Молекулярно-генетическая диагностика наиболее распространённых грибных инфекций хвойных пород Беларуси

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждение образования «Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины»

Биологический факультет

Кафедра лесохозяйственных дисциплин

Дипломный проект

Молекулярно-генетическая диагностика наиболее распространенных грибных инфекций хвойных пород Беларуси

Исполнитель:

студент группы ЛХ-61

Цымбал А.А.

Научный руководитель:

к.с.-х.н., доцент

Лазарева М.С.

Гомель 2012



Реферат

Дипломный проект __ страниц, __ рисунков, __ таблиц, __ источника.

Перечень ключевых слов: ДНК-МАРКЕРЫ, ГРИБНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ПЦР, РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ

Объект исследования: различные виды патогенных грибов хвойных пород Беларуси

Цель работы: разработка методологических основ молекулярно-генетической диагностики наиболее распространенных грибных инфекций хвойных пород Беларуси

Метод исследования и используемая аппаратура: ПЦР-ПДРФ анализ локусов рибосомальной ДНК грибов. Лабораторный комплекс по проведению молекулярно-генетического анализа.

Основные конструктивные и технико-эксплуатационные характеристики.

Полученные результаты и их новизна: разработан молекулярно-генетический атлас видовой идентификации 7 видов патогенов. Для Беларуси результаты получены впервые.

Область применения: лесное хозяйство.

Степень внедрения результатов дипломного проекта.

Экономическая эффективность и практическая значимость работы: Результаты работы будут использованы для создания молекулярно-генетического атласа основных фитопатогенов лесных древесных пород Беларуси. Окончательной целью работы является создание системы ранней диагностики заболеваний лесных древесных пород.



Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов

A -- аденин (6-аминопурин), азотистое основание, производное пурина, комплементарное тимину, урацилу, входящее в состав нуклеотидов ДНК и РНК.

Агароза -- полисахарид, полученный из морских водорослей и являющийся составной частью агара. Используется как гелевая среда в хроматографии и электрофорезе.

Азотистых оснований комплементарность -- строго определенная дополнительность азотистых оснований по отношению друг к другу: аденин одной полинуклеотидной цепи молекулы нуклеиновой кислоты всегда связан с тимином (в РНК - с урацилом), а гуанин - цитозином. Таким образом, аденин комплементарен тимину (урацилу), гуанин - цитозину.

Буферная система -- совокупность растворов электролитов, стабилизирующих кислотно-щелочную среду при проведении электрофореза.

Г -- гуанин (2-амино- 6- оксипурин), азотистое основание, производное пурина, комплементарное цитозину, входящее в состав ДНК, РНК.

Гель -- поддерживающая среда для электрофореза, обладающая свойствами молекулярного сита. Свое название гели получают в зависимости от главного компонента, используемого для его приготовления, например: крахмальный, полиакриламидный и т. д.

Генетические маркеры -- гены или фенотипические признаки, для которых установлен генетический характер наследования.

Генетический портрет -- см. генотип.

Геном -- гаплоидный (основной) набор хромосом.

Генотип -- 1. вся генетическая информация организма, т.е. совокупность всех генов отдельной особи; 2. генетическая структура организма по одному или нескольким изучаемым генным локусам.

Денатурация ДНК -- расщепление двуцепочечной молекулы ДНК на отдельные нити. Д. может вызываться как химическими (щелочь, формамид и др.), так и физическими (температура) факторами.

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) -- материальный носитель наследственности. Является биологическим полимером, молекула которого построена из двух спиральных полинуклеотидных цепей.

Комплементарность -- свойство нуклеотидов образовывать парные комплексы при взаимодействии цепей нуклеиновых цепей.

Консервативная последовательность -- последовательность нуклеотидов в генетическом материале или последовательность аминокислот в полипептидной цепи, вовсе не измененная или незначительно измененная в течение эволюции.

Локус -- место в хромосоме, где расположен ген. Часто используется вместо термина “ген”.

Маркер молекулярной массы -- набор фрагментов ДНК известной длины. Используется в качестве калибровочной шкалы для определения размера анализируемых в ходе электрофореза зон.

Нуклеотид -- наименьшая структурная единица полимерных молекул ДНК. Представляет собой сложное органическое соединение, в состав которого входят молекулы одного из азотистых оснований, пентозного сахара и фосфорной кислоты.

Отжиг -- процесс восстановления (ренатурация), называемый также гибридизацией, нуклеиновой кислоты, во время которого одноцепочечные полинуклеотиды образуют двухцепочечную молекулу с водородной связью между комплементарными нуклеотидами двух цепей.

Полимеразная цепная реакция, ПЦР -- процесс амплификации in vitro, при котором фрагмент ДНК длиной до 15 кб может быть амплифицирован (размножен) до 108 раз (копий).

Полиморфизм -- одновременное присутствие в популяции двух или нескольких генотипически и фенотипически отличающихся форм признака.

Праймер -- короткий олигонуклеотид ДНК или РНК, комплементарный участку более длинной молекулы ДНК или РНК.

Секвенирование -- определение последовательности оснований в ДНК или РНК или аминокислот в белке.

Т -- тимин (2,4-диокси-5-метилпиримидин), азотистое основание, производное пиримидина, комплементарное аденину, входящее в состав ДНК.

Тыс. п.о. -- тысяч пар оснований.

Ц -- цитозин (2-окси-4-аминопиримидин), азотистое основание, производное пиримидина, основание, входящее в состав ДНК и РНК.

Электрофорез -- техника разделения молекул, основанная на их различной подвижности в электрическом поле.

Элонгация -- удлинение нуклеотидной цепи путем добавления новых нуклеотидов (ДНК- или РНК-синтез) или аминокислотной цепи путем присоединения аминокислот.

