Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ УКРАЇНИ

БІЛОЦЕРКІВСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Мадіч А.В. Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20.- біотехнологія. - Білоцерківський державний аграрний університет, Біла Церква, 2004.

Дисертацію присвячено питанням стимуляції раннього ембріонального розвитку тварин in vivo і in vitro та підвищення ефективності ембріобіотехнологічних методів для розуміння механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних ембріональних конструкцій і трансферабельних ембріонів тварин з групи бластомерів. Це наукове завдання вирішене шляхом теоретичного і практичного обґрунтування можливості створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу, і використання таких факторів, складників, середовищ, які здатні стимулювати ооцитарний і ембріональний розвиток. Розроблено і запропоновано морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів та спосіб гормональної корекції відтворної функції норок, досліджено закономірності і видові особливості ембріонального розвитку норок і песців. Удосконалено методи одержання химерних конструкцій з ембріонів синхронних і асинхронних стадій у норок із застосуванням електростимуляції агрегації мембран чужорідних бластомерів у корів. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод мікроманіпуляцій для одержання чверток деконсервованих морул і нащадків після їх трансплантації. Розроблено і експериментально перевірено “Середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro”, яке забезпечує одержання дозрілих, здатних до запліднення in vitro ооцитів тварин. Ефективність запропонованого середовища підтверджена одержанням ембріонів овець поза організмом та життєздатного приплоду від їх трансплантації.

Ключові слова: норки, песці, шиншили, корови, вівці, ооцити, ембріони, біотехнологічні методи, фідерні клітини, дозрівання in vitro.

Аннотация

Разработан способ гормональной коррекции овуляторной функции у норок комплексным гормонально-витаминным “Препаратом для стимуляции течки у свиноматок” в суммарной дозе 24 ИЕ ГСЖК по 3-дневной схеме, что позволяет увеличить число покрытых самок маточного стада и получить приплод от бесплодных норок в количестве 2,5 потомка на 1 гнездо. Установлено, что интенсивность секреции специфических белков репродуктивными органами норок находиться в прямой связи с количеством эмбрионов и стадией их развития. Одновременное развитие значительного числа эмбрионов и процесс их первичной дифференциации сопровождаются присутствием в яйцепроводах и матке низкомолекулярных белков с Мм в диапазоне 7-10 кДа и 16-24 кДа, начало латентного периода совпадает с наличием в них специфичного белка с Мм 33-35 кДа.

Впервые в Украине получен молодняк от трансплантации интактных и химерных эмбрионов норок, агрегированных с зародышей синхронных и асинхронных стадий (приживляемость 16,7% и 37,5% соответственно); установлены параметры электростимуляции внутризональной адгезии мембран чужеродных бластомеров в химерных эмбрионах коров, получены телята-мозаики. Усовершенствован и получил дальнейшее развитие метод микроманипуляций, рекомендуемый для получения эмбрионов 2-й генерации с половинок розмороженных морул коров, которые способны к воссозданию морфоструктуры и развитию in vivo после повторной микрохирургической бисекции на четвертинки благодаря ко-культивированию их с фидерными клетками эмбрионального (трофобласт) и маткового (ендометрий) происхождения. Этот прийом позволяет 27,3% половинкам деконсервированых эмбрионов коров оставаться жизнеспособными в культуре на протяжении 72 часов, обеспечивает 18,8% имплантации четвертинок и получение груп идентичных животных. Разработаны научно-обоснованные подходы к регуляции интесивности роста фидерных клеточных культур, которые связаны с активированием эндокринного механизма клеточной пролиферации. Это дало возможность получить клеточные популяции эпителия яйцепроводов коров, которые способны увеличивать свой пролиферативный рост в 5-5,5 раза от 2,0 - 2,5 млн. до 13,20,57 (р<0,001); 14,02 0,85 (p<0,01) и 12,41 0,33 (p<0,001) млн. /мл; а клеток эндометрия в 3 раза от 1,8 - 1,9 млн. до 5,940,52 (р<0,01) и 8,340,37 млн. /мл. Установлено, что первичная культура фидерных клеток маткового происхождения стимулирует процеси дозревання in vitro ооцитов коров, которые в свою очередь могут быть тест-системами функциональной активности фидерных культур. Ко-культивирование ОКК коров с фидерными клетками под действием ФСГ, эстрадиола-17в и преднизолона повышает морфологическое качество и количество способных к оплодотворению ооцитов. В присутствии преднизолона, в концентрации 0,2-0,6 мкг/мл, 83,3% (р<0,05) и 86,7% (р<0,001) ооцитов на моношаре эпителиальных клеток яйцепроводов, а так же 53,3% и 63,3% ооцитов на моношаре клеток эндометрия коров приобретают закрытую сферу лучистого венца и отличаются высоким уровнем экспандации кумулюса за счет чего достигается их дозревание in vitro.

Разработана и експериментально проверена эффективная “Среда для дозревания ооцитов коров и овец in vitro ”, которая обеспечивает получение морфологически качественных, дозревших ооцитов, способных к оплодотворению и развитию в эмбрионы трансферабельных стадий. Научная новизна подтверджена решением о выдаче декларационного патента 52177А. Впервые в Украине получены эмбрионы овец от дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro и здоровый приплод от трансплантации таких эмбрионов. Разработаные способы высокоэффективны и доступны для использования в селекции животных.

Ключевые слова: норки, песцы, шиншиллы, коровы, овцы, ооциты, эмбрионы, биотехнологические методы, фидерные клетки, дозревание in vitro.

