Ранній ембріональний розвиток тварин in vivo і in vitro та біотехнологічні фактори його регуляції

Незначні зміни в морфології химерних конструкцій 1-ї групи свідчили про відсутність адекватної відповіді ембріонів на слабкий сигнал в 15 В. Імпульс напругою 25 В впродовж 200 мкс (2-га група) викликав дегенеративні явища: зміну форми ембріона, в окремих випадках явище тургору, травматичне зменшення бластопорожнини, часткову руйнацію бластомерів і утворення загальної цитоплазматичної маси внаслідок теплового пошкодження мембран. Оптимальні параметри електростимуляції виявлено при напрузі 20 В з 2-4 разовим спрямуванням електричного імпульсу та з експозицією дії кожного 150 мкс (3-тя дослідна група). При цьому найчастіше спостерігали збільшення перивітелінового простору за рахунок ущільнення бластомерної маси химерних бластоцист без зміни їх форми, дегенерації і руйнації клітин.

В результаті нехірургічної трансплантації 16-ти химерних ембріонів дослідних груп по одному в кожний матковий ріг 8-ми телицям-реципієнтам та 7-ми химерних ембріонів контрольної 7-ми реципієнтам одержано 3 тільності (20,0%), в тому числі 2 від пересадки химерних бластоцист після застосування електростимуляції, які закінчилися народженням трьох телят (1 телиця-реципієнт 1-ї дослідної групи розтелилася двійнятами). Незначне підвищення приживлення химерних ембріонів у 1-й дослідній групі можна пояснити слабким електроімпульсом і відсутністю будь-яких порушень у морфологічній будові химерних ембріонів. Результати досліджень дають можливість гіпотетично стверджувати химеризм одержаних ембріональних форм.

Таблиця 4 - Розвиток половинок розморожених морул корів in vitro за умов культивування з трофобластичними везикулами і без них

Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи.

Для підвищення життєздатності поділених ембріонів корів застосовували фідерні клітини ембріонального і маткового походження. Від 47 розморожених і культивованих 9-10-денних бластоцист корів відсікали трофобластичні фрагменти за допомогою мікроманіпулятора і мануально і використовували для відновлення мітотичного дроблення 19 половинок розморожених морул корів дослідної групи. Їх пари склали контроль.

Через 24 години культивування 84,2% (р<0,01) половинок дослідної і 26,3% контрольної груп оцінили як ембріони 2-ї генерації. Їх знову піддали бісекції методом внутрішньозональної сепарації бластомерів на дві чвертки без підсадки в окремі прозорі оболонки і трансплантували 20 телицям-реципієнтам зі спонтанною охотою, по дві чвертки в один матковий ріг. Тільність від трансплантації чверток розморожених морул, яку визначали за результатами перегулів, наприкінці другого місяця становила 15% (3 з 20), виключно за рахунок реципієнтів дослідної групи. Були одержані дві пари ідентичних близнюків: телички і бички; і 1 бичок (18,8% приживлення).

Епітеліальні клітини маткового походження використовували для рекомпактизації і стимуляції розвитку in vitro 22-х половинок розморожених 7-денних морул корів дослідної групи упродовж трьох діб. Їх пари склали контрольну групу (табл.5).

Таблиця 5 - Життєздатність половинок розморожених морул корів in vitro за умов культивування з клітинами епітелію і без них

Примітка: *- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи.

Життєздатність та розвиток in vitro половинок залишалися задовільними впродовж перших 12 год за умов культивування їх з клітинами епітелію у дослідній групі (72,7%) в порівнянні з їх парами у контрольній (54,5%). Через 36 год життєздатність половинок морул контрольної групи дедалі зменшувалась, а дослідної лишалася на одному рівні з вірогідною різницею між групами (р< 0,05). Через 48 годин у 54,5% половинок дослідної і 86,4% контрольної груп спостерігали явища, що не сумісні з довготривалою життєздатністю ембріональних клітин: часткової дисоціації бластомерів, відсутності достатнього рівня компактизації, часткового некрозу цитоплазми, налипання на прозорій оболонці ембріона чужорідних елементів, які свідчили про зміну її ізоелектричного потенціалу. Протягом 72 годин 27,3% половинок дослідної групи лишалися життєздатними, в той час як у контрольній групі 95,5% половинок дегенерували.

Удосконалення середовища для дозрівання in vitro ооцитів тварин

Стероїдні гормони, глюкокортикоїди та інсулін належать до важливих елементів системи регуляції обміну речовин і впливають на процеси проліферації, росту і диференціації клітин, перебіг реакцій синтезу і розщеплення органічних речовин (De Meyts P. et al., 1996; Wessely O. et al., 1997; Viveiros S. et al., 1999, Штапенко О.В., Розгоні І.І., 2000; Broussard J.R. et al, 2000). Оскільки молекули цих біологічно-активних речовин мають властивість зв`язуватися зі специфічними рецепторами, які є структурними компонентами плазматичних мембран клітин кумулюсу, ми припустили, що їх додавання до культурального середовища буде покращувати морфологічну якість ооцит-кумулюсних комплексів (ОКК) тварин in vitro.

