Нетрадиційні методи створення селекційного матеріалу пшениці

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут землеробства

української академії аграрних наук

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора сільськогосподарських наук

Нетрадиційні методи створення селекційного матеріалу пшениці

Гірко Володимир Сергійович

Київ -1999

Анотація

Гiрко В.С. Нетрадицiйнi методи створення селекцiйного матерiалу пшеницi.- Рукопис.

Дисертацiя на здобуття наукового ступеня доктора сiльськогосподарських наук за спецiальнiстю 06.01.05 селекцiя та насiнництво. - Iнститут землеробства УААН, Київ, 1999.

Вiдпрацьованi технологiї i лабораторнi регламенти синтезу iнтрогресивних форм злакiв, хiмiчного та фiзичного мутагенезу in vitro, добору та оцiнки генотипiв пшеницi в системах in vitro на стiйкiсть до лiмiтуючих абiотичних та бiотичних факторiв зовнiшнього середовища.

Дослiдженi спектри рекомбiнантної та мутацiйної мiнливостi, визначенi тенденцiї, спрямованiсть та вектори стратегії добору селекцiйного матерiалу в репродуктивних поколiннях.

Видiлено обширний селекцiйний матерiал, створено один сорт озимої, сорт ярової пшеницi, п'ять сортiв тритiкале, три сорго-суданковi синтетичнi популяцiї. Дев'ять з них включенi в Нацiональнi Реєстри сортiв України та Росiї.

Ключовi слова: пшениця, незрiлi зародки, молодi суцвiття, калуснi культури, регенерацiя, iнтрогресiя, мутагенез, клiтинна селекцiя, бiотичнi та абiотичнi фактори.

Аннотация

пшениця гібридизація ембрiодогенез постембрiональний

Гирко В.С. Нетрадиционные методы создания селекционного материала пшеницы.- Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук по специальности 06.01.05 - селекция и семеноводство. - Институт земледелия УААН, Киев 1999.

В рамках интрогрессивной селекции отрабатывались методы преодоления нескрещиваемости и проэмбриональных барьеров несовместимости у пшеницы путем подбора родительских компонентов, выявления генотипов с хорошей скрещиваемостью, а также за счет использования эффектов kr-генов, оказывающих влияние на рост пыльцевых трубок, и ph-генов, контролирующих спаривание хромосом.

Изучена сравнительная эффективность сохранения и клонального размножения отдаленных гибридов от скрещивания пшеницы (Triticum aestivum L.) c таксономически отдаленными видами с использованием эмбриокультуры (выход растений до 100 %), а также через соматический эмбриогенез в культуре незрелых зародышей и молодых соцветий (до 50-70 растений на эксплант).

Исследована генетическая обусловленность морфогенных реакций в культуре in vitro, их зависимость от стадии развития экспланта и компонентов питательной среды.

Выявлены оптимальные и пороговые концентрационные, экспозиционные интервалы, а также дозовые нагрузки при определении условий предобработок, питательных и селективных сред.

Теоретически обоснована и экспериментально доказана возможность существенного расширения спектра, а также повышения частоты генетически доступной изменчивости при индукции ее в системах in vitro физическими и химическими мутагенами (9-14 % для химических, 6-10 % для физических мутагенов).

Доказано наличие, определен размах и установлены значения (2,5-5,2 %) сомаклональной изменчивости у мягкой пшеницы, очерчены перспективы использования ее в селекционногенетических программах.

В условиях моделирования стрессов in vitro и in vivo исследованы особенности реакции тканей и клеток пшеницы на действие селективных факторов биотической и абиотической природы, показана специфика ответа конкретных сортиментов. Установлены и оптимизированы дифференцирующие режимы скрининга генотипов пшеницы по абиотическим факторам для каллусов: 20 г/л NaCl, 60 г/л маннитола и -12оС; в суспензионной культуре клеток 0,1-0,4 М NaCl, 10-20 % ПЭГ-6000 и 1-2 мМ Al-ЭДТА, а также 10-50 % культуральных фильтратов токсических метаболитов вредных фитопатогенов на протяжении 4-х недель.

Экспериментально доказана возможность получения клеточных линий пшеницы, устойчивых к низким температурам, осмотическому и ионному стрессам, а также токсинам фитопатгенов, которые сохраняют эти качества в ряду репродуктивных поколений.

Ключевые слова: пшеница, незрелые зародыши, молодые соцветия, каллусные культуры, регенерация, интрогрессия, мутагенез, клеточная селекция, биотические и абиотические факторы.

Abstract

Girko V.S. Non-traditional methods of making wheat breeding material. Manuscript.

Dissertation for the degree of Doctor of Sciences in Agriculture (D Sc Agr) in the speciality 06.01.05 - according to breeding and seed production. - Institute of Agriculture of the UAAS (Ukrainian Academy of Agrarian Sciences), Kyiv, 1999.

Technologies and laboratory regulations of synthesis of introgressive cereal forms, in vitro chemical and physical mutagenesis, selection and estimation of wheat genotypes in the systems in vitro for resistance to limiting abiotic and biotic factors of environment were mastered by practice.

Ranges of recombinant and mutation variability were investigated; tendencies, trends and

vectors of selection of breeding material in reproductive generations were defined.

Vast breeding material was singled out, one winter wheat variety, one spring wheat variety, five triticale varieties were developed and three sorghum-Sudan grass synthetic populations were created. Nine of them are included in National Registers of Ukraine's and Russia's varieties.

Key words: wheat, immature embryos, young inflorescences, callus cultures, regeneration, introgression, mutagenesis, cell selection, biotic and abiotic factors.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальнiсть теми. Протягом останньої половини нашого сторiччя в умовах рiзкого збiльшення народонаселення врожайнiсть сiльськогосподарських культур на планетi виросла бiльше, нiж в 2,5 рази. Причому майже половина приросту одержано за рахунок селекцiї, яка на рубежi сторiч зробила перехiд від професійного мистецтва до професiйної технологiї. Проте подальший рiст та стабiлiзацiя продуктивностi сiльськогосподарських рослин при використаннi тiльки традицiйних селекцiйних технологiй малоймовiрнi. Якiсно змiнити ситуацiю можуть успiхи в галузi клiтинної бiологiї та молекулярної генетики, якi тепер набувають обрисiв наук, що приносять практичну користь. З появою нової штучно створеної моделi -- систем in vitro вищих рослин-- з'явилася можливість, манiпулювати клiтинами, тканинами та органами рослин поза органiзмом на штучних поживних середовищах, та виникли передумови для розробки принципово нових селекцiйних технологiй створення нових сортiв i навiть видiв рослин.

Крiм перспективи збiльшення загальної бiомаси та врожаю, вiдкриваються великi можливостi поєднати в одному генотипi тi ознаки, котрi важко комбiнуються, досягти якiсних змiн, створити широку генетичну рiзноманiтнiсть, вiдібрати та стабiлiзувати цiннi генотипи нетрадицiйними методами селекцiї.

На початкових ланках селекцiйного технологiчного ланцюга у блоцi методiв, що пов'язанi з управлiнням мiнливiстю, стає можливим манiпулювати цiлими наборами хромосомних детермінант, з'являється широке поле дiяльностi при подоланнi таксономiчних бар'єрiв несумiсностi, простiр для розвитку принципiв мiкрохiрургiї, що дозволяє зберiгати, клонально розмножувати унiкальнi генотипи нестатевим шляхом. Це суттєво розширює можливостi нерекомбiнантних пiдходiв в селекцiї, зокрема мутагенезу та сомаклональної мiнливостi.