Annotation

Key words: mink, polar fox, chinchilla, cows, sheep, oocytes, embryos, biotechnological methods, feeder cells, in vitro maturation.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема розробки і удосконалення методів, які забезпечують скерування клітинних процесів та механізмів формування цілісних систем, просторових структур і морфогенезу в ланцюгу ембріонального розвитку від яйцеклітини до сформованого плоду, лишається актуальною для досліджень з біології раннього розвитку, генетики тварин, клітинної і генної інженерії. Їх застосування вже сьогодні дозволяє одержувати тварин бажаних генотипів, прискорено розмножувати потомство генетично цінних особин, відтворювати генотипові копії бугаїв-плідників та корів-рекордисток (Завадовський М.М., 1961; Зубець М.В. та інш., 1995, 1997, 2000; Буркат В.П., 1997, 1998; Безуглий М.Д., 1995, 1997; Глазко О.Є., 1995; Кузнєцов В.Є. та інш. 1997, 1998, 1999; Willadsen S.M., 1989, 1999; Gandolfi F. et al, 1997, 2000, 2003; Bavister B. et al, 1997, 2000; Betteridge K.J., 2000; Greve T. et al. 1998, 2002; Robl J.M., 2003). Нагромаджені сучасні знання свідчать, що без розуміння складних біологічних процесів оо- та ембріогенезу, внутрішніх факторів системи ембріон-материнський організм не можна створити загальні моделі їх формування, а отже і розробити сучасні біотехнології для регуляції розвитку і підтримки оптимального функціонування біологічних об`єктів (Мартиненко Н.А., 1971; Квасницкий А.В.и др., 1988; Эрнст Л.К.и др., 1982, 1992; Сергеев Н.И., 1990, 1992, 1995; Осташко Ф.І., 1992; Мадисон В.В., 1998; Шеремета В.І., 1997; Шаловило С.Г., 1999; Смолянінов Б.В., 1995, 2000; Гузєватий О.Є., 2000; Heyman Y., 1995, 1998; Parrish J.J., 1986, 1989, 2001; Fukui Y. et al., 1989, 1990; Brem G. 1995, 2000; Evans A.C. et al, 2000; Wierzchos E. 2002).

Актуальним є використання різних видів тварин як моделей ембріогенетичних досліджень, що зумовлює одержання нових теоретичних даних з вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і ембріогенезу ссавців. Особливого значення набуває застосування ряду методів клітинної інженерії у біотехнології відтворення і селекції великої рогатої худоби і овець, яке передбачає суттєвий комерційний інтерес. У цьому аспекті створення оптимальних умов для розуміння механізмів дозрівання, запліднення ооцитів, розвитку химерних ембріональних конструкцій і ранніх ембріонів тварин з групи бластомерів з використанням фідерних культур ембріонального і маткового походження в умовах in vitro є надзвичайно важливим.

Зв`язок з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН за завданнями: “Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації UA01001476Р); “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських тварин” (№ держреєстрації 0196U016325); та Інституту біології тварин УААН за завданнями: “Вивчити молекулярні механізми регуляції обмінних процесів у репродуктивних органах самиць, ооцитах і ембріонах та розробити способи стимуляції процесів відтворення у корів і свиноматок. Удосконалити склад інкубаційних середовищ для запліднення in vitro” (№ держреєстрації 0198U009013); “Розробити методи стимуляції ембріонального розвитку тварин із застосуванням клон-технологій” (№ держреєстрації 0198U003431) упродовж 1991-2002 рр.; підтримана договорами з Інститутом розведення і генетики тварин УААН та Харківським біотехнологічним центром УААН.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було теоретичне та експериментальне обґрунтування впливу ендо- і екзогенних факторів на процеси оо- та ембріогенезу модельних і сільськогосподарських тварин в умовах in vivo i in vitro, розробка й удосконалення біотехнологічних способів їх регуляції, одержання життєздатних ембріональних форм і нащадків з ознаками клону, химер та від запліднення in vitro.

Для реалізації мети досліджень були поставлені наступні завдання:

1. Визначити й охарактеризувати видові морфологічні особливості доімплантаційних ембріонів норок і песців, механізми ранньої клітинної диференціації та розвитку.

2. Розробити морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів норок.

3. Встановити фактори ембріонального оточення, які впливають на доімплантаційний розвиток хутрових тварин.

4. Розробити спосіб гормональної корекції овуляторної функції неплідних норок. Дослідити у них формування ембріонально-маткового сигналу на ранніх стадіях ембріогенезу під дією ендо- і екзогенних гормонів.

5. Оптимізувати існуючі і розробити нові методичні підходи створення агрегаційних та ін`єкційних химер норок і корів з доімплантаційних ембріонів синхронних і асинхронних стадій розвитку, з використанням ефекту електростимуляції.

7. Підібрати оптимальні умови для одержання первинної культури фідерних клітин яйцепроводів і матки з достатнім проліферативним ростом і функціональною активністю, дослідити її вплив на дозрівання ооцитів корів in vitro.

8. Встановити й охарактеризувати відмінності впливу різних біологічно- активних речовин на морфологічні показники якості ооцитів хутрових і сільськогосподарських тварин. Удосконалити середовище для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro.

9. Удосконалити метод дозрівання і запліднення in vitrо ооцитів овець. Одержати трансферабельні ембріони та нащадків від трансплантації розвинутих in vitro ембріонів.