Этидиум бромид (бромистый этидий) -- флуоресцирующий краситель, способный интеркалировать между парами оснований двухнитчатой ДНК и РНК. Комплекс нуклеиновой кислоты с красителем флуоресцирует под УФ-светом.

Для составления словаря терминов использован энциклопедический словарь “Генетика” [1] и руководство по электрофорезу “Электрофорез на практике”[2].

Введение

Последнее двадцатилетие ознаменовалось широким внедрением в биологические, медицинские и сельскохозяйственные науки молекулярно-генетических методов.

Современные технологии во многих случаях позволили на более глубоком уровне начать изучение тонкой структурно-функциональной организации ядерных и внеядерных геномов различных организме Особое значение это имело для разработки новых методов диагностики и лечения различных заболеваний. Не менее важным оказалась возможность использования достижений молекулярной генетики и в остальных областях биологии.

Успехи в развитии генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркеров. Первоначально в качестве генетических маркеров использовались морфологические (фенотипические) признаки, например, с использованием маркеров этого типа в 1913 г. была построена первая генетическая карта (карта генома Drosophilla melanogaster). Однако количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды. Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов генов (белковый или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК) [3, 4].

В настоящее время наиболее прогрессивным является использование в качестве маркерных систем полиморфных нуклеотидных последовательностей ДНК, позволяющих тестировать генетический полиморфизм непосредственно на уровне генов, а не на уровне продуктов генов, как в случае использования метода белкового полиморфизма. ДНК-маркеры позволяют решить проблему насыщения генома маркерами и маркировать практически любые участки ДНК, в том числе некодирующие.

Кроме того, эта маркерная система дает возможность использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма и имеет целый ряд преимуществ по сравнению с другими типами маркеров: возможность тестирования любых последовательностей генома, повсеместность распространения, возможность анализа материнского типа наследования, возможность анализа отцовского типа наследования, стабильность наследования, отсутствие плейотропного эффекта, множественность аллелей, информативность о природе генетических изменений, возможность проведения ретроспективных исследований.

Кроме того, ДНК-маркеры характеризуются рядом методических преимуществ: возможность определения в любых тканях, возможность определения на любых стадиях развития, длительность хранения образцов ДНК, возможность использования гербарного материала, ископаемых остатков и т.п., отсутствие ограничений в числе маркеров на образец, наличие маркеров для белок-кодирующих последовательностей, наличие маркеров для некодирующих последовательностей (интронные, межгенные, регуляторные области и т.п.), наличие маркеров для повторяющихся последовательностей [3, 5].

Как показывает мировая практика, значение ДНК-маркеров в настоящее время быстро возрастает, что проявляется в увеличении числа методов анализа ДНК. Так, например, если до конца 80-х гг. прошлого века разнообразие ДНК-маркеров было невелико (ПДРФ и минисателлиты), то на сегодняшний день молекулярная генетика располагает большим количеством (около 30 видов) самых разнообразных ДНК-маркеров, различающихся по своим свойствам и информативности [1, 2, 3, 5].

В различных странах мира молекулярно-генетические методы широко используются в генетических и селекционных исследованиях лесных древесных растений (сосна, дуб, лиственница, ель, тополь, ива и др.). Область применения ДНК-маркеров велика и постоянно расширяется: выявление генетического разнообразия в популяциях; анализ генетического родства отдельных генотипов, сортов, популяций; паспортизация ценных генотипов; идентификация клонов и сортов; построение генетических карт; решение спорных вопросов таксономии; коммерческая сертификация и т.д. [5]. Однако, несмотря на все разнообразие методов анализа ДНК и их все более широкое применение, они до сих пор в малой степени использовались в области лесной фитопатологии.

Исходя из всего выше сказанного целью данной работы является разработка методологических основ молекулярно-генетической диагностики наиболее распространенных грибных инфекций хвойных пород Беларуси.

Актуальность данной работы связана с необходимостью разработки системы ранней диагностики и точной идентификации основных видов фитопатогенов лесных древесных пород. Аналогичные системы разработаны, опробированы и уже длительное время используются в повседневной медицинской практики для выявления и анализа различных инфекций человека. Системы молекулярно-фитопатологического мониторинга в системе лесного хозяйства Беларуси, как и других стран СНГ, не существует. Особенно эффективен метод ДНК-анализа для диагностики трудно-культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов. Применение ПЦР-диагностики также крайне эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Следует отметить, что методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в растительном материале, полученном от зараженных растений, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва).

Научная новизна полученных результатов заключается в выявлении видоспецифических последовательностей ДНК грибных фитопатогенов, характеризующихся наибольшим уровнем консервативности внутри вида, что позволит использовать данные маркеры для диагностики и идентификации инфекций. Практическая значимость работы заключается разработке элементов системы молекулярно-фитопатологического мониторинга. Результаты работы будут использованы для создания молекулярно-генетического атласа основных фитопатогенов лесных древесных пород Беларуси.