Важливий етап селекцiйного процесу -- штучний добiр -- в межах клiтинних технологiй зводиться до процесу зростаючого домiнування в штучно створених селективних умовах in vitro клiтин певного типу, що започатковують форми з господарськи цiнними ознаками. При цьому з'являється можливiсть оцiнювати мiльйони генотипiв та вiдбирати з них стiйкi до комплексу бiотичних та абiотичних лiмiтуючих факторiв зовнiшнього середовища.

Інтенсифікація досліджень по розробці нових прийомів та методів створення вихідного матеріалу виявилася актуальною для зернових культур, і особливо для пшениці -- досить складного та мало відпрацьованого в плані культуральних процедур біологічного об'єкта, що і зумовило розгортання та реалізацію цієї дослідницької програми.

При цьому не стоїть питання про альтернативну замiну чи витiснення традицiйних пiдходiв, а мова може йти лише про гармонiйну iнтеграцiю зусиль, науковий та технологiчний вплив нетрадицiйних пiдходiв на розвиток селекцiйної науки.

Мета та завдання дослiджень. Мета роботи полягає у розробці і вдосконалені нетрадиційних методів створення вихідного селекційного матеріалу пшениці та інших злакових культур. Відповідно до цього програмою досліджень передбачалося вирішити такі завдання:

- подолання проембрiональних бар'єрiв несумiсностi шляхом видiлення генотипiв з високою схрещуванiстю та використання ефекту генiв kr та ph;

- подолання постембрiональних бар'єрiв несумiсностi за допомогою культури iзольованих абортивних зародкiв in vitro;

- збереження та клональне розмноження продуктiв вiддаленої гiбридизацiї в раннiх репродуктивних поколiннях з використанням соматичного ембрiодогенезу через культуру незрiлих зародкiв i молодих суцвiть;

- досягнення карiотипiчної стабiлiзацiї та подолання стерильностi вiддалених гiбридiв з використанням беккросiв і амфiдиплоїдiї;

- оптимiзацiя умов поєднання культури тканин з хiмiчним та фiзичним мутагенезом;

- вивчення бiологiчної активностi рiзних типiв мутагенiв в системах in vitro, їх вплив на процеси калусогенезу i регенерацiї;

- визначення порогових концентрацiйних та експозицiйних iнтервалiв i дозових навантажень мутагенiв на рiзнi рослиннi експланти;

- дослiдження експресiї мутантних змiн в репродуктивних поколiннях, визначення частоти та спектру мутацiй на рiзних генетичних фонах;

- з'ясування процесiв регулювання сомаклональної мiнливостi пшеницi, вивчення можливостей використання iндукованого in vitro розмаїття в селекцiйному процесi;

- вiдпрацювання технiки та визначення критерiїв оцiнки та добору стiйких до низької температури, засолення та посухи, а також до токсинiв фiтопатогенiв (Septoria tritici, Fusarium graminearum, Pseudocercosporella herpotrichoides) генотипiв пшеницi в умовах культури клiтин i тканин in vitro.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослiдження реалiзованi у вiдповiдностi з тематичними планами Миронiвського iнституту пшеницi iм. В.М. Ремесла в рамках державних комплексних науково-технiчних програм: 1996-2000рр. НТП «Зерновi i олiйнi культури» (0195U002178, 197U019469-71); НТП «Теоретичнi основи селекцiї i насiнництва сiльськогосподарських культур» (0197U019541, 197U019450, 0197U019461); 1991-1995гг. НТП «Продовольство-95» (UA01009637P, UA01009547P, UA01009565P); НТП «Фундаментальнi дослiдження» (UA01009537P, UA01009572P, UA01009576-73P); ДКНТП «Бiологiя», напрям 5; ДКНТП "Наука про Землю, Всесвiт i проблеми довкiлля», напрям 6 та iн.

Наукова новизна дослiджень. Розроблено комплекс прийомiв i методiв, які дозволяють в умовах in vitro iндукувати розширений спектр рекомбiнантної та мутацiйної мiнливостi у пшеницi, а також з високим ступенем надiйностi оцiнювати та добирати генотипи, резистентнi до стресових бiотичних та абiотичних чинникiв середовища. Проведено схрещування сортименту м'якої пшеницi зi значним набором диких, ендемiчних та культурних видiв злакiв, показана роль мутанта ph та залежнiсть сумiсностi вiд конкретного поєднання генотипiв тих чи iнших геномiв схрещуваних видiв через контроль мікромпорогенезу та озерненності гібридів, визначена направленiсть та iнтенсивнiсть процесiв цитокарiотипiчної стабiлiзацiї продуктiв мiжвидової та мiжродової гiбридизацiї при їх збереженнi та розмноженнi.

Встановлена ефективність методів подолання постембріональних бар'єрiв несумiсностi при використаннi ембрiокультури, культури незрiлих зародкiв i молодих суцвiть.

Визначена роль умов культивування генотипiв схрещуваних форм, основних компонентiв поживного середовища, експлантiв та стадiї їх iнiцiювання на процеси калусогенезу i регенерацiї у вiддалених гiбридiв.

В межах пiдтриби Triticinae Holmb. суттєво розширена та накопичена генетична різноманітність в вигляді форм з комплексом гомподарсько цінних ознак, видiлено новi iнтрогресивнi лiнiї м'якої пшеницi, в тому числi вперше створена серiя пшенично-ячмiнних i трiтiкале-ячмiнних гiбридiв, а також пшенично-житнiх комерцiйних амфiдиплоїдiв з принципово новою архiтектонiкою, високим потенцiалом продуктивностi та стiйкостi до стресових факторiв середовища.

Вивчена чутливість рослинних експлантiв до iнактивуючої дiї мутагенних чинникiв рiзної природи, виявлені загальнi i специфiчнi особливостi бiологiчної активностi мутагенiв в залежності від дози, типу та стадії розвитку експлантів.

Теоретично обгрунтована та експериментально доведена можливiсть суттєвого розширення спектру i пiдвищення частоти генетичної мiнливостi за рахунок iндукування її в системах in vitro фiзичними i хiмiчними мутагенами більш, ніж за 25 ознаками.

Виявленi оптимальнi i пороговi концентрацiйнi, експозицiйнi та дозовi навантаження при дiї мутагенних факторiв на рiзнi експланти i генотипи, дослiджена експресiя мутантних змiн в репродуктивних поколiннях, визначений вектор добору при видiленнi варiантних лiнiй.

Встановлено розмах сомаклональної мiнливостi у м'якої пшеницi, визначенi перспективи використання її в селекцiйно-генетичних програмах по створенню вихідного матеріалу та нових сортів злакових культур.

В умовах моделювання стресiв in vitro та in vivo виявлені особливостi реакцiї тканин i клiтин пшеницi на дiю селективних агентiв бiотичної та абiотичної природи, визначена специфiка реакції конкретних сортиментiв, встановленi та оптимiзованi диференцiюючi умови скринiнгу генотипiв пшеницi, розширенi загальнi уявлення про клiтиннi механiзми стiйкостi рослинних органiзмiв до стресових факторiв середовища.На цій основі експериментально доведена можливiсть одержання клiтинних лiнiй пшеницi, стiйких до низьких температур, осмотичного та iонного стресiв, токсинiв грибних фiтопатогенiв, якi зберiгають цi якостi в рядi репродуктивних поколiнь.