Об`єкт дослідження: процеси ооцитарного та ембріонального розвитку тварин в умовах in vivo i in vitro.

Предмет дослідження: ооцити та ембріони норок, песців, шиншил, овець, корів, репродуктивні органи самиць, біотехнологічні фактори.

Методи дослідження: зоотехнічні; ветеринарні; морфологічні; гістоморфометричні; фізико-біохімічні; біотехнологічні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розглянутий комплексний вплив біотехнологічних факторів і методів на доімплантаційний розвиток ембріонів тварин за умов in vivo і in vitro. Доведено доцільність застосування хутрових тварин як лабораторних моделей для ембріогенетичних досліджень. Розроблено і запропоновано морфологічну шкалу оцінки ембріонів норок доімплантаційних стадій, вивчено видові особливості їх ембріонального розвитку, зокрема регуляторні механізми первинної диференціації бластомерів; запропоновано застосування на норках методу оцінки якості сперми за інтенсивністю її дихання. Встановлено біологічний годинник ембріонального розвитку песців. Удосконалено метод хірургічного вимивання ранніх ембріонів норок та песців попередньо визначених стадій розвитку від евтаназованих та живих донорів з використанням загальної анестезії, одержано приплід після хірургічної трансплантації ембріонів норок. Розроблено спосіб гормональної корекції овуляторної функції норок. Дістали подальший розвиток дослідження морфофункціонального стану матки тварин з різною ембріопродуктивністю на ранніх стадіях ембріонального розвитку. Вперше встановлено, що присутні у репродуктивних органах норок специфічні білки мають мітогенну дію, регулюють ембріональний розвиток і диференціацію бластомерів.

Удосконалено методи реконструкції ембріональних клітин норок і корів. Вперше одержано химерні зародки норок з ембріонів різного віку і нащадки-мозаїки від їх пересадки. Після застосування методу електростимуляції на химерних ембріонах корів і їх трансплантації одержано телята. Удосконалений і дістав подальший розвиток метод мікроманіпуляцій для одержання ембріональних клонів трансферабельних стадій з чверток деконсервованих ембріонів корів. Внаслідок цього розроблені теоретичні і практичні підходи для відновлення ембріогенезу з групи бластомерів, одержано телят.

Розроблено науково-обґрунтовані підходи до регуляції інтенсивності росту фідерних ізольованих епітеліальних клітин яйцепроводів та ендометрію корів, що здатні підтримувати ооцитарний і ембріональний розвиток поза організмом, гормональними препаратами і ростовими факторами. Одержано фідерну клітинну культуру зі стійким проліферативним ростом і збільшено кількість морфологічно якісних, здатних до подальшого розвитку ооцитів та половинок ембріонів корів.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено морфологічну шкалу оцінки доімплантаційних ембріонів норок та спосіб зменшення кількості неплідних самиць під час гону, який забезпечує одержання додаткового приплоду від норок з порушеннями репродуктивної функції. Удосконалено мікроманіпуляційні методи бісекції, агрегації і мікроін`єкції ембріональних клітин хутрових і сільськогосподарських тварин і оптимізовано умови їх розвитку in vitro, що дозволяє збільшити кількість морфологічно якісних і трансферабельних ембріонів з половинок і чверток деконсервованих зародків корів і зумовлює одержання груп ідентичних телят. Розроблено високоефективне “Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів і овець”, яке забезпечує одержання дозрілих поза організмом ооцитів від живих тварин або після їх забою. Матеріали дисертаційної роботи увійшли до методичних рекомендацій “Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення”, затверджених НТР Головного управління сільського господарства і продовольства Львівської облдержадміністрації 15 жовтня 2003 року (протокол №2).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно розроблена дослідницька програма; проведені більшість досліджень; огляд і аналіз першоджерел літератури; розроблено теоретичні обґрунтування щодо механізмів регуляції оо- і ембріогенезу у ссавців; виконано фотографії. Зроблено статистичний аналіз отриманого цифрового матеріалу, опубліковані результати досліджень. За участю наукового консультанта розроблено схему й методику виконання досліджень з використанням сучасних біотехнологічних методів. Лапароскопічне одержання ооцитів овець проводили спільно зі співробітниками кафедри розведення овець і кіз під керівництвом проф. Е. Вешхося (Краківська аграрна академія ім. Х. Коллонтая, Польща); трансплантацію ембріонів корів- за участю науковців лабораторії біотехнології відтворення Інституту біології тварин УААН; загальну анестезія і хірургію хутрових тварин - за участю спеціалістів кафедри загальної хірургії Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького, за що автор висловлює їм щиру подяку. Із спільних наукових дослідів і публікацій дисертант використав, за згодою співавторів, лише свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації і результати досліджень доповідалися на міжнародних та республіканських науково-практичних конференціях і з`їздах: The 1-st Polish-Ukrainian Scientific Conference ”Animal Sciences in the XXI centure” (Краків, Польща, 2001), The 4-th Parnas Conference “Molecular mechanisms of cell activation: biological signals and their target enzymes“ (Вроцлав, Польща, 2002), Міжнародна конференція присвячена пам`яті професора І.В.Шостаковської (Львів, 2002), “Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин” (Харків, 1993), “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин” (Асканія-Нова, 1997), “Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технології продуктів тваринництва (Львів, 1997), “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин” (Київ, 1999), “Проблеми неінфекційної патології тварин” (Біла Церква, 1998), “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико -селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998), “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин” (Київ, 1999), “Наукові основи сучасних технологій виробництва продукції тваринництва” (Харків 2003), обговорювалися на засіданнях вченої ради та координаційних нарадах Інституту розведення і генетики УААН (1991-1998рр), Інституту біології тварин УААН (1999-2002), наукових семінарах співробітників Інституту біології тварин УААН.