Культивування in vitro ооцитів песців різних розмірів. 28 ОКК від 6 самиць (проеструс-еструс) оцінили за розмірами, грануляцією ооплазми, інтенсивним блиском кумулюсу при поляризації світла, інтенсивністю розпушення або денудації кумулюсу (часткової або повної). Через 24 і 36 годин культивування серед ооцитів діаметром 100 мкм одержано 33,3% і 44,4% морфологічно якісних, більше 100 мкм - 80,0% і 100%, відповідно. Вони характеризувалися утворенням закритого, розпушеного шару кумулюсу, що характерно для процесів його експандації, яке пов`язане з дозріванням ОКК до метафази 2 і узгоджується з результатами Srsen V. et al. (1997). Оскільки клітини кумулюсу контролюють початок мейозу в ооцитах (Farstard W., 2000; Wen X.H., 1994), у подальших дослідженнях до середовища для дозрівання їх in vitro нами вводився преднізолон, який у встановленій концентрації міг би забезпечити достатню розпушеність кумулюсу і стимулював процеси, пов`язані з бажаними змінами у клітинній сфері ОКК.

Морфологія і культивування ооцитів шиншили. Яскраво виражене у норок та песців явище функціональної асинхронності яєчників виявилося характерним і для шиншил. Максимальна кількість фолікулів в 1 яєчнику становила 23, що вносить корекцію до результатів інших авторів (Barabasz B., 2001). Від 2-х самиць (проеструс) одержали 37 ОКК 1-ої та 2-ої категорії якості з різним ступенем дозрівання і розміром від 80 до 120 мкм, які культивували 24 год у середовищі DM 335 (“Gibco”, Англія). Додавання 0,2 мкг/мл преднізолону та 1 і 4 мкг/мл естрадіолу-17в покращило морфологічну якість у 84,6% і 75% ооцитів відповідно 1-ї і 2-ї дослідних груп проти 50% у контролі (р<0,05) за рахунок утворення розпушеного, з рівною клітинною сферою кумулюсу і чітко гранульованою ооплазмою. Решта ОКК дегенерували, що проявлялося у “відлежуванні” ооплазми, її зсуванні на бік, набуття нею серпанкової форми або міграції гранул ооплазми у перивітеліновий простір, розірваному променистому вінці, що тьмяно висвічував за умов поляризації світла.

Культивування нативних і вітрифікованих ооцитів норок. 62 морфологічно якісні ОКК норок від 8 самиць (еструс) культивували 24 год нативними або розмороженими після кріоконсервування надшвидким методом (зберігання в азоті 1 і 3 доби) у ДМЕМ (контроль) з додаванням 0,2 мкг/мл преднізолону та 1 і 4 мкг/мл естрадіолу-17в у дослідних групах. Їх оцінювали за аналогічними показниками морфології кумулюсу і ооплазми. Преднізолон і естрадіол-17в у вищевказаних концентраціях стимулювали експансію клітин кумулюсу і сприяли тісному контакту мембран цих клітин з оолемою 85% нативних ооцитів, але не вплинули на покращення морфології деконсервованих. У 78,6% розморожених ооцитів, незалежно від часу перебування їх у рідкому азоті, зафіксовано погіршення морфологічної якості, яке проявлялося у руйнуванні клітин кумулюсу, зміщенні ооплазми до одного з полюсів або у загальній деформації форми, фрагментарному порушенні цитоплазми, утворенні псевдобластомерів, частковому руйнуванні ооцитарної мембрани з утворенням дірок і виходом ооплазми у середовище.

Культивування in vitro ооцитів корів на культурах фідерних клітин маткового походження. Досліджували дію ФСГ, естрадіолу-17 та преднізолону в різних концентраціях на проліферацію епітеліальних клітин яйцепроводів і ендометрію корів та морфологію ооцитів. У кожному з 5-ти дослідів було використано 120 ооцитів корів, по 30 ооцитів у групі. ОКК культивували упродовж 24 год по 10 ОКК у 100 мкл середовища ДМЕМ. Найгустішу популяцію епітеліальних клітин яйцепроводів одержано у 3-й дослідній групі з найвищою концентрацією гормонів 12 мкг/мл ФСГ, 4 мкг/мл естрадіолу 17 та 0,6 мкг/мл преднізолону: 13,20,57х10⁶ (р<0,001); що підтвердилося двома повторними дослідами: 14,020,85 (p<0,01) та 12,41 0,33 (p<0,001) х 10⁶ клітин/мл (рис.2).

Кількість клітин яйцепроводів була у 5-5,5 разів вище за початкову посівну концентрацію 2,0-2,5 х 10⁶ клітин/мл (дослід 1).

