Инфекционное заболевание расплода медоносных пчел, вызываемое спорообразующей бактерией паенибациллюс ларве (Paenibacillus larve) - паенибацилла личиночная.

Это злокачественный гнилец, наиболее опасное заболевание расплода медоносных пчел. Приводящее к массовой гибели расплода, вследствие чего наступает резкое ослабление пчелиной семьи и затем ее гибель.

Возбудитель обладает высокой устойчивостью во внешней среде.

Признаки болезни: поражается печатный расплод, при этом погибают личинки рабочих пчел, маток, трутней в стадию выпрямления предкуколок, реже куколок. Заболевание чаще проявляется в конце июня, реже в мае, а классические признаки обнаруживаются в июле. Отмечают пестрый расплод, когда ячейки со здоровыми личинками разного возраста чередуются с больными и погибшими. Крышечки над погибшими личинками потемневшие, втянутые внутрь (вдавленные; личинка, прикрепленная в центре с внутренней стороны крышечки, подсыхая, втягивает её). Цвет личинок и предкуколок серо-желтый, затем он становится серовато-коричневым, коричневым, темно-кофейным. Крышечки продырявлены, отверстия имеют неровные, рваные края, иногда в одной крышечке обнаруживаются два и более отверстия. Это объясняется тем, что пчелы, проделывая отверстия, пытаются очистить ячейку, однако натыкаются на тягучую гниль и, не справившись с работой, прекращают её.

Гнилостная масса очень тягучая, в виде тонкой нити (паутины, может тянуться 15 см и более за спичкой или пинцетом), имеет запах разогретого столярного клея. Постепенно подсыхая. Гниль превращается в корочку, которая в ячейке располагается весьма характерно и специфично для американского гнильца, лежит на нижней стороне ячейки и части дна. Высохшая корочка чрезвычайно прочно прикрепляется к стенке и донышку, и если отделяется, то с большими трудностями: порой легче разрушить ячейку сота, чем извлечь корочку. Нередко отмечается шелковистость сота, он как бы покрыт лаком. Это чаще наблюдается при «махровом» американском гнильце. Пчелы из-за липкой, тягучей гнили не способны очистить ячейки, а когда количество погибших личинок на соте резко увеличивается, пчелы превращают его в «кладбище», покрывая их прополисом вместе с воском, отсюда и высокая злокачественность заболевания. Сами пчелы справиться с ним не могут, и семья гибнет в середине или конце лета. У слабо пораженных пчелиных семей постепенно уменьшается количество молодых пчел, часть таких семей погибает зимой или ранней весной, так как они идут в зиму с недостаточным количеством молодых пчел.

1.3 Парагнилец (ложный гнилец)

Это заболевание личинок позднего возраста и куколок, вызываемое бациллой параальвеи (Bacillus paraalvei).

Клинические признаки данного заболевания напоминают симптомы европейского и американского гнильцов. Заболевание характеризуется поражением открытого и печатного расплод а. Больные личинки теряют блеск, изменяют окраску от жемчужно-белой до серовато-белой (тусклой), меняется положение тела личинки перед ее гибелью. Гибель личинок чаще всего происходит после их запечатывания пчелами. При поражении печатного расплода вначале изменяются крышечки. Они утолщаются. Становятся жирными, вогнутыми, коричневого цвета. Личинки и куколки, находящиеся под крышечками, становятся прозрачными, теряют сегментацию, у куколок просвечивается трахея и пищеварительный тракт. Чаще крышечки имеют отверстия неправильной формы. Погибшие личинки разлагаются, превращаются в водянистую, а затем в более тягучую гнилостную массу неприятного запаха. При удалении её из ячеек. Образуются короткие, легко рвущиеся нити. После высыхания гниющей массы образуются темные, красновато-коричневые (красно-бурые) корочки, которые легко отделяются от стенок ячеек и удаляются из них.

Пораженные куколки недоразвиты, темно-коричневого цвета, слегка размягчены. При этом количество погибших личинок в запечатанных ячейках больше чем в открытых.

Таким образом, на основании клинико-эпизоотологических данных ставят предварительный диагноз. Что позволит в дальнейшем проводить лабораторные исследования более целенаправленно.

Необходимо также помнить, что гнильцовые болезни часто протекают атипично и сопровождаются сходными признаками с другими болезнями: мешотчатым расплодом, застуженным расплодом, варроозом и др. В связи с этим, для постановки окончательного диагноза, необходимо в обязательном порядке использовать лабораторные методы диагностики, включая бактериологический (микроскопия, выделение чистой культуры и изучение их биологических свойств), серологический (определение антигенных свойств путем постановки серологических реакций), постановку биопробы и фагодиагностику.

Достоверность и точность лабораторных исследований во многом зависит от того, на сколько правильно взят патологический материал, упакован и в какие сроки доставлен.

1.4 Лабораторная диагностика гнильцовых болезней

Для уточнения диагноза на гнильцовые болезни в ветеринарную лабораторию направляют образец сотов (или сот целиком) размером 10х15 см с больными и погибшими личинками, причем, на одной стороне образца должно быть их не менее 10. если поражены отдельные участки сота с резкой границей пораженного расплода, то образец должен содержать как пораженные, так и нормальные его участки, или направляют сот в целом виде.

Отобранные соты или пробы укладывают в деревянный ящик, отделяя их, друг от друга, от стенок, дна и крышки ящика деревянными планками. Все это делается для притока воздуха и с целью предохранения личинок от преждевременного разложения. Вместе с сопроводительным документом отобранный от пчелиной семьи патологический материал должен быть доставлен в течение суток.

В лаборатории пробы исследуют по следующей схеме.

1. Образец сота или сот располагают так. Чтобы лучи света проникали вглубь ячеек и падали на их нижнюю стенку. При этом по общему виду расплода (сплошной или пестрый, одно- или разновозрастной), возрасту и цвету каждой исследуемой больной личинки, их положению в ячейке. Состоянию гнилостной массы (цвет, тягучесть, запах), расположению корочки, степени её прилипания к стенке ячейки и количеству погибших личинок устанавливают тяжесть заболевания. (табл.1.)

