Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет»

Кафедра паразитологии и ветсанэкспертизы

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТА ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

«Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных»

СТАВРОПОЛЬ - 2008



Для успешной практической диагностической работы при гельминтозах животных выпускник факультета ветеринарной медицины, т. е. ветеринарный врач обязан:

1. Знать:

а) Морфологию возбудителей гельминтозов животных во всех его развития (имаго, яйцо, личинка).

б) Существующие методы лабораторной и клинической диагностики гельминтозов. гельминтоз животное диагностика

в) Инструкции и наставления при гельминтозах животных.

2. Уметь:

а) Выполнять методы лабораторной диагностики при гельминтозах.

б) Учитывать результаты исследований.

3. Приобрести навыки:

а) Подготовки оборудования, инструментария и необходимых реактивов для гельминтоскопии, овоскопии, лярвоскопии.

б) Проведение гельминтоскопии, овоскопии, лярвоскопии.

в) Анализа результатов лабораторных исследований и принятие решения по результатам исследования.

Цель может быть достигнута:

1. Если знать, что паразитические черви (гельминты, глисты) по своей морфологии бывают или плоскими (тип Plathelmintes), или круглыми (тип Nemathelmintes), или скребнями (тип Acantocephales).

Тип плоских гельминтов является гермафродитами, а тип круглых и скребней - раздельнополыми.

При этом надо помнить, что тип плоских гельминтов разделен в свою очередь на класс трематод (сосальщики) - Trematoda и класс цестод (ленточные) - Cestoda, тело которых состоит из отдельных члеников.

2. Известно, что большинство гельминтов паразитирует в имагинальной (половозрелой) стадии в желудочно-кишечном тракте строго специфичных для них животных. Однако они могут паразитировать и в паренхиматозных органах (печень, легкие, сердце и т. д.) в мышцах, сухожилиях, подкожной клетчатке.

3. Во внешнюю среду преимущественно с испражнениями могут выделяться целые гельминты, фрагменты их тела, яйца или личинки гельминтов. Во внешней среде в яйце в различные сроки образуется личинка, покидающая его или остающаяся в нем, что усложняет лабораторные исследования.

4. Обнаружение некоторых желудочно-кишечных и легочных гельминтов или фрагментов их тела визуальным осмотром, или прямой микроскопией допустимо, но трудоемко. Такой метод не приемлем для овоскопии (обнаружение яиц) и лярвоскопии (обнаружение личинок) гельминтов

5. Существуют методы обогащения (накопления) исследуемого материала, позволяющие облегчить обнаружение яиц, личинок, гельминтов или фрагментов, основанные на флотации (всплывании), на седиментации (осаждении) или термопровакации с седиментацией.

6. При гельминтозах нередко наблюдается субклиническое течение, в связи, с чем их диагностика только по клиническим симптомам не дает надежных результатов. Диагностировать гельминтозы необходимо комплексно, с учетом эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов специальных исследований (лабораторными методами).

ГЕЛМИНТОКОПРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Взятие и доставка материала для исследования.

Пробы фекалий, направляемые в лабораторию для исследования, должны быть свежими, только что выделившимися или взятыми из прямой кишки рукой, одетой в тонкую резиновую перчатку.

У мелких животных (овец, коз, телят, свиней) фекалии берут двумя пальцами - средним и указательным; у лошадей, верблюдов, крупного рогатого скота - всей рукой. Масса пробы в зависимости от величины животного - 5-10г.

У кроликов извлекают несколько шариков фекалий, надавливая на брюшинную стенку ближе к прямой кишки. Если кроликов (и пушных зверей) содержат в отдельных клетках, что свежие фекалии можно взять с пола.

Чтобы получить фекалии от птиц, их отсаживают в отдельные клетки поодиночке или берут фекалии с пола от целой группы.

Пробы от мелких животных, а также телят, жеребят и овец можно брать с помощью резиновой груши, снимая грушу, вводят воздух, затем наконечник груши вынимают. Эта манипуляция вызывает рефлекторный акт дефекации.

