Молекулярно-генетическая диагностика наиболее распространённых грибных инфекций хвойных пород Беларуси



Глава 3. Полученные результаты

Проведенный анализ различных заболеваний позволил идентифицировать следующие виды грибных патогенов, которые представлены в таблице 2.

Таблица 2 -- Выявленные виды грибных патогенов

Название патогена	Название заболевания
Melampsora pinitorqua	Сосновый вертун
Phacidium infestans	Снежное шютте
Lophodermium pinastri	Обыкновенное шютте сосны
Peridermium pini	Смоляной рак (сосна)
Cronartium flaccidum	Смоляной рак (сосна)
Heterobasidion annosum	Корневая губка (сосна)
Heterobasidion parviporum	Корневая губка (ель)
Armillariella mellea	Корневая гниль (Опенок осенний)
Armillaria borealis	Корневая гниль (Опенок осенний)

Ниже приведены наиболее распространенные (консенсусные) нуклеотидные последовательности для каждого из вида, полученные для белорусских изолятов.

3.1 Смоляной рак

Признаки поражения растений при данном заболевании были следующими: стволы пораженных деревьев характеризовались наличием многолетних ран, расположенных вдоль и по окружности ствола. Раны были вытянутой формы, длиной 60-120 см. Кора на ранах была отшелушена или отсутствовала. Вытекающая из разрушенных смоляных ходов смола застывала на воздухе в виде серо-желтых желваков и потеков, придавая ранам характерную черновато-желтоватую окраску. Раны располагались на всем протяжении ствола, чаще - в средней и верхней частях.

Проведенный сравнительный анализ возбудителей смоляного рака -- Cronartium flaccidum и Peridermium pini выявил, что они представляют собой один и тот же вид. Cronartium flaccidum является телеоморфой (половая стадия), а Peridermium pini аноморфой (бесполая стадия).

Нуклеотидная структура ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона была следующая:

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ttaaaaaaaa aaggcaaagg ggtgcccttt

61 attttgtggc tctgaacctt ttaaatatat tttaacccat ttttaaaacc caaagttgtt

121 atgtgtgcct tttttggtat agcatctcaa cagtacgtta acttgtgttg ttgtttcaca

181 tgagctctga cattaccccc ctttataagt gacccttttt tttttaatta attactcttt

241 ataaaaatgt tcttaagaat gtaaaaaaaa aaccccttat aaaaataact tttaacaatg

301 gatctcttgg ctctcacatc gatgaagaac acagtgaaat gtgataagta atgtgaattg

361 cagaattcag tgaatcatca aatctttgaa cgcaccttgc accttttggt attccaaaag

421 gtacacctgt ttgagtgtca tgaaaccctc tcattccaat tcttatatat ttttttatat

481 aaggattttt gtgtaatgga tgatgagtgt tgctattaat tatatatata tagctcactt

541 taaatatata agtactttta tttgaaaaat aaatggagta atacttggtg taatatttat

601 attattcatt gaggagtgtg tagtttttta attacttaca gccatttatt tttcagataa

661 atagcttctt aaccccaatt tccatttttt tagacctcaa atcaggtggg actacccgct

721 gaacttaagc atatcaataa gcggagga

3.2 Сосновый вертун

Сосновый вертун был выявлен в питомниках, а также в молодняках сосны до 10--12-летнего возраста. Признаки пораженных растений были следующими: наличие эцидий гриба под эпидермисом побегов, образующих жёлтые продолговатые вздутия, на месте которых появляется засмолённая язва. Вышележащая часть побега зачастую была засохшей или искривленной. На хвоинках и стволиках всходов и сеянцев 1-го года было выявлено наличие эцидий, располагающихся прерывистыми рядами.

