «Придунайський», ДГ ім. Суворова, ДП ДГ «Таїровське»

Миколаївська область: радгосп «Інгулецький»

Херсонська область: АФ радгосп «Білозерський»

Закарпатська область: радгосп «Виноградівський»

АР Крим: СВК «Ізумрудний», які охоплюють щорічне виробництво в Україні понад 3 мільйонів щеплених саджанців категорії «стандартні» та поки що десятки тисяч саджанців категорій базові та сертифіковані.

Оцінено санітарний стан рослин банку 50 перспективних клонів вітчизняної селекції 37 технічних, столових та підщепних промислових сортів винограду. Проведено візуальний санітарний добір та вибірковий лабораторний контроль базових та сертифікованих маточних насаджень винограду загальною площею понад 150 га. Визначено добрий санітарний стан даних насаджень, що дозволило приступити до виробництва базового та сертифікованого садивного матеріалу винограду в Україні з 2007 року.

Особистий внесок здобувача

Дисертантом особисто обґрунтовано наукову концепцію дисертаційної роботи, здійснено інформаційний пошук і аналіз літературних даних за темою дисертації, розроблено робочі гіпотези, обґрунтовано методологію постановки дослідів, виконано експериментальні дослідження та обстеження, проведено інтерпретацію та узагальнення експериментальних даних, підготовлено друковані праці.

В роботі для аналізу санітарного стану клонів використано дані з тестування кущів клонів індексації щепленням, одержані на Донецькій дослідній станції виноградарства в 1980-1985 роках кандидатом біологічних наук Чайкіним Б.А. та методом ІФА, одержані в 1986 - 1995 роках доктором біологічних наук Мілкусом Б.Н. та Картузовою В.І.

Роботи з виявлення збудника бактеріального раку винограду ПЛР-методом проведено старшим науковим співробітником Баришевою І.А. за нашої участі.

У співавторстві виконано:

Обґрунтування, розробка та впровадження системи санітарного контролю для спеціалізованих виноградних розсадників України, розробка нормативних та регламентуючих документів (кандидат біологічних наук Тулаєва М.І., кандидат сільськогосподарських наук Чисніков В.С.).

Розробку методу виявлення вірусної інфекції шляхом молекулярної гібридизації з біотініліруваними длРНК зондами (1996-1998 рр.) здійснено під науковим керівництвом Мілкуса Б.Н.

Особистий внесок здобувача (авторське право на клони винограду, рекомендовані для розмноження) становить 15 відсотків.

Усім зазначеним колегам автор висловлює щиру вдячність за неоціненну допомогу.



Апробація результатів дисертації

Основні положення роботи викладені і обговорені на вчених Радах ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» у 1996-2005 рр., на вченій Раді інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (2006 р.), на засіданнях координаційно-методичних нарад з виноградарства в ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» (2006 р.), в Закарпатському інституті АПВ (2007 рік), Національному інституті винограду і вина «Магарач» (2008 р.) та координаційно-методичних нарадах з сільськогосподарської біотехнології в Південному біотехнологічному Центрі в рослинництві в 2001-2008 рр., на науковій конференції „Науково-технічний прогрес у виноградарстві” (Кишинів, Молдавський аграрний університет, 1998 р.), на міжнародній науково-практичній конференції „Імунітет і фітосанітарна селекція в системі інтегрованого захисту виноградних насаджень” (Кишинів, Молдова, 2001 р.), ювілейній науковій сесії з приводу 100-річчя Інституту виноградарства і виноробства (Плевен, Болгарія, 2002 р.), 14-й конференції Міжнародної Ради з дослідження вірусів та вірусних хвороб винограду (Locorotondo (Bari), Italy, 2003 р.), міжнародному симпозіумі „Виноградарство і виноробство XXI століття” (ННЦ „ІВіВ ім. В.Є. Таїрова”, Одеса, 2005 р.), V міжнародній спеціалізованій виставці-симпозіумі «Вино и виноделие XXI столетия» (Одеса, 2005 р.), нараді «Современное состояние селекции винограда в Украине. Выведение, регистрация и использование сортов и клонов» в Національному інституті винограду і вина «Магарач» (11-15 вересня 2006 р.), міжнародній науково-практичній конференції «Технології та прийоми боротьби з бактеріальним раком винограду» (АФ радгосп «Білозерський», 2007 р.), міжнародній науково-практичній конференції «Мобилизация и сохранение генетических ресурсов винограда, совершенствование методов селекционного процесса» (13-14 серпня 2008 р., Новочеркаськ, Російська Федерація).