Рис. 2. Проліферативний ріст фідерних клітин під дією гормональних препаратів: дослід 1 та його повтор - епітеліальних клітин яйцепроводів корів; дослід 2 та його повтор - клітин ендометрію корів; 1-контрольна група, 2, 3, 4-перша, друга і третя дослідні групи відповідно.

Найкращі результати збільшення росту і щільності клітинної популяції ендометрію одержано в 2-й і 3-й дослідній групах з середнім вмістом гормонів: 5,940,52х10⁶ (р<0,01) у досліді 2 та 8,340,37х10⁶ (р<0,001) клітин/мл у повторній серії, що тільки у 3 рази перевищувало початкову посівну концентрацію клітин 1,8-1,9х10⁶/мл. Максимальне підвищення концентрації гормонів у середовищі викликало супресивний ефект і затримувало мітотичний поділ клітин ендометрію, що підтвердилося відсутністю у дослідних групах зон інтенсивної проліферації. Незначне збільшення початкової посівної концентрації клітин ендометрію з 1,8 до 1,9 х 10⁶/мл, також як і зменшення епітеліальних клітин яйцепроводів з 2,5 до 2,0 х 10⁶/мл, викликало суттєву різницю у їх кількості внаслідок культивування, до 1млн./мл, не тільки по групах, але й у повторних дослідах.

Морфологічна якість ОКК корів на культурі епітеліальних клітин яйцепроводів була вища, ніж на клітинах ендометрію і становила 83,3 і 86,7% проти 63,3 і 53,3%, відповідно, у групах з середнім і максимальним вмістом гормонів. Після 24 год культивування кумулюсні клітини лишалися життєздатними, з високим ступенем експансії, не зафарбовувалися трипановим синім, оолема гранульованою, зернистою.

Культивування in vitro ооцитів корів на фідерних клітинах під дією інсуліну та ЕФР. Клітинну суспензію епітелію яйцепроводів корів у початковій посівній концентрації 0,675х10⁶/мл культивували у середовищі ДМЕМ (контроль), з додаванням 20 мкг/мл інсуліну пролонгованої дії (1-ша дослідна) та 10 нг/мл EФР (2-га дослідна група). Функціональність фідерних систем тестували дозріванням на них ОКК корів 1-ї і 2-ї категорій якості по 15 ооцитів в кожній групі. Підрахунок клітин в 1 мл середовища впродовж 24 год (1-й пасаж) і 48 год з початку культивування (2-й пасаж) було використано як індикатор специфічного ефекту інсуліну, EФР та сумісної дії цих чинників (табл.6).

Таблиця 6 - Вплив інсуліну та EФР на проліферативний ріст культури епітеліальних клітин яйцепроводів і морфологічну якість ОКК корів, М m (n=3)

Примітка: *, ***- вірогідність відмінностей по відношенню до контрольної групи.

Через 24 год кількість клітин під дією інсуліну збільшилася в 2 рази (р<0,05), а після перепосіву у 4 рази (p<0,001), одержано 86,7% (р<0,05) якісних ОКК стадії полярного тільця. Додавання ЕФР суттєво не вплинуло на проліферативний ріст епітеліальних клітин, їх кількість збільшилася тільки у 1,2 рази після 1-го пасажу в 1,9 рази в результаті 2-го, що відобразилося і на якості 66,7% морфологічно якісних ОКК, здатних до подальшого розвитку). Найяскравіший ефект стимуляції клітинної проліферації спостерігався за умов сумісної дії чинників (3-тя дослідна група): збільшення клітинної популяції у 2,8 рази (р<0,001), а після перепосіву в 4,2 рази з високим ступенем вірогідності (р<0,001), одержано 93,3% (р<0,05) морфологічно якісних ОКК. У контролі кількість клітин збільшилася тільки у 1,2 рази а після перепосіву - у 1,6 рази з одержанням 53,3% якісних ОКК.

У морфологічно якісних ОКК спостерігали характерну для них чітку грануляцію ооплазми, інтенсивний блиск кумулюсу при поляризації світла, розпушення і утворення закритої сфери клітин променистого вінця внаслідок руйнування міжклітинних з`єднань між клітинами кумулюсу і мембраною ооцита, що підтверджує результати інших авторів (Жернокльов Г.В., 2001). Сумісна експресивна дія епідермального ростового фактору і інсуліну, що проявилася у посиленому проліферативному рості фідерних клітин і покращенні морфології ОКК, може бути пояснена активацією IФР-системи, функціональність якої є вирішальним моментом оогенезу як in vivo так і in vitro.

Удосконалення середовища для дозрівання in vitro ооцитів. 120 ОКК корів 1-ї, 2-ї і 3-ї категорій морфологічної якості культивували в середовищі ТС-199 (контроль) з додаванням 10, 20 і 50 мкг/мл лізину у дослідних групах. Очікували покращення морфологічної якості і дозрівання ооцитів корів in vitro, оскільки лізин є першою незамінною амінокислотою у синтезі білків та важливий у багатьох процесах метаболізму і ядерного синтезу. У 1-й, 2-й і 3-й дослідних групах спостерігали значне підвищення морфологічної якості ОКК: 66,7%; 86,7% (р<0,01); і 73,3%, відповідно, проти 33,3% у контрольній, яке проявлялося гомогенністю ооплазми, розташуванням багатошарового кумулюсу навколо мембран ооцитів без дегенеративних змін.