Глава 1. Состояние проблемы по данным литературы

1.1 Фитопатологическое состояние лесов Беларуси

лес рестрикционный полимеразный праймер секвенирование

Лесопатологическое обследование, проводят с целью оценки состояния лесов, выявления площадей, заражённых вредителями и болезнями и определения лесозащитных мероприятий. В зависимости от организации форм лесопатологического обследования выделяют текущие, специальные (экспедиционные и др.) и авиадесантные. Текущие лесопатологические обследования планируются органами лесного хозяйства и осуществляются лесопатологами при участии аппарата лесничеств по поступающим сигналам с мест. По результатам текущих лесопатологических обследований назначаются санитарные рубки, выбираются участки для лесопатологического надзора, проводятся профилактические лесохозяйственные мероприятия. Экспедиционные лесопатологические обследования проводятся в процессе лесоустройства таксаторами, а также специализированными лесопатологическими партиями Леспроекта. При этом выявляются площади лесов, нуждающихся в специальных лесозащитных мероприятиях, и составляется перспективный план их выполнения. Авиадесантные лесопатологические обследования осуществляются в малодоступных, удалённых от населенных пунктов местах предприятиями Леспроекта, специалистами-лесопатологами. Они включают два этапа: разведку с воздуха на самолётах и вертолётах неблагополучных в лесопатологическом отношении площадей, проведение в этих местах экспедиционными группами рекогносцировочного обследования насаждений по маршрутным ходам и при необходимости -- учёт численности вредителей, степени усыхания насаждений и развития в них грибных болезней. Учёт очагов опасных вредителей и болезней лесных пород в лесхозах проводят ежегодно осенью комиссией с участием межрайонного лесопатолога. Исходные материалы для инвентаризации очагов -- данные о наличии их в прошлом году и материалы по лесопатологическому надзору. При необходимости границы и площади очагов уточняются на месте. По результатам инвентаризации в лесхозах органами лесного хозяйства составляются сводные ведомости по видам главнейших вредителей и болезней [1].

1.2 Обзор основных методов молекулярно-генетического анализа

Изучение полиморфизма молекул ДНК основано на разнице нуклеотидных последовательностей сравниваемых образцов. Это различие может быть количественным (варьирование длины ДНК-фрагментов образцов) или качественным (изменчивость в последовательности нуклеотидов). В первом случае полиморфизм выявляется с помощью электрофоретического фракционирования, хроматографии, масс-спектрометрии образцов ДНК. Изменчивость в последовательности нуклеотидов определяется наличием/отсутствием комплиментарного взаимодействия (отжига) образцов ДНК с фрагментами, нуклеотидная последовательность которых заранее известна (RAPD, DAF, AP-PCR, ISSR (RAMS), SSR, минисаттелиты, SCARs, EST и др); наличием/отсуствием сайтов рестрикции (RFLP, PCR-RFLP (CAP), PCR-RFLP-SSCP и др.). Кроме описанных выше методов изучение полиморфизма ДНК, существует прямой метод анализа нуклеодиной последовательности нуклеиновых кислот - секвенирование.

ДНК-маркеры можно классифицировать на основании различных критериев: по характеру проявления (доминантный, кодоминантный); по механизму передачи (обоеполое наследование, наследование только по материнской или отцовской линии); по локализации в геноме (ядерная ДНК, хлоропластная ДНК, митохондриальная ДНК); по уровню изменчивости (мономорфность, гипервариабельность).

В последнее время наибольшую популярность приобрели методы, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Данные методы классифицируются по типам используемых праймеров. В ходе ПЦР могут быть использованы специфичные праймеры, сконструированные на основе известных нуклеотидных последовательностей, примыкающих к изучаемому региону ДНК (группа STS-маркеров (sequence-tagget sites)), или произвольные праймеры, отражающие последовательности встречающиеся в той или иной степени в геномах разных видов (random primed amplification - произвольно праймированная амплификация). Амплификация со строго специфическими праймерами является детерминированным процессом, требующим знания последовательности матрицы, а мишенью являются один определенный либо многочисленные сайты амплификации на обеих нитях ДНК.

В зависимости от целей и задач исследований можно выделить несколько типов ПЦР со специфическими праймерами. Стандартная ПЦР. Используется для получения двуцепочечных продуктов амплификации. Лежит в основе большинства методов ДНК-анализа. К этой группе относят следующие методы: SSR (Simple Sequence Repeat), или микросаттелиты, минисаттелиты, SCARs (Sequence-Characterised Amplified Regions), CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence), EST (Ехрrеssed Sequence Tag).

Мини- и микросаттелиты. Значительная часть повторяющейся (саттелитной) ДНК состоит из тандемно повторяющихся копий длиной 1-6 нуклеотидов (микросаттелиты) и от 9-10 до несколько сотен нуклеотидов каждая (минисаттелиты). Минисаттелитный локус может насчитывать от 2 до нескольких сотен повторов, микросаттелитный локус - от 10 до ста повторов. Данный тип изменчивости получил название “варьирующего числа тандемных повторов” (VNTR). Мутации типа инсерций/делеций, изменяют число повторов, т.е. общую длину такой многокопийной последовательности. Таким образом, аллели данных локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.

SCAR-маркеры представлены ДНК-локусами, для которых определена нуклеотидная последовательность. Если данная область является структурным геном или его фрагментом, то данный маркер обозначается как EST-маркер. Дополнительный рестрикционный анализ SCAR-маркеров получил название CAPS-анализ, или PCR-RFLP.

Ассиметричная ПЦР. Используется для получения продуктов амплификации в одноцепочечной форме. Его суть заключается в том, что один из двух праймеров для ПЦР берется в 100-кратном избытке. На ранних циклах реакции происходит образование двухцепочечной ДНК и экспоненциальный рост ее количества. Как только пул лимитирующего праймера исчерпывается (примерно к 20-му циклу), начинается образование одноцепочечной ДНК. Ее накопление носит линейный характер, но этого оказывается достаточно для получения одноцепочечной ДНК в количествах, необходимых для секвенирования или использования в качестве зонда.

Инвертированная ПЦР. Используется при изучении промоторных областей генов известных белков, сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов. ДНК гидролизуется рестриктазой, вносящей разрывы не внутри известной последовательности, а в некоторых точках правее и левее ее. Образующийся фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и амплифицируется в результате ПЦР. Основное отличие от стандартной ПЦР заключается в том, что праймеры, гибридизующиеся с концевыми участками известной последовательности, направлены 3'-концами не внутрь ее, а наружу. В результате амплифицируются фланкирующие участки ДНК.