Публікації

Результати дисертації викладені у 40 наукових публікаціях, з них одна монографія, 30 статтей в наукових збірниках і журналах, з них у фахових виданнях 21 стаття; 2 методичні рекомендації, 1 інструкція, 6 в доповідях і тезах наукових конференцій та симпозіумів.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, 8 розділів основної частини (227 стор.), загальних висновків, рекомендацій виробництву, списку використаних джерел (51 стор., 468 найменувань, з них 436 - англомовних) та дев'яти додатків (266 стор.). Загальний обсяг дисертації складає 543 сторінки комп'ютерного тексту. Основний текст ілюстрований 79 таблицями та 50 малюнками (з них 26 фотознімків).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Сучасний стан вивчення вірусних, бактеріальних та фітоплазмових хвороб винограду на виробничих виноградниках. Методи їх діагностики та заходи санітарного контролю у боротьбі з ними

У вступній та аналітичній частині обґрунтовано актуальність теми, визначено мету і завдання досліджень, показано пріоритетні шляхи розв'язання проблеми. В огляді використаної літератури проведено аналіз результатів наукових праць вітчизняних і закордонних авторів, які розглядають складові схем санітарного контролю. Наведено дані з вивчення вірусних, бактеріальних, фітоплазмових та грибних хвороб у виноградарських країнах світу. Проаналізовано особливості методів детекції та ідентифікації збудників цих хвороб за допомогою серологічних і молекулярно-біологічних методів. Представлено результати епідеміологічних досліджень найбільш шкідливих вірусних хвороб і бактеріального раку винограду. Проаналізовано заходи боротьби з вірусними хворобами та бактеріальним раком, які комплексно застосовуються в рамках схем санітарного контролю садивного матеріалу винограду. Зазначено, що в основних виноградарських областях України ще недостатньо досліджені особливості прояву та розповсюдження вірусних хвороб і бактеріального раку протягом останнього десятиріччя та вплив на санітарний стан виробничих виноградників і маточних насаджень безконтрольного ввезення в країну імпортного садивного матеріалу.

Визначено, що в Україні у недостатньому обсязі проведено роботи з дослідження шляхів природного поширення вірусних хвороб і бактеріального раку. Встановлено, що у виноградному розсадництву України немає науково обґрунтованої єдиної системи санітарного контролю за виробництва садивного матеріалу селекційних категорій. На підставі проведеного аналізу обґрунтовується необхідність вивчення особливостей прояву та поширення вірусних хвороб і бактеріального раку на виробничих виноградниках України в залежності від уражених сортів і регіону проведення досліджень. Визначається актуальність розробки, оптимізації та застосування молекулярно-біологічних методів діагностики латентного ураження збудниками вірусних хвороб та бактеріального раку для одержання вірогідних результатів аналізу. Обґрунтовується актуальність оцінки санітарного стану маточних насаджень селекційних категорій, закладених у виноградних розсадниках Центру клонової селекції і визначення ризиків їх ураження системними патогенами. Зазначено необхідність науково-методичного обґрунтування і розробки системи санітарного контролю для виноградних розсадників України.

Умови, методи та методики проведення досліджень

Візуальні спостереження за проявом вірусних хвороб і бактеріального раку винограду здійснювали на виробничих насадженнях 27 прищепних і підщепних сортів загальною площею близько 817 га та маточних насадженнях 15 прищепних і підщепних сортів категорії „стандартні” загальною площею 443 га.

Сортимент виробничих виноградників був представлений прищепними сортами Каберне Совіньйон, Піно чорний, Мерло, Одеський чорний, Рубін таїровський, Голубок, Іллічівський ранній, Сапераві північний, Трамінер рожевий, Іршаї Олівер, Аліготе, Шардоне, Рислінг рейнський, Ркацителі, Сухолиманський білий, Біанка, Мускат одеський, Мускат жемчужний, Мускат янтарний, Королева виноградників, Восторг, Одеський сувенір, Молдова та підщепними - Берландієрі х Ріпарія СО4, Берландієрі х Ріпарія Кобера 5ББ, Ріпарія х Рупестріс 101-14, Феркаль.

Обстежені маточні насадження категорії «стандартні» знаходилися у п'яти виноградних розсадниках (Одеська область - ДГ „Таїровске”, ДГ ім. Суворова, ВАТ „Придунайський”, Херсонська область - АФ радгосп „Білозерський” та АР Крим - СВК „Ізумрудний”), виробничі виноградники, що використовувались в якості маточних насаджень - у семи виноградних розсадниках і дев'яти виноградарських господарствах Одеської, Миколаївської та Херсонської областей.

Візуальний санітарний контроль та лабораторне тестування на ураження збудниками вірусних хвороб і бактеріального раку регулярно проводили на двох клонодослідних ділянках і банку клонів в теплиці ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова». Ці заходи були застосовані також на базових та сертифікованих маточниках 25 клонів 14 прищепних та підщепних сортів винограду загальною площею понад 150 га в п'яти областях України.

Для росту і розвитку винограду за метеорологічними умовами найбільш сприятливими були 2002 і 2005 роки, а найбільш складними - 1997, 2004 та 2007 роки.

Осінні періоди 2001, 2004 та 2005 років були тривалішими в порівнянні з багаторічними даними. Вісім з дванадцяті років дослідження відрізнялися більш теплими осінніми сезонами (в середньому на 1-4°С).