Для визначення комплексного впливу преднізолону і лізину на морфологічну якість ОКК корів проводили дозрівання 60 ооцитів 1-ї, 2-ї та 3-ї категорій морфологічної якості у вищевказаному середовищі з додаванням преднізолону і лізину у дослідній групі, що дозволило одержати 86,7% (р<0,05) морфологічно якісних ОКК проти 60,0% у контролі. Представлені дані дозволили оформити їх у вигляді Деклараційного патенту 52177 А ”Середовище для дозрівання ооцитів in vitro корів та овець”.

Дозрівання ооцитів овець в удосконаленому середовищі, одержання ембріонів in vitro, їх трансплантація і одержання приплоду

Лапароскопічно одержані від 8-ми кросбредних вівцематок 27 якісних ОКК різної морфології і ступеня зрілості культивували упродовж 24 год у модифікованому нами середовищі для дозрівання ооцитів, що містило NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂ 6H₂O, NaH₂PO₄, NaHCO₃, фенол червоний, хепес (HEPES), гентаміцин, естральну сироватку овець, ФСГ+ЛГ, Na піруват і гепарин (модифіковане ДМЕМ), до якого додатково ввели преднізолон і лізин. Після морфологічної оцінки 81,5% ОКК виявилися якісними, здатними до запліднення і подальшого розвитку: 51,9% 1-ї категорії якості з чітко ідентифікованими полярними тільцями, 25,9% 2-ї категорії з залишками одношарового кумулюсу, 1 ОКК з частково некротичною ооплазмою 3-ї категорії. (табл.7).

Таблиця 7 - Результати дозрівання, запліднення і дроблення in vitro ооцитів овець

Капацитацію розмороженої сперми барана породи саффолк польської селекції проводили упродовж 30 хв у розчині TALP (Parish J.J. et al, 1988), запліднення дозрілих in vitro ооцитів у середовищі ДМЕМ з додаванням 5,0 мкг/мл гепарину і 5 мМ /мл кофеїну (Fert-TALP) капацитованою спермою у концентрації 1 млн/мл упродовж 18 годин. Презумптивні зиготи переносили у модифіковане ДМЕМ для мітотичного дроблення і подальшого розвитку. Через 24 і 48 годин культивування стадію розвитку зигот визначали підрахунком в них кількості бластомерів: 14 зигот (63,6%) розпочали дроблення і через 48 годин знаходилися на ранніх стадіях розвитку з утворенням макро- і мікробластомерів, з них 13 зигот розвинулися до стадії 8-16-ти бластомерного ембріона, 1 зупинився на 4-6-бластомерній стадії.

Хірургічна трансплантація 3-х ранніх ембріонів одержаних in vitro вівці-реципієнту, яка раніше була використана як донор ооцитів при їх лапараскопічному одержанні, закінчилася на 171-й день народженням ягнички живою масою 5420 г за кличкою Діана. Різниця в тривалості пренатального періоду її розвитку у порівнянні з ягнятами - напівсібсами становила 21 день. Однак, це не вплинуло на живу масу Діани при народженні. Цей феномен можна пояснити збільшенням тривалості доімплантаційного розвитку ембріонів одержаних in vitro, оскільки після трансплантації реципієнту вони потребують додаткового часу для компенсації необхідної клітинної маси внаслідок певної кількості циклів мітотичного дроблення, що віддаляє імплантацію і таким чином, очевидно, збільшує загальний термін вагітності реципієнтів. Це опосередковано підтверджує попередні дані S. Iwasaki et al (1990), T.H. Thompson et al (1995), В.Е. Щербак (1997) про достовірно меншу питому масу ембріонів одержаних поза організмом.

ембріогенез клон запліднення

Висновки

У дисертації теоретично узагальнено сучасне вирішення наукового завдання використання біотехнологічних методів, що сприяють одержанню нових даних щодо вивчення закономірностей та видових особливостей оо- і ембріогенезу тварин за умов розвитку in vivo і in vitro, дозволяють зберегти цінний ембріональний матеріал, підвищують потенціал плідності самиць. Експериментально вивчено механізми клітинної регуляції, які проявляються у компенсації ембріонами клітинних втрат, відновленні мітотичного дроблення, стимуляції процесів дозрівання ооцитів. Обґрунтована можливість створення in vitro таких умов, які були б максимально наближені до специфічного маткового середовища на ранніх стадіях ембріогенезу.

1. Застосований нами у норок метод визначення якості сперміїв за інтенсивністю їх дихання дозволяє внести корекцію в оцінку самців основного стада. Сперма активністю 7-9 балів знебарвлюється упродовж 15-20 хв, 5-6 балів - 25-30 хв, нижче 5 балів - через 40-45 хв.