Нуклеотидная структура ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона возбудителя соснового вертуна Melampsora pinitorqua была следующая:

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atacatgttg agnttgcttt attgcgattc

61 tttgtatnac cattnnnacc ccccaaccca gaggtgcatt gtggcctttc acgaggttag

121 cagtgtatca gtacgtatta caaagtctga ctttgtctta cattacatat aagttacccc

181 ccatttacac ttaagaagtt ttaagaatga taccctataa ttatataact ttcagcaatg

241 gatctctagg ctctcacgtc gatgaagaac acagtgaaat gtgatacgta atgtgaatcg

301 cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcactttgc accttttggt tattccgaaa

361 ggtacgcctg tttgaatgtc acaaaactcc cctcggcttt aacactttct aaaagggtta

421 ttgacggatt ctgagtgttg gcgtgtcaac gcctcgcttt aaatatatca gcacttttgg

481 atggttccat gttagttcaa aagacgtact tgatgtcgta tttatacaat tcatcgagat

541 ggtctttggt cgtatcgact atccgctaat atgatgactt gaagaatagc ttcctaaccc

601 cattaaattt acctttagac ttcaaatcag gtgggactac ccgctgaact taagcatatc

661 aataagcgga gga

3.3 Снежное шютте

Снежное шютте было выявлено в питомниках и молодых культурах сосны. Признаки инфицированных растений были следующими: поражённая хвоя под снегом имела бледно-оливковую или «мраморную» окраску. После схода снега больные растения были покрыты сероватыми быстро исчезающими плёнками мицелия. При более позднем обследовании было выявлено отмирание хвои, сопровождающееся изменением окраски на красновато-рыжую, затем серую, и в конце пепельно-белесоватую. Отмершая хвоя характеризовалась хрупкостью, однако практически не опадала.

Нуклеотидная структура ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона возбудителя снежного шютте Phacidium infestans была следующая:

1 gaactgcgga aggtcattac agagttcatg ccctcacggg tagatctccc acccttgtat

61 atatataatt atctgttgct ttggcgggcc gcgagcctag cttgcccggg ttctgcccgg

121 cgtgcccgcc agaggaagcc taaaccctga atgttagtgc gtctgagtac tatataatag

181 ttaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc

241 gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc

301 cccttggtat tccggggggc atgcctgttc gagcgtcatt ataaccaatc cagcctggct

361 gggtcttggg cctcgcggta tagcgggctt taaaaacagt ggcggtgctc tcatgctata

421 cgcgtagtaa ttttctcgct atagggttct gggagatgct tgccaacaac ccccaattta

481 tataggttga cctcggatca ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg

541 agga

3.4 Обыкновенное шютте сосны

Обыкновенное шютте сосны было выявлено в питомниках. Признаки поражения сводились пожелтению хвои и ее отмиранию, а затем к появлению темных поперечных линий на отмерших хвоинках.

Нуклеотидная структура ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона возбудителя обыкновенного шютте сосны Lophodermium pinastri была следующая:

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattt gggatcgggc ttcacggccg ctatattctc

61 accctttgtt aactacactt tgttgccttg gcgcctagtg ccagtggacc aaaacccttg

121 aatcattgct gtctgagtac tatataatag ttaaaacttt caacaacgga tctcttggtt

181 ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg

241 aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cccctggcat tccggggggc atgcctgttc

301 gagcgtcatt acaaccctca agctctgctt ggtattgggc tcgccccgta gggcttgcct

361 caaaatcagt ggcggccact gtccgaccct tcagcgcagt actactcgtg gctcgtagga

421 ggatgggaag ccgttataca acccccacca tacaaggttg acctcggatc aggtagggat

481 acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga

3.5 Корневая губка

Корневая губка была выявлена в усыхающих культурах сосны 25-летнего возраста. Признаки полного поражения растений сводились к наличию плодового тела патогена на нижней части ствола. Плодовые тела достигали 20-30 см в длину, большей частью распростертые, с отвороченными в виде шляпки краями. Поверхность шляпок была желтовато-коричневая или коричневого цвета с концентрическими полосами. Ткань у молодых плодовых тел была белая, у старых- желтая. Трубочки короткие, с маленькими округлыми белыми порами.