Зимові температури семи з дванадцяти років також були теплішими за багаторічні значення і сприяли добрій перезимовці виноградних кущів, а також зберіганню грибної інфекції. У 1996, 1997, 2000, 2005 та 2006 роках відмічались різкі коливання температур з короткочасними значними зниженнями їх значень. Взимку 2005-2006 рр. та 2006-2007 рр. внаслідок короткочасного значного зниження зимової температури спостерігалось пошкодження багаторічної деревини, що призвело до збільшення проявів бактеріального раку винограду. Спостерігалась тенденція до зменшення тривалості зим, за виключенням 2003 року.

Весняні температури повітря 1996-2007 років в цілому були близькі до середніх багаторічних значень, за виключенням помітного перевищення в 2007 році. Весняний період відрізнявся нестійкою погодою, достатнім вологозабезпеченням (за виключенням 2007 року, коли кількість опадів була майже на 30% нижчою від середніх багаторічних значень). Весною 1999 і 2000 років на початку травня відмічались приморозки до - 3?С.

За температурним режимом найтеплішими були 1999, 2000, 2001, 2002 та 2007 роки, коли днів з середньодобовою температурою повітря 25?С було в три рази більше норми.

Середньомісячні температури червня були вищими від кліматичної норми в 1999 та 2007 роках, що негативно впливало на виявлення мозаїки жилок та мозаїчних симптомів за ураження коротковузлям винограду. Збільшення середньомісячних температур серпня в 2000, 2001, 2003, 2005, 2006 та 2007 роках позначилося на збільшенні прояву ураження вірусом скручування листя винограду.

Найбільш вологими були 1997, 2000, 2004 роки, коли за вегетацію опадів випало в 2 рази більше багаторічної норми. Ці роки характеризувалися високими рівнями прояву епіфітотій грибних хвороб, що відображено в даних санітарного контролю на виноградниках.

Тривалість періоду з температурою повітря стабільно вище + 10?С в середньому була довше середніх багаторічних. Особливо довгою була активна вегетація в 2004 і 2005 роках.

Описані вище кліматичні умови позначалися на фізіологічному стані рослин винограду і відповідно впливали на прояв симптомів вірусних, фітоплазмових хвороб, бактеріального раку, хвороб багаторічної деревини грибного походження. Цей вплив позначався також на концентрації збудників в тканинах рослин, а отже - певною мірою на результатах виявлення рівнів латентного ураження цими хворобами.

На виробничих виноградниках та маточниках категорії „стандартні” візуальне виявлення вірусних хвороб і бактеріального раку винограду проводили шляхом покущового огляду від 5 до 10 відсотків рослин, в залежності від загальної площі насадження. При цьому здійснювали не менше, ніж два проходи по кожній ділянці (клітині), згідно з «Методическими рекомендациями по агротехническим исследованиям в виноградарстве Украины» (2004). Загальна кількість рослин, оглянутих на одній ділянці, складала від 500 до 2000 шт.

Епідеміологічні дослідження проводили візуально на всій площі обраної ділянки. Обліки симптомів коротковузля на зелених частинах виноградного кущу (листя, пагони) проводили в травні - червні, скручування листя - в серпні - вересні, борознистості деревини - в квітні - травні та жовтні - листопаді, мозаїки жилок - в травні - на початку червня.

Кількість уражених кущів визначали у відсотках від загальної кількості обстежених кущів.

Ступінь ураження бактеріальним раком оцінювали за п'ятибальною шкалою згідно з Лемановою Н.Б. (1989) та «Методическими рекомендациями по агротехническим исследованиям в виноградарстве Украины» (2004).

Візуальний санітарний контроль проводили на клонодослідних ділянках двох вегетативних поколінь, банку клонів в теплицях ННЦ „Інститут виноградарства і виноробства ім. В.Є. Таїрова”, базових та сертифікованих маточниках в шести виноградних розсадниках п'яти областей України двічі на рік: наприкінці травня - червні та в серпні - вересні в період з 1996 по 2007 рік.

Санітарний контроль проводили шляхом покущового візуального огляду усіх рослин на маточних насадженнях згідно з “Технологією виробництва безвірусного садивного матеріалу” (1989) та інструкцією з виробництва елітного щепленого садивного матеріалу винограду (1987).

Імуноферментний аналіз проводили відповідно до метрологічно атестованої методики № МВВ 001-85/3 - 2006 та згідно з інструкцією до діагностичних наборів виробництва фірми “Agritest”(Італія).

В якості джерела антигену використовували листя та зскрібки кортикального шару визрілої лози.

Дволанцюгову РНК винограду виділяли за оригінальним методом Грама та Майор (1989) та з нашими попередніми модифікаціями (1992).

Обробку нуклеазами здійснювали за загальноприйнятою методикою (1985).