2. Отбор личинок под лупой и отбор больных личинок. С помощью лупы, микроскопа (лучше энтомологического отбирают больных личинок с тусклым покровом, пожелтевших и увеличенных в объеме, с затрудненным дыханием (подергиванием тела). При микроскопии здоровых личинок дыхание едва улавливается.

3. Вскрытие личинок. Больную личинку осторожно извлекают из ячейки и помещают на предметное стекло или дно чашки Петри и острым лезвием со стороны спины, с помощью лупы, разрезают покров, затем двумя препаровальными иглами отодвигают пищеварительную трубку и регистрируют её состояние.

У здоровых личинок кишечник желтоватого цвета, рельефно сегментирован, упругой консистенции. У больной европейским гнильцом личинки, на первом этапе болезни (продромальный период) кишечник бледный, содержит незначительное количество корма. В период разгара болезни он становится беловато-серым, плохо сегментированным, с дряблыми растянутыми стенками, нередко в виде бесформенного конгломерата мягкой, тестоватой консистенции.

Микробиологическое исследование включает:

а) микроскопию

б) посев на питательные среды, выделение чистой культуры и изучение их биологических (биохимических) свойств

в) определение антигенных, серологических свойств

г) определение патогенности выделенных чистых культур

Микроскопия Микроскопическому исследованию подвергают мазки, приготовленные из патологического материала (вскрытых личинок, гнилостную массу и пр.) и из чистых культур, выращенных на средах накоплением.

Микроскопия нативных мазков Из каждого образца сотов отбирают 6 и более больных или погибших личинок. При подозрении на европейский, американский гнилей или парагнилец (в случае гибели запечатанного расплода) используют гнильцовую массу и высохшие корочки.

Содержимое кишечника личинки или гнилостную массу помещают на предметное стекло в каплю стерильного физиологического раствора, тщательно растирают и приготавливают мазок отпечаток обычным способом. При наличии сухих корочек, в том числе и прочно прикрепленных к стенке ячейки, поступают следующим образом. Приготавливают треугольные флажки из прочной бумаги, нумеруют их и ставят с одной из сторон (или рядом) исследуемой ячейки. Затем стерильной пастеровской пипеткой вносят в ячейку стерильный физиологический раствор и оставляют на 30-120 минут до размягчения. После этого приготавливают мазок или делают посевы на питательные среды накопления микробной массы.

Высушенные мазки фиксируют физическим или химическим способом и окрашивают: один - по Граму, второй - 2%-ным феноловым (карболовым) фуксином Циля, с целью обнаружения спор. После окрашивания мазки промывают, высушивают, микроскопируют под иммерсионной системой микроскопа (х90 объектива).

В мазках приготовленных из патологического материала и чистых культур Melissococcus pluton располагается в виде крупных скоплений, состоящих из одиночных, парных, или собранных в цепочки удлиненных грамположительных, а иногда и грамнегативных кокков размером 0,7х1,5 мкм в диаметре.

Кокки - Enterococcus faecalis (Enterococcus liquifaciens) в мазках из патологического материала располагается одиночно и короткими цепочками диаметром 0,7-0,9 мкм, что обуславливает, кислую форму гнильца (запах кислых яблок).

Bacillus alvei - крупная грамположительная, подвижная (аэробная ульевая бацилла) палочка размером 3,5-4,5х0,8-1,0 мкм, образующая споры размером 2,5-4,0х0,8-1,5 мкм. Споры крупные с заостренными концами, располагаются в центре клетки; в мазках из патологического материала они чаще встречаются параллельными рядами, напоминающие частокол, палисад.

Bacillus laterosporum (Bac. opfeus) - аэробные, подвижные с закругленными концами грамположительные палочки. Размером 2,5-5,0х1,0-1,2 мкм, хорошо красятся всеми анилиновми красителями. Споры овальной формы 1,2-2,0х0,7-1,2 мкм, располагаются в средней части клетки, характерно для них наличие амфорообразного или лодкообразного параспорального тела. В мазках из патологического материала можно обнаружить палочки, в том числе со спорами и параспоральными телами.

Bacillus larvae - грамположительная, подвижная (перетрих), стройная палочка, размером 1,5-6,0х0,5-0,8 мкм, стрептобацилла. Микроб образует споры овальной формы размером 1,2-1,8х0,6-0,7 мкм. В начальной стадии инфекционного процесса бацилла обнаруживается в личинке в виде длинных цепочек и нитей. После гибели личинки наступает процесс спорообразования: палочка укорачивается, утрачивает способность образовывать цепочки. В мазках из нативного материала хорошо видны короткие палочки и палочки с овальными мелкими эндоспорами (период спорообразования) и свободно лежащими зрелыми спорами, окрашенными фуксином в розовый цвет (кстати, «молодые» споры могут краситься грамположительно). Нередко споры в мазках располагаются параллельными рядами. В культурах на питательных средах спорообразование происходит с трудом, а чаще вообще отсутствует, что требует частых пересевов вегетативной формы возбудителя (через 14-18 дней).

Bacillus paraalvei - - грамположительная, подвижная (перетрих), спорообразующая (размер спор 1,8-2,3х0,9-1,3 мкм), с закругленными концами, необразующая капсул, аэробная (факультативно) палочка, размером 2,2-5,7х0,5-0,8 мкм.

В мазках из патологического материала возбудитель виден в виде грамположительных палочек. Чаще лежащих одиночно, а в период спорообразования обнаруживают палочки с формирующимися в центре эндоспорами. В мазках из гнилостной массы или корочек чаще обнаруживаются споры. В отличие от спор альвейной бациллы у них заметна большая ширина в поперечнике, а по сравнению со спорами возбудителя американского гнильца они более крупные. Споры образуются как в погибших личинках, так и на питательных средах.