Заякоренная ПЦР. Используется в случаях, когда для участка нуклеиновой кислоты, подлежащего амплификации, известна нуклеотидная последовательность лишь для одного праймера (например, в случае молекул РНК, для которых легко определить лишь 3'-концевую последовательность). Метод состоит в том, что с молекулы РНК получают кДНК-копию, к 3'-концу которой пристраивают поли(dG)-блок с помощью терминальной трансферазы. Амплификацию такой кДНК проводят при участии «заякоренного» праймера, содержащего на 3'-конце поли(dC)-последовательность и потому гибридизующегося с поли(dG)-блоком, и «специфического» праймера, синтезированного на основании известной 3'-концевой последовательности РНК.

Амплификация с произвольными праймерами. Произвольная амплификация является недетерминированным процессом, не требующим предварительного знания матричной последовательности и использующим единичные или множественные сайты в геноме. Этот тип амплификации может использовать один или несколько произвольных праймеров или комбинацию произвольного и направленного праймеров к специфическим, но неизвестным сайтам в геноме, многие из которых являются полиморфными.

RPCR (Random Polymerase Chain Reaction - произвольная ПЦР). Этот метод позволяет конструировать библиотеки полных кДНК из очень малого количества РНК (эквивалентного количеству РНК, содержащейся в одной эукариотической клетке, ста клетках бактерий или в ста тысячах частиц ретровируса). В качестве праймера для синтеза кДНК используют универсальный праймер, содержащий на 3'-конце гексамер с призвольной последовательностью.

RAPD-анализ (Random Amplified Polymorphic DNA - произвольно амплифицированная полиморфная ДНК). Оригинальность RAPD-анализа заключается в двух особенностях: при амплификации ДНК применяется только один праймер, так как “мишенью” являются, как принято считать, инвертированные повторы в геноме; для использования “произвольных” праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома. При подборе праймеров для RAPD-анализа достаточны следующие условия: олигонуклеотидная последовательность праймера должна содержать от 50 до 80% G+C оснований, а его длина должна быть около 10 оснований. RAPD-анализ характеризуется следующими свойствами: при использовании большинства типов праймеров RAPD-спектр представлен 6-12 амплимерными зонами; RAPD-маркеры обладают доминантным характером проявления; RAPD не включает в себя гибридизацию/авторадиографию или другие трудоемкие методы визуализации продуктов анализа; RAPD чувствителен к изменениям ПЦР-условий, поэтому воспроизведение результатов может быть получено лишь при стандартизации условий пользования.

AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction - произвольно праймированная ПЦР). В данном типе ПЦР используются праймеры, сходные по длине с таковыми в классической ПЦР (15-25 нуклеотидов). Особенностью этого метода является проведение отжига праймера в нескольких первых циклах при более низкой, чем оптимальная, температуре (так называемый «мягкий» отжиг), что повышает эффективность праймирования при дальнейших «жестких» циклах. Продукты амплификации разделяют в агарозном геле и визуализируют бромистым этидием.

DAF (DNA Amplification Fingerprinting - фингерпринтинг амплифицированной ДНК). При DAF используют праймеры длиной 5-8 нуклеотидов. Сложные информационно насыщенные профили ДНК получают в полиакриламидном геле и окрашивают серебром для обнаружения пикограммовых количеств ДНК. В результате DAF с октамерным праймером образуются фингерпринтеры в 3-10 раз более сложные, чем ДНК-профили, полученные при RAPD-анализе с декамерным праймером. Техника DAF использовалась для характеристики многих организмов - от бактерий до человека.

ПЦР в реальном времени. Методы ПЦР в реальном времени можно разделить на две основные группы, различающиеся по способам генерации репортерной флуоресценции: применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК (в качестве интеркалирующего красителя наиболее часто используют SYBR Green), использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплиментарных участку PCR-продукта (TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler).

SYBR Green анализ базируется на детекции и количественном определении флуоресцирующих комплексов ДНК-SYBR Green. Особенность красителя SYBR Green заключается в способности образовывать комплексы только с двухцепочечной молекулой ДНК. Двухцепочечные формы ДНК в ПЦР присуствуют только на стадии отжига (праймер-матрица ДНК) и элонгации (ампликон). Таким образом, изменение флуоресцентной эмиссии на конечном этапе элонгации каждого последующего цикла, в основном, отражает увеличение числа ампликонов в ходе ПЦР.

TaqMan ПЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют 2 праймера, комплементарных областям, фланкирующих амплифицируемый локус и ДНК-зонд (праймер), меченный на 5'-конце флуоресцентным красителем, а на 3'-конце -- тушителем флуоресценции. Зонд комплиментарен участку, находящемуся внутри ампликона. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение. При отжиге зонд связывается с комплементарным участком ДНК внутри ампликона Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять его за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально накоплению числа ампликонов.

При использовании в качестве образца молекулы РНК, а не ДНК, в реакционную смесь добавляется реагенты для проведения обратной транскрипции и в программе ПЦР на первом этапе выполняется синтез ДНК, которая будет выступать в качестве исходной матрицы для последующей амплификации.

Гибридизация. Одним из первых появившихся методов анализа ДНК является -- полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), или RFLP. Данная технология основана на изучении изменчивости размера определенных ДНК фрагментов, образовавшихся в следствии расщепления ДНК рестрикционными ферментами. Разница в RFLP-спектре, выявляемая между двумя организмами, является следствием либо точковой мутации (образование или нарушение сайта рестрикции) -- отсутствие/наличие фракции, либо реорганизации областей ДНК между рестрикционными сайтами (делеция или вставка) -- изменение длины фрагмента. На начальном этапе разработки данного метода, исследователи просто сравнивали электрофоретические спектры рестриктов изучаемых образцов, представленные большим числом фракций, что являлось достаточно трудоемкой процедурой. В ходе усовершенствования RFLP-анализа, технология была дополнена последующей гибридизацией рестриктов с меченной пробой. Проба является специфичной для выявление одного локуса (RFLP: sigle-locus probe) -- геномные, кДНК, мтДНК, хлДНК библиотеки или нескольких локусов (RFLP: multi-locus probe) -- тандемные повторы (микро и минисаттелиты), короткие последовательности (DNA fingerprinting).