Горизонтальний електрофорез проводили в 0.7-1.5% гелі агарози за напруги від 100 до 250 В протягом 0.5=2 годин.

Дволанцюгову РНК очищали мікрометодом на целюлозі CF-11 та CF-15 за Dodds et al. (1983) або препаративним електрофорезом за Маніатіс та ін. (1984).

Біотинілірування длРНК проводили за допомогою реакції з фотобіотином (1990 р.) за методикою фірми-виробника.

Гібридизацію імобілізованих на нейлоновому фільтрі екстрактів проводили за методом Маніатіс та ін. (1984).

Колориметричну реакцію здійснювали відповідно McInnes et al. (1988).

За діагностики бактеріального раку бактерії з тканин винограду виділяли за методом Лехоцкі (1971).

Агробактерії виділяли на напівселективному поживному середовищі Рой і Сассера ) (1983). Одержані на чашках Петрі колонії агробактерій висівали на пробірки зі скошеним картопляним агаром і витримували 1 добу в термостаті за температури + 28єС. Культури використовували для ураження рослин-індикаторів.

В якості індикаторів для виявлення збудника бактеріального раку використовували рослини з класу Дводольні, в тому числі каланхоє та диски моркви.

ПЛР проводили відповідно до метрологічно атестованої методики №МВВ 002-85/3 - 2006 та методу, запропонованого Haas et al. (1995).

Виділення плазмідної ДНК Agrobacterium vitis проводили з цетавлоном, кип'ятінням або лужним лізісом. Для виявлення A. vitis використовували специфічні праймери virD2 та ipt. Ампліфікацію проводили в ампліфікаторі, який забезпечував розбіг температур від +4єС до 100єС, в режимі: 1. 94єС - 4 хв.; 2. 50єС - 1 хв, 72єС - 1 хв, 94єС - 1 хв (35 циклів); 3. 50єС - 1 хв., 72єС - 10 хв. Розчин з продуктами ампліфікації зберігали при -20^єС.

Електрофорез продуктів ампліфікації ДНК проводили в горизонтальному гелі 4% агарози в трис-боратному буфері при напрузі 5В/см. Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програм „Microsoft Exel” та пакету варіаційної статистики. Використовували методи варіаційної статистики (парний т-крітерій Стьюдента) та кореляційний аналіз. Визначення випадковості співвідношення результатів, одержаних вихідними та модифікованими методами діагностики, проводили згідно Літтл Т. та Хіллз Ф. (1981).

Моніторинг санітарного стану виробничих виноградників у розсадниках

Добрий санітарний стан маточних насаджень в розсадниках є визначальним для отримання здорових саджанців. Тому дослідження загальної санітарної ситуації в розсадницьких господарствах є необхідним етапом розробки елементів системи санітарного контролю.

Для визначення переліку хвороб, які необхідно включити до системи санітарного контролю маточних насаджень та садивного матеріалу винограду в Україні, була здійснена оцінка санітарного стану насаджень в найбільших виноградних розсадниках. Ці розсадники в сукупності охоплюють близько 60-70% обсягу виробництва садивного матеріалу в п'яти регіонах України та значну частину маточників і виробничих виноградників, які часто використовують в якості маточних.

Прояв вірусних і бактеріальних хвороб досліджували на типовому сортименті виноградних насаджень України (табл. 1).

Серед досліджених 917 га виробничих ділянок коротковузля було виявлено на 32 га, скручування листя - на 87,2 га та бактеріальний рак - на 278,6 га (табл. 2). При цьому візуальна зустрічаємість коротковузля складала 0,7-1,5%, скручування листя - 1,1-6,5% від загальної кількості оглянутих кущів. Рівні латентного ураження збудниками вірусних хвороб коливались від 2-3% до 8% (табл. 3). Склад вірусних хвороб залежав від регіону розташування розсадника.

Бактеріальний рак винограду більше поширений на виноградниках України ніж вірусні хвороби. За рівнями ураження він у два - три рази перевищує рівні ураження вірусними хворобами. На відміну від вірусних хвороб, бактеріальний рак зустрічається відносно рівномірно в усіх досліджених регіонах. Виявлене візуальне ураження складало від 0,5 до 25,6%, латентного - від 5 до до 45%. Було виявлено помірну кореляцію між значеннями рівнів ураження бактеріальним раком і кількістю загиблих кущів (випадів) (r = 0,47 та 0,63 для старих та молодих виноградників відповідно) та сильну негативну кореляцію (r = - 0,835) між кількістю загиблих кущів та врожайністю.

Таблиця 1

Сортимент та кількість виробничих виноградників, на яких оцінювали прояв вірусних хвороб і бактеріального раку (сумарно по п'яти областях України, 2002-2006 рр.)