2. Матеріали і методи досліджень

Експериментальна частина роботи виконана на норках, песцях, шиншилах, великій рогатій худобі, вівцях; 1137 ооцитах і 272 доімплантаційних ембріонах в умовах господарств „Гряда” Жовківського, „Бартатівське” Городоцького, „Галичхутро” Сокальського, селянської спілки “Кам`янка” Кам'янко-Бузького районів Львівської області та лабораторії клітинної інженерії Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН та Інституту біології тварин УААН.

Перевірку самців норок на якість сперми здійснювали взяттям мазків з піхви самиць та визначенням інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової синьки. Самиць норок контрастних генотипів живою масою 0,9-1,1 кг, песців 5,5-6,5 кг, шиншил 450 г використовували як донорів ооцитів і ембріонів під час природного гону. Кількість послідовних мітотичних циклів у зиготах норок визначали відрахуванням годин дроблення (16-20 годин) від дня осіменіння в 2-у охоту, песців - емпірично. Одержання ранніх ембріонів норок здійснювали на 3-5-й день, морул - на 6-7-й, бластоцист та реекспандованих бластоцист- на 8-9-й день (Максимовский Л.Ф., 1994), песців після 1-го спаровування на 8-11-й день. Вимивання ембріонів виконували за методом Л.В. Козикової (1988); М. Манка (1990) фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) Дюльбекко з 0,4% сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (БСА) або 10% фетальної сироватки телят (ФСТ) та 40 мкг/мл гентаміцину. Після промивання репродуктивні органи евтаназованих тварин вимірювали за розмірами, яєчники аналізували на наявність жовтих тіл, підраховували кількість фолікулів, ембріони оцінювали морфологічно, класифікували за стадіями розвитку. Зародки норок інтактними або після агрегації половинок хірургічно трансплантували у верхівки рогів маток білатерально, по 3-4 ембріони, реципієнтам контрастного генотипу. Належність приплоду до того чи інакшого генотипу визначали за забарвленням хутра.

Для стимуляції репродуктивної функції норок застосовували комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок” В.Ю. Шавкуна, О.Б. Андрушка (ДП 44006А №7А01К67/02), який містив гонадотропний гормон, естрадіол-17, вітаміни, амінокислоти, донатори SH-груп, мікроелементи та енергетичні субстанції, у сумарній дозі 24 ІО гонадотропіну (ГСЖК) на 1 кг живої маси (3 ін`єкції в дозі 8 ІО через 1 добу): самицям з ознаками “тихої” охоти на 5, 6 та 7-й дні після не результативних спроб до спаровування, а тим, що не проявили ознак еструсу - в кінці періоду гону. Тварини, які прийшли в спонтанний гін, слугували як контроль. На 6-й день після коїтусу здійснювали контрольний забій норок з кожної групи.

В яєчниках визначали кількість жовтих тіл та фолікулів, оцінювали морфологічну якість і стадію розвитку ооцитів та ембріонів, виготовляли гістологічні зрізи з верхівок рогів матки (3 мм від істмусу), забарвлювали гематоксиліном та еозином (Афанасьєв Ю.И. и др.1967). За рештою тварин спостерігали до щеніння, аналізували за кількістю нащадків.

Концентрацію білка в лізатах тканин яєчників, яйцепроводів, рогів маток норок і шиншил та у вимивному середовищі з них на ранніх стадіях оо- і ембріогенезу (природний гін) визначали за G.Peterson (1977), розділяли на фракції в блоках градієнтного (5-17%) поліамідакрилового гелю (ПААГ) за U.Laemmli (1970); O.Lowry et al. (1995) і зафарбовували сріблом (Gorg A. et al, 1985), порівнювали з білковим спектром сироватки крові. Кількість окремих білків на електрофореграмах визначали за допомогою комп`ютерної програми „Image Tool”. Про молекулярну масу (Мм) окремих білкових фракцій судили за даними електрофорезу з використанням 9 маркерів з Мм 6,5 кДа; 14,4; 21,5; 31; 45; 66; 97; 116; 200 кДа (“Broad Range Markers”, США). Екстракцію ліпідів проводили сумішшю хлороформ-метанол (1:1) (Штоль М.Л., 1970). Ліпіди розподіляли на класи методом тонкошарової хроматографії. Кількість нейтральних ліпідів визначали біхроматним методом, фосфоліпідів - за вмістом ліпідного фосфору реакцією з 10%-им розчином фосфомолібденової кислоти в етанолі.

Мікроманіпуляції з ембріонами норок і корів виконували за допомогою механічних маніпуляторів, мікроін'єкторів („Leitz”, Німеччина; „Біоприлад”, Росія), мікроскопів МБС-10 та МБИ-15, відслідковували на моніторі. Химерні ембріони норок моделювали з груп бластомерів, що належали ембріонам контрастних генотипів синхронних і асинхронних стадій розвитку (Манк М., 1991). Їх хірургічно трансплантували самицям-реципієнтам і одержували приплід. Химерні ембріони корів одержували мікроін'єкцію групи бластомерів з половинок розморожених 6-ти денних морул симентальської породи у бластопорожнину нативних ембріонів чорно-рябої породи (Кузнєцов В.Є., 1991). Внутрізональну адгезію мембран бластомерів в химерних ембріонах дослідних груп здійснювали електричним імпульсом (одним або декількома) напругою 15, 20, 25 В з експозицією дії 160-200 мкс у 5%-му розчині сахарози (Лісін В.І., 1997; 2000). Для цього використовували прилад для електрозлиття („Біоприлад”, Росія) і два платинові електроди 30 і 60 мкм (Шигімага В.О., 1997). Химерні ембріони корів трансплантували по одному телицям-реципієнтам.