Некоторые авторы утверждают, что параальвейная бацилла вызывает разновидность европейского гнильца, однако эти микробы отличаются следующими признаками:

1. Параальвейная бацилла обладает резко выраженными антагонистическими свойствами по отношению к альвейной бацилле

2. Эти два возбудителя имеют разный антигенный состав

3. Так Bacillus paraalvei обладает ползучим ростам в отличие от ульевой и не обладает гемолитическими свойствами

4. Нуклеотидный состав ДНК представителей вида Bacillus paraalvei заключается в интервале 45,3+0,1 мол% СГЦ (Х. А. Хамедрабаданов, В.А. Фомин, 1988). Методом ДНК-ДНК гибридизации показано, что штаммы вида Bacillus paraalvei представляют собой высокогомологичную группу с уровнем гомологии нуклеотидной последовательности ДНК 94-100%. В свою очередь, эта группа по уровню подобия ДНК отличается от штаммов вида Bacillus alvei уровень гомологии ДНК 10-60%. Выявленные различия молекулярно-биологических характеристик ДНК Bacillus paraalvei и Bacillus alvei подтверждают самостоятельность таксономической единицы Bacillus paraalvei и, следовательно, правомочность выделения самостоятельной болезни - парагнильца.

Таблица. Роль клинических признаков в дифференциальной диагностике гнильцовых болезней и мешотчатого расплода

Таблица. Некоторые морфологические показатели возбудителей гнильцовых болезней пчел

Посев на среды, выделение чистой культуры, изучение культуральных, биохимических и других свойств возбудителей гнильцов.

Приготовление питательной среды для первичного посева из патологического материала зависит от того, какого вида предполагается выделить микроорганизм.

В случае получения смешанных культур, когда наряду с возбудителями гнильцов отмечается рост банальной микрофлоры, выделяют чистые культуры. Для этого посев возбудителя проводят в соответствующие ему плотные питательные среды в бактериологических чашках (Петри) фракционным методом (Дригальского) с последующим всесторонним изучением колоний, и пересевом (первичной) одной из них, обладающими сходными культуральными свойствами, на жидкую и плотную питательную среду в пробирках. При этом следует учитывать биологические особенности каждого возбудителя и создавать для его роста соответствующие условия.

Melissococcus pluton из патологического материала высевают на следующие специальные питательные среды:

Среда Бейли - дистиллированной воды берут 1 литр, глюкозы, экстракта дрожжей, растворимого крахмала по 10 г, калия фосфорнокислого однозамещенного КН₂РО 13,6 г, агар-агара стеблевидного (растительного) 20 г, рН = 6,6. Стерилизуют автоклавированием при 116⁰С три дня подряд по 20 минут. Первичный рост возбудителя появляется через 4-7 суток при 35⁰С, при последующих пересевах колонии формируются через 24-48 часов.

Среда Черепова - в 1 литр водопроводной воды вносят 300 г очищенного картофеля (с обязательным удалением глазков), варят в течение 15-20 минут, не допуская, чтобы клубни разваривались, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К одному литру фильтрата добавляют 2% растительного агара и 3 г пептона, затем стерилизуют в автоклаве при 1 атм. 20 минут, после чего добавляют 3% экстракта пекарских дрожжей и 3 % глюкозы, устанавливают рН= 6,8, стерилизуют дробно в аппарате Коха, или в автоклаве текучим паром при открытом пароотводном кране три дня подряд по 15 минут.

В первых генерациях возбудителя на средах Бейли, Черепова посевы культивируют в анаэробных условиях, последующее выращивание можно проводить в аэробных условиях.

Для выращивания Melissococcus pluton можно использовать 0,15%-ный картофельный агар, приготовленный аналогично среде Черепова, но вместо 2% агар-агара добавляют 0,15%.

На плотных средах Melissococcus pluton образует мелкие, гладкие, круглые, бесцветные, жемчужно-белые колонии, диаметром 1-1,6 мкм.

В полужидком агаре возбудитель растет с образованием помутнения и нежного пристеночного кольца. Разлагают глюкозу и фруктозу с образованием кислоты без газа. Не ферментирует лактозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, раффинозу, манит, сорбит, инозит, глицерин и крахмал.

Enterococcus faecalis (Str.apis) выделяют из патологического материала и культивируют в лабораторных условиях на обычных питательных средах - МПА и МПБ при 37⁰С. Через 24 часа на МПА образуются мелкие, прозрачные, бесцветные колонии или сплошное наложение, легко снимающееся бактериологической петлей. На МПБ энтерококк растет в виде помутнения, характерного для стрептококка; МПЖ разжижает, молоко свертывает и пептонизирует, сероводород и индол не образуется, выделяет следы аммиака; глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу разлагает с образованием кислоты без газа, не гидролизует крахмал, нитриты не восстанавливает в нитраты, не обладает гемолитическими свойствами. Энтерококк растет также на средах Бейля, Черепова, кровяном агаре Цейслера.

Bacillus alvei выделяют из патологического материала и пересевают на обычные питательные среды МПА и МПБ, культивируют при 37⁰С. Через одни сутки на МПА вырастают крупные, грязно-желтого цвета, шероховатые (R-формы) колонии. Старые колонии неприятного запаха. Для бациллы ульевой характерно явление лизогении, что отчетливо заметно в старых культурах, на плотных питательных средах наступает «остекленение» культуры, а это нередко приводит к образованию микробных клеток с булавовидным утолщением, в виде длинных извитых нитей и пр.

На МПБ вызывает интенсивное помутнение с образованием интенсивного осадка, а на поверхности образуется бесцветная или сероватая, гладкая, тонкая пленка и пристеночное кольцо. При встряхивании пленка оседает на дно пробирки мелкими хлопьями. На кровяном агаре Цейслера бацилла растет в виде крупных, неправильной формы колоний с отростками, типа оленьих рогов, грязно-желтого цвета; обладает гемолитическими свойствами, вокруг колоний образуется зона гемолиза типа бета, иногда типа альфа.