Сорт	Кількість досліджених насаджень	Загальна площа досліджених насаджень, га
Аліготе	5	70
Совіньйон зелений	1	12,0
Шардоне	1	16,0
Рислінг рейнський	3	6,4
Ркацителі	1	15,0
Совіньйон зелений	1	12
Сухолиманський білий	4	26,0
Шардоне	1	16
Іршаї Олівер	3	56,0
Трамінер рожевий	4	41,0
Мускат Одеський	1	5,0
Каберне Совіньйон	18	159,5
Мерло	6	99,0
Сапераві	3	82,9
Піно чорний	3	13,7
Голубок	2	10,5
Одеський чорний	12	64,5
Мускат жемчужний	1	2,9
Мускат янтарний	2	26,0
Королева виноградників	1	17,0
Восторг	2	12,0
Одеський сувенір	2	9,0

Таблиця 2

Площі виробничих виноградників, на яких відмічено ураження вірусними хворобами та бактеріальним раком при візуальних спостереженнях (2002-2006 рр.)

Область	Загальна площа насаджень, га	Площа насаджень, на яких виявлено хвороби (га)	Загальна площа насаджень, на яких виявлено хвороби, га
		Коротковузля	Скручування листя	Бактеріальний рак
Одеська	430,4	2	49	165	228,9
Миколаївська	122,0	0	20	68	88
Херсонська	81,3	0	11,5	31,5	43
Закарпатська	9,01	0	0,65	0,6	1,25
АР Крим	174,25	30	6	13,5	49,5
РАЗОМ	816,9	32	87,2	278,6	411

Таблиця 3

Латентне ураження виробничих виноградників вірусними хворобами (1997-2005 рр.)

Область, господарство	Сорт	Площа, га	Хвороба та візуальне ураження (%)	Вірус, який виявляли	Латентне ураження (%)
Одеська область ВАТ «Придунайський»	Піно чорний	6	GLRaV, 3,9	GLRaV 1, 3	2,0
Одеська область, ДГ «Таїровське»	Одеський сувенір	2	GFLV, 0,5	GFLV	3,0
-/ -	Одеський чорний	3	GLRaV, 1,1	GLRaV 3	4,0
-/ -	Мускат жемчужний	2,9	відсутня	GLRaV 1	2,0
Херсонська область, АФ радгосп «Білозерський»	Каберне Совіньйон	9,5	GLRaV, 0,5	GLRaV 3	8,0
Закарпатська область, радгосп «Виноградівський»	Піно чорний	0,2	GLRaV, 0,65	GLRaV 3	4,0
АР Крим, СВК «Ізумрудний»	Одеський чорний	6	GLRaV, 1,8	GLRaV1,3	7,0
-/ -	Аліготе	30	GFLV	GFLV	4,0

Примітка: візуально досліджено від 1 до 5% площі (від 1000 до 1500 кущів). Для аналізу відібрано до 100 кущів з ділянки

На обстежених нами насадженнях фітоплазмові хвороби зустрічались рідко. Серед досліджених 88 насаджень симптоми фітоплазмових хвороб були відмічені на 5-ти.

Ураження багаторічної деревини грибної етіології найчастіше виявлялось у вигляді так званої «сухорукавності» та прояві симптомів ураження грибом Phomopsis viticola.

Оцінка кількості випадів та кореляції між значеннями рівнів ураження грибними хворобами багаторічної деревини і кількістю загиблих кущів (випадів) показало наявність сильної кореляції між цими параметрами (r = 0,73 та 0,85 для старих та молодих виноградників відповідно).

Згідно з одержаними нами даними, санітарний стан виробничих виноградників, серед яких більшість використовується в якості маточників, характеризується наступними загальними рисами:

найбільш часто серед вірусних хвороб візуально виявляється скручування листя винограду. Методом ІФА встановлено, що частіше зустрічається третій серотип ВСЛВ, рідше - перший серотип. Другий серотип на виробничих насадженнях не виявлено. Інші вірусні хвороби зустрічаються відносно рідко, окрім мармуровості, рівні латеного ураження якою сягають 30%;

серед бактеріальних хвороб часто зустрічається бактеріальний рак винограду, візуальне ураження яким складає від 0,5 до 25,6%, латентне - від 5 до 45%. Фітоплазмові хвороби відмічено частіше в розсадниках південних регіонів (Одеська та Миколаївська області, АР Крим);

- хвороби багаторічної деревини грибної етіології зустрічаються відносно рівномірно на насадженнях усіх досліджених розсадників. Найчастіше виявляється ураження сухорукавністю та чорною плямистістю, рідше - ураження ескою.

Регіональні особливості санітарного стану маточних насаджень категорії «стандартні» та виробничих виноградників характеризуються такими відмінностями:

по розсадниках Одеської області (ВАТ «Придунайський», ДГ ім. Суворова, ДГ «Таїровське» - часте виявлення симптомів ураження скручуванням листя та фітоплазмами;

по розсаднику АФ радгосп «Білозерський» Херсонської області - високі рівні ураження бактеріальним раком;

по розсаднику радгосп «Виноградівський» Закарпатської області - локальне виявлення симптомів борознистості деревини винограду;

по розсаднику СВК «Ізумрудний» АР Крим - локальне виявлення жовтої крапковості сорту Ркацителі (хвороба віроїдного походження).