Микрочипы (microarray analysis) представляет собой метод анализа, в котором один компонентов образец ДНК или меченная проба иммобилизированы на твердой поверхности (например, на специальной стеклянной пластине). В ходе гибридизации в растворе, содержащей второй компонент, происходит образование комплексов между комплементарными молекулами. После удаления не связавшихся молекул, пластина анализируется в специальном детектирующем устройстве для определения. Автоматизация анализа и использование лазерных технологий позволяют анализировать большое количество образцов (до 100 тысяч образцов на 1 см² пластины) за относительно короткое время.

Комбинированные методы. AFLP анализ (ПДАФ, полиморфизм длинны амплифициованных фрагментов). Принцип данного метода состоит в рестрикции образцов ДНК, последующей лигацией рестриктов с адаптерами, амплификацией модифицированных рестриктов с праймерами на 2-4 нуклеотида, превышающих размер адаптера. Таким образом изменчивость изучается у в последовательности (1-3 нуклеотида), примыкающей к сайту рестрикции. Многопрофильные AFLP-спектры (200 и более зон) анализируют с помощью специального сканера. Интерпритация результатов сводится к выявлению наличия/отсуствия ампликона с определенного размера. В целом данный метод характеризуеся доминантным характером проявления маркеров, высокой воспроизводимостью результатов и информативностью -- 200 и более локусов, выявляемых за 1 анализ.

PCR-RFLP (CAPS) анализ является комбинированным методом, сочитающим принципы полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа. Проводимая на первом этапе ПЦР выявляет полиморфизм в краевых областях локуса (местах посадки праймеров), а последующий рестрикционный анализ позволяет анализировать изменчивость во внутренней части

Секвенирование. Кроме описанных выше методов изучение полиморфизма ДНК, существует прямой метод анализа нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот -- секвенирование. Наиболее популярным способом секвенирования является метод терминации цепи, или метод Сэнжэра, основанный на применение дидеооксинуклеотидтрифосфатов. На основании сравнения последовательности нуклеотидов разработан метод SNP анализа (полиморфизм на уровне отдельных нуклеотидов). Использование автоматических секвенаторов позволяет существенно повысить производительность и упростить процедуру анализа последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК образцов.

1.3 Обзор основных методов фитопатологии

Наиболее важной составляющей фитопатологического обследования является установление вида заболевания. Болезнь диагностируется по вызвавшим ее причинам, возбудителю и симптомам поражения или ослабления растения. Для определения болезней пользуются морфологическим, гистологическим, микологическим, физическим, химическим и физиологическим методами.

При использовании морфологического метода, выявление и типирование различных заболеваний зачастую проводят уже при наличии явных симптомов болезни: гнилей, пятнистости листьев, опухолей, некрозов и др., т.е. на поздних стадия ее развития. Кроме того, данный метод не позволяет точно определить возбудителя, т.к. сходные симптомы заболеваний могут быть вызваны различными видами патогенных организмов.

Для установления видовой принадлежности для грибных инфекций используют в основном микроскопический метод. Определение ведут по особенностям строения мицелия, плодовых тел, спор. Однако, проведение достоверного анализа пораженных растительных тканей или почвенных образцов может быть затруднено при отсутствии в собранном материале плодовых тел или спор, деградации мицелия, наличия чужеродных примесей, структур и др. Поэтому для микроскопического метода оптимальным является изучение чистых культур, которые создаются путем изоляции патогенного организма из собранного материала и выращиванием его в лабораторных условиях на специальных питательных средах. К недостаткам метода анализа чистых культур является длительность исследований, их трудоемкость и отсутствие специфических сред для каждого конкретного вида. Кроме того, некоторые грибные организмы в культуре могут терять стадию полового процесса, что делает данные культуры непригодными для видовой идентификации. Особые требования предъявляются также и к уровню квалификации персонала проводящих культивирование и определение микроорганизмов.

Изучение особенностей обмена веществ и биохимического состава клеток ряда фитопатогенов позволило разработать химические экспресс-тесты, позволяющие выявлять наличие инфекции. Однако существующее разнообразие таких тестов невелико, и как правило, для получения четкой положительной реакции требуются высокий уровень зараженности патогеном тканей растения.

Наиболее современными и перспективными способами изучения фитопатогенов являются методы, основанные на анализе молекул ДНК. К настоящему времени ДНК-маркеры нашли свое широкое применение и получили длительную апробацию в различных областях медицины -- для выявления и профилактики инфекционных, врожденных и онкологических заболеваний. Преимуществами ДНК-маркеров, перед остальными группами методов, являются ранняя диагностика болезней, точность определения и быстрота выполнения анализов [2].

Молекула ДНК является материальным носителем информации о строении и функциях организма, и содержится в каждой живой клетке. Информация закодирована в виде последовательности элементарных единиц ДНК -- нуклеотидов. В целом, у каждого индивидуального организма эта последовательность уникальна по строению. Однако, определенное подобие ее фрагментов наблюдается среди всех живых организмов. Наибольшим сходством последовательностей ДНК обладают представители одного и того же вида. По мере увеличения таксономического ранга (род-семейство-порядок и далее) различия постепенно увеличиваются.

Наличие уникальности структуры ДНК разных видов является одной из составляющих, лежащих в основе выявления и идентификации различных патогенов. Другая составляющая базируется на уникальном свойстве молекулы ДНК -- явлении комплементарности. Суть данного процесса заключается в следующем. В нормальном состоянии молекула ДНК состоит из двух параллельных цепей, каждая из которых является своеобразным “зеркальным” отражением другой. И если с помощью какого-либо способа эти цепи разъединить, то в дальнейшем каждая из одиночных нитей будет пытаться восстановить первоначальную двухцепочечную структуру, “отыскивая” комплементарную нить. На данном явлении и построено большинство существующих ДНК-технологий [3].