Для відновлення мітотичного дроблення в половинках розморожених 7-денних морул корів чорно-рябої породи використовували фідерні клітини ембріонального (трофобласт) і маткового (епітеліальні клітини) походження. Половинки дослідних груп культивували з кластерами трофобластичних клітин розморожених і культивованих бластоцист (Манк М., 1990), з розрахунку 4 трофобластичні везикули на 1 половинку у 1 мл середовища ДМЕМ; або епітеліальними клітинами матки корів (Voelkel C.A., 1984) у кількості 100 мкл суспензії клітин і 3-4- половинки у 1мл середовища ТС-199. Половинки контрольних груп культивували без фідерних клітин. Через 4 і кожні 12 годин культивування розвиток всіх половинок оцінювали за морфологією, здійснювали повторний мікрохірургічний поділ, залишали парами у власній прозорій оболонці і трансплантували телицям-реципієнтам на 6-й день статевого циклу, або продовжували культивувати in vitro.

У дослідженнях з дозрівання in vitro ооцитів тварин різних розмірів і морфології їх культивували у 100 мкл середовища ТС-199, DM-335 (“Gibco”) або ДМЕМ з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, антибіотиками та 10 мкг/мл фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) і 1 мкг/мл естрадіолу -17в (песці); 10 мкг/мл ФСГ і 1 або 4 мкг/мл естрадіолу -17в та 0,2 мкг/мл преднізолону (норки, шиншили); 10 мкг/мл ФСГ, 1 мкг/мл естрадіолу -17в, 0,2 мкг/мл преднізолону та 10, 20 і 50 мкг/мл лізину (корови, вівці). Ооцити тварин морфологічно оцінювали за інтенсивним блиском кумулюсу при поляризації світла, описували характер грануляції ооплазми, стан дисоціації кумулюсу: песців за X.H. Wen (1994), норок за Л.Ф. Максимовським и др. (1996), корів і овець - за Г.В. Стефановичем (1988).

Фолікулярні ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) норок культивували нативними або після зберігання їх в азоті протягом 1 та 3 діб. Їх заморожували надщвидким методом у вітрифікаційному середовищі, яке містило 4,5М етиленгліколя, 3,4М диметилсульфоксиду (ДМСО), 5,56 мМ глюкози, 0,33 мМ Na-пірувату та 0,4 % БСА у ФСБ Дюльбекко за методикою для вітрифікації ооцитів м`ясоїдних (Luvoni G., 2000). Ооцити корів одержували аспірацією фолікулів після забою, дозрівали на клітинному субстраті фідерних клітин з яйцепроводів і матки корів у середовищі ДМЕМ з 25 Мм HEPES, 0,4% БСА, 40 мкг/мл гентаміцину, 0,1% розчином глюкози, Nа -піруватом (контроль) та з 8, 10 і 12 мкг/мл ФСГ; 1; 2 і 4 мкг/мл естрадіолу-17 та 0,2; 0,4 і 0,6 мкг/мл преднізолону у дослідних групах. Оцінювали морфологічну якість ооцитів корів, проліферативний ріст та функціональну активність епітеліальних клітин з яйцепроводів корів під дією 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактора (ЕФР) та за умов сумісного впливу цих чинників. ОКК овець одержували лапароскопічно вiд асканійських кросбредних вiвцематок, стимульованих в анестральний період (Ledda S. et al., 1999), дозрiвали in vitro у модифікованому нами “Середовищі для дозрівання in vitro ооцитів корів і овець”. Дозрілі ооцити запліднювали розмороженою спермою баранів породи сафолк польської селекції, капацитованою у середовищі TALP (розчин Тіроде з альбуміном, лактатом і піруватом) з 5,0 мкг/мл гепарину (Parrish J.J. et al, 1988). Середовище для запліднення (Fert-TALP) виготовляли на основі середовища ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину та 5 мМ/мл кофеїну. Презумптивні зиготи культивували у середовищі ДМЕМ упродовж 48 годин, хірургічно трансплантували реципієнту [Cергеев Н.И., 1998], одержували приплід. Результати документували відповідними актами і фотографіями.

3. Результати власних досліджень та їх аналіз

Видові особливості доімплантаційного ембріонального розвитку хутрових тварин.

Хутрові тварини були використані як моделі для розробки і вдосконалення окремих біотехнологічних прийомів і методів. Сперму 48 самців норок, яку оцінили як „сумнівна” у піхвових мазках, додатково перевіряли методом визначення інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової сині. Сперма активністю 7-9 балів знебарвлювалася впродовж 15-20 хв, 5-6 балів - 25 -30 хв, рідка, малоактивна сперма нижче 5 балів - 45-50 хв. Добру якість сперми підтверджено у 83,3% самців (p<0,05).