Нуклеотидные структуры ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона возбудителей корневой губки сосны (Heterobasidion annosum) и ели (Heterobasidion parviporum) в целом оказались сходными:

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta acgaatatcg tgcggggttg aagctggcct

61 ctcggggcat gtgctcgcct tgttcatatc catctcacac ctgtgcacac tcgcgtgggt

121 cggtcgggct cttttttgcg cccttccgag ccgcgtcttc tcacaaactc ttcgtatgtc

181 ttcagaatgg tatcaatgct ataaaacgca tcttatacaa ctttcaacaa tggatctctc

241 ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc

301 agtgaatcat cgaatctttg aacgcacctt gcgccctttg gtattccgaa gggcacgcct

361 gtttgagtgt cgtgaaattc tcaaccctgc gcttttcttg tgaaagcgcg tgggcttgga

421 cttggaggct ttgctggtcc tcgcggatcg gctcctctca aatgcattag cgagaccctt

481 gtggtgccgc ccccggtgtg ataattgtct acgccgtggg tacaccgcga ttgtggggga

541 cctgcttcca accgtcgaaa gacaacttca tcgaaacttg acctcaaatc aggcgggact

601 acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga

3.6 Опенок осенний

Пораженные осенним опенком деревья сосны были выявлены в природных насаждениях. Признаки поражения дерева опенком были следующими: наличие продольных трещин на корнях, потемнение и влажная гниль луба, присутствие ризоморф на корнях или плодовых тел опенка. Плодовые тела были однолетние, и имели вид мясистых шляпок на центральной ножке. Шляпки были округлые, до 15 см в диаметре. Поверхность шляпок была желтовато-бурой или желтовато-коричневой, с желтоватыми или бурыми чешуйками. Ткани плодовых тел были белыми или беловатыми с приятным запахом. Под шляпкой находилось беловатое пленчатое пушистое кольцо. Плодовые тела были расположены группами, распространяющимися по стволу на высоту 1-2 м.

Нуклеотидные структуры ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона возбудителей корневой гнили, вызванной опенком осенним были следующими:

Armillariella mellea

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta atgaaacttg aattngtagc attgagaact

61 gttgctgacc tgttaaaggg tatgtgcacg ttcaaagtgt tacgggttct gttctaatcc

121 acctgtgcac ctttgtagac ttggttaagc ttcgctttcg agcggtttga agggttgctt

181 gctttcgagc taagctccgt ttgtcttacc gagtctatgt ctatataaac ttttgtatgt

241 ttagaatgtc ttgtttatag gacgcaagtc ctttaaatgt tatacaactt tcaacaacgg

301 atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataactaa tgtgaattgc

361 agaattcagt gaatcatcga gtctttgaac gcaccttgcg ccctttggta ttccgaaggg

421 catgcctgtt tgagtgtcat taaattctca acctcgcctt cttttattac aagtgcggtg

481 gattggatta tgggggtttg ctggtctcta acgagatcag ctcctctgaa atgcattagc

541 agaaaccgtt tgactttggc tgctaggctg tgataatatc tacgctttgg tagtcgggtt

601 ggaatataaa gtgttagagt ggtaaggaaa ctggcttagg atcggtttgg agggttgctt

661 aacggctcct tttactttct ccctttgttg gagatacttg tccgattgta agagaggaaa

721 tngcttagcg caagcttagc tttccaagag tttcttgtta cngcttgact ttgtagaagg

781 attcagcttc taacggtcca ttgacttgga caatttattg actatttgac ctcaaatcag

841 gtaggactac ccgctgaact taagcatatc aataagcgga gga

Armillaria borealis

1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ttgaaacttg aatcgtagca ttgagaactg

61 ttgctgacct gttaaagggt atgtgcacgt tcgacgtgtt gcgttctatt catccacctg

121 tgcacctttg tagacttgat taactttcgc tctcgagcgg ttagaagggt tgcatttcga

181 gctccctttg tctatcaagt ctatgtctat ataatctctt gtatgtctag aatgtcttgt

241 ttatgggacg caagtccttt aaatcttata caactttcaa caacggatct cttggctctc

301 gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aactaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat

361 catcgagtct ttgaacgcac cttgcgccct ttggtattcc gaagggcatg cctgtttgag

421 tgtcattaaa ttctcaacct tccccttctt tcataaggag tgcggcggat tggatatggg

481 ggtttgctgg tttctaacga aatcagctcc tctgaaatgc attagcagaa accgtttgac

541 tctggctgct aggctgtgat aatatctacg ccttggtagt tgggtcggaa tacgagtcat

601 acagtggtaa ctaatcaggc tttcgagtct ggcttaggat tggtttggaa ggtgcttaac

661 ggctccttct gctttctccc tttgtggaga tacttgtccg attctaagag aggagttgct

721 tagcgcgagc ttagctttcc ttgatttttc ccttgacttt gtagaaggat tcagcttcta

781 accgtccatt gacttggaca atttattgac tatttgacct caaatcaggt aggactaccc

841 gctgaactta agcatatcaa taagcggagg a



Глава 4. Анализ и обобщение результатов

В ходе проведенного ПЦР-анализа и секвенирования чистых культур изученных патогенов были определены точные размеры ампликонов, представленные в таблице 3.