Материалом для выделения ДНК могут являться любые части растения (как живые, так и мертвые), вода, почва и др. Количество материала достаточного для анализа применительно к растительным тканям может составлять несколько миллиграмм, образцам воды и почвы -- нескольких грамм. В ходе анализа специфические ДНК-зонды отыскивают и связываются с молекулами ДНК патогенного организма, отделяя их от других молекул ДНК, в том числе и растения-хозяина. Следует отметить, что современные методы ДНК-анализа (например, ПЦР-анализ) способны обнаружить болезнетворный микроорганизм даже при условии, что в образце будет присутствовать только одна живая клетка патогена.

Интерпретация данных, полученных с помощью ДНК-анализа, является процедурой несложной и сводится к визуальной оценке наличия/отсутствия ДНК патогена в образце. Также существует ряд компьютерных программ, позволяющих автоматизировать процесс анализа. Количественное определение содержания патогена в образце проводится с помощью одного из разновидностей ДНК-анализа -- RealTime PCR. Кроме того, данный метод также применяется и для оценки устойчивости растений. Принцип анализа состоит в сравнительной оценке содержания в тканях растения чужеродной ДНК патогена по отношению к собственной ДНК растения среди различных инфицированных клонов. Чем ниже это соотношение, тем клон считается более устойчивым.

За последние десятилетие для большинства хозяйственно-важных фитопатогенов расшифрованы некоторые фрагменты ДНК их генома. Данная информация представлена для открытого доступа на Интернет-сайте Генного Банка и ежедневно пополняется. Имеющиеся нуклеотидные последовательности позволяют разработать ДНК-зонды для выявления практически любого вида. С другой стороны, если данный вид является новым или данные о нем в Генном Банке отсутствуют, то с помощью специального прибора -- секвенатора, можно провести расшифровку ДНК этого вида.



Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материал для анализа

В ходе выполнения работы были выбраны пять типов заболеваний хвойных пород, имеющих наибольшее распространение на территории Беларуси: смоляной рак (или серянка), сосновый вертун, шютте (снежное и обыкновенное), корневые гнили, вызываемые корневой губкой и опенком осенним.

В качестве экпериментального материала для разработки системы молекулярно генетического маркирования были использованы чистые культуры патогенов, фрагменты пораженных растений из коллекции кафедры лесозащиты и садово-паркового строительства БГТУ (г. Минск), любезно предоставленные проф. Н.И. Федоровым и к.б.н. Ярмоловичем В.А. Для проверки и оценки качества разработанных маркеров, был использован экспериментальный материал, собранный на территории Гомельского лесхоза и Кореневской экспериментальной лесной базы Института леса НАН Беларуси. Данный материал представлял собой фрагменты плодовых тел грибов, пораженных растений, и образцы почвы из очагов заражения.

2.2 Методика анализа

2.2.1 Выделение ДНК из образцов чистых культур

Навеску мицелия массой 5-10 мг помещали в центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл, содержащую 400 мкл экстрагирующего буфера следующего состава: 200 мМ р-р трис; 250 мМ р-р хлорида натрия; 25 мМ p-p трилона Б; 0,5% лаурилсульфата натрия, (рН буфера довести НCl до значения 8,1).

Далее, используя прокаленные стеклянные пестики, производили гомогенизацию материала при комнатной температуре в течение 30-40 с. По окончании гомогенизации пробирку с растертым образцом закрывали и перемешивали на вихревом смесителе (400-600 мин ^-1) в течение 5 с. После этого пробирки помещали во встряхивающую ванну (200 мин ^-1) и инкубировали в течение 15 мин. при 65 ⁰С.

После экстракции в пробирку добавляли 350 мкл охлажденного р-ра 5М ацетата натрия (рН 5,0). Содержимое перемешивали на вихревом смесителе (400 мин ^-1) и инкубировали на ледяной бане (Т = 0 ⁰С) в течение 60 мин. После инкубации гомогенаты центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 20 мин. По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 650 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и смешивали с 650 мкл хлороформа и центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 20 мин.

По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 500 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и добавляли 500 мкл изопропанола. Содержимое пробирки перемешивали на вихревом смесителе (600 мин ^-1) и оставляли в роторе центрифуги на 5 мин. Далее производили центрифугирование при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 15 мин.

Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 1000 мкл 65% этанола, охлажденного до температуры - 10 ⁰С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Процедуру промывки проводили 2-3 раза для удаления из осадка остатков трилона Б, ацетата натрия и изопропанола.

После промывки этанолом пробирки размещали в штативе горизонтально и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 мин. (Т = 45 ⁰С) до полного испарения этанола.

Высушенный осадок растворяли в 100 мкл бидистиллированной и деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 мин ^-1) при 40 ⁰С в течение 30 мин. Растворенную ДНК хранили при 4 ⁰С для последующего анализа.



2.2.2 Выделение ДНК из пораженных растительных образцов

Фрагмент растения с признаками поражения (масса 40-50 мг) помещали в центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл, содержащую 500 мкл экстрагирующего буфера (Т = 65 ⁰С), следующего состава: 2% р-р бромида цетилтриметиламмония (CTAB); 0,1М р-р трис; 1,4М р-р хлорида натрия; 20 мМ р-р трилона Б, (рН буфера довести НCl до значения 8,0). Далее, используя прокаленные стеклянные пестики, производили гомогенизацию материала при комнатной температуре в течение 30-40 с. По окончании гомогенизации пробирку с растертыми тканями закрывали и перемешивали содержимое на вихревом смесителе (400-600 мин ^-1) в течение 5 с. После этого пробирки помещали на водяную баню и инкубировали в течение 30 мин. при 65 ⁰С.