Встановлено, що норкам і песцям властиве явище функціональної асиметрії (періодичності) яєчників. На ранніх стадіях вагітності спостерігається інтенсивна мережа кровоносних судин репродуктивних органів, потовщення і скорочення яйцепроводів, видовження роги матки, що свідчить про наявність в них ембріонів. За результатами морфологічної оцінки 143 ембріонів норок (за Максимовским Л.Ф., 1994), які одержали від 26 самиць спарованих у спонтанному еструсі, на 6-8-й день після запліднення якісними виявилися 87,4% ембріонів, дегенерованими 12,6% зародків (табл.1).

Таблиця 1 - Результати морфологічної оцінки доімплантаційних ембріонів норок за стадіями розвитку

Примітка: ^а) % від загальної кількості ембріонів; ^b) % від кількості ембріонів вимитих у певний день; ^с) % від кількості бластоцист; (n=...)- кількість самиць -донорів ембріонів; *- р<0,05; **- p<0,01; ***- p<0,001 - вірогідність відмінностей між кількістю ембріонів вимитих у різні дні циклу.

На 6-6,5 день одержали 82,1% якісних ембріонів стадії морули (р<0,001). На 8-й день якісні ембріони становили 97,9%, з них 16,6% - компактні морули, 81,3% - бластоцисти, в тому числі 74,4% - реекспандовані початку латентного періоду.

Діаметр ембріонів норок до стадії компактної морули включно становив близько 140-155 мкм, а товщина прозорої оболонки дорівнювала 13-15 мкм. Разом з компактними морулами (Мо-2) і бластоцистами (Бл-1 і Бл-2) класичної морфології, на 8-й день одержали реекспандовані бластоцисти початку латентного періоду ембріональної діапаузи (Бл-3) діаметром 240-300 мкм з характерними морфологічними ознаками. Результати наших досліджень доводять, що початок латентного періоду ембріональної діапаузи у норок спостерігається на 8-й день після запліднення, а не на 9-й, як це вважалося раніше (Максимовский Л.Ф., 1994), що свідчить про прискорення темпів ембріонального дроблення. Припинення процесів первинної клітинної диференціації під час латентного періоду ембріональної діапаузи сприяє виникненню специфічних умов для дії механізмів, які відповідають за утворення гігантських реекспандованих бластоцист норок. Це супроводжується потоншенням прозорої оболонки, розширенням перивітелінового простору, змінами в характері зчеплення клітин: відбувається ретракція клітин трофобласту у напрямку до центру, бластомерна маса реекспандованих бластоцист стає максимально ущільненою, скорочується бластопорожнина. Характерне для ембріональної діапаузи накопичення рідини у перивітеліновому просторі викликає збільшення ембріонів до 240-300 мкм, що у 2 рази більше об`єму попередніх стадій.

Отже, в ембріонах норок початку латентного періоду створюються специфічні умови, які забезпечують активний перехід рідини, як з бластоцелю, так, очевидно, і ззовні, крізь прозору оболонку у перивітеліновий простір ембріона, а також гальмують виникнення факторів, які відповідають за взаємовідношення ембріон-материнський організм. Одержані нами дані опосередковано підтверджують теорію осмотичного тиску, як основної діючої сили раннього ембріогенезу, висунуту М.Д. Безуглим (1995). Хірургічна трансплантація 28-ми інтактних ембріонів норок 4 самицям-реципієнтам, привела до народження щенят-трансплантатів від 2-х тварин. Приживлення трансплантованих ембріонів становило 10,7%. Решту ембріонів норок використовували у подальших різнопланових експериментах, результати яких викладено нижче.

Характерні для норок процеси функціональної асиметрії яєчників знайшли свої аналогії у песців, що узгоджується з результатами А.І. Желєзової (1993); спостерігали тенденцію до скорочення яйцепроводів і видовження рогів матки 9-ти евтаназованих самиць, які знаходилися в еструсі та метаеструсі (р<0,05; p<0,01). Темпи раннього ембріонального розвитку песців встановлювали за результатами промиванням репродуктивних органів 6 самиць. Експериментально встановлено, що біологічний годинник мітотичного дроблення ембріональних бластомерів у песців становить 16-20 годин. Отримані дані дозволяють одержувати ембріони попередньо визначених стадій: на 12-й день після осіменіння самиць песців можна очікувати формування 32-бластомерної морули, а на 14-й день - експандованої бластоцисти, що вносить елемент новизни у вивчення видових особливостей раннього ембріонального розвитку песців.

Дослідження динаміки раннього ембріогенезу хутрових тварин дозволяють стверджувати, що одною з причин їх ранньої ембріональної смертності є старіння ооцитів або сперміїв у статевих шляхах самиць. У норок овуляція провокується самцем, і результативне запліднення, переважно, відбувається в 2-гу охоту, через 6-7 днів, коли ооцити знаходяться у статевих шляхах самиці в очікуванні гамет самця (в цей час спермії норок від 1-го спаровування вже гинуть, оскільки їх виживаність становить близько 48 -72 год). За цих умов фактор старіння діє у відношенні до яйцеклітин норок. Ембріональний розвиток песців, за нашими даними, відбувався за умов запліднення яйцеклітин сперміями, які залишалися життєздатними у репродуктивних органах самиць близько 7 днів в очікуванні овуляції (для песців характерна розтягнутість цього процесу у часі), що узгоджується зі спостереженнями інших авторів (Максудов Г.Ю. і Артюшкова В.А., 1989). Результати запліднення і дроблення зигот (або його припинення) у песців залежать від виживання або старіння певної частки сперміїв. Це підтверджує результати, що раніше одержані на інших видах тварин (Мартиненко Н.А., 1971; Козикова Л.В., 1988) і у людини (Rushton С., 1999). Таким чином, старіння ооцитів у норок і сперміїв у песців можуть бути одною з причин ранньої ембріональної смертності цих хутрових тварин.