2. Встановлено закономірності і видові особливості раннього ембріонального розвитку хутрових тварин, що полягає у наступному:

- початок латентного періоду ембріональної діапаузи у норок спостерігається на 8-й день після запліднення, а не на 9-й, як це вважалося раніше, що свідчить про прискорення темпів ембріонального дроблення і супроводжується змінами в характері зчеплення бластомерів реекспандованих бластоцист;

- біологічний годинник мітотичного дроблення ембріональних бластомерів у песців складає 16-20 годин. Згідно розробленої схеми, на 12-й день після осіменіння самиць песців можна очікувати формування ранньої 32-бластомерної морули, а на 14-й день - експандованої бластоцисти, що вносить елемент новизни у вивчення видових особливостей їх раннього ембріонального розвитку;

- існує суттєва різниця в темпах доімплантаційного розвитку норок і песців: для норок характерна ембріональна діапауза зі специфічними морфологічними ознаками в будові реекспандованої бластоцисти; ембріонам песців притаманний динамічний розвиток. На основі цього розроблена шкала морфологічної оцінки доімплантаційних ембріонів норок, яка дозволяє здійснити селекцію зародків за стадіями розвитку;

- висунуто і експериментально доведено концепцію внутрішніх причин ранньої ембріональної смертності хутрових тварин, яка базується на принципах біологічного “старіння” ооцитів норок і сперміїв песців.

3. Комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок“ (ДП № 44006А. 7 А01К676/02.-авт. В.Ю.Шавкун, О.Б.Андрушко) у загальній дозі 24 ІО ГСЖК за розробленою схемою може бути застосований для стимуляції овуляції у норок, що сприяє спаровуванню самиць в кінці періоду гону, створює оптимальні умови в матці для розвитку ембріонів за рахунок збільшення кількості крипт, наповнення їх матковим секретом і призводить до імплантації зародків у неплідних самиць та народження 2,5 нащадків на гніздо.

4. Інтенсивність секреції специфічних білків репродуктивними органами норок знаходиться у прямому зв`язку з кількістю ембріонів та стадією їх розвитку: на 5-8-й дні після запліднення білковий спектр яйцепроводів самиць насиченіший, ніж тканин матки; на 9-й - навпаки, що пов`язано з функціональністю цього органа в латентний період ембріональної діапаузи. Одночасний розвиток значної кількості ембріонів з їх первинною диференціацією супроводжується в яйцепроводах присутністю групи низькомолекулярних білків (7-10 кДа та 16-24 кДа), що характерна для специфічних поліпепетидів та ростових факторів, які беруть участь в процесах ембріогенезу і володіють мітогенною дією. Початок латеного періоду у норок співпадає з наявністю специфічного білка з Мм 33-35 кДа. Кількість нейтральних ліпідів та холестерину у репродуктивних органах самиць норок на ранній стадії вагітності може визначати їх багатоплідність.

5. Ранні зародки норок володіють механізмом регуляції перерозподілу примордіальних зародкових клітин і здатні компенсувати свій розвиток in vivo після мікрохірургічного втручання і агрегації недиференційованих бластомерів синхронного і асинхронного (в межах 3-х мітотичних дроблень) розвитку з приживленням химерних ембріонів 16,7% і 37,5% відповідно.

6. Оптимальні параметри неушкоджуючого електростимулюючого впливу на химерні ембріони корів, що одержані мікроін`єкцією групи бластомерів розморожених морул у нативні бластоцисти, знаходяться в межах 15-20 В з 2-4 - разовим імпульсом експозицією 100-150 мкс. За цих умов досягається внутрішньозональна адгезія мембран чужорідних бластомерів без їх теплового пошкодження з життєздатністю і приживленням химерних ембріонів у телиць-реципієнтів.

7. Застосування культур клітин ембріонального і маткового походження доцільно для підтримки розвитку поділених навпіл ембріонів корів, зокрема для збільшення кількості трансферабельних ембріонів 2-ої генерації або для одержання ембріональних клонів за рахунок бісекції попередньо культивованих in vitro половинок. Цей прийом забезпечує 18,8% приживлення чверток розморожених морул корів, що в перерахунку на половинку розмороженого ембріона становить 37,6%, а на цілий ембріон- 75,2%, значно підвищує ефективність методу трансплантації та забезпечує одержання ембріональних клонів і груп ідентичних тварин.

8. Мікроманіпуляції з ембріонами, довготривале культивування in vitro та взаємодія цих факторів в цілому дестабілізуюче впливають на життєздатність і подальший розвиток in vitro половинок розморожених морул. Проте, їх морфологічну якість можна підвищити культивуванням з епітеліальними клітинами маткового походження, що в 1,9 рази підвищує їх життєздатність упродовж 24 годин, у 3,3 рази через 48 годин і в 6 разів через 72 годин (27,3% половинок ембріонів лишаються морфологічно якісними).