После экстракции пробирку охлаждали до комнатной температуры, и к образцу добавляли 500 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Содержимое перемешивали на вортексе (200 мин ^-1) в течение 20 мин. при комнатной температуре. Далее центрифугировали при 13000g (Т = 18-20 ⁰С) в течение 10 мин. После этого пипеткой отбирали 500 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и добавляли к нему 100 мкл буфера 5хCTAB (5% р-р CTAB; 350 мМ р-р трилона Б). Содержимое перемешивали на вихревом смесителе (400 мин ^-1) и инкубировали на водяной бане в течение 10 мин. при 65 ⁰С. После инкубации добавляли 500 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Содержимое перемешивали на вортексе (200 мин ^-1) в течение 10 мин. при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 5000g (Т = 18-20 ⁰С) в течение 10 мин. (если раствор был мутный или отмечалось присуствие большого количества осадка в интерфазе, то процедру очистки хлороформом и изоамиловым спиртом повторяли).

По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 300 мкл супернатанта и переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл, после чего добавлялиИ, (рН буфера довести НCl до значения 8,0). Содержимое перемешивали на вихревом смесителе (400 мин ^-1) и оставляли на 60 мин. при комнатной температуре. Далее производили центрифугирование при 13000g (Т = 18-20 ⁰С) в течение 20 мин.

Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК растворяли в 400 мкл буфера следующего состава: 1М р-р хлорида натрия; 10мМ р-р трис; 1мМ р-р трилона Б, (рН буфера довести НCl до значения 8,0). Далее добавляли 500 мкл охлажденного изопропанола и оставляли на 30 мин. После промывки содержимое пробирки центрифугировали при 8000g (Т = 4 ⁰С ) в течение 10 мин. Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК растворяли в 200 мкл дистиллированной воды, затем к раствору приливали 100 мкл 7,5М ацетата аммония (рН 7,5). Пробирки инкубировали на ледяной бане (T = 0 ⁰С) в течение 20 мин., после чего центрифугировали при 13000g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Далее к отобранному супернатанту добавляли 300 мкл охлажденного изопропанола и оставляли на 20 мин., после чего центрифугировали при 13000g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Полученный осадок ДНК промывали 1000 мкл 65% этанола, охлажденным до температуры -10 ⁰С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин.

После промывки этанолом пробирки размещали в штативе и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 мин. (Т = 45 ⁰С) до полного испарения этанола.

Высушенный осадок растворяли в 100 мкл бидистиллированной и деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 мин ^-1) при 40 ⁰С в течение 30 мин. Растворенную ДНК хранили при 4 ⁰С для последующего анализа.

2.2.3 Выделение ДНК из почвы

Навеску образца почвы массой 500 мг помещали в центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл, содержащую 1000 мкл экстрагирующего буфера следующего состава: 200 мМ р-р фосфата натрия; 1 мМ дитиотрейтол (DTT), 100 мМ р-р хлорида натрия; 50 мМ p-p трилона Б; 0,2% р-р гексадецилтриметилбромид аммония (CTAB), (рН буфера довести до значения 8,0).

Далее производили гомогенизацию материала при комнатной температуре путем перемешивания содержимого пробирок на вихревом смесителе (2400-2600 мин ^-1) в течение 30 мин.

После гомогенизации образцы центрифугировали при 15000?g (Т = 25 ⁰С) в течение 30 мин. По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 750 мкл супернатанта, и переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и смешивали с 750 мкл хлороформа. Далее производили перемешивание содержимого пробирок на вихревом смесителе (400-600 мин ^-1) в течение 10 мин. и далее центрифугировали при 15000?g (Т = 25 ⁰С) в течение 20 мин.

По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 700 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и добавляли 750 мкл осаждающего буфера следующего состава: 20% р-р полиэтиленгликоля (PEG) 6000 и 2,5 M р-р хлорида натрия. Содержимое пробирки перемешивали на вихревом смесителе (600 мин ^-1) и инкубировали (Т = 25 ⁰С) в течение 30 мин. Далее производили центрифугирование при 15000?g (Т = 25 ⁰С) в течение 30 мин. Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 1000 мкл 65% этанола, охлажденного до температуры - 10 ⁰С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15000?g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Процедуру промывки проводили 2-3 раза для удаления из осадка различных примесей ингибирующих ПЦР.

Далее полученный осадок ДНК растворяли в 200 мкл дистиллированной воды, затем к раствору приливали 100 мкл 7,5М ацетата аммония (рН 7,5). Пробирки инкубировали на ледяной бане (T = 0 ⁰С) в течение 20 мин., после чего центрифугировали при 13000?g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Далее к отобранному супернатанту добавляли 300 мкл охлажденного изопропанола и оставляли на 20 мин., после чего центрифугировать при 13000?g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин.

Полученный осадок ДНК промывали 1000 мкл 65% этанола, охлажденным до температуры -10 ⁰С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15000?g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. После промывки этанолом пробирки размещали в штативе горизонтально и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 мин. (Т = 45 ⁰С) до полного испарения этанола. Высушенный осадок растворяли в 100 мкл бидистиллированной и деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 мин ^-1) при 40 ⁰С в течение 30 мин. Растворенную ДНК хранили при 4 ⁰С для последующего анализа.

2.3 Проведение ПЦР

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в специальных полипропиленовых пробирках объемом 0,2 мл.

На основании проведенного сравнительного изучения различных вариантов ПЦР-смеси была выбрана оптимальная смесь, состав которой представлен в таблице 1.