Спрямований вплив на овуляторну функцію яєчників і стан слизової оболонки рогів матки у норок

Завдяки дії комплексного гормонально-вітамінного препарату (авт. В.Ю. Шавкун, О.Б. Андрушко), за розробленою нами схемою, 76,9% самиць з ознаками “тихої “охоти (1-ша дослідна) були спаровані з самцем, а 69,2% з них народили приплід; 41,7% самиць з відсутністю охоти (2-га дослідна) прийшли в гін і були спаровані, з них 16,7% (р<0,05) народили щенят (табл.2).

Таблиця 2 - Результати спаровування і щеніння норок з різною інтенсивністю овуляторних процесів

Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи.

За результатами щеніння тварини контрольної (природний гін) і 1-ої дослідної груп залишалися на близькому рівні: 3,8 та 3,6 щенят на 1 гніздо відповідно. У 2-ій дослідній групі цей показник дорівнював 2,5 щенят і був у 1,5 рази нижчий за контрольну.

Позитивний вплив застосованого препарату підтверджено гістоморфо-метричними дослідженнями ампульно-істмусової ділянки рогів матки норок контрольної і дослідних груп (Шавкун В.Ю., 1968; Gandolfi F., 1999). Індивідуальним аналізом репродуктивних органів евтаназованих тварин на 6-й після спаровування день встановлено стимулюючу і синхронізуючу дію препарату на фолікулярний ріст (до 16-18 антральних фолікулів в 1 яєчнику) і овуляцію яйцеклітин (до 2-5 жовтих тіл). Спостерігали збільшення величини і кількості маткових залоз, максимально до 62 і 42 у полі зору, їх загальної площі до 2,5 і 6,2 мм² у тварин 1-ї і 2-ї дослідних груп, відповідно, за рахунок наповнення крипт матковим секретом, а також звуження каналу рогів матки. Максимальна кількість крипт у норок 1-ої дослідної групи наближалася до контролю, 62 проти 63 у полі зору.

Вони були розтягнуті в діаметрі, розташовані по всій слизовій оболонці. У самиць 2-ої дослідної групи кількість маткових залоз не збільшена, максимально 42 проти 63 у полі зору, однак їх площа більша за контрольні зразки (максимально до 6,2 мм² проти 1,2 мм² у контролі), оскільки просвіти крипт заповнені секретом маткових залоз, що свідчить про позитивний вплив застосованого гормонального препарату на проліферативні (збільшення кількості крипт на одиницю площі) й функціональні (збільшення загальної площі крипт за рахунок наповнення їх секретом) процеси у слизовій оболонці матки. Акцентуючи увагу на одержаних гістоморфометричних даних, підтверджено стимулюючу дію використаного препарату і на приживлення ембріонів. Зокрема, у тварин 2-ої дослідної групи, які не приходили в природній гін, внаслідок дії препарату спостерігали спаровування, імплантацію зародків і народження в середньому 2,5 нащадків на 1 самицю.

Формування ембріонально-маткового сигналу у норок і шиншил на ранніх стадіях оо- і ембріогенезу. Кількісна і якісна характеристика специфічних білків і ліпідів

У вимивній рідині від 7 норок на 5-9-й дні після запліднення виявили 60 ембріонів доімплантаційних стадій: ранні ембріони, морули, експандовані і реекспандовані бластоцисти. Припустили, що в репродуктивних органах самиць містяться білки тотожні білкам сироватки крові і білки специфічні для цих тканин, які відіграють вирішальну роль у формуванні ембріонально-маткового сигналу і взаємовідношення мати-плід (Хомин С.П. та інш., 1997; Gandolfi F., 2000). Це знайшло своє відображення у білковому спектрі яйцепроводів, матки та вимивного середовища з них. Серед білків загальних для репродуктивних органів і сироватки крові виявили лізоцим (14,4 кДа), ангідразу (31 кДа), сироватковий альбумін (66 кДа).

Групу поліпептидів з Мм 14-21 кДа, 38-41 та близько 97 кДа спостерігали у складі розчинних білків репродуктивних органів, але вони були відсутні у сироватці крові і у незначній кількості представлені у вимивній рідині. Встановлено тенденцію до збільшення кількості білків й посилення інтенсивності білкового спектру тканини маток і яйцепроводів у норок зі значною кількістю ембріонів (8-16 зародків) аналогічних стадій розвитку, в основному за рахунок групи низькомолекулярних білків, які відсутні в органах самиць зі значно меншою ембріопродуктивністю (3-5 зародків). Їх молекулярна маса знаходилася в діапазоні 7-10 кДа та 16-24 кДа, що може бути проявом функціонального зв`язку між специфічними для репродуктивних органів молекулами або різними ростовими факторами присутніми у рідині яйцепроводів, які беруть участь у проліферації епітеліальних клітин яйцепроводів та дробленні ембріональних клітин початкового ступеня диференціації (Никольский Н.Н., 1995). Ними можуть бути білки з молекулярною масою 7-28 кДа, які спостерігали в лізатах тканин репродуктивних органів норок - донорів максимальної кількості морул та бластоцист різного ступеня диференціації.