Таблица 3 -- Размер амликонов для различных грибных патогенов

Название патогена	Размер ампликона в п.о.
Peridermium pini, или Cronartium flaccidum	748
Melampsora pinitorqua	673
Phacidium infestans	553
Lophodermium pinastri	515
Heterobasidion annosum и Heterobasidion parviporum	635
Armillariella mellea	883
Armillaria borealis	871

Как, видно из таблицы, все грибные патогены имеют достаточно явные различия по величине амплифицированного фрагмента, что может быть использовано на первом этапе видовой диагностики. Так, например при анализе почвы на наличие корневой губки, можно идентифицировать данный вид в ПЦР-спектре микромицетов, что представлено на рисунке 1.

Рисунок 1 -- ПЦР-спектры видового разнообразия микромицетов в образцах почвы, зараженных корневой губкой (стрелками обозначены ампликоны корневой губки)



Аналогичные результаты были получены и для тканей, растений имеющие инфекцию со стороны Heterobasidion annosum, что показано на рисунке 2.

Рисунок 2 -- ПЦР-спектры образцов тканей сосны, пораженных различными инфекциями (стрелками обозначены образцы ампликонов корневой губки)

Исходя из структур полученных ампликонов с помощью программного обеспечения CLC Sequence Viewer 6. и NEB Cutter 2.0.для кажого из патогена были подобраны рестриктазы фрагментирующие регион ITS1-5.8SrRNA-ITS2 в консервативных для вида областях. Назвние рестриктаз и спектр рестрикционных фрагментов для каждого из видов представлены в таблицах 4-10.

Таблица 4 -- Рестрикционные спектры Peridermium pini, или Cronartium flaccidum

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	1	748
TaqI	2	319, 429
AluI	4	84,131, 184,349
RsaI	4	131,154,195,268
HinfI	2	372, 376
HaeIII	1	748



Таблица 5 -- Рестрикционные спектры Melampsora pinitorqua

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	1	673
TaqI	7	1, 21, 59, 74, 118, 184, 216
AluI	3	42, 84, 547
RsaI	5	55, 77, 144, 166, 231
HinfI	6	8, 17, 56, 107, 239,246
HaeIII	2	104, 569

Таблица 6 -- Рестрикционные спектры Phacidium infestans

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	4	11, 106, 195, 232
TaqI	4	53,59, 215, 217
AluI	2	100, 444
RsaI	2	168, 376
HinfI	3	8, 266, 270
HaeIII	3	88, 174, 282

Таблица 7 -- Рестрикционные спектры Lophodermium pinastri

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	2	233, 282
TaqI	4	53, 59, 187, 216
AluI	2	193, 322
RsaI	3	115, 138, 262
HinfI	4	8, 120, 120, 267
HaeIII	1	515

Таблица 8 -- Рестрикционные спектры Heterobasidion annosum и Heterobasidion parviporum

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	2	142, 493
TaqI	5	16, 59, 64, 245, 251
AluI	2	53, 582
RsaI	2	114, 521
HinfI	3	8, 304, 323
HaeIII	2	57, 578

Таблица 9 -- Рестрикционные спектры Armillariella mellea

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	1	883
TaqI	5	27, 59, 133, 158, 506
AluI	10	5, 5, 11, 23, 24, 40, 97, 149, 203, 326
RsaI	1	883
HinfI	5	8, 103, 160, 211, 401
HaeIII	1	883

Таблица 10 -- Рестрикционные спектры Armillaria borealis

Название рестриктазы	Количество зон в спектре	Размер выявляемых зон
MspI	1	871
TaqI	7	24, 59, 62, 91, 127, 248, 260
AluI	6	5, 40, 97, 181, 223, 325
RsaI	1	871
HinfI	9	8, 31, 40, 56, 68, 72, 103, 173,317
HaeIII	1	871

Как видно из данных представленных в таблице ряд спектров характеризуется фрагментами, разница размера между которыми не превышает разрешающей силы электрофоретического фракционирования 1,4% агарозного геля. Такие зоны на фореграммах будут представлять одну диффузную фракцию. Исходя из данных ограничений для каждого из вида был составлен атлас рестрикционных спектров, исходя из существующих технологических условий и результатов фракционирования. Электрофоретические спектры представлены на рисунках 3-9.