Методами клiтинної селекцiї в умовах жорсткого скринiнгу до комплексу абiотичних факторiв середовища виділені нові лінії пшениці з господарсько цінними ознаками, а також вперше створено та передано на держсортовипробування сорт озимої пшеницi Троян, який, характеризуючись високою морозостійкістю та посухостійкістю, забезпечує стабільний рівень продуктивності в умовах різких кліматичних перепадів, що мають місце на Україні в останні роки.

Практичне значення отриманих результатiв. За пiдсумками проведених дослiдних робiт створенi передумови для реального прискорення та пiдвищення ефективностi селекцiйного процесу по пшеницi в системах in vitro, в тому числі в стресових умовах по бiотичних i абiотичних факторах середовища, якi оформленi в виглядi методичних рекомендацiй.

Накопичено широкий дiапазон рекомбiнантної, мутацiйної та сомаклональної мiнливостi; збереженi, пiдтримуються та швидко розмноженi унiкальнi генотипи -- носії господарсько-цінних ознак, деякi з них занесено до генофонду Центру генетичних ресурсiв України.

Створенi та успiшно проходять державне сортовипробовування в Українi, країнах СНД, Центральної та Захiдної Європи вiсiм сортiв озимого трiтiкале, один сорт озимої та один сорт ярої пшеницi, три сорго-суданковi синтетичнi популяцiї, які крім високої та стабільної продуктивності, формують інтенсивний агроценоз та щільний стеблестій, не потребують (крім пшениці) обробок гербіцидами, повністю пригнічуючи розвиток бур'янів, витримують низький рівень родючості грунту, ефективно використовуючи мінімальні дози мінерального живлення, практично не вражаючись шкідливими фітопатогенами, майже не потребують захисту фунгіцидами -- і тому забезпечують високу рентабельність при вирощуванні та екологічну чистоту при переробці. Дев'ять iз них уже занесенi в Нацiональнi Реєстри сортiв рекомендованих для вирощування в рiзних екологiчних зонах України та Росiї.

Встановлені закономірності та оціночні критерії культурабельності експлантів, біологічної та генетичної активності в системах in vitro мутагенів різної природи, а також ефективності доборів в умовах скрінінгу in vitro за біотичними та абіотичними факторами, можуть бути використані широким колом біологів-експериментаторів, а також застосовуватись в практичній селекції. Окремi положення дисертацiйної роботи ввiйшли в програми курсу селекцiї i генетики Бiлоцеркiвського державного аграрного унiверситету.

Особистий внесок здобувача. Ця дослiдницька програма iнiцiйована, спланована та реалiзована здобувачем, а пiдготовлена до захисту дисертацiйна робота є результатом дослiджень бiльш нiж 20-рiчного перiоду. Доля участi автора у внесених до Реєстру сортів рослин становить 30-55 %.

Апробацiя результатiв дисертацiї. Основнi положення та результати дослiджень по темi дисертацiйної роботи обговорювалися на засiданнях вченої ради Миронiвського iнституту пшеницi iм.В.М. Ремесла (Миронiвка 1993-1998 рр.), Всесоюзних координацiйних нарадах та семiнарах: по селекцiї озимої пшеницi (Миронiвка-Алма-Ата-Краснодар-Одеса, 1983-1991рр.), по сiльськогосподарськiй бiотехнологiї (Москва, 1987-1990 рр.); З'їздах Всесоюзної та Республiканської спiлки генетикiв i селекцiонерiв (Ленiнград, 1987; Кишинiв, 1982; Полтава, 1992); Мiжнародних конференцiях, симпозiумах та конгресах: по клiтиннiй бiологiї i бiотехнологiї (Ленiнград, 1988; Новосибiрськ, 1988; Алма-Ата, 1988; Цiлиноград, 1991; Москва, 1997; Київ, 1997, 1998; Одеса, 1998; Єрусалим, 1998); по генетицi (Київ, 1989); по нетрадицiйному рослинництву (Алушта, 1997, 1998) та iн.

Публiкацiї. По матерiалах дисертацiї опублiковано 142 друкованi роботи. Iз них: монографiя -- 1, методичнi рекомендацiї -- 15, статтi в наукових журналах та збiрниках -- 49, тези конференцiй, з'їздiв, конгресiв -- 68, авторських свiдоцтв -- 9.

Об'єм i структура роботи. Дисертацiя викладена на 305 сторiнках машинописного тексту, складається зi вступу, 5 роздiлiв, висновкiв, практичних рекомендацiй, списку використаних джерел та додатку. Робота мiстить 33 таблицi та 68 комбiнованих рисункiв. Бiблiограбiчний список включає 388 лiтературних джерел, iз них 194 iноземними мовами.

В рамках iнтрогресивної селекцiї як партнери для схрещування з м'якою пшеницею Triticum aestivum (AuBD) використовували зразки T. monococcum L. (Ab), T. dicoccum (Schrank) Schuebc. (AuB), T. ispahanicum Heslot (AuB), T. turgidum L. (AuBl), T. durum Desf (AuB), T. polonicum L. (AuB), T. timopheevii (Zhuk) Zhuk. (AbG), Aegilops tauschii Coss. (Deu), Ae. cylindrica Host (SD), Ae. triuncialis L. (CCu), Ae. biuncialis Vis. (CuUb), Ae. triaristata Willd (CuUt), Ae. columnaris Zhuk (CuUe), Ae. ovata L. (UM), Ae. recta (Zhuk) Chennat (UMUn), Triticale (ABR), Secale cereale L. (R), Hordeum vulgare L.(H).

При пiдборi модельних сортиментiв м'якої озимої пшеницi в дослiдах по експериментальному мутагенезу виходили з контрастностi використаних сортiв по комплексу господарсько цiнних ознак та їх еколого-географiчного походження, в експериментах по клiтиннiй селекцiї керувалися вiдмiнностями (високий, середнiй, низький) в рiвнях стiйкостi до відповідних лiмiтуючих абiотичних та бiотичних факторiв зовнiшнього середовища.

Дорощування абортивних зародкiв та iнiцiацiя калусогенезу, ембрiоiдогенезу та регенерацiї в культурi незрiлих зародкiв та молодих суцвiть в системах in vitro проводилися на поживних середовищах: MS (Murashige, Scoog 1962), B5 (Gamborg, 1968) з модифiкацiями (Sears, 1982; Staba, 1962; Kao 1975) та iн. по методиках Прилюк (1986), Лукьянюк, Iгнатової (1980), Гiрко та iн (1996).

Для iнiцiацiї суспензiйної культури використовувалися калуси, фрагменти асептично вирощених проросткiв, незрiлi та зрiлi зародки, молодi суцвiття пшеницi (Гiрко, Волощук 1990). При цьому використовувалися поживнi середовища: MS (Murashige, Skoog 1962), SD (Sears, Deckard, 1982) а також B5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), Т (Dudits e.a.,1975), Masuda (Masuda e.a., 1981), SH (Schenck, Hilderbrandt, 1972).