Пробы берут от 10% поголовья группы, но не менее 30-50 и не более 300 животных каждой группы. Коров дойного стада обследуют всех, чтобы выявить инвазированных животных и дифференцированно проводить дегельминтизацию. Птиц обследуют не более 5% поголовья.

Пробы фекалий доставляют в стеклянных банках, целлофановых пакетах, в плотной оберточной и пергаментной бумаге с обязательной описью проб в сопроводительном документе (с указанием хозяйства, бригады, фермы, вида животных, на какие гельминтозы исследовать, дату взятия и направления материала).

В теплое время года пробы фекалий нужно доставлять в лабораторию в течение суток. Поздней осенью и зимой они могут храниться до исследований несколько дней при температуре от 3-5є до минус 1-2єС.

Гельминтокопрологические исследования в зависимости от вида возбудителя могут быть направлены на выявление в исследуемых фекалиях яиц гельминтов (гельминтоовоскопия), личинок (гельминтолярвоскопия), самих гельминтов или их фрагментов (гельминтоскопия).

ГЕЛЬМИНТОСКОПИЯ - обнаружение гельминтов или их фрагментов.

Наиболее простой метод гельминтоскопии - поверхностный осмотр фекалий, в которых можно обнаружить гельминтов или их фрагменты (например, членики цестод) и поставить групповой диагноз на гельминтоз.

Для уточнения диагноза исследования ведут более тщательно. Из специальных методов гельминтоскопии приемлем метод последовательного промывания: фекалии разбавляют 5-10 кратным объемом воды, взвесь размешивают, отстаивают 5-10 мин., надосадочную жидкость сливают. Затем к осадку вновь добавляют воду, перемешивают, отстаивают и сливают. Так поступают до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной.

Небольшие порции осадка помещают в кювету или бактериологическую чашку, располагают их на черной или белой бумаге и рассматривают. При необходимости используют штативную лупу.

ГЕЛЬМИНТОВОСКОПИЯ - обнаружение яиц гельминтов.

Для лабораторных исследований чаще применяют биологический микроскоп (МБИ) разных систем и выпусков. Препараты целесообразно исследовать с опущенным конденсором. Уровень конденсора и величину диафрагмы регулируют в процессе работы.

Яйца гельминтов (как и личинки) в исследуемом объекте находятся на разных уровнях, поэтому препарат просматривают по вертикали на всех уровнях.

Препарат (предметное стекло со взвесью яиц) начинают исследовать с левого или правого края, зигзагообразно, как при исследовании мазка крови (сверху - вниз - в сторону - к верху - в сторону - вниз и т. д.). Препарат перемешивают на одно поле зрения.

Наиболее объективные результаты исследований достигают при соблюдении следующих параметров:

- масса пробы фекалий при овоскопии равна 3г.

- объем флотационного раствора 50мл.

- время флотации (в зависимости от состава флотационного раствора)

- применение в качестве емкостей для обработки проб стеклянных стаканов.

- использование для фильтрации взвеси металлической сетки или капроновой (чулочной) ткани с величиной ячеек 0, 25 - 0,30мм.

- применение петли для снятия яиц с поверхности взвеси с диаметром кольца 8-10мм.

- исследовать не менее 3х капель с разных мест поверхности взвеси.

Гельминтоовоскопическая методика основана на разнице удельного веса яиц гельминтов и жидкой среды, в которой взвешены исследуемые фекалии. В зависимости от плотностей компонентов используют флотационные или седиментационные методы и их комбинацию.

Методы седиментационные, основаны на осаждении яиц гельминтов. Применяются для диагностики трематодозов, реже других гельминтозов.

Метод последовательного промывания.

1. Из пробы взять пинцетом (стекл. или дерев. палочкой) небольшую порцию фекалий 3г., поместить в стаканчик, влить небольшое количество воды и размешать до образования кашецеообразной массы.

2. Добавить порциями 50мл. воды, постоянно перемешивая.

3. Смесь фильтровать через металлическое ситечко (или слой марли) в другой стаканчик и отстаивать 3-5мин.