Рисунок 3 -- Рестрикционные спектры Peridermium pini, или Cronartium flaccidum

Рисунок 4 -- Рестрикционные спектры Melampsora pinitorqua

Рисунок 5 -- Рестрикционные спектры Phacidium infestans

Рисунок 6 -- Рестрикционные спектры Lophodermium pinastri

Рисунок 7 -- Рестрикционные спектры Heterobasidion annosum и Heterobasidion parviporum

Рисунок 8 -- Рестрикционные спектры Armillariella mellea

Рисунок 9 -- Рестрикционные спектры Armillariella borealis

Проведенная проверка данных, представленных в атласе, показала полную идентичность получаемых рестрикционных спектров. Фореграммы некоторых образцов представлены на рисунках 10-11.



Рисунок 10 -- Сравнительный анализ данных атласа и результатов электрофоретического фракционирования

Образцы 1, 4, 5, 8 -- различные изоляты H. annosum (HinfI), 2,3 -- изоляты Peridermium pini (AluI), 6,7 -- изоляты Cronartium flaccidum (AluI), 9 -- Lophodermium pinastri (MspI)

Рисунок 11 -- Рестрикционные спектры патогенов чистых культур

На основании обобщенных результатов амплификации и рестрикционного анализа, разработан первичный вариант стратегии определения основных патогенов хвойных видов Беларуси, представленный в таблице 11.

Таблица 11 -- Стратегия проведения диагностики патогенов с помощью молекулярных маркеров

Отбор образцов для анализа
Почва	Растение	Чистые культуры
Выделение ДНК
Амплификация ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона (Таблица 1)
Анализ электрофоретических спектров ампликонов
Выявление в видовом спектре микромицетов зон, аналогичных по размеру с искомыми патогенами	Определение количества патогенных видов в растении по количеству различных ампликонов, исключая ампликоны растения хозяина.	Первичная диагностика по размеру ампликона с имеющейся базой данных (Таблица 3)
Изоляция ампликонов совпадающих размером с ампликонами патогенов из базы данных (Таблица 3)	Изоляция всех ампликонов по отдельности.
Реамплификация ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона	Реамплификация ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона	Проведение рестрикционного анализа
Анализ электрофоретических спектров ампликонов	Анализ электрофоретических спектров рестриктов
Первичная диагностика по размеру ампликона с имеющейся базой данных (Таблица 3)	Первичная диагностика по размеру ампликона с имеющейся базой данных (Таблица 3)	Окончательное установление вида патогена согласно данных атласа (Рисунок 3-9)
Проведение рестрикционного анализа	Проведение рестрикционного анализа
Анализ электрофоретических спектров рестриктов	Анализ электрофоретических спектров рестриктов
Окончательное установление вида патогена согласно данных атласа (Рисунок 3-9)	Окончательное установление вида патогена согласно данных атласа (Рисунок 3-9)



Заключение

1. Отработана методика выделения суммарной ДНК из почвы, растительных тканей и чистых культур грибов.

2. Отработана методика амплификации ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона патогенных грибов.

3. Проведено изучение особенностей ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона патогенных грибов, вызывающих пять типов заболеваний хвойных пород, имеющих наибольшее распространение на территории Беларуси (смоляной рак (или серянка), сосновый вертун, шютте (снежное и обыкновенное), корневые гнили, вызываемые корневой губкой и опенком осенним).

4. Определен видовой состав патогенов методом секвенирования ITS1-5.8SrRNA-ITS2 региона изолятов: Melampsora pinitorqua, Phacidium infestans, Lophodermium pinastri, Peridermium pini, Cronartium flaccidum, Heterobasidion annosum, Heterobasidion parviporum, Armillariella mellea, Armillaria borealis.

5. Проведенный сравнительный анализ возбудителей смоляного рака -- Cronartium flaccidum и Peridermium pini выявил, что они представляют собой один и тот же вид. Cronartium flaccidum является телеоморфой (половая стадия), а Peridermium pini аноморфой (бесполая стадия).