В умовах in vitro використовувались хiмiчнi мутагени: 1.4-бiс-дiазоацетилбутан (ДАБ), N-нiтрозоетилсечовина (НЕС) в дiапазонi концентрацiй 0,01-0,05-0,1%, а також фiзичнi мутагени: гама- (5, 10, 15 Гр) та лазернi випромiнювання 632,8 нм (5 та 10 хв) i 337,1 нм (10 хв), магнiтне (500, 1000, 1500 Е) та електричне (2, 4, 6, 8 кВ) поле, надвисокочастотнi хвилi.

Селективну оцiнку та добiр генотипiв in vitro на рiвнi недиференцiйованих i регенеруючих калусiв, а також в суспензiйнiй культурi клiтин проводили на фонi низьких температур (8-16 оС), пiдвищеного вмiсту NaCl, полiетиленглiколю (ПЕГ-6000), манiтолу та Al3+-ЕДТА. Селекцiю по стiйкостi до бiотичних факторiв проводили на фонi культуральних фiльтратiв моноспорових культур патогенiв Pseudocercosporella herpotrichoides, Septoria tritici, Fusarium graminearum.

Моносомний аналiз та визначення плоїдностi проводилося згідно з методикою Кембрiджського унiверситету (Wanige, 1965).

Польовi дослiдження проводили в рамках традицiйної селекцiйної схеми. Напрацювання iнокулюму, створення штучних iнфекцiйних фонiв та облiк iнтенсивностi ураження рослин основними грибними фiтопатогенами проводили за загальноприйнятими методиками (Бабаянц та iн., 1988; Пижикова та iн., 1989; Новожилов та iн., 1988; Григорьев та iн., 1976). Оцiнку морозостiйкостi селекцiйного матерiалу проводили шляхом пiдрахунку рослин, що перезимували в польових умовах, та облiку в процесi проморозки рослин в посiвних ящиках (Кириченко, 1969; Юр'єв, 1958), в рулонах (Дубовий та iн., 1998) та проморозки проросткiв (Самигiн, 1967). Культивування рослин в штучному клiматi проводилося з використанням методик Шалiна та iн. (1985), Животкова, Дубового та iн. (1989). Фенологiчнi спостереження та бiометричнi вимiри елементiв структури врожаю та iнших господарсько корисних ознак проводили з врахуванням вимог УПОВ.

Аналiз експериментальних даних проводився з використанням методiв математико-статистичного аналiзу (Рокицький, 1974; Доспехов, 1985; Урбах, 1963; Литтл, Хиллз, 1981) на ПК Pentium 166 при використаннi аналiтичних програм "StatGraphics», "Statistica 5.0», SPSS та iн.

Новiтнi роботи по синтезу нових вiддалених гiбридiв дають можливiсть суттєво розширити межi генетичної мiнливостi, пiдвищити ефективнiсть селекцiї за низкою лiмiтуючих ознак i при постiйному покращеннi ще довго будуть займати провiдне мiсце в наукових стратегiях, спрямованих на вдосконалення рослин. Але, не зважаючи на потенцiйну можливiсть геномiв, хромосом та iндивiдуальних послiдовностей ДНК до дрейфу мiж видами в процесi еволюцiї, геном пшеницi, завдяки еволюцiї є досить збалансована система, захищена кiлькома рiвнями блокування iнтродукцiї чужерiдної спадковостi.

Причому в єдиному ланцюзi закономiрних, послiдовних та взаємопов'язаних перетворень гамет, зародка та тканин гiнецея, найбiльш значущі, в планi прояву несумiсностi, етапи росту пилкових трубок та формування насiння. Саме на подолання цих критичних перiодiв були спрямованi нашi зусилля в процесi пiдвищення ефективностi iнтрогресивної селекцiї.

Несхрещуванiсть, проембрiональнi бар'єри несумiсностi у пшеницi долалась шляхом пiдбору батькiвських компонентів, виявленням генотипiв з високою схрещуванiстю, а також за рахунок використання ефектiв kr-генiв, які впливають на рiст пилкових трубок та ph-генiв, що контролюють спарювання хромосом. Технологiї вирощування iзольованих незрiлих зародкiв на штучних поживних середовищах запобiгали загибелi нежиттєздатних гiбридних зародкiв на постембрiональних етапах розвитку. Мiкроклональне розмноження при використаннi культури незрiлих зародкiв i культури молодих суцвiть дало змогу рiзко збiльшити кiлькiсть рослин в раннiх репродуктивних поколiннях та забезпечити пiдтримку їх життєздатностi. Подолання стерильностi та карiотипова стабiлiзацiя вiддалених гiбридiв забезпечувалася шляхом використання беккросiв та регулювання рiвня плоїдностi.

Дослiдження Скуригiної (1988), Будашкiної (1977), Дорофєєва (1976), Наскiдашвiлi (1984), Шнайдер (1984) та нашi експерименти констатують значну мiнливiсть як мiж видами, так i в межах виду за рiвнями сумiсностi та свiдчать про те, що успiх схрещування м'якої пшеницi з iншими видами та родами визначається не лише геномною структурою останнiх, але i в значнiй мiрi генотиповими особливостями сортiв м'якої пшеницi та умовами вирощування донорних рослин. Так середнiй рiвень схрещуваностi з сортиментом м'якої пшеницi за багаторiчними даними в наших експериментах для Triticum militinae складає 9,9% при розмаху варiювання показника по окремих комбiнацiях 3,6-22%. Для T. timopheevii цей показник становив 27,8% при значному коливаннi по роках (19,3-40,4%) та комбiнацiях (4,4-44,8%).

Рiвень схрещуваностi T. monococcum з м'якою пшеницею складав 21,1% при незначних коливаннях по роках, в той час, як для окремих комбiнацiй дiапазон схрещуваностi з м'якою пшеницею складав вiд 0,7 до 46,5%. Для широкого сортименту видiв Aegilops виявлено стабiльний по роках рiвень схрещуваностi з м'якою пшеницею (44,0-50,8%) при значнiй середнiй величинi цього показника (46,3%).

Озерненiсть при використаннi за материнський компонент ендемiчних форм в умовах штучного клiмату, як правило, була суттєво нижчою, нiж у польових умовах.

Як свiдчать реципрокнi вiдмiнностi по рiвню схрещуваностi, що мали мiсце в наших експериментах, цитоплазматичний вплив материнської компоненти досить істотний, як приклад односторонньої перехресної несумiсностi (Anderson, Dewinton, 1931; Mather, 1943; Stout, 1952).

Виходячи з коливань зав'язуваностi в вiддалених схрещуваннях по роках та вiдмiнностей по цьому показнику в умовах штучного клiмату та польових умовах, вплив модифiкуючих умов культивування донорних рослин є вiрогiдним.

Встановлений нами рiвень мiжвидової та внутрiшньовидової рiзноманiтностi в компонентiв вiддалених схрещувань дозволив видiлити та рекомендувати як iнструмент iнтрогресiї форми з генетично детермiнованою високою схрещуванiстю: серед сортиментiв м'якої пшеницi -- Напiвкарлик та Lutescens 14662, ячменю -- Бемiр 2, а серед вивчаних диких та ендемiчних видiв -- K 29557 T. timopheevii, K 20364, K 30090 T. monococcum, K 2682 Ae. biucialis, K 1810 Ae. cylingrica, K 1809 Ae. triucialis та iн.