4. Слой надосадочной жидкости слить, к осадку добавить такое же количество воды и вновь отстаивать 3-5мин.

5. Такие операции - добавление и слив воды (промывание) после отстаивания - повторить до полного просветления надосадочной жидкости.

6. Последний раз верхний слой сливают или отсасывают спринцовкой, а осадок переносят на предметные стекла или чашку Петри и микроскопируют. Если исследования проводят на предметных стеклах, то просматривают не менее 3-5 стекол, с 3мя каплями осадка на каждом.

Методы флотационные, основаны на всплытии яиц гельминтов. Для выявления яиц гельминтов применяют насыщенные или высокой плотности растворы различных солей или других жидкостей, удельный вес которых выше удельного веса яиц гельминтов и они всплывают на поверхность жидкости.

Метод Ф. Фюллеборна.

1. Из пробы пинцетом (палочкой) взять 5-10г. Фекалий и поместить в ступку.

2. Добавить небольшое количество насыщенного раствора поваренной соли и тщательно перемешать (соотношение пробы фекалий к раствору в разных странах неодинаковое, стандарты не отработаны).

3. Насыщенный раствор готовят: 400г. соли размешивают в 1л. Воды, нагревают до кипения и растворения соли, охладив фильтруют через слой ваты или марли. Применяют раствор холодный.

4. Долить насыщенного раствора поваренной соли до соотношения 1:20 и перемешать

5. Профильтровать жидкость через металлическое ситечко или слой марли.

6. Дать жидкости отстояться 40-60минут.

7. Снять проволочной петлей поверхностную пленку отстоявшейся жидкости, перенести ее на предметное стекло, покрыть покровным стеклом (можно обойтись без него).

8. Исследование проводить под малым увеличением микроскопа.

Метод широко применяется для диагностики нематодозов, реже цестодозов и др. гельминтозов

Метод Г.А. Котельникова и В.М. Хренова.

Отбор порций фекалий из исследуемого материала и технология исполнения этого метода такая же, как и при гельминтоовоскипии по Фюллеборну, но вместо насыщенного раствора поваренной соли используют насыщенный раствор аммиачной селитры (1500г. в литре воды).

Соотношение веса пробы фекалий и раствора 3г. к 50мл. Поверхностную пленку для микроскопии снимают через 15-20мин.

Метод применяется в основном для обнаружения яиц круглых и частично для ленточных червей (цестод).

Комбинированные методы - использование приемов седиментации и флотации.

Метод Дарлинга.

Фекалии (3-5г.) смешивают с водой до получения полужидкой консистенции, процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют смесь равных частей глицерина и насыщенного раствора поваренной соли; содержимое взбалтывают и вновь центрифугируют (при вторичном центрифугировании можно использовать лишь раствор соли без глицерина). Всплывшие яйца собирают проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют.

Метод применяют для диагностики различных нематодозов.

Исследование нативного мазка - заключается в том, что пробы фекалий микроскопируют в естественном состоянии, не подвергая предварительной обработке, как это делается при исследовании седиментационными или флотационными методами.

Метод нативного мазка.

На предметное стекло нанести 2-3 капли воды или смеси равных частей глицерина и воды и небольшой кусочек фекалий, затем пробу растереть палочкой и удалить грубые частицы. Каплю накрывают покровным стеклом и исследуют под малым увеличением микроскопа.

Эффективность данного метода низкая, поэтому для большой точности просматривают 5-10 препаратов от каждой пробы фекалий; на одно предметное стекло можно наносить по 2-3 капли жидкости.

ГЕЛЬМИНТОЛЯРВОСКОПИЯ - обнаружение личинок гельминтов.

Гельминтолярвоскопию применяют для диагностики диктиокаулеза травоядных, протостронгилеза, мюллериоза и цистокаулеза овец, стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных, стронгилоидозов молодняка домашних животных.

Метод Бермана и Орлова.

1. Пробу фекалий (15-20г.) кладут на металлическое сито или заворачивают в марлю (8х8см.) и помещают в воронку, соединенную резиновой трубкой (длиной 10см.) с пробиркой.