9. Висока інтенсивність утворення і одночасного дозрівання декількох фолікулів у хутрових тварин забезпечується періодичною функціональною активністю яєчників. Ступінь фолікулярного дозрівання, розмір і морфологія ооцитів норок, песців і шиншил можуть бути тестом їх здатності до подальшого розвитку in vitro. Культивування у середовищі з додаванням ФСГ, естрадіолу -17в та преднізолону стимулює експансію клітин кумулюсу у 80-85% ооцитів і в окремих випадках сприяє розшаровуванню з`єднань між клітинами променистого вінця і цитоплазматичною мембраною ооцита.

10. Додавання до культурального середовища ФСГ, естрадіолу-17в, преднізолону у малих дозах (0,2-0,6 мкг/мл) забезпечує одержання моношару епітеліальних клітин яйцепроводів і ендометрію та пов`язано з активуванням ендокринного механізму регуляції клітинної проліферації. Ізольовані клітини епітелію яйцепроводів реагують на підвищення концентрації гормонів у середовищі збільшенням щільності клітинної популяції у 5 -5,5 разів з 2,0 - 2,5 млн. до 13,2 0,57 (р<0,001); 14,02 0,85 (p<0,01) та 12,41 0,33 (p<0,001) млн. клітин в 1 мл, а клітини ендометрію - у 3 рази, з 1,8 - 1,9 млн. до 5,94 0,52 (р<0,01) та 8,34 0,37 млн. клітин в 1 мл. Підвищенння концентрації гормонів ФСГ до 12 мкг/мл, естрадіолу-17 - 4 мкг/мл, преднізолону - 0,6 мкг/мл веде до затримки процесів мітотичного дроблення клітин ендометрію.

11. Первинна культура фідерних клітин маткового походження стимулює процеси дозрівання in vitro ооцитів корів, а ооцит-кумулюсні комплекси можуть бути тест- системами функціональної активності фідерних культур. Ко-культивування з фідерними клітинами під впливом ФСГ, естрадіолу-17в і преднізолону підвищує кількість морфологічно якісних ооцитів корів до 83,3% (р<0,05) і 86,7% (р<0,001) на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів і 53,3% і 63,3% на моношарі клітин ендометрію.

12. Додавання до культурального середовища 20 мкг/мл інсуліну та 10 нг/мл епідермального ростового фактору прискорює процес вирощування фідерного клітинного субстрату і дозрівання ооцитів. Щільність клітинної популяції епітеліальних клітин яйцепроводів під дією інсуліну і ЕФР через 24 години збільшується у 2,8 рази, а після пере посіву - у 4,2 рази. Це дозволяє одержувати 86,7% морфологічно якісних ооцитів під дією інсуліну, 66,7% при культивуванні з ЕФР, а за умов сумісної дії чинників - 93,3%, проти 53,3% у контролі.

13. Застосування модифікованого “Середовища для дозрівання ооцитів корів і овець in vitro” забезпечує дозрівання 86,7% ооцитів корів і 81,5% ооцитів овець.

14. Удосконалено технологію запліднення in vitro ооцитів овець, яка гарантує 63,6% дроблення запліднених яйцеклітин овець та одержання життєздатного молодняку.

Практичні пропозиції

1. Видані методичні рекомендації “Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення”, які можуть бути використані у науковій роботі і у практиці звірівництва та в навчальному процесі у ВУЗах.

2. Рекомендується одержувати ембріони норок доімплантаційних стадій для культивування і ембріобіотехнологічних досліджень до 8-го дня розвитку, оскільки в зародках старшого віку розпочинається період ембріональної діапаузи, а ембріони песців - на 12-14-й дні, коли ембріони досягають компактних стадій.

3. Використовувати комплексний гормонально-вітамінний “Препарат для стимуляції тічки у свиноматок” для стимуляції овуляції у самиць норок з відсутністю природного гону шляхом 3-разової ін`єкції його через 1 добу в загальній кількості 24 ІО ГСЖК, що також сприяє створенню оптимальних умов в матці для розвитку ембріонів, призводить до народження нащадків у неплідних норок.

4. Рекомендується з метою одержання ідентичних близнюків від високопродуктивних корів застосовувати метод проміжного культивування половинок ембріонів з наступним поділом їх на чвертки. Для стимуляції ембріонального розвитку розморожених ембріонів зі зменшеною клітинною масою обґрунтовано використання попередньо культивованих трофобластичних везикулів з 9-10-ти денних розморожених бластоцист у співвідношенні 4 трофобластичні фрагменти на 1 половинку ембріона або клітин ендометрію корів з розрахунку 100 мкл клітинної суспензії на 3-4 половинки в 1 мл культурального середовища.

5. Обґрунтовано використання фідерних моношарів епітеліальних клітин яйцепроводів у in vitro- та клон-технологіях для стимуляції процесів оогенезу і одержання трансферабельних ембріональних клонів тварин.