На підставі даних з розповсюдження та шкідливості досліджених хвороб визначено їх перелік для включення в систему санітарного контролю у виноградних розсадниках.

В залежності від вимог Європейської Спілки та шкідливості зазначених хвороб для виноградарства України проведено умовний розподіл хвороб на групи за актуальністю їх виявлення в системі.

Належність до першої групи обумовлюється високими рівнями шкідливості та поширення хвороб і визначає необхідність проведення двократного щорічного візуального санітарного контролю і регулярної лабораторної діагностики з періодичністю та обсягами вибірки відповідно до етапу дослідження або розмноження.

До першої групи нами віднесено хвороби, які відрізняються значною шкідливістю та поширенням на виноградниках України, а саме:

Вірусні хвороби

1. Коротковузля винограду та його штами, до яких належать власне коротковузля, жовта мозаїка (інфекційний хлороз) та облямування жилок, а також вірусс мозаїки резухи.

2. Скручування листя винограду та асоційовані з ним віруси (виявляють перший та третій серотипи).

3. Борознистість деревини винограду (віруси А і В винограду).

4. Мармуровість винограду

Бактеріальний рак винограду (Agrobacterium tumefaciens( vitis)).

До другої групи хвороб, які виявляються в системі санітарного контролю винограду, віднесено такі, за ураження якими не спостерігається істотних збитків, пов'язаних із тривалістю життя, зрідженістю насаджень, зменшенням врожаю. Належність до другої групи визначає проведення щорічного візуального санітарного контролю в тих випадках, коли хвороба виявляється візуально. Проведення індексації щепленням та лабораторного виявлення при цьому є бажаним, але не суворо обов'язковим.

Вірусні або вірусоподібні хвороби другої групи в першу чергу виявляють на клонах підщепних сортів з метою зниження ризику їх розповсюдження за отримання щепленого садивного матеріалу винограду. До цієї групи відносяться мозаїка жилок та некроз жилок винограду.

До третьої групи віднесено бактеріальний некроз винограду та хвороби, які викликаються фітоплазмами (золотаве пожовтіння і почорніння деревини винограду). Особлива увага має приділятися карантинним аспектам контролю даних хвороб та з цією метою - лабораторному виявленню ураження ними.

До четвертої групи нами віднесено хвороби багаторічної деревини винограду, які викликаються грибами (ескоріоз (чорна плямистість), еутипоз, еска). Хоча для боротьби з цією групою хвороб використовуються хімічні препарати, їх поширення викликає необхідність принаймні візуального контролю у виробництві сертифікованого садивного матеріалу винограду.

Особливості застосування методів санітарного контролю на різних технологічних етапах отримання садивного матеріалу винограду селекційних категорій

Важливою складовою систем санітарного контролю є методи виявлення латентного ураження вірусною та бактеріальною інфекцією. Проте застосування того чи іншого методу в умовах конкретної країни та проведення аналізу в даній лабораторії вимагає:

- відпрацювання методів та в ряді випадків - їх оптимізації з метою підвищення чутливості та можливості широкого застосування;

- оптимізації відбору проб (час відбору, матеріал, який відбирається, особливості відбору точкових проб та способи складання середньої проби).

Для попереднього скринінгу маточних кущів клонів на латентне ураження вірусною інфекцією було оптимізовано методику відбору проб та метод виділення і очищення длРНК. Модифіковану методику використано для тестування маточних кущів вихідних клонів та рослин банку клонів.

Для спрощення проведення аналізу та підвищення його чутливості нами було розроблено метод молекулярної гібридизації з нерадіоактивно міченими длРНК-зондами. Метод використано для тестування кущів в банку клонів

У зв'язку із складністю виявлення збудників вірусних хвороб в тканинах багаторічних рослин нами було запропоновано та стандартизовано метод відбору точкових проб для ІФА за виявлення вірусів винограду та спосіб складання середньої проби. Кількість точкових проб має складати не менше 5-ти за використання вегетативних органів та не менше 3-х за використання лози.

Для тестування на бактеріальний рак винограду було оптимізовано проведення ПЛР-діагностики, зокрема, методи виділення плазмідної ДНК, а також умови ампліфікації (рис. 1).

Як видно з рисунку, порівняльне виділення ДНК штаму A.tumefaciens №28 з колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного за допомогою трьох методів (термальне виділення, з цетавлоном та лужний лізіс) показало добрі результати (слоти 1, 2, 3 та 7, 8, 9). Оптимізація температурного режиму ампліфікації показала, що за проведення реакції можливо використовувати температури відпалу +45єС та +50?С.

За допомогою відпрацьованого методу ПЛР нами було протестовано саджанці вітчизняного та закордонного виробництва.