У норок евтаназованих на 5-8-й дні після запліднення білковий спектр яйцепроводів більш насичений, ніж матки; у самиць 9-го дня - навпаки. Присутність білка з Мм 33-35 кДа яскраво виражена в матках самиць - донорів реекспандованих бластоцист. Можна припустити, що він характерний для початку латентного періоду ембріональної діапаузи у норок. Виявлений в яйцепроводах овальбумін (45 кДа) свідчить про підготовку репродуктивних органів до нової хвилі овуляції, яка зазвичай наступає через 5-7 днів. Це підтверджують і дані про кількість антральних фолікулів та ооцит-кумулюсних комплексів в яєчниках.

У вимивній рідині та репродуктивних органах всіх норок виявлено групу високомолекулярних білків (Мм понад 116 кДа), які відсутні у сироватці крові. Це можуть бути специфічні негліколізовані білки, які також функціонально зв'язані з ембріональним розвитком, що узгоджується з даними F.Gandolfi (1997). За даними індивідуального аналізу, кількість розчинних білків у яйцепроводах самиці на 5-й день (одержали 8 морул) склала 4,2 мг/мл; яйцепроводах норки на 7-й день (10 морул і 6 бластоцист) - 6,5 мг/мл, а матки - 7,0 мг/мл; у яйцепроводах самиці на 8-й день (4 реекспандовані бластоцисти, 1 морула) - 5,4 мг/мл, матки - 6,0 мг/мл. У вимивному середовищі з репродуктивних органів норок кількість білків становила від 1,8 до 2,9 мг/мл .

Нами була використана унікальна можливість дослідити електрофореграму розчинних білків репродуктивних органів самиці шиншили через 10 днів після народження кроленят, яка перебувала в стадії проеструсу і була призначена на хутро. В результаті обстеження яєчників нараховано 22 фолікули, розтином яєчникової строми одержано 17 ОКК різної стадії дозрівання, в більшості малі і недозрілі ооцити, які були використані нами в подальших дослідженнях з культивування їх in vitro. Серед насиченого білкового спектру тканини яєчників виявлено високомолекулярні (з Мм понад 116 кДа) і низькомолекулярні (з Мм 7-21 кДа та 31-45 кДа) білки. Вимивне середовище з репродуктивних органів шиншили характеризувалося наявністю білків з Мм близько 12 кДа й 50 кДа, а його білковий спектр подібний до спектру яйцепроводів за виключенням меншої насиченості низькомолекулярними білками. У матці виявлено білки з Мм близько 12 і 17 кДа, насичений спектр в діапазоні 30-45 кДа, з інтенсивною секрецією овальбуміну (45 кДа), та вище 200 кДа, що свідчить про посилену функціональність цього органу у досліджуваний період.

У репродуктивних органах норок з різною ембріопродуктивністю визначали класи ліпідів: лізофосфатиди, фосфатидилсерин, сфінгомієлін, лецитин, фосфогліцерин, N-диметил-фосфатидил етаноламін, кардіоліпін, холестерин, нейтральні ліпіди. За результатами індивідуального аналізу виявлено, що яйцепроводи і матки норок, від яких одержано значну кількість ембріонів (від 8 до 16) на 6-8-й дні після запліднення містять 5,9; 7,7 мг, максимально 9,0 мг ліпідів, серед яких основна кількість належить холестерину і нейтральним ліпідам.

Особливо їх багато у репродуктивних органах самиць в період ембріональної діапаузи: на 9-й день після запліднення яйцепроводи і матки норок характеризувалися значною кількістю цереброзидів (від 76,0 до 88,6 мг), N-метил фосфатидилетаноламіну (від 82,1 до 88,0 мг), холестерину та нейтральних ліпідів (від 88,8 до 99,6 мг). Детальний аналіз характеристики нейтральних ліпідів у репродуктивних органах самиць латентного періоду ембріональної діапаузи виявив перевагу тригліцеридів. Дані наших досліджень свідчать, що кількість нейтральних ліпідів та холестерину у репродуктивних органах самиць норок може визначати їх багатоплідність.

Одержані нами дані доводять, що взаємозв`язок між ембріонами і репродуктивними органами норок упродовж перших 10-ти днів вагітності відбувається за участю неспецифічних і специфічних білків, які оточують ембріон. Можна стверджувати, що ембріони норок здатні стимулювати синтез і секрецію білків слизовою оболонкою репродуктивних органів і таким чином впливати на оптимізацію власного оточення у статевих шляхах матері ще до моменту імплантації, формуючи інтенсивність ембріонально-маткового сигналу. Це пояснює різну насиченість білкового спектру тканин репродуктивних органів.

Мікроманіпуляційні методи реконструкції ембріональних клітин

Внаслідок мікрохірургічного поділу і агрегації половинок 5-6-денних морул норок з синхронним розвитком від самиць коричневого (St) і сіро-голубого (Bl) генотипів було одержано 6 химерних ембріональних конструкцій, які хірургічно трансплантували двом реципієнтам, по 3 химерні ембріони в один матковий ріг. Контрольну групу склали 5 інтактних морул (Bl), які пересадили 1 реципієнту (St). Власні ембріони у тварин-реципієнтів не вимивали через ризик зменшення ембріонально- маткового сигналу. Трансплантація химерних ембріонів норок призвела до народження 1 щеня контрастного генотипу, яке успадкувало мозаїчну форму химеризму (16,7% приживлення). З інтактних ембріонів контрольної групи прижився також один (20%).