Ульевая бацилла разжижает МПЖ, но медленно, молоко свертывает и пептонизирует, образуя индол, выделяет следы аммиака, нитриты не восстанавливает, не гидролизует крахмал, ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, глицерин с образованием кислоты без газа, но биохимические свойства не постоянны.

Bacillus laterosporus (Bac. оrpheus) выделяется из патологического материала и культивируется в лабораторных условиях на обычных питательных средах - МПА и МПБ, но лучше бацилла растет на печеночном агаре при слабощелочной или нейтральной реакции при температуре 35-36⁰С.

На плотных питательных средах Bacillus laterosporus через 24 часа образует гладкие, беловато-серые колонии, с ровными краями и металлическим блеском диаметром 2-3 мм. Через двое суток отмечается обильный рост в виде серовато-белого наложения.

МПБ мутнеет, затем просветляется, на дне пробирки образуется осадок. МПЖ разжижается (медленно), молоко свертывается, образуя плотный сгусток казеина. Ферментирует глюкозу, мальтозу, ксилозу, галактозу, сорбит, дульцит, инозит, адонит. Не образует сероводорода и индола, реакция с Фогес-Проскауера положительная, реакция с метилротатом отрицательная, восстанавливает нитриты, на кровяном агаре вокруг колоний образуется зона гемолиза типа альфа.

Bacillus larve выращивается на следующих питательных средах:

Среда Томашеца - к расплавленному и охлажденному до 45-50⁰С МПА (рН= 6,8-7,0) добавляют 10%-ной стерильной сыворотки крови лошади, перемешивают путем вращения пробирок между ладонями, и оставляют в наклонном положении для застывания и получения наибольшей поверхности для посева. Агар-агар используют только стеблевидный, на МПА с рыбным автолизатом возбудитель американского гнильца не растет.

В лаборатории ВГАВМ для стимуляции роста в данную среду вносят дополнительно 10-20% стерильного экстракта пекарских дрожжей, причем МПА готовят из отвара конского мяса.

Кровяная среда Тошкова - в обычный или с добавлением желточной эмульсии МПА или МПБ вносят стерильно дефибринированную кровь лошади или овцы в количестве 10%.

Кровяной агар Цейслера - приготовленный из стеблевидного агара 3%-ный МПА (рН=7,2-7,4) заготавливают впрок: разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют при 1 атм. (120⁰С) 20 минут. По мере надобности приготовленный МПА расплавляют в водяной бане, остужают до 42-45⁰С, добавляют 10 мл 20%-ного стерильного раствора глюкозы, 15-20 мл стерильной (свежей) дефибринированной крови лошади или овцы, перемешивают и разливают в стерильные бактериологические чашки, которые подсушивают в термостате в течение 4-6 часов.

Яичный агар и бульон Уайта - в начале приготавливают суспензию желтка. Свежее яйцо тщательно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, затем вскрывают стерильным инструментом, отделяют белок, желток помещают в стерильную колбу, вносят 70 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают до однородной массы. В пробирки с 5 мл МПБ и в предварительно расплавленный и охлажденный до 45⁰С МПА (пробирку можно взять в ладони без ощущения жжения) вносят стерильно по 1 мл суспензии желтка, тщательно перемешивают путем вращения пробирки между ладонями. Пробирки с МПА располагают в наклонном положении до застывания. Перед посевом пробирки с МПБ и МПА помещают в термостат при 37⁰С для проверки на стерильность.

Среда Майкла - приготавливается экстракт дрожжей, в один литр водопроводной воды вносят 100 г измельченных пекарских дрожжей, тщательно перемешивают до образования однородной массы, кипятят 30 мин, отстаивают. Жидкость фильтруют в горячем состоянии через 3-4 слоя марли в стеклянную посуду и оставляют для отстаивания (в лаборатории ВГАВМ жидкость фильтруют через фильтр Зейтца).

Для приготовления среды в 1 л дистиллированной воды добавляют 10 мл дрожжевого экстракта, 10 г пептона, 15 г растительного агар-агара, 0,1 г тиамина. Все это стерилизуют текучим паром три дня подряд по 45 мин, или при 112-115⁰С (0,5 атм.) 30 мин., затем пробирки помещают в термостат для проверки на стерильность.

На плотных питательных средах получить культуру личиночной бациллы трудно, поэтому на поверхность сред следует вносить побольше гнилостной массы погибших личинок.

На плотных питательных средах личиночная бацилла растет в виде отдельных колоний или сплошного наложения. Через сутки на среде Томашеца образуются нежные, слегка выпуклые, с неровными краями, с отростками (R- форма), вначале прозрачные, а затем серо-белые колонии. Колонии более четко различимы невооруженным глазом через 2 суток. При сплошном росте ответвления видны по краям.

Кроме типичных колоний в R-форме обнаруживаются и атипичные «R» и гладкие «S», что обусловлено действием различных факторов, в том числе и ларвейного бактериофага (он был выделен и применен для диагностических и лечебных целей профессором ВГАВМ Н.И. Смирновой).

На жидких питательных средах (МПБ с сывороткой) уже через сутки возбудитель образует помутнение, а через 48-72 часа среда просветляется с образованием осадка в виде клочка ваты (подобие роста сибиреязвенного микроба); при встряхивании пробирки осадок легко разбивается, образуя равномерную муть.

В мазках, приготовленных из атипичных колоний, обнаруживают короткие, толстые палочки, не образующие цепочек. Бацилла обладает антибиотическими свойствами и, подавляя рост других микробов, выделяется как монокультура.

Биохимические свойства определяются на обычных питательных средах, содержащих 10% стерильной сыворотки крови лошади. Типичные бактерии возбудителя американского гнильца медленно (6-10 суток) расщепляют глюкозу и левулезу с образованием кислоты, возбудитель не ферментирует лактозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, мальтозу, ксилозу, а из многоатомных спиртов - маннит, сорбит, дульцит, инозит. Он не образует сероводорода, индола, аммиака (сероводород и аммиак некоторые штаммы выделяют в незначительном количестве), разжижает желатин, свертывает и пептонизирует молоко, не гидролизует крахмал, восстанавливает нитриты в нитраты, не обладает гемолитическими свойствами, не образует каталазу (каталазный тест отрицательный).