Методом ПЛР також було оцінено садивний матеріал виробництва АФ радгосп «Білозерський» після обробки бактеріологічним препаратом “Паурін КС” та термотерапії.

Таким чином, в системі розсадників Центру клонової селекції ННЦ “ІВіВ ім. В.Є. Таїрова” вперше застосовано метод полімеразної ланцюгової реакції для високоспецифічного швидкого виявлення збудника бактеріального раку винограду.

Для визначення оптимального співвідношення методів діагностики вірусної інфекції за тестування клонового матеріалу було проведено аналіз даних тестування періоду 1980 - 2006 років.

Роботу було здійснено на клонах, відібраних в різних регіонах України, які представляли собою складний матеріал для санітарного контролю в зв'язку з різним епідеміологічним станом насаджень в цих регіонах.

Аналіз заходів санітарного контролю в Центрі клонової селекції винограду ННЦ „ІВІВ ім. В.Є. Таїрова” показує, що протягом останніх 20 років клоновий матеріал пройшов повне та всебічне тестування на латентне ураження вірусною інфекцією за допомогою різноманітних методів. Аналіз результатів тестування, одержаний за допомогою кількох різних методів, підтверджує, що лише застосування щонайменше 2-х - 3-х різних методів дає вірогідну оцінку санітарного стану маточних кущів та садивного матеріалу.

На основі проведеного аналізу даних тестування клонового матеріалу на етапах клонодослідження та первинного розмноження клонів, а також беручи до уваги вимоги регламентації сертифікованого розсадництва європейських країн, нами запропоновано наступний перелік методів тестування на латентне ураження та етапність їх використання.

Виявлення вірусних хвороб має проводитись методом індексації щепленням на відповідний індикатор та тестуванням на трав'янистих тест-рослинах, ідентифікацію вірусів слід проводити методом імуноферментного аналізу. реакції. Перші два методи рекомендується використовувати переважно в технології виробництва сертифікованого садивного матеріалу на етапах клонової селекції. Імуноферментний аналіз використовується практично для всіх категорій і типів маточних насаджень і садивного матеріалу.

Попередній скринінг на віруси у разі проведення чергового обстеження клонового матеріалу відомого санітарного стану та імпортного садивного матеріалу може здійснюватися також методом молекулярної гібридизації з длРНК-зондами.

Виявлення збудника бактеріального раку винограду має проводитись методом ПЛР-аналізу на всіх етапах дослідження та розмноження клонів.

Система санітарного контролю на етапах селекції і технології розмноження клонів. Характеристика санітарного стану та контроль для виробництва садивного матеріалу категорії «стандартний»

Садивний матеріал категорії «стандартний» уходить з технології виробництва більшості європейських країн. Його виробництво в Україні також є тимчасовим, але поки що більша частина вітчизняного садивного матеріалу представлена цією категорією.

За дослідження санітарного стану маточників категорії «стандартні» та порівняння їх з виробничими виноградниками виявлено низькі значення візуального ураження стандартних маточників вірусними хворобами та бактеріальним раком.

Так, ураження скручуванням листя на маточнику категорії «стандартний» сорту Піно чорний в ДГ ім. Суворова (Одеська обл.) складало 0,25%, на маточнику сорту Каберне Совіньйон в ВАТ “Придунайський” - 0,8%. Ураження бактеріальним раком на сорті Одеський сувенір не перевищувало 1,6%. Це свідчить як про ефективність відборів, проведених у попередні роки, так і про своєчасність проведення заходів санітарного контролю на цих насадженнях. В той же час рівні ураження скручуванням листя обстежених ділянок виробничих насаджень коливались від 1,1 до 6,5%, бактеріальним раком - від 6,5 до 19,2%.

За даними по трьох господарствах різниця у ступені зрідженості між маточниками категорії «стандартні» та виробничими виноградниками в середньому складає 3,5%, по окремих господарствах досягає 4,4-6,15%.

В ході розробки елементів системи санітарного контролю для виробництва садивного матеріалу категорії «стандартний» нами було проведено дослідження з природного поширення вірусних хвороб та бактеріального раку.

Відображенням розповсюдження вірусних хвороб винограду в природних умовах є зростання ступеню ураження ними у просторовому та часовому відношенні. Нами було досліджено в природних умовах зміни санітарного стану маточників категорії „стандартні” та виробничих виноградників протягом п'яти років, а також особливості і швидкість поширення вірусних хвороб і бактеріального раку в межах ділянки.

Дослідження змін санітарного стану маточних насаджень категорії „стандартні” та виробничих виноградників показали, що із збільшенням їх віку практично не змінюється кількість ділянок, на яких виявлено коротковузля винограду. В той же час збільшується кількість ділянок, на яких виявлено ураження збудником бактеріального раку винограду.

За період досліджень нами не було виявлено візуальних симптомів скручування листя на маточних насадженнях прищепних сортів категорій базові та сертифіковані. Це підтверджує, що протягом періоду від закладання насаджень (з 2002 р.) не відбулося ураження збудником скручуванням тих рослин, які при закладанні були вільними від двох його серотипів. Латентного ураження першим та третім серотипами збудника скручування на усіх перевірених насадженнях не виявлено.