6. Рекомендується використовувати ”Середовище для дозрівання ооцитів in vitro корів та овець” (ДП №52177А. - МКИ UA 7 А61D19/04. -№2002031913), яке забезпечує одержання ембріонів жуйних з метою інтенсивного відтворення поголів'я за технологією in vitro та відпрацювання окремих етапів клон-технологій.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Монографії

1. Буркат В.П., Влізло В.В., Кравців Р.Й., Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Шаран М.М., Пасіцький М.Д., Гамота А.А., Мадісон Л.В., Мадісон В.В., Яремчук І.М., Дудчак В.О. Довідник з репродуктивної біотехнології великої рогатої худоби //Львів. -2004. -150с.

Брошури

2. Мадіч А.В. Інтенсифікація хутрового звірівництва удосконаленням біотехнологічних методів відтворення. Методичні рекомендації //Інститут біології тварин, Львів. -2003. -30с.

Статті у наукових фахових виданнях

3. Мадіч А.В. Культивування та мікроманіпуляції з відтаяними ембріонами корів. //Тваринництво України. -1998. -№3. -С.12-13.

10. Madich A.V. Forming of embryo-uterine signal in mink at early embryogenesis. //Біологія тварин. -2002. -Т.4. -№1-2. -С.228-235.

11. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Ідентичні близнюки як додатковий фактор підвищення плодючості. //Тваринництво України.-1992. -№2. -С.24-26. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).

12. Шаловило С.Г., Мадіч А.В., Бец М.Й., Шаран М.М. Біотехнологія відтворення у скотарстві. //Сільські обрії. -1997. - №10-12. - С.35 (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).

13. Мадіч А. В., Саєнко І.М., Шаловило Л. Є. Розвиток половинок мишачих ембріонів отриманих поділом на мікроманіпуляторі та вручну. //Розведення і генетика тварин: Міжвідомчий тематичний наук. збірник. Київ: Аграрна наука. -1998. -№30. - С.116-119. (Дисертант розробив схему і провів ряд досліджень, узагальнив результати, оформив роботу до друку).

14. Мадіч А.В., Федько М.В. Отримання здорового молодняка норки при застосуванні деяких біотехнологічних прийомів. //Вісник Білоцерківського ДАУ, Біла Церква. -1998. -В.5. -Ч.2. -С.53-55. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів дослідження, підготував роботу до друку).

15. Мадіч А.В., Шаран М.М., Ігліцький І.І. Особливості хірургії у норок. //Ветеринарна медицина України. -1998. -№11-12. -С.40. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, підготував роботу до друку).

16. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Застосування новітніх біотехнологій у тваринництві. //Сільські обрії. -1998. -№3. -С.23-24. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, узагальнив результати, оформив роботу до друку).

17. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Перші результати трансплантації ембріонів норок в Україні. //Розведення і генетика тварин. Міжвідомчий тематичний науковий збірник. - Київ: Аграрна наука. -1999. -№32. -С.149-150. (Дисертант теоретично обґрунтував схему досліду, провів морфологічні дослідження, узагальнив результати, оформив роботу до друку).

18. Мадіч А.В., Ігліцкий І.І., Шаловило С.Г., Шаловило Л.Є., Дєдова А.І. Експериментальні химери у норок. //Науковий вісник НАУ. Збірник наукових праць, Київ: Національний аграрний університет. - 1999. - Вип.16. - С.121-124. (Дисертант особисто провів експериментальні дослідження з агрегації ембріонів, підготував роботу до друку).

19. Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Соціальні проблеми ембріонального клонування. //Тваринництво України. -2000. -№ 3-4. -С.12-14. (Дисертант розробив концепцію, провів теоретичний аналіз досліджень, оформив роботу до друку).

20. Шичкін В.П., Мадіч А.В. Використання та можливості застосування гібридних клітин у репродуктивній біотехнології. //Вісник Полтавського державного сільськогосподарського інституту, Полтава. -2001.-№2-3. -С.10-11. (Дисертант теоретично обґрунтував концепцію, підготував роботу до друку).

21. Мадіч А.В., Гевкан І.І., Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І., Шаловило Л.Є., Ільницька О.М. Використання методу in vitro запліднення ооцитів овець та перші практичні результати трансплантації зигот. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин, Львів. -2001. -Вип.1-2. -С.273-276. (Дисертант розробив схему і особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготовив роботу до друку).

22. Мадіч А., Сливчук Ю., Чорненький Т., Гевкан І., Шаран М., Муравський М. Вона називається Діана. Одержання життєздатного молодняку від хірургічної трансплантації отриманих in vitro ембріонів овець. //Тваринництво України. -2002. -№10. -С.12-14. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку).

23. Мадіч А.В., Яремчук І.М. Життєздатність та компетенція до подальшого розвитку вітрифікованих ооцитів норок. //Вісник Сумського національного аграрного університету: Серія Тваринництво, Суми. -2002. -Вип.6. -С.426-430. (Дисертант розробив схему експерименту, особисто провів ряд досліджень, узагальнив результати, підготував роботу до друку).