Bacillus paraalvei культивируется при 34-38,5⁰С в аэробных условиях, плохо растет на обычных питательных средах - МПА и МПБ, но хорошо растет на глюкозно-кровяном агаре Цеслера и среде Томашеца (жидкой и плотной при рН=5,8-7,0). На МПБ отмечается рост в виде слабого осадка на дне пробирки. На поверхности плотных питательных сред образуются шероховатые колонии с синеватым металлическим отливом. Микроб обладает ползучим ростом. Все штаммы возбудителя не ферментируют глюкозу, раффинозу, маннит, салицин, адонит: гидролизуют крахмал, образуют индол, восстанавливают нитриты, разжижают желатин, на кровяном агаре не образуют зоны гемолиза, реакция Фогес-Проскауера отрицательная.

Основные дифференциально-диагностические показатели культурально-биохимических свойств представлены в таблице.

Таблица. Дифференциально-диагностические показатели культурально-биохимических свойств возбудителей гнильцовых болезней

Возбудители	Культуральные свойства	Биохимические свойства
	На плотных средах	На жидких средах
Melissococcus pluton	Колонии мелкие, гладкие, круглые, бесцветные (желто-белые)	Через 24-48 часов на дне пробирки образуется белый осадок, нежное помутнение, пристеночное кольцо	Разжижает глюкозу и фруктозу с образованием газа без кислоты
Enterococcus faecalis	Колонии мелкие, прозрачные, затем полупрозрачные, бесцветные, рост может быть в виде сплошного наложения	Нежное помутнение, осадок	Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит: МПЖ - разжижает, молоко свертывает и пептонизирует
Bacillus alvei	Колонии крупные, грязно-желтые, шероховатые (R- форма). В старых культурах возможна лизогения - под (влиянием) действием бактериофага колонии становятся стекловидными	Интенсивное помутнение с образованием обильного осадка, на поверхности сероватая или бесцветная тонкая пленка и пристеночное кольцо	Ферментирует глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу с образованием кислоты без газа: МПЖ медленно разжижает, молоко свертывает и пептонизирует, образует индол. Биохимические свойства не постоянны
Bacillus laterosporus	Через 24 часа образуются гладкие, с ровными краями, бледно-серые с голубоватым оттенком и металлическим блеском колонии, диаметром 2-3 мм; через 48 часов - обильный рост в виде серовато-белого наложения	Помутнение, затем просветление и образование осадка	Ферментирует глюкозу, мальтозу, маннозу, декстрозу, маннит, сальцин с образованием кислоты без газа, обладает гемолизом, восстанавливает нитриты
Bacillus larvae	Нежные слегка выпуклые, с неровными краями (R- форма) с отростками колонии. Образующиеся чаще через 48 часов	Образуется помутнение чаще через 48 часов, затем просветление с образованием осадка в виде клочка ваты	Разлагает глюкозу, левулезу с образованием газа без кислоты, МПЖ разжижает, молоко свертывает и пептонизирует
Bacillus paraalvei	Колонии шероховатые с синеватым металлическим отливом, наблюдается ползучий рост	Слабый осадок на дне пробирки	Гидролизирует крахмал, образует индол: МПЖ разжижает, не ферментирует глюкозу, маннит, адонит

Определение патогенности (биопроба)

Патогенные свойства европейского гнильца могут быть установлены путем заражения расплода в чашках Петри, в специально подготовленных садках, микроульях, а при необходимости в обычных ульях.

При американском гнильце можно использовать для заражения кроликов и морских свинок.

Для заражения личинок используют двухмиллиардную взвесь микробов в сахарном сиропе (1 часть воды+2 части сахара) в соотношении 1 часть культуры и 5 частей сахарного сиропа. Лучше использовать корм, состоящий из 100 мл воды, 50 г перги, 5 г пекарских дрожжей. Смесь подогревают при 100⁰С 45 минут, охлаждают и вносят равный объем меда.

Постановка биопробы в чашках Петри. Дно стерильной бактериологической чашки выстилают тонким слоем стерильной гигроскопической ваты, накладывают несколькими слоями стерильный бинт (или марлю), вносят по 10-12 мл теплого корма, состоящего из сахарного сиропа и взвеси микробов. Затем в чашки на бинт, пропитанный сахарным сиропом и микроорганизмами, осторожно раскладывают личинки 3-4-х дневного возраста по 15-20 штук, полученных от здоровых пчелиных семей. После заражения ежедневно, под контролем лупы, отбирают больных личинок и подвергают бактериологическому исследованию. В качестве контроля служат неинфицированные личинки, содержащиеся в аналогичных условиях.

Биопроба в микроульях и ульях. Приготавливают сахарный сироп, добавляют смесь микробов и скармливают в микроулье по 50 мл, а в семье в стандартном улье по 500 мл ежесуточно. В течение 3-5 дней. Признаки гнильца и парагнильца проявляются через 8-10 суток с момента заражения. Заражение осуществляется следующим образом: инфицированный сироп наливают в банки, обвязывают тремя слоями марли, ставят их вверх дном на рамки в стандартном улье или на специальные отверстия в потолке улья или микроулья.

Биопроба на кроликах и морских свинках. Вначале готовят взвесь спор бациллы ларве, используя сухие корочки пчелиных личинок, погибших от американского гнильца. Стерильным пинцетом вынимают корочки из ячеек, помещают в стерильную ступку, растирают, добавляя стерильный физраствор из расчета 1 мл на 1 корочку, тщательно перемешивают, затем суспензию фильтруют через вату. При наличии слизи в суспензию добавляют физраствор до ее исчезновения, и снова фильтруют через фильтровальную бумагу. Фильтрат центрифугируют дважды, к осадку, содержащему чистые споры, добавляют стерильный физраствор, доводя концентрацию спор с помощью оптического стандарта до 5-6 млн. в 1 мл.