Дослідження розповсюдження коротковузля в межах ділянки практично не показали збільшення кількості уражених кущів. Тим самим підтверджується низька ймовірність ураження маточних насаджень селекційних категорій коротковузлям винограду.

За дослідження поширення хвороб в межах ділянки було виявлено, що найбільш швидко збільшувалась кількість кущів з проявами ески - з 0,5% у 2002 р. до 3,4% у 2005 р. Помірно збільшувалась кількость кущів з ураженням сухорукавністю, відмічено незначне збільшення кількості рослин з симптомами ураження скручуванням листя (0,4% за 5 років).

Дослідження природного поширення бактеріального раку показало, що швидкість зростання ураження збудником хвороби залежить від первинної кількості уражених кущів на ділянці.

Особливості розповсюдження бактеріального раку винограду в межах ділянки вивчали на насадженнях сорту Каберне Совіньйон у ВАТ “Коблеве” Миколаївської області. Залежність збільшення ураження бактеріальним раком від первинної кількості уражених кущів показана через встановлення сильної кореляції між кількістю вихідних хворих кущів у 2005 році та кількістю хворих кущів на тих же ділянках у 2007 році (r = 0.999). Крім того, виявлено сильну кореляцію між кількістю первинних хворих кущів на ділянці та відсотком загиблих рослин на ній (r = 0.950).

Аналіз схем розташування хворих кущів на ділянці свідчить про те, що майже від усіх первинних осередків ураження протягом трьох років відбувалось подальше поширення хвороби. Значення ризиків ураження в осередках є статистично вірогідно більшими від значень ризиків ураження поза осередками для трьох досліджених насаджень. Це свідчить про більш високу ймовірність ураження бактеріальним раком в осередках ураження, отже - про наявність процесів природного переносу хвороби.

Одержані нами дані з природного поширення вірусних хвороб винограду показують, що найбільш шкідливі та поширені в Україні - коротковузля та скручування листя - передаються, головним чином, садивним матеріалом. Отже, ризики ураження ними маточних насаджень категорій базові та сертифіковані є низькими. Їх природне поширення відіграє невелику роль в ураженні насаджень порівняно з розповсюдженням хвороби садивним матеріалом і не становить загрози санітарному стану маточних насаджень винограду селекційних категорій.

Таблиця 4

Розрахунок ризиків ураження бактеріальним раком в осередках та поза ними на ділянках сорту Каберне Совіньон (Миколаївська область, ВАТ «Коблеве», 2005-2007 рр.)

Кількість кущів	Саджанці виробництва АФ радгосп «Білозерський», закладання - осінь 2001	Саджанці виробництва АФ радгосп «Білозерський», закладання - весна 2002	Саджанці виробництва Morvico Overseaes, Сербія, закладання - осінь 2002
	Уражених кущів (шт.)	Здорових кущів, що межують із хворими (шт.)	Уражених кущів (шт.)	Здорових кущів, що межують із хворими (шт.)	Уражених кущів (шт.)	Здорових кущів, що межують із хворими (шт.)
В осередках ураження	190 (А)	794 (В)	76	309	11	49
Поодинокі уражені кущі	43 (С)	308 (Д)	29	213	25	222
R - ризик ураження В осередку ураження: R1 = А / (А + В) За межами осередку ураження: R2 = С / (С + Д)	R1 = 0,192 R2 = 0,123	R1 = 0,202 R2 = 0,119	R1 = 0,232 X±Sx 0,209±0,012 * R2 = 0,101 X±Sx 0,114±0,007

Бактеріальний рак, особливо за високих вихідних рівнів ураження садивного матеріалу винограду та провокуючих умов (морозні пошкодження), може поширюватися дуже швидко, із зростанням рівнів ураження удвічі - втричі за 1-2 роки. Тому ризики ураження маточних насаджень є дуже високими. Посилений контроль та висока періодичність тестування на латентне ураження бактеріальним раком сприятимуть підтримці мінімальних рівнів ураження маточних насаджень.

Організаційна схема виробництва садивного матеріалу винограду категорії «стандартний» є дуже простою. Санітарні заходи в цій схемі представлені переважно щорічним дворазовим візуальним санітарним контролем з метою зниження рівня ураження зазначеними вище хворобами.

Санітарна оцінка рослин винограду на етапах їх дослідження та первинного розмноження

За нашою участю у 2002-2005 роках в Центрі клонової селекції ННЦ «ІВіВ ім. В.Є. Таїрова» було детально розроблено технологію виробництва сертифікованого садивного матеріалу. Відповідно до технології дослідження селекційного матеріалу проходить протягом трьох вегетативних поколінь - етапів розмноження виділених клонів (банк клонів, базовий та сертифікований маточники).