Носiї генiв ph -- mono 5B Favorit а також kr -- Lutescens 430, Lutescens 427 також виявилися дiєвими знаряддями iндукцiї спарювання за рахунок пiдвищення частоти кон'югацiї хромосом гомеологiчних геномiв у першому випадку та збiльшення швидкостi росту пилкових трубок -- у другому. Причому тут також мала мiсце специфiчнiсть їх дiї на рiзних генетичних фонах схрещування, а також залежнiсть вiд дози генiв-супресорiв.

Результати наших експериментiв вказують на те, що статева гiбридизацiя мiж таксономiчно вiддаленими видами злакiв цiлком можлива, проте iнтерес до цiєї роботи може бути втрачений, якщо гiбриднi органiзми не будуть одержанi через нездатнiсть зернiвок проростати та розвиватися в нормальну рослину. Тут ми маємо справу ще з однiєю системою захисту вiд проникнення чужеродної генетичної iнформацiї -- несумiснiстю таксономiчно вiддалених партнерiв через механiзми, котрi зводяться, з одного боку, до невiдповiдностей в темпах розвитку зародка та ендосперму i, з другого, -- до непридатностi (токсичностi) метаболiтiв тканин материнської рослини для живлення зародка.

В експериментальних умовах втрата здатностi насiння розвиватися ефективно долається шляхом переносу незрiлих зародкiв у критичнi етапи їх розвитку на штучне поживне середовище, що значно розширює можливостi вiддаленої гiбридизацiї.

Критичними етапами розвитку гiбридного зародка та ендосперму в наших дослiдженнях були рiзнi вiковi фази розвитку, як на стадiї бластомеризацiї, так i органогенезу. Причому, характер та мiра вираженостi аномалiй для рiзних комбiнацiй схрещування виявилися досить видоспецифiчними. Бiльшiсть зародкiв гинула на раннiх етапах розвитку, оскiльки вже в процесi перших подiлiв клiтин проявляються фактори антагонiзму мiж двома геномами.

Мають мiсце вiрогiднi (r=0,63; P<0,05) кореляцiйнi зв'язки мiж величиною зародка та здатнiстю його до проростання. Оптимальним, як правило, був їх розмiр бiльше 1 мм, критичним - менше 0,3-0,4 мм. Такi зародки, як правило, досягали критичного розмiру на 16-18 день розвитку, як, зокрема, у гiбридiв T. monococcum i T. aestivum, вони не могли пройти процесу диференцiацiї та адекватно завершити її в умовах in vitro. Коливання розмiрiв зародкiв одного i того ж вiку було досить значним -- вiд 0,4 до 1,3 мм для пшенично-егiлопсних гiбридiв, вiдмiнностi в їхнiй зрiлостi та диференцiйованостi були вiрогiдними.

Оскiльки диференцiацiя гiбридних зародкiв протiкає та регулюється в системi зародок зовнiшнє середовище яким є безпосередньо тканини материнської рослини, то вплив умов формування донорної рослини на розвиток зиготичного зародка в продуктах вiддаленої гiбридизацiї виявився достатньо суттєвим. Так у контрольованих умовах штучного клiмату вирощування батькiвських компонентiв гiбридiв T. timopheevii х T. aestivum помiтно збiльшує число гiбридних абортивних зародкiв (до 41,9 %), якi здатнi завершити ембрiогенез поза материнським органiзмом та розвинутися в повноцiнну рослину в порiвняннi з польовими умовами (лише 14,3%).

Введення в середовище абсцизової кислоти для збiльшення розмiрiв незрiлих гiбридних зародкiв та нормалiзуючого впливу на їх рiст i диференцiацiю, стимуляцiя проростання гiбридних зернiвок гiберелiновою кислотою не були достатньо ефективними (доля вкладу фактора 10,2%). В обох випадках зберiгалась значна залежнiсть цього прийому вiд генотипiв, що приймають участь в схрещуваннях (розмах варiювання 0-44,4%). Це пояснюється рiзними рiвнями активностi генiв, що приймають участь у контролi метаболiзму цих фiтогормонiв у дорощуваних гiбридних органiзмiв.

На прикладi схрещувань сортименту м'якої пшеницi з шiстьма видами Aegilops спостерiгалась залежнiсть здатностi до успiшного проростання гiбридних зародкiв вiд генотипових особливостей видiв, що використовувались в гiбридизацiї. При цьому, судячи з величини дисперсiї, найбiльший вплив на проростання гiбридних зародкiв в умовах in vitro спричиняли ефекти взаємодiї сортозразкiв пшеницi з видами Aegilops (вклад фактора -- 50,3%). Дещо меншу роль вiдiгравали генотипи м'якої пшеницi (19,6%), i найменшу --спостерiгали з боку видового сортименту Aegilops (4,1%), що можна пов'язати з нiвелюючим i маскуючим впливом материнської компоненти, а також подiбнiстю механiзму впливу з боку рiзних видiв Aegilops.

У реципрокних схрещуваннях (T. monococcum x T. aestivum та T. timopheevii x T. aestivum) виявили значну роль материнського органiзму, що забезпечує потреби формування гiбридного зародка, а також значимiсть плацентно-халазного джерела поживних речовин в перiод формування гiбридних зародкiв.

В раннiх репродуктивних поколiннях вiддалених гiбридiв у мейозi спостерiгається велика кiлькiсть порушень, що зумовлює їх стерильнiсть. В результатi значна кiлькiсть рослин гине, дослiдницька програма переривається та потребує повторення, що пов'язано зi значними додатковими витратами. Крiм того, має мiсце нагальна необхiднiсть створення мiнiмальної кiлькостi копiй малочисельних генотипiв, необхiдних для проведення ефективної селекцiйної роботи.

Цi проблеми вирiшують технологiї клонального мiкророзмноження з використанням тканин первинного ембрiонального походження, котрi iнiцiюються спочатку до калусоутворення, а потiм до диференцiацiї та соматичного ембрiогенезу.

Результати проведених нами дослiджень, на прикладi гiбридiв вiд схрещування п'яти генотипiв T.timopheevii, T. monococcum та Ae. juvenalis з п'ятьма сортозразками м'якої пшеницi на 5% рiвнi значимостi, не залишили нiяких сумнiвiв щодо переважаючої ролi генотипу дикої форми у визначеннi здатностi до калусоутворення та ембрiогенезу, однак морфофiзiологiчний потенцiал батькiвських генотипiв i процеси калусогенезу та ембрiогенезу вiддалених гiбридiв з їх участю - явища малопов'язанi (коефiцiєнт кореляцiї в системi батьки-нащадки 0,33-0,35). При цьому значнi кiлькiснi вiдмiнностi в частотах по здатностi до калусогенезу (59,8 %) i по морфофiзiологiчному потенцiалу калусiв (22,7 %) можуть вказувати на їх рiзний генетичний контроль.

Виявився можливим добiр форм з високою комбiнацiйною здатнiстю за поведiнкою в чужорiдному генетичному середовищi як серед ендемiчних форм (K 29557 T. timopheevii), так i серед сортименту м'якої пшеницi (Lutescens 14612, Lutescens 14662).