Взвесь спор вводят кроликам внутривенно по 1 мл, морским свинкам подкожно по 0,5 мл (3 млн. спор). Кролики погибают на 5-7-й день, морские свинки - на 8-10-й. Из органов и крови погибших животных выделяют возбудителя американского гнильца.

Серологическое исследование. Серодиагностику проводят с помощью реакции агглютинации (РА) и реакции преципитации (РП).

РА ставится капельным методом. Для постановки РА при гнильцовых болезнях следует использовать стандартные агглютинирующие моносыворотки, содержащие антитела к возбудителям гнильцовых болезней пчел. При их отсутствии агглютинирующие моносыворотки получают путем гипериммунизации кроликов чистыми культурами возбудителей.

Антиген для РА приготавливают из 5-10 свежих трупиков личинок или корочек: трупики помещают в ступку, заливают стерильным физраствором, содержащим 0,5% фенола, тщательно растирают, фильтруют через вату, фильтрат центрифугируют 10-15 мин при 1,5 тыс. об/мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 10-15 мл фенолизированного физраствора, прогревают в водяной бане до 70⁰С и фильтруют в горячем виде через бумажный фильтр, вновь центрифугируют, снова удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют физраствор с таким расчетам, чтобы в 1 мл жидкости содержалось 10 млрд. микробных спор, если возбудитель спорообразующий. Эта взвесь используется в качестве антигена.

Перед постановкой РА агглютинирующую сыворотку разводят 1: 80 (0,1 мл сыворотки+7,9 мл физраствора).

На предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю физраствора, каплю нормальной кроличьей сыворотки и каплю агглютинирующей сыворотки, затем в каждую из них вносят такое же количество антигена. Реакция считается положительной, если в капле с агглютинирующей сывороткой, содержащей антитела против определенного вида возбудителей, в течение 10-12 мин. наблюдается мелкозернистая агглютинация - образование мелких крупинок, а жидкость просветляется (положительная реакция). В других каплях, служивших контролем, жидкость остается мутной, агглютинация отсутствует (отрицательная реакция).

РП ставят классическим методом подслаивания и наслаивания. Для постановки РП используют преципитирующие сыворотки (ларвейную, плутоновую и др.) и антиген, приготовленный из патологического материала.

При исследовании на американский гнилец преципитиноген для РП готовят из 10 погибших личинок, их вынимают из ячеек и помещают в ступку. При использовании взрослых погибших личинок в ступку вносят 15 мл физраствора, для 3-4 дневных личинок - 7 мл, получают десятикратное разведение. В ступке личинки тщательно растирают, кипятят в водяной бане 15 мин., фильтруют через асбестовую вату до полной прозрачности. Полученную жидкость используют в качестве антигена.

РП ставят в уленгутовских (преципитационных) пробирках методом подслаивания. Пастеровской пипеткой вносят 0,2-0,3 мл антигена на дно пробирки, а затем другой пастеровской пипеткой, уперев в дно, подслаивают исследуемую преципитированную сыворотку в таком же количестве.

При постановки РП методом наслаивания в пробирку вносят вначале исследуемую сыворотку, а преципитиноген, как более легкий, наслаивают на сыворотку осторожно по стенке пробирки. Контролем служат пробирки с заведомо известным ларвейным антигеном: в одну подслаивают иммунную сыворотку (положительный контроль), в другую - нормальную кроличью сыворотку (отрицательный контроль).

При учете реакции вначале обращают внимание на контроли. РП считается положительной, если в течение 1-3 мин. (наблюдение проводят до 15 мин.) при комнатной температуре на границе двух компонентов реакции образуется преципитат в виде тонкого, нежного, голубовато-матового диска, который при покачивании пробирки представляется в виде кольца (кольцепреципитация). Следовательно, с помощью специфических к ларвейному микроорганизму преципитинов произошло изменение дисперсности коллоидов антигена, и они образовали визуально заметный агломерат в виде диска (кольца) - диагноз положительный.

При исследовании на европейский гнилец для постановки РП берут 5-10 трупиков погибших личинок из образца сотов. Личинки растирают в фарфоровой ступке в 5 мл физраствора, затем содержимое помещают в пробирки, экстрагируют в водяной бане при 100⁰С в течение 15 мин., фильтруют через асбестовую вату, а фильтрат в дальнейшем используют как антиген. Далее поступают, так же как и при исследовании на американский гнилец, но для реакции используют ряд пробирок: в одну - альвейную, в другую - плютоновую сыворотку и т.д.

Исследования можно проводить и с помощью постановки РДП. В агаровом геле, в чашке Петри, в центральную лунку вносят антиген, а в другие расположенные по кругу, на одинаковом расстоянии от центральной, гипериммунные сыворотки, содержащие антитела к определенному виду возбудителя.

После инкубации в термостате, при соответствии антигена и антитела образуется зона преципитации.

Фигодиагностика. Используется в основном для идентификации возбудителей. При наличии специфических бактериофагов (ларвейного, альвейного и т.д.), выделенную молодую культуру, находящуюся в стадии логарифмического роста, рассевают на плотной питательной среде в чашках Петри, подсушивают в термостате, а затем в центр вносят каплю фага, дают ей стечь к краю чашки по радиусу, подсушивают в термостате, переворачивают, завертывают в бумагу и помещают в термостат при 37⁰С. В положительных случаях, при соответствии культуры и бактериофага, на месте стекания капли через 16-48 часов рост микробов будет отсутствовать.

Определение чувствительности выделенных микроорганизмов к антибиотикам и химиопрепаратам.

Определение чувствительности не является диагностическим тестом, но он необходим для правильного выбора лекарственных препаратов и степени их эффективности при проведении лечебно-профилактических мероприятий.

Чувствительность микробов к антибиотикам определяется разными методами: бумажных дисков, серийных разведений и др. Для производственных целей используют, главным образом, метод бумажных дисков.