6. Разработан атлас определения 7 видов патогенов на основании использования ПЦР-ПДРФ-анализа.

7. Разработан вариант стратегии диагностики грибных инфекций на основании использования молекулярно-генетического атласа грибных инфекций.



Литература

1. Картель Н.А. Генетика: Энциклопедический словарь / Н.А. Картель, Е.Н. Макеева, А.М. Мезенко. - Минск: Технология, 1999. - 448 с.

2. Westermeier R. Electrophoresis in practice (Third Edition) / R. Westermeier. -WILEY-VCH Verlag: Weinheim, 2001. - 349 р.

3. Ford-Lloyd B. Measuring genetic variation using molecular markers / B. Ford-Lloyd, K. Painting. - Rome: International Plant Genetic Resources Institute, 1996. - 72 p.

4. Which DNA Marker for Which Purpose. Final Compendium of the Research Project Development, optimisation and validation of molecular tools for assessment of biodiversity in forest trees in the European Union / URL; E.M. Gillet (lead.), DGXII Biotechnology FW IV Research Programme Molecular Tools for Biodiversity. - Frankfurt, 1999. - 253 p.

5. Гостимский С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений / С.А. Гостимский, З.Г. Кокаева, В.К. Боброва В.К. // Генетика. - 1999. - Т. 35, № 11. - С. 1538-1549.

6. Падутов В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа / В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. - Мн.: Юнипол, 2007. - 176 с.

7. Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / T. Maniatis, J. Sambrook, E.F. Fritsch. - Cold Spring Harbor: Laboratory Press, 1989. - 321 р.

8. Дорохов Д.Б. Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. - 1997. - Т. 33, № 4 - С. 443-450.

9. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях: Научно-методическое руководство / Под. ред. Ю.М.Сиволапа.- Киев: Аграрная наука, 1998. - 156 с.

10. Справочник по защите леса от вредителей и болезней / И.В. Тропин, Н.М., Ведерников, Р.А. Крангауз и др. - М.: Лесная промышленность, 1980. - 376 с.

11. Kumar S. Evolutionary relationships of eukaryotic kingdoms / S. Kumar, A. Rzhetsky // J. Mol. Evol. - 1996. - V. 42. - P. 183-93.

12. The fungal mitochondrial genome project: evolution of fungal mitochondrial genomes and their gene expression / B. Paquin [et al.] // Curr. Genet. - 1997. - V. 31. - P. 380-95.

13. Van de Peer, Y. Evolutionary relationships among the eukaryotic crown taxa taking into account site-to-site rate variation in 18S rRNA / Y. Van de Peer, R. De Wachter // J. Mol. Evol. - 1997. - V. 45. - P. 619-30.

14. Phytophthora Threat Management: Standard Operating Procedure: Department for Environment and Heritage, 2002. - 48 p.

15. Newhook, F.J. Tabular key to the species of Phytophthora / F.J. Newhook, G.M. Waterhouse, D.J. Stamps // Mycotaxon. - 1976. - V. 32. - P. 199-217.

16. Revised Tabular key to the species of Phytophthora / D.J. Stamps [et al.] // 2nd Ed. Mycological Paper / Commonwealth Mycological Institute. - Kew, 1990. - №. 162: Mycological Paper. - P. 45-66.

17. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection of Phytophthora species infecting potatoes / P.W. Tooley [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - V. 63. - P. 1467-1475.

18. Mackay I.M. Real-time PCR in virology / I.M. Mackay, K.E. Arden, A. Nitsche // Nucleic Acids Res. - 2002. - V. 30. - P. 1292-1305.

19. Development of a one-step real-time PCR assay for diagnosis of Phytophthora ramorum / K.J.D. Hughes [et al.] // Phytopathology (in press).

20. Sequence analysis of the small subunit ribosomal RNAs of three zoosporic fungi and implications for fungal evolution / Fцrster H. [et al.] // Mycologia. - 1990. - V. 82. - P. 306-312.

21. Cooke D.E.L. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on the ITS1 and ITS2 sequences of ribosomal DNA / D.E.L. Cooke, J. M. Duncan // Myc. Res. - 1997. - V. 101. - P. 667-677.

Размещено на Allbest.ru