При “перемиканнi” програми розвитку незрiлих зародкiв на рiзнi типи морфогенезу з використанням аналога ауксину 2,4-Д, що репресує морфогенетичнi процеси в клiтинах, мала мiсце значна сортоспецифiчнiсть, що забезпечується генетичною здатнiстю сортiв до морфогенезу in vitro та сортовими вiдмiнностями в швидкостi включення ауксину в метаболiзм тканин експланту.

На прикладi гiбридiв вiд схрещувань м'якої пшеницi Favorit з шiстьма видами Aegilops, як i в iнших системах схрещувань, iстотно доведенi переваги шляху через соматичний ембрiоїдогенез, що забезпечив середнiй вихiд рослин 256,8%, при 95,9% через ембрiокультуру.

Iнший експлант -- культура молодих суцвiть -- також часто використовується для клонального розмноження шляхом iнiцiацiї калусних тканин з наступною регенерацiєю (Fedak, 1985, Ozias-Akins, Vasil, 1982, Rajyalakshmi, Dhir, 1988). Як i в культурi незрiлих зародкiв, в культурi молодих суцвiть успадкування морфогенних реакцiй гiбридами здiйснюється за принципом взаємодiї комбiнуючих факторiв з суттєвою роллю генотипу i з незначною залежнiстю вiд їх власного морфогенного потенцiалу видiв, що схрещуються.

Детальне дослiдження залежностi ефективностi клонального розмноження вiддалених гiбридiв злакiв через культуру молодих суцвiть на прикладi трiтiкале-ячмiнних гiбридiв вiд вiку та стадiї розвитку первинного експланту показало, що довжина вихiдного експланту (зона оптимуму 20-40 мм) виявила визначальний та вiрогiдний вплив на максимальний вихiд вторинних експлантiв та iнiцiацiю калусiв. При цьому спостерiгалися утворення рiзних за морфологiєю та морфогенним потенцiалом калусiв. Вiрогiдною виявилася роль генотипових вiдмiнностей, а також взаємодiї генотип-довжина експланту.

Синхронiзацiя розвитку та iнгiбування дострокового проростання ембрiоїдiв при збереженнi ембрiогенного потенцiалу культури молодих суцвiть може досягатися введенням в середовище речовин типу абсцизової та аскорбiнової кислоти.

Загалом, вибiркове культивування молодих суцвiть мiжвидових та мiжродових гiбридiв забезпечувало високий вихiд рослин (до 230-260 %) по вiдношенню до первинного експланту.

У вiддаленiй гiбридизацiї особливу актуальнiсть набуває пошук прийомiв i способiв подолання генетичної несумiсностi та стерильностi гiбридних нащадкiв шляхом досягнення амфiдиплоїдного рiвня.

Проведенi експерименти вказують на принципову можливiсть поєднання в одному технологiчному процесi збереження вiддалених гiбридiв в культурi in vitro, їх клонального розмноження, а також регулювання рiвня плоїдностi.

При цьому встановлено позитивний вплив добавок колхiцину в поживне середовище на частоту утворення калусiв з ембрiогенними зонами та вiдсутнiсть такого впливу на процеси стеблового морфогенезу, що можна пов'язати з селективними перевагами таких морфологiчних реакцiй у полiплоїдизованих клiтин та здатнiстю колхiцину до регулювання ростових процесiв.

За рахунок рiзноманiтних порушень в ходi онтогенезу соматичних ембрiоїдiв мала мiсце втрата регенерацiйного потенцiалу, а також змiна числа хромосом i поява химер.

Цитокарiотипiчна стабiлiзацiя геномiв вiддалених гiбридiв вiдбувається також у процесi збереження i розмноження in vitro та в результатi беккросування гiбридних нащадкiв вiддалених гiбридiв в репродуктивних поколiннях.

В процесi реалiзацiї дослiдницької програми при iнтрогресивнiй селекцiї встановлено:

- у гiбридiв м'якої пшеницi вiд гомеологiчних схрещувань з T. spelta, T. turgidum, T. compactum, T. dicoccum та iн. першi помiтнi ознаки стабiлiзацiї з'являються в третьому, а явнi -- в четвертому i особливо -- в п'ятому поколiннях (при цьому нормалiзуються процеси мiкроспорогенезу, пiдвищується фертильнiсть пилку та озерненiсть колосу, що обумовлено послiдовним природним та штучним добором, спрямованим на елiмiнацiю нежиттєздатних гамет та низькофертильних генотипiв);

- гiбриди м'якої пшеницi з тетраплоїдними видами T. militinae, T. timopheevii характеризуються послабленою кон'югацiєю хромосом у мейозi та зниженням частоти хiазм за рахунок збiльшення хромосомних порушень (98,2%), пов'язаних зi структурною диференцiацiєю хромосом при поступовій прогресуючiй карiотипiчнiй стабiлiзацiї геномiв в процесi беккросування;

- при гiбридизацiї з м'якою пшеницею менш сумiсних та несумiсних видiв T. monococcum, Aegilops, Secale iн. карiотиповий стан у значнiй мiрi залежить вiд наявностi, рiвня гомеологiчностi i її частоти в спадкових структурах схрещуваних компонентiв, а також ефективностi процесiв амфiдиплоїдизацiї їх геномiв;

- мейоз пшенично-ячмiнних та трiтiкале-ячмiнних гiбридiв вiдбувається зi значними аномалiями (рис 3.А), формування ж одиничних зернiвок пов'язане, ймовiрно, з утворенням нередукованих гамет.

Поряд з рекомбiнантними джерелами генетичної мiнливостi в сiльськогосподарських рослин доцiльним i перспективним видається пошук ефективних прийомiв та методiв створення нового генофонду на основi iндукованого мутагенезу. Можливостi, що виникають при застосуванні клiтинних технологiй, для манiпулювання мiльйонами клiтин, як мутабiльними одиницями, з одночасною їх селекцiєю та наступною експресiєю мутантних варiантiв на рiвнi цiлого органiзму, вважаються нам достатньо привабливими, а дана модель -найбiльш перспективною.

Експериментальне дослiдження фiзiологiчної активностi мутагенної дiї на рiзнi експланти та чутливостi клiтин i тканин до iнактивуючої дiї мутагенiв є необхiдним етапом вивчення мутагенезу в системах in vitro. Очевидно, мале практичне значення матимуть мутагеннi фактори, що спричиняють значну iнгiбуючу дiю на калусоутворення та регенерацiйну здатнiсть, оскiльки при цьому через пригнiчення згаданих процесiв отримання достатньої кiлькостi мутантiв стає проблематичним. Процеси ембрiоїдогенезу та регенерацiї найповнiше вiддзеркалюють ступiнь порушення морфогенетичних потенцiй клiтин та тканин, безпосередньо зачiпаючи морфогенетичнi процеси та регуляторнi шляхи залучення їх в морфогенез.

Дослiдження проводили на сортах м'якої пшеницi Миронiвська остиста, Миронiвська 808, Миронiвська 61, Донська напiвкарликова та Roazon, а також на реципрокних гiбридах F1 Миронiвська 808 x Донська напiвкарликова.

Хiмiчнi мутагени та гамма-променi не проявляли вираженої токсичної дiї на життєздатнiсть та рiст калусiв у культурi недозрiлих зародкiв, хоча i спостерiгалася слабо виражена тенденцiя до зменшення калусоутворення при збiльшеннi їх дози.