В стерильные чашки Петри наливают, соответствующую данному виду микроорганизма расплавленную плотную питательную среду, на поверхность которой после застывания наносят 1 мл смыва с агаровой культуры (реже бульонной), приготовленного с помощью стерильного физраствора, затем стерильным шпателем смыв равномерно рассевают по всей поверхности среды. После подсушивания посевов в термостате, стерильным пинцетом на среду накладывают бумажные диски (могут быть стандартные) и диски питательных веществ определенной концентрации (приготовленные ех tempore), а так же диски, содержащие антибиотики, сульфаниламиды. Диски (4-6 штук) раскладывают, слегка приживая стерильным пинцетом к поверхности питательной среды, на одинаковом расстоянии друг от друга, от центра и краев чашки. Антимикробную (бактериостатическую) активность препарата определяют по величине зоны задержки роста микробов вокруг диска после 16-24 часов (48 часов при американском гнильце) инкубации в термостате. При этом зона размером 24 мм и более свидетельствует о высокой чувствительности микробов к антибиотику.

Чувствительность к химиопрепаратам можно определить методом диффузии, используя питательную среду с препаратом. Эту среду заливают в канавку, вырезанную (в соответствии возбудителю) питательной среде.

Устойчивость возбудителей гнильцов. Данные, касающиеся устойчивости возбудителей гнильцов, являются основой для проведения профилактических и лечебных мероприятий при гнильцовых болезнях пчел.

Вегетативные формы обладают невысокой устойчивостью, так Melissococcus pluton в трупиках личинок, корочках, в сухом содержимом среднего отдела кишечника личинок при комнатной температуре сохраняется до 3-х лет. На пасеках летом возбудитель жизнеспособен 50-55 дней, на вощине 55-65 дней, в перге - 365 дней, на внутренней поверхности медогонки 45-48 дней, спецодежде -95 дней.

Погибают о в 0,5%-ном растворе перманганата калия за 30 мин., в 5%-ном растворе за 1 мин., в 0,5%-ном растворе формальдегида за 10 мин.

Enterococcus faecalis сохраняет жизнеспособность на вощине, сотах, на деревянных предметах, в меде до 256 дней: в перге, медо-перговой смеси до 129 дней, в сахарном сиропе и водопроводной воде до 14-ти дней; при температуре 70-80⁰С в пробирке погибают в течение 30-50 минут, в растворе хлорной извести, содержащей 2% активного хлора за 30 минут, в 0,5%-ном растворе калия перманганата за 50 минут, а в 5%-ном - за 5 минут.

Bacillus alvei в корочках личинок споры сохраняются более 20-ти лет, в меде до 450 дней, в перге и медо-перговой смеси - до 171 дня, кипячение убивает их в течение 15-120 минут. В 2%-ом растворе хлорамина при 40⁰С они погибают через 6-12 часов, в 5%-ном растворе хлорной извести через 45-60 минут, в 2%-ном растворе калия перманганата за 7 часов, а в 5%-ном за 1 час. В воске, при автоклавировании (120⁰С, 1 атм.) споры погибают через 2 часа. Сода, перекись водорода, каустифицированная содопаташная смесь, щелочной раствор формальдегида убивают споры от 5-ти минут до 3-х часов.

Bacillus larvae обладает такой же устойчивостью как и бацилла ульевая (альвейная). Споры бациллы в культурах сохраняются десятки лет, в высохших трупиках личинок - несколько лет, в меде - более года, в зараженных сотах - 35 лет, на внутренней поверхности ульев, на вощине - 20 лет, на внутренних стенках медогонки - 5 лет. В кипяченом меде споры теряют активность через 40 минут, в кипяченом воске, при открытой емкости, споры погибают на 5-ый день, при кипячении в воде в течение 5 минут, автоклавирование убивает за 2 часа. 1%-ный подкисленный раствор перекиси водорода вызывает гибель в трупиках личинок за 3 часа, 10%-ный раствор каустической соды - за 4 минуты,10%-ный раствор натрия гидроокиси - за 2 минуты.

Bacillus paraalvei обладает высокой устойчивостью, споры сохраняют жизнеспособность при 15-20⁰С в трупиках личинок, меде - более 500 дней, на деревянных предметах - 467 дней, в перге - 3 года, в медогонке - до 300 дней; при минусовых температурах сохраняется более длительно.

При кипячении споры погибают в течение 30-50 минут, 3% раствор перекиси водорода убивает за 8-9 часов, 10%-ный - за 2,5 часа; 10% раствор натрия гидроокиси при 20⁰С - за 48 часов, при 60⁰С - за 30 минут.

Дифференциальная диагностика.

Гнильцовые болезни пчел необходимо дифференцировать от мешотчатого расплода, порошковидного и застуженного расплода, а так же от варрооза, тропилелапсоза.

При мешотчатом расплоде погибшие личинки располагаются отдельными участками на соте и имеют вод прозрачного мешочка в нижней части наполненного зернистой жидкостью. Трупики при этом заболевании не имеют запаха, корочка подсохшей личинки характерно расположена и легко извлекается.

При застуженном расплоде погибшие личинки располагаются сплошными участками и чаще в нижней части сотов.

Следует иметь в виду. Что при сложной эпизоотической ситуации пчелиные семьи часто бывают, заражены одновременно несколькими заразными инфекциями.

Заключительный диагноз ставят на основании эпизоотических данных, клинических признаков, лабораторных методов диагностики, с учетом дифференциальной диагностики от других сходный по проявлению инфекционных заболеваний.