24. Андрушко О.Б., Мадіч А.В., Шаловило С.Г. Удосконалення методики капацитації сперміїв та запліднення яйцеклітин в умовах in vitro. //Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. -Львів. -2002. -Вип.4.-№1. -С.19-24. (Дисертант брав участь у підготовці і проведенні експерименту, оформленні роботи до друку).

25. Мадіч А.В., Андрушко О.Б., Шаловило С.Г., Гевкан І.І.. Розгоні І.І.. Шавкун В.Ю. Гормональна стимуляція репродуктивної функції у норок //Біологія тварин. -2003. -Т.5. -№1-2. -С.320-329. (Дисертант особисто планував і проводив дослідження, узагальнив результати, підготував роботу до друку).

26. Федорова С.В., Мадіч А.В. Вплив інсуліну та епідермального фактора росту на проліферацію культури фідерних клітин та дозрівання ооцитів корів in vitro //Науково- технічний бюлетень Інституту тваринництва, Харків. -2003. -№85. -С.123-126. (Дисертант розробив схему досліджень, визначав концентрацію клітин, провів статистичну обробку даних та узагальнення результатів).

27. Ігліцький І.І., Дудчак І.П., Надопта (Мадіч) А.В. Хірургічна пересадка ранніх ембріонів у норок //Сільський господар. -2003. -№5-6. -С.20. (Дисертант брав участь у плануванні і проведенні експерименту, особисто виконав хірургічну трансплантацію ембріонів норок).

Патенти

28. Деклараційний патент на винахід 52177 А Україна, МКИ UA 7 А61D19/04. Середовище для дозрівання in vitro ооцитів корів та овець. І.І. Гевкан, А.В. Мадіч, Т.Я. Чорненький, І.І. Розгоні (Україна); Держ. Деп. Інтел. Власності. -№2002031913; Заявл. 07.03.02; Опубл. 16.12.02; Бюл. №12. -3с.

Статті у наукових журналах і збірниках

29. Мадіч А.В. Ооцит - кумулюсні комплекси корів як тест-системи функціональної активності фідерних клітин. //Вісник Львівського університету. Серія Біологічна. -2003. -Вип..32. -С.186-194.

31. Мадіч А.В., Ігліцький І.І., Гамота А.А. Метод загальної анестезії норок і песців. //Аграрна наука - виробництву. Науково-інформаційний бюлетень завершених наукових розробок. - Київ: Аграрна наука. -2001. -№-3. -С.21. (Дисертант брав участь у розробці методу, оформив роботу до друку).

Тези конференцій і симпозіумів

32. Мадіч А.В. Методичні підходи для одержання химерних ембріонів корів інєкційним способом. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З. Гжицького. -1997. -С. 521-523.

37. Мадіч А.В., Саєнко І.М. Порівняльна характеристика техніки створення агрегаційних та інєкційних химер від ембріонів різних порід ВРХ. //“Біотехнологія в розведенні і відтворенні нових генотипів сільськогосподарських тварин”. Матеріали наук.-практ. конференції, Харків. -1993. -С.134.

38. Саєнко І.М. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Порівняльна характеристика розвитку in vitro половинок мишачих ембріонів, одержаних різними методами бісекції. //”Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії та технологій продуктів тваринництва”. Збірник матеріалів наук.-практ. конференції, Львів: ЛАВМ ім. С.З.Гжицького. -1997. -С.385-387.

39. Мадіч А.В. Саєнко І.М., Шаловило Л.Є. Оцінка розвитку поділених ембріонів корів з використанням культуральної системи in vitro. //“Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворенні сільськогосподарських тварин”. Матеріали міжнародної наук.-вир. конференції; Київ, Асканія-Нова: УААН. -1997. -С.53-54.

40. Мадіч А.В., Шаловило Л.Є. Визначення якості сперми самців норок за інтенсивністю її дихання. //”Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико -селекційних дослідженнях”. Збірник матеріалів 2-ї Міжнародної конференції, Одеса. -Київ: Аграрна наука. -1998. -С.118-119.

41. Мадич А.В., Гамота А.А. Использование кетамина и ксилазина в эмбриогенетических экспериментах на норках и песцах. //”Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”. Збірник матеріалів 4-ої міжнародної наук. - практ. конференції, Київ. -1999. -С.70-74.

42. Madich A., Hevkan I., Chornenky T., Slyvchuk Yu. Effect of Various Hormonal Preparations on proliferation and Functional Activity of Feeder Cells. //“Molecular Mechanisms of Cell Activation: Biological Signals And Their Target Enzymes”. Proc. of 4-th Parnas Conference -Poland: Wroclaw. - September, 2002. -P.65.

43. Мадіч А.В., Гевкан І.І.. Чорненький Т.Я., Сливчук Ю.І. Вплив фолікотропіна, естрадіола та преднізолона на проліферативний ріст та функціональну активність фідерних клітин. //Мат. міжн. конф. присвяч. пам`яті проф. Шостаковської І.В. -Львів. -2002. -С.102.

Размещено на Allbest.ru