При порiвняннi бiологiчної активностi фiзичних (4.А) i хiмiчних (4.Б) впливiв на процеси регенерацiї виявлена висока iнгiбуюча активнiсть алкiлюючих хiмiчних агентiв та гама-променiв на вiдмiну вiд дiї електричного та магнiтного полiв, лазерних променiв та надвисоких частот, коли мало мiсце як iнгiбування, так i стимуляцiя. Факторiальний (дисперсійний) аналiз виявив, що вплив типу мутагена та дозового навантаження є суттєвим та вiрогідним.

Серед вивчених експлантiв максимальну чутливiсть до мутагенiв виявили зародки (LD50 для хiмiчних мутагенiв склало в середньому 0,025%). Недиференцiйованi калуси виявилися бiльш стiйкими (LD50 0,07-0,09%), оскiльки при мутагеннiй iнтоксикацiї в калуснiй масi поряд з безповоротно пошкодженими дiлянками завжди могли знаходитися менш пошкодженi групи клiтин, що забезпечували в майбутньому повторний ембрiоїдогенез та регенерацiю рослинних нащадкiв.

Колосся в середньому було менш сприйнятливим до шкодочинної дiї (LD50 0,1%), що, можливо, пов'язане зi значними градiєнтами концентрацiй мутагенiв при їх транспортуваннi до життєво важливих структур.

Таким чином пролонгована дiя на зародки (варiант з добавкою мутагенiв у середовище), порiвняно з опосередкованим (обробка колосся), виявилася бiльш сильною i спричиняла істотно бiльший вплив на наступнi регенерацiйнi процеси.

Виявленi мiжсортовi вiдмiнностi за їх регенерацiйною здатністю на фонi мутагенної обробки, свiдчать про сортоспецифiчнiсть до iнгiбуючої дiї відповідного мутагена.

Привертає увагу те, що ДАБ, який не викликає значної чисельності хромосомних порушень, на вiдмiну вiд НЕС, дiяв на всiх генотипах та експлантах подiбним чином, а саме пригнiчуючи регенерацiйнi процеси, тодi як дiя НЕС, для якої характерна бiльша частота хромосомних порушень, носила не завжди однозначний характер, що пов'язано з елiмiнацiєю значних хромосомних перебудов на етапах культури тканин за рахунок зменшення числа аберантних клiтин.

Аналогiчнi залежностi вiдмiченi при обробцi гама-променями, хоча рiзниця в реакцiї генотипiв тут була дещо меншою. Щодо використаних нами iнших полiв та випромiнювань, встановлено, що в середньому по всiх генотипах дiя фiзичних факторiв вiдрiзняється вiд дiї хiмiчних мутагенiв. Пiслядiя лазерних променiв, електричного та магнiтного полiв, а також випромiнення надвисокої частоти проявилася в тому, що вiдмiчена певна стимуляцiя як росту калусних культур, так i ембрiоїдогенезу. Лазерне випромiнювання спичиняло значний стимулюючий ефект, а при збільшеній напруженості електромагнитних полiв генотипи подiлялися на три групи: на тi, у яких регенерацiйна здатнiсть не змiнювалась, та тi, у яких вона мала тенденцiю або до зниження, або до зростання. Нами не встановлено прямої залежностi чутливостi i мутагенного ефекту, проте реакцiя експлантiв все ж дає змогу попередньо оцiнити ефективнiсть мутагенiв та вибрати дiапазон доз i варiанти обробки, якi доцiльно використовувати в подальшiй роботi.

Факторiальний аналiз дозволив ймовiрно визначити фактори, найбiльш суттєвi для проходження мутацiйних процесiв in vitro: тип мутагену, генотип, умови обробки, експлант, доза.

Широта спектру iндукованих мутацiй (кiлькiсть змiнених морфотипiв) i його характер (вiдносна частота мутацiй певних ознак, в % вiд всiх мутантних) залежали вiд генотипу i дози мутагена. Порiвняння частот i спектрiв iндукованих мутагенами змiн з частотою сомаклональної мiнливостi вказує на виникнення в обох випадках близьких за морфологiчним проявом спадкових змiн, при дiї мутагенiв їх частоти суттєво вищi i спектр ширший.

Специфiчнiсть використаного експланту на спектрах одержаних мутацiй визначалась в тому, що найбiльш низькi частоти мутування окремих ознак виявлені при дiї хiмiчних мутагенiв на експланти в предкультуральнiй стадiї (тобто при обробцi колосся), максимальна загальна частота мутацiй спостерігалась при iндукцiї калусiв на середовищi з мутагенами (експлант -- зародки), промiжними мiж цими варiантами були частоти мутацiй при обробцi недиференцiйованих калусiв на поживному середовищi.

При дiї фiзичних мутагенiв in vitro в наших експериментах серед мутантних варiантiв були знайденi форми, вiдсутнi у сомаклональних варiантiв та варiантiв, одержаних при обробцi хiмiчними мутагенами, зокрема при дiї лазерного випромiнення, а саме: рослини з сильним кущiнням, товстою соломиною та з потужною листовою поверхнею i збiльшеною довжиною та шириною листя.

На фоні значної мутагенної активнiсті гама променiв, iншi використанi в дослiдах поля та випромiнення показали суттєво меншу активнiсть у появi видимих мутацiй в R2M2, хоча частоти останнiх в рядi варiантiв були вищими порiвняно з рiвнем спонтанної сомаклональної мiнливостi. Також переважали мутацiї за ознаками, що впливають на висоту рослин (високi, еректоїди), будову колоса (спельтоїди, довгi, рихлi, веретеневиднi), тривалiсть вегетацiйного перiоду (пiзньостиглi).

При дiї гама-променiв iстотно виявилася залежнiсть частоти i спектру мутацiй вiд генотипу, нiж вiд доз. Дiя лазерного випромiнювання з бiльш короткою довжиною хвилi (жорстке випромiнення) збiльшувало частоти мутування окремих ознак, однак довгохвильове випромiнювання, особливо при збiльшенiй експозицiї, iндукувало бiльше число мутантiв. При цьому, як i в випадку дiї хiмiчних мутагенiв, число мутантних ознак зростало.

Одержанi нами результати свiдчать про перспективнiсть обробки калусiв деякими фiзичними мутагенами, зокрема лазерним випромiненням i гама-променями для одержання мутантних лiнiй пшеницi, пов'язаних з тривалiстю вегетацiйного перiоду.

При дiї фiзичних мутагенiв встановлено бiльш високу частоту множинних змiн (2-5 одночасно змiнених ознак на рослинi), однак при цьому часто спостерiгався негативний зв'язок з деякими господарсько-цiнними ознаками. При хiмiчному мутагенезi на спектри одержаних мутацiй найбiльш істотний вплив обумовлювали доза мутагена i експлант, а при фiзичному -- тип мутагену i генотип.

В цiлому ж прологована дiя хiмiчних мутагенiв при введеннi їх в поживне середовище в значнiй мiрi модифiкувала спектр iндукованих змiн i частоти появи мутантних генотипiв.

Частота мутантних змiн при iндукованому мутагенезi, оцiнена в R2M2, склала для хiмiчних мутагенiв 9,0-14,4%, для фiзичних 6,4-10,1%, при цьому середня частота сомаклональної мiнливостi була на рiвнi 3,5-5,2% (табл. 1). Крiм того, у вивченому наборi генотипiв проявилася пряма залежнiсть частоти iндукованих мутацiй, в т.ч. корисних, вiд рiвня спонтанної (без дiї мутагена) сомаклональної мiнливостi.