Таблица 1 -- Состав ПЦР-смеси, используемой в ходе анализа

Наименование реагента	на 1 образец (мкл)
Вода	18,2
10хПЦР-буфер (100 мM Трис-HCl (pH 8.8 при 25 0C), 500 мM KCl, 0.8% Nonidet P40)	2,5
MgCl2, 25 мМ	2,5
дНТФ, 10 мМ	0,4
Праймер ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG), 100 мкМ	0,1
Праймер ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC), 100 мкМ	0,1
Taq-полимераза (5 ед./мкл)	0,2
Образец ДНК (30-40 нг/мкл)	1
Общий объем ПЦР-смеси	25

Подбор условий протекания ПЦР для амплификации локусов из препаратов ДНК, полученных из различных типов образцов, позволил оптимизировать программу амплификации:

1 этап (1 цикл):

Денатурация. t = 3 минуты, T = 94 ⁰С.

2 этап (35-40 циклов):

Денатурация. t = 20 секунд, T = 94 ⁰С.

Отжиг. t = 25 сек, T = 65 ⁰С.

Элонгация. t = 45 секунд, T = 72 ⁰С.

3 этап (1 цикл):

Элонгация. t = 7 минут, T = 72 ⁰С.

Охлаждение реакционной смеси. t = 5 минут, T = 4 ⁰С.

2.4 Проведение рестрикционного анализа ампликонов

В ходе работы была использована рестрикционная смесь следующего состава: 10 ? кратный буфер Tango (Fermentas) -- 1 мкл, дистиллированная вода (MilliQ) -- 2 мкл, образец ампликона (40-50 нг/мкл) -- 5 мкл, раствор рестриктазы (5 едениц/мкл) -- 1 мкл. Были использованы рестриктазы MspI, TaqI, AluI, RsaI, HinfI, HaeIII.

Рестрикционную смесь инкубировали при 37 ⁰С в течение 16 ч. Реакцию остановливали добавлением 1 мкл 0,5 М р-ра Трилона Б (рН = 7,5), либо денатурированием фермента при 70 ⁰С в течение 15 мин.

2.5 Проведение электрофоретического анализа

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в агарозном геле. Агарозный гель (1,4%) приготавливался путем растворения 1,4 г агарозы (2000 -- 3000 мономеров) в 98,6 г 1,5 ? Трис-ЭДТА-боратного буфера. Гель помещался в электрофоретическую камеру типа “Submarine” (фирма “Helicon”). В этом типе камер катодный и анодный отсеки заполняются 1,5 ? Трис-ЭДТА-боратным буфером, таким образом, чтобы гель был погружен в буфер на 5 мм. Загрузочный раствор каждой дорожки состоял из 6 мкл образца ДНК и 1 мкл загрузочного буфера (30% глицерин, 0,5% бромфеноловый синий). Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 2 ч. При следующих параметрах тока -- 90 V/60 мА.

Визуализация продуктов электрофореза достигалась окрашиванием гелевых пластин в растворе бромистого этидия. Гелевая пластина помещалась в раствор бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и выдерживалась в красителе в течение 15 мин. Затем гель извлекался и промывался в дистиллированной воде для удаления остатков красителя. Для визуального наблюдения гель помещался в УФ-трансиллюминатор. Фотодокументирование продуктов электрофореза достигалось за счет видеосканирования в УФ-свете специальной системой Image Master (фирма “Amersham Pharmacia Biotech”). Расчет размеров выявляемых зон производился с помощью программного обеспечения Quantity One (фирма “Biorad”). Ошибка при определении молекулярного веса ПЦР-зон соответствовала требованиям предъявляемым к агарозным гелям и не превышала 3%.

2.6 Изолирование фрагментов из геля и реамплификация

Для видовой идентификации патогенов в образцах почвы и фрагментах раститений производили иссечение фрагмента геля, содержащего ДНК-фрагмент патогена. Фрагмент геля помещали в криогенную пробирку и замораживали в жидком азоте на 1-2 ч. Затем пробирку размораживали и разделяли содержимое на фракции путем центрифугирования при 15000?g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин.

По окончании центрифугирования пипеткой отбирали 50 мкл супернатанта, переносили в другую центрифужную пробирку типа “Eppendorf” объемом 1,5 мл и смешивали с 100 мкл этанола и центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 20 мин.

Супернатант сливали, а полученный осадок ДНК промывали 500 мкл 65% этанола, охлажденного до температуры - 10 ⁰С. После промывания содержимое пробирки центрифугировали при 15000g (Т = 4 ⁰С) в течение 10 мин. Процедуру промывки проводили 2-3 раза для удаления из осадка остатков электрофоретического буфера.

После промывки этанолом пробирки размещали в штативе горизонтально и, открыв крышки, просушивали осадок ДНК в течение 30-40 мин. (Т = 45 ⁰С) до полного испарения этанола.

Высушенный осадок растворяли в 1000 мкл бидистиллированной и деионизированной воды во встряхивающей ванне (200 мин ^-1) при 40 ⁰С в течение 3 мин. Растворенную ДНК хранили при 4 ⁰С для последующего анализа.

2.7 Проведение секвенирования фрагментов

Пробоподготовка образцов и секвенирование фрагментов ДНК было осуществлено научным персоналом лаборатории генетики и биотехнологии Института леса НАН Беларуси с помощью генетического анализатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) по методике, предложенной фирмой производителем.

2.8 Обработка генетических данных

Интерактивный рестрикционный анализ нуклеотидных последовательностей производился с помощью программы NEBcutter V2.0.

Полученные результаты секвенирования в формате FASTA были использованы для идентификации видов с помощью программы BLAST (http://0-www.ncbi.nlm.nih.gov.mill1.sjlibrary.org/BLAST/) в генном банке http://0-www.ncbi.nlm.nih.gov.mill1.sjlibrary.org/genome/seq/BlastGen/BlastGen.

Анализ размеров ампликонов, получаемых в ходе ПЦР-диагностики проводился с помощью программы Beacon Designer V.3.0., CLC Sequence Viewer 6., NEB Cutter 2.0.