2. Воронку заполняют теплой водой (35-40є) выше уровня пробы фекалий.

3. Аппарат, заполненный фекалиями и водой, оставляют при комнатной температуре на 2-3 часа (можно материал заложить в конце рабочего дня и оставить до утра следующего дня). За это время личинки нематод выходят из фекалий и опускаются на дно пробирки.

4. Пробирки разъединяют от резиновой трубки, предварительно пережав ее зажимом.

5. Осторожно сливают жидкость из пробирки до осадка, не встряхивая последнего; воду из пробирки можно отсасывать пипеткой.

6. Осадок переносят на предметное стекло или сливают в чашку Петри и микроскопируют.

Метод И.А. Щербовича.

1. Пробу фекалий (6-10г.) кладут на кусочек марли (8х8см.), углы которого соединяют вместе и скалывают проволокой (скрепкой).

2. Пробу в подвешенном состоянии (на проволоке) погружают в стакан, наполненный теплой водой (35-40є); пробу можно также расположить между стенкой стакана и наклонно стоящим предметным стеклом.

3. Фекалии овец и лошадей выдерживают 1-4 часа, а фекалии крупного рогатого скота 12-16 часов.

4. Пробу фекалий извлекают пинцетом, жидкость осторожно сливают, а оставшееся небольшое количество ее переносят на предметное стекло (чашку Петри) и микроскопируют.

Метод Вайда.

1. На предметное стекло (или часовое) стекло кладут 3-5 шариков свежевыделенных фекалий от коз, овец.

2. Увлажняют водой (несколько капель), подогретой водой до 35-40є.

3. Через 20-40 мин. Фекалии удаляют.

4. Оставшуюся на стекле жидкость микроскопируют.

Метод прост по выполнению, может использоваться непосредственно на ферме или в пастбищных условиях, но выявляет лишь до 70% инвазированных животных при интенсивной инвазии.

После гельминтолярвоскопического исследования фекалий дополнительно можно исследовать по любому гельминтоовоскопическому методу. Например, если фекалии одного животного следует проверить на диктиокаулез, потом на мониезиоз по Фюллеборну и, наконец, полученный осадок, методом последовательных промываний или пробой со дня исследовать на фасциолез.

К настоящему времени предложено много методов овоскопии и лярвоскопии. Здесь приведены только качественные методы исследований и лишь те, которые просты по выполнению и наиболее приемлемы в лабораторной практике. Все методики количественных исследований как седиментационные, так и флотационные не дают объективного представления об интенсивности инвазии. И это потому, что выделение яиц и личинок зависит от многих факторов: сезона года, возраста, общего состояния животных, характера корма, времени суток и т.д. Количественные методы применяются преимущественно в научно - экспериментальных работах и реже на практике для контроля над снижением инвазии при дегельминтизациях животных.

Культивирование личинок проводят с целью дифференциальной диагностики гельминтов, подотряда, паразитирующих в пищеварительном тракте животных. Выделяющиеся с фекалиями яйца этих нематод трудно различимы. Поэтому методами овоскопии можно поставить лишь общий диагноз. Инвазионные личинки различаются по величине, по форме и числу кишечных клеток, по форме и величине хвостового конца.

Культивирование личинок стронгилят:

1. Пробы фекалий (10г.) кладут в стакан или чашку Петри, слегка увлажняют, закрывают крышкой и ставят в термостат при температуре 25-30є на 7-10 дней.

2. Стаканы и чашки Петри ежедневно открывают для аэрации и при необходимости слегка увлажняют.

3. После культивирования фекалии исследуют лярвоскопически.

Культивирование личинок стронгилоидесов (по Т.И. Поповой)

Пробы фекалий кладут в стаканы на 1-2 дня и оставляют при комнатной температуре . Вышедшие из яиц личинки выползают из стенки стаканов и образуют инееподобные (серовато - белые) скопления, хорошо видимые невооруженным глазом.