Таблиця 1. Частота макромутацій (R2M2-R3M3) у озимої пшениці, індукованих in vitro хімічними та фізичними мутагенними факторами.

Мутагенний фактор	Миронівська 808	Донська напівкарликова	Миронівська 61
	Мутацій	Мутацій	Мутацій
	в М2		в М3 сімей, в % від М2	в М2		в М3 сімей, в % від М2	в М2		в М3 сімей, в % від М2
	%	Sx	%	%	Sx	%	%	Sx	%
Контроль	0,19	0,13	100	0,32	0,16	100	0,34	0,17	100
Культура тканин	3,53	0,87	87,50	4,06	0,91	89,47	5,18	1,08	90,91
НЕC	11,81	0,56	83,94	12,74	0,56	90,63	14,42	0,54	95,21
ДАБ	9,00	0,51	89,97	10,66	0,51	95,65	12,91	0,53	94,17
Лазерне випромінювання	11,49	0,91	89,36	12,20	1,00	84,62	15,72	1,09	83,43
Гама-промені	8,01	0,85	90,12	10,26	0,83	95,65	12,34	0,92	89,31

У всiх вивчених варiантах обробки спостерігається бiльш висока частота корисних мутацiй які були iндукованi хiмiчними i фiзичними мутагенами в середнiх дозах i концентрацiях, що пов'язане зi збiльшенням iмовiрностi мутацiй в низькомутабiльних локусах, а також з тим, що леталi не “виносять” iншi типи змiн, як при високих дозах. В R4M4 серед макромутацiй були виявленi лiнiї, які характеризувалися рядом селекцiйно-цiнних ознак, доля яких в окремих випадках досягала 17-21%.

У наших дослiдах виявлено, що y м'якої пшеницi бiльшiсть iндукованих in vitro мутантiв пов'язана зi змiною форми i структури колосу (бiльше 50% вiд загальної кiлькостi зареєстрованих мутацiй). Цi мутанти представленi спельтоїдами, сверхедами, компактоїдами та деякими iншими формами (табл. 2).

Таблиця 2. Типи макромутацій та середні частоти мутування ознак при мутагенезі in vitro.

Тип мутації	Середні по всіх генотипах і мутагенах частоти мутування ознак, %
	фізичні фактори	хімічні мутагени
І	Мутації стебла
1	Карлики	0,479	0,678
2	Напівкарлики	0,493	0,772
3	Високорослі	0,551	0,623
4	Еректоїди	0,558	0,374
5	Товстостебельний	0,261	-
ІІ	Мутації колоса
6	Спельтоїдний	1,182	1,440
7	Скверхедний	1,051	1,191
8	Компактоїд	0,471	0,892
9	Циліндричний	0,138	0,967
10	Довгий, рихлий	0,413	0,897
11	Великий, щільний	0,123	0,862
12	Призматичний	0,812	0,643
13	Багатоколосковість	0,160	-
III	Мутації остистості
14	Безості	0,319	0,329
15	Напівостисті	0,268	0,508
16	Остисті	0,239	0,653
IV	Мутації прапірцевого листа
17	Коротке листя	0,109	0,598
18	Довге листя	0,602	0,224
V	Хлорофільні
19	Жовта смугастість	-	0,110
20	Червона смугастість	-	0,135
VI	Фізіологічні
21	Пізньостиглі	0,798	0,414
22	Ранньостиглі	0,160	0,154
VII	Восковий наліт
23	Наявність чи відсутність нальоту	0,573	0,718
VIIІ	Інші
24	Антоціанове забарвлення	0,258	-
25	Опушення	0,086	-

При цьому бiльшiсть мутацiй супроводжувалися наявнiстю мiнiмум ще однiєї змiненої ознаки в фенотипi мутантної рослини, а значна кiлькiсть похідних мутантних сiмей мали спадковi змiни вiдразу по декiлькох ознаках. Переважали наступнi комбiнацiї мутацiй: висота-форма колоса-остистiсть, висота-форма колоса-восковий налiт, форма колоса-остистiсть-восковий налiт.

Бiльша частина видiлених в R2М2 вихідних змiнених зразків успадковувала цi ознаки в R3М3, причому значна частина останнiх виявилися константними в наступних поколiннях.

Вивчення коефiцiєнтiв варiацiї ознак в R2M2 i бiльш пiзнiх поколiннях дозволило нам не тiльки оцiнити вплив факторiв експерименту (тип, мутагену, доза, генотип, експлант i т.д.) на iндукцiю генетичної мiнливостi при мутагенезi in vitro, але й оцiнювати генотипiчну однороднiсть сiмей, одержаних з мутантних рослин в бiльш пiзнiх поколiннях, а також видiляти сiм'ї, в яких на фонi макрозмiн можна видiляти мiкромутанти по кiлькiсних ознаках, які мають селекцiйну цiннiсть.

Одержанi з R2M2 лiнiї R3M3 були дослiдженi за кiлькiсними ознаками, для них побудованi кривi розподiлу. Крiм нормального розподiлу переважали кривi, що мають тенденцiю як до негативної, так i до позитивної асиметрiї, якi iнколи наближалася до одновершинних кривих. Розподiл за деякими ознаками, наприклад, по висотi рослин, iнколи проявляв багатовершиннiсть, котра може обумовлюватися наявнiстю рiзних генiв. При аналiзi розподiлу в межах кожної вивченої лiнiї в крайнi фенотиповi класи потрапляли мутанти з рангу мiкромутацiй або нерiзких мутацiй. Ця обставина була основою того, що внутрiлiнiйнi добори протягом кiлькох поколiнь дозволили в значнiй мiрi покращити мутанти iнодi по двох i бiльше ознаках. Успiх такого добору переважно залежав вiд генотипу вихiдного сорту, в меншiй мірі -- вiд мутагену i експланту. Проведення такого добору з урахуванням взаємної скорельованостi ознак структури колоса в мутантних генотипах приводили до збiльшення в пiзнiх поколiннях кiлькостi «плюс»-варiантiв за цими ознаками. Бiльшiсть з видiлених мiкромутантiв зберiгали у наступних поколiннях успадковували такі мiкрозмiни i були константними.

Якщо припустити, що мутантна клiтина має бiльш високу життєздатнiсть, то проходячи через соматичний добiр в системах in vitro, вона пригнiчує рiст решти клiтин культури i дає початок однаково спадково змiненим рослинам R1M1. Збiльшення частки константних мутантних сiмей у загальнiй кiлькостi мутантiв свiдчить про бiльшу генетичну пристосованiсть мутантних клiтин.

В бiльш пiзнiх поколiннях мутантiв виникали форми з новими ознаками, які не зустрічалися в поколінні мутантiв в R2M2, але при цьому сумарний спектр мутацiй не змiнювався.

Сумісна дія чинників мутагенезу та гiбридизацiї суттєво посилює рiвень мінливості в репродуктивних поколiннях, оскiльки в результатi рекомбiногенезу вдається поєднати мутантнi гени з генами від рiзних сортiв, змiнити негативний прояв взаємодiї цих генiв на позитивний при перенесеннi їх у нове генотипове середовище і одержати рекомбiнанти з принципово новими ознаками.