Таблица. Дифференциальная диагностика гнильцовых заболеваний от мешотчатого расплода

Название болезни	Возбудители	Возраст пораженных личинок	Основные отличительные признаки	Характер изменений крышечек (вид сбоку, сверху)
			Консистенция	запах	Форма и расположение корочек
Европейский гнилец	Mtlissococcus pluton Enterococcus faecialis Bacilla alvei Bacilla laterosporus	3-4 суток	Плохо замешанного теста, нити короткие	Кислый, пота ног (в запущенных случаях)	Легко извлекается	В запущенных случаях поражается печатный расплод
Американский гнилец	Bacilla larvae	6-9 cуток	Тягучая, длинная нить гнилостной массы за бакпетлей 10-15 см.	Разогретого столярного клея	Не извлекается
Парагнилец	Bacilla paraalvei	4-9 суток	Водянистая, затем тягучая	гнилостный, неприятный	Извлекаются
Мешотчатый расплод	Вирус РНК-содержащий	8-9 суток	Водянистая вид мешочка наполненного жидкостью в нижней части личинки	Запаха нет	Легко извлекается	Часто крышечки удалены

Таблица. Дифференциальные культурально-биохимические свойства возбудителей гнильцовых болезней пчел

Возбудители показатели	M. pluton	Ent. faecalis	Bac. alvei	Bac. laterosporus	Bac. Larvae	Bac. paraalvei
Подвижность Окраска по Граму Рост на МПА - на МПБ - на глюкозно-кровяном - Томашеца (Черепова) - сывороточном МПА Молоко свертывает - \\ - пептонизирует МПЖ - глюкоза - лактоза - сахароза - фруктоза - галактоза - мальтоза - рамноза - раффиноза - арабиноза - декстроза - манноза - L-ксилоза Гемолиз эритроцитов - маннит - сорбит - инозит - адонит - дульцит - глицерин - салицин Гидролиз крахмала Образование индола - аммиака - сероводорода Восстановление нитратов Образование каталазы Реакция Фогес-Проскауера	- + - - + - к - - (+) к - - - - - - - - - к(+) -	- + + + + + + + + + к к к к к к - - к - - к к - - к к - - + следы - -	+ + + + + + + + + + к к к к - - - + - к к (+) + - -	+ + + + + + + + + к к+ -(к+)

Страница:

•  1 
•  2 
•  3 

дипломная работа "Гнильцовые болезни и микозы пчёл" скачать

Подобные документы

• Общая характеристика разведения пчел на примере пасеки "Apis Melifera"

  Знакомство с карпатской породой пчёл. Техника осмотра пчелиных семей и их содержание в разных конструкциях ульев. Влияние биологически активных веществ на роль и развитие пчелиных маток. Обеспечение пчёл кормами в осенний период и подготовка к зимовке.
  
  реферат [2,2 M], добавлен 04.02.2014
  

• Зимовка пчёл на воле

  Особенности и условия зимовки пчёл на воле. Способы утепления ульев с большим подрамочным пространством. Сохранение маток вне клуба пчелиной семьи. Метод холодной зимовки, разработанный в Финляндии. Зимостойкость семей метизированных и чистопородных пчёл.
  
  курсовая работа [37,3 K], добавлен 24.02.2013
  

• Болезни пшеницы и меры борьбы с ними в условиях агропромышленного комплекса

  Биологические особенности возбудителей болезней пшеницы. Развитие болезни на культуре в конкретном опыте. Биологические особенности возбудителей болезней. Методы и способы защиты культуры от болезней и их влияние на снижение ее пораженности и урожайность.
  
  курсовая работа [51,4 K], добавлен 09.09.2012
  

• Болезни проса и огурцов защищенного грунта, обоснование и разработка мероприятий по борьбе с ними

  Систематическое положение вредителей и диагностика болезней. Биоэкология возбудителей болезней. Методика учета распространенности и степени развития болезней. Меры борьбы против гельминтоспориоза проса, гельминтоспориоза, мучнистой росы, склеротиниоза.
  
  курсовая работа [644,7 K], добавлен 19.04.2012
  

• Аскофероз пчёл

  История изучения аскофероза пчёл, географическое распространение, биология возбудителя, течение заболевания. Мероприятия по предупреждению распространения других заболеваний, приводящих к ослаблению семей пчел. Экономический ущерб, наносимый аскосферозом.
  
  реферат [43,8 K], добавлен 09.03.2014
  

• Диагностика болезней животных

  Основы клинической диагностики, классификация и номенклатура болезней животных, нозологические единицы и формы. Симптомы болезни: их классификация, распознавание и оценка диагностической значимости. Синдромы болезней животных и их характеристика.
  
  реферат [28,2 K], добавлен 22.12.2011
  

• Влияние антропогенных и биотических факторов на пчелиные семьи и их продукцию на территории Клецкого района

  Влияние антропогенных и биотических факторов на жизнедеятельность пчёл на территории Клецкого района. Место и методы исследования вредителей. Эффективность методов и средств борьбы с паразитами пчёл. Анализ данных о содержании металлов в пчелином мёде.
  
  дипломная работа [2,0 M], добавлен 23.03.2019
  

• Общие требования по предупреждению и ликвидации болезней животных и обеспечение безопасности в ветеринарном отношении продуктов животноводства

  Внешние и внутренние причины возникновения болезней. Определение, причины, признаки, течение и исход воспалений; их классификация. Незаразные болезни, их этиология, клиническое проявление, диагностика, профилактика и неотложная лечебная помощь животным.
  
  контрольная работа [80,8 K], добавлен 06.10.2015
  

• Зимовка пчел

  Влияние возраста маток и стимулирующих препаратов на продуктивность пчелиных семей. Состояние пчелиных семей в период зимовки в зависимости от типа ульев. Степень наполнения прямой кишки и активность каталазы ректальных желёз у пчёл в период зимовки.
  
  дипломная работа [866,0 K], добавлен 19.03.2014
  

• Мероприятия по защите сеянцев и саженцев древесных пород от болезней

  Надзор за появлением болезней в лесном питомнике. Методы диагностики болезней древесных растений. Основные болезни лесных культур и методы борьбы с ними. Организационно-технические мероприятия по проведению санитарных рубок и противопожарная профилактика.
  
  курсовая работа [4,7 M], добавлен 24.05.2015
  

Другие документы, подобные "Гнильцовые болезни и микозы пчёл"

• главная
• рубрики
• по алфавиту
• вернуться в начало страницы
• вернуться к началу текста
• вернуться к подобным работам