При более высокой температуре (25-30є) развитие личинок и образование видимых колоний происходит быстрее, через 12-20 часов.

Выполняя задание по решению производственной ситуации студент должен выбрать нужный метод лабораторной диагностики. При этом следует руководствоваться:

1.А. Вариант первый, при отсутствии сформулированной конкретной задачи необходимо одновременно исследовать пробу фекалий:

А) Гельминтоскопией методом последовательного промывания (сидементация).

Б) Лярвоскопией (термопровокация с седиментацией).

В) Овоскопией одновременно как флотационно (всплывание), а также одновременоо последовательным промыванием (седиментация).

1.Б. Вариант второй, когда известна цель на какие гельминтозы (трематодозы, цестодозы, нематодозы) необходимо провести исследование, применяют:

1.1. при трематодозах гельминтоскопию методом последовательного промывания фекалий.

1.2. при трематодозах овоскопию только методом последовательного промывания фекалий.

2.1. при цестодозах гельминтоскопию методом последовательного промывания фекалий.

2.2. возможен при цестодозах, но недостоверен любой флотационный метод овоскопии.

3.1. при нематодозах одновременно применяют для овоскопии любой флотационный метод.

3.2. при нематодозах одновременно применяют лярвоскопию.

2. После выбора цели и формулирования задачи копрологи выбирают приемлемые методы (метод) и приступают к работе в строгом соответствии с методикой выполнения. Если исследования на трематоды, то из варианта 1Б используют 1.1. и 1.2, а если цестоды то 2.1., 2.2., для нематодозов используют 3.1, 3.2.

3. После обнаружения любым методом гельминта, его фрагментов, яиц или личинок приступают к определению родовой принадлежности путем сопоставления (сравнения) на основе морфологических признаков их внешнего и внутреннего строения. Для этих целей используют описательные определительные таблицы, или рисунки яиц, личинок гельминтов для данного вида животных.

4. Определив родовую принадлежность гельминта (фрагмента), яйца, личинки необходимо подсчитать их количество в поле зрения.

5. Сделать в журнале запись результатов исследований и принять решение о лечебно - профилактических мероприятиях.

Таблица записи результатов лабораторных копрологических исследований

Дата исследования материала_________________________________________

Район____________________хозяйство_________________________________

Вид животного____________________возраст___________________________

Дата поступления материала__________________________________________

№ пробы (кличка животного)	Метод исследования	Что обнаружено	Количество в поле зрения	Заключения, рекомендации

Кто проводил исследования________

Консультант_____________________

Оценка работы___________________

Контрольные вопросы

1. Дайте характеристику морфологии гельминта на основании обнаруженных: яиц, личинок, гельминтов или их фрагментов.

2. Чем отличается внутреннее строение, форма, наружная оболочка яиц трематод от цестод? Основные отличительные признаки яиц трематод и цестод.

3. По каким признакам отличаются яйца нематод от яиц трематод?

4. Какие методы применяются для лабораторной диагностики цестодозов плотоядных, их дифференциальная достоверность?

5. При каких гельминтозах проводят лярвоскопию фекалий овец?

6. В каком случае при овоскопии или лярвоскопии говорят о заболеваниях животных, а в каких носительстве?

7. Почему и при каких гельминтозах исследования необходимо проводить только со свежими испражнениями животных?

8. Как приготовить насыщенный раствор поваренной соли и кто из авторов предложил его применение для диагностики гельминтозов?

9. Какое оборудование необходимо для исследования фекалий по Вайду, по Берману - Орлову?

10. Как снять и при помощи чего поверхностную пленку жидкости из стакана при исследовании фекалий?

11. Через какой интервал времени приступают к лярвоскопии исследуемых фекалий?

12. Для каких целей проводят копрологическое исследование?

13. Опишите метод Фюллеборна.

14. Опишите метод Щербовича.



Рекомендуемая литература

1. Паразитология и инвазионные болезни с/х. животных (любого года издания для ВУЗов).

2. Лабораторный практикум по паразитологии (любого года издания для ВУЗов).

Размещено на Allbest.ru