Совершенствование технологии производства и способов применения вакцин против ньюкаслской болезни

На правах рукописи

Скотникова Татьяна Анатольевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА И СПОСОБОВ ПРИМЕНЕНИЯ ВАКЦИН ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ

03.00.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии), биологические науки

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Щелково - 2010 г.

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный консультант:

академик РАСХН,

доктор ветеринарных наук, профессор,

лауреат Государственной премии РФ,

Заслуженный деятель наук РФ Анатолий Яковлевич Самуйленко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

лауреат Государственной премии,

Заслуженный ветеринарный врач РФСР Николай Данилович Скичко

доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Борис Филлиппович Бессарабов

доктор ветеринарных наук Виктор Васильевич Соболев

Ведущая организация

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко»

Защита состоится 25 июня 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината, д. 17, ВНИТИБП; e-mail: vnitibp@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности.

Автореферат разослан __________________ 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фролов Ю.Д.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Птицеводство в Российской Федерации (РФ) является наиболее развитой и наукоемкой отраслью сельскохозяйственного производства, в состав которой входят промышленные, фермерские и лично-подсобные хозяйства (Фисинин В.И., 2008, 2009).

В птицеводстве существует реальная угроза заболевания птиц ньюкаслской болезнью (НБ), что заставляет промышленные предприятия вакцинировать все поголовье куриных против этой инфекции (Бакулов И.А., 2008; Джавадов Э.Д., 2008). Частные хозяйства в непосредственной близости от промышленных предприятий усугубляют ситуацию, так как синантропные птицы могут способствовать переносу возбудителя НБ. Для этих хозяйств необходимо разрабатывать вакцины против НБ в мелкой дозировке, удобные в применении (Венгеренко Л.А., 2006).

Отечественные производители выпускают живые вакцины против НБ из штаммов «В₁», «Ла-Сота», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», «ГАМ-61» (Сюрин В.Н.,1958, 1963; Лагуткин Н.А.,1975; Сафонов Г.А.,1984; Креймер Ю.Х.,1986; Смоленский В.И., Руденко Т.В., 1999; Сергеев В.А. с соавт., 2007), доля которых составляет около 23 % в общем объеме производства вакцин для профилактики инфекционных болезней птиц в РФ.

Традиционная технология приготовления живых аттенуированных вакцин против НБ имеет резервы для совершенствования (Lancaster D., 1988; Cameron J.,1990; Смоленский В.И., 2001, 2007; Тихонов И.В. с соавт., 2008). Требуют совершенствования способы концентрирования и очистки вируса от балластных белков; повышения стабильности вакцины и ее оценки; технологического контроля производства вакцины; гармонизации методов контроля с международными требованиями (Сергеев В.А., Непоклонов Е.А., Алипер Т.И., 2007).

Концентрирование и очистка вируса НБ является важнейшим технологическим элементом получения более эффективных и безопасных препаратов, поскольку для конструирования ассоциированных и инактивированных вакцин важно иметь вируссодержащий материал (ВСМ) с высокой антигенной и иммуногенной активностью в минимальных объемах.

Перспективным компонентом для создания ассоциированных вакцин, с эпизоотологической точки зрения, является вирус инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ). В ряде регионов РФ ИЛТ встречается в ассоциации с НБ, нанося значительный экономический ущерб при выращивании цыплят-бройлеров (Кулаков В.Ю. с соавт., 2007).

Проблема повышения стабильности препаратов актуальна для птицеводства, поскольку доля препаратов для птиц составляет 95 % мирового рынка препаратов для животных. Требования к углубленному изучению стабильности лекарственных средств (ЛС) содержатся в Правилах GMP. Наиболее перспективным для оценки стабильности биологических препаратов различной природы считается метод «ускоренного старения» (Мешковский А.П., 2000; 2008).

Эффективность вакцинации во многом определяется дозой антигенного материала. Существует зависимость между силой антигенного раздражения и интенсивностью иммунного ответа при введении вакцины в организм. Большие дозы вакцины угнетают иммуногенез до развития иммунологической толерантности; малые же дозы не вызывают иммунологической перестройки в организме и синтеза защитного уровня антител (Лагуткин Н.А. с соавт., 1997; Alexander D.E., 1997).

Интенсивное развитие мясного птицеводства требует совершенствования технологии вакцинации цыплят против НБ с использованием специального оборудования, обеспечивающего экологическую безопасность для персонала и окружающей среды. Особенно важной является защита человека от контактов с вирусом НБ, поскольку он относится к зоонозам (ВОЗ, СТД № 682.,1985).

Выполнение требований стандартов менеджмента качества (ГОСТ Р ИСО 9001-2008) и Правил GMР (ГОСТ Р 52249-2009) способствует повышению качества вакцин. Технологический контроль становится главным инструментом, обеспечивающим основные составляющие качества биопрепаратов: безопасность, эффективность и стабильность. Постоянный мониторинг показателей качества в критических контрольных точках предупреждает возможность появления дефектов продукции. Рекомендуемый стандартами процессный подход связан не только с документированием, но и с детальным анализом и вмешательством в технологические процессы, которые рассматриваются в том числе, с точки зрения бизнес-процессов.

1.2 Цель и задачи исследований

Цель работы состояла в совершенствовании технологии производства вакцины против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота», разработке новых вакцин на основе концентрированного вируса и экологически безопасных технологий вакцинации цыплят-бройлеров в условиях промышленного птицеводства.

Для реализации поставленной цели нами были определены следующие задачи:

- изучить кинетику термоинактивации биологической активности вируса НБ, разработать методы оценки стабильности вакцины против НБ на всех этапах ее жизненного цикла и определить возможность прогнозирования сроков годности вакцины;

- научно обосновать и количественно определить оптимальную иммунизирующую дозу вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота»;

- разработать технологический процесс получения концентрированного вируссодержащего материала для изготовления вакцин;

- разработать технологию изготовления моновакцины из концентрированного вируса;

- разработать технологию изготовления ассоциированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;

- разработать экологически безопасные технологии крупнокапельной и камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров против НБ;

- оценить технологический процесс производства вакцины против НБ и возможность его совершенствования с учетом требований международных стандартов ИСО серии 9000:2008 и Правил GMP (ГОСТ Р 52249-2009).

1.3 Научная новизна

Применение линейной модели для изучения изотермической кинетики инактивации вакцины против НБ (сложного многокомпонентного по составу иммунобиологического препарата) позволяет обоснованно перейти к количественной оценке стабильности биологической активности препаратов и прогнозированию их сроков годности. В качестве критерия оценки эффективности мероприятий по совершенствованию технологических процессов производства вакцины из штаммов «Ла-Сота», «В₁», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» применен тест «ускоренного старения».

Количественный метод оценки стабильности вакцины против НБ применен в процессе разработки новой защитной среды (патент РФ «Защитная среда для приготовления сухой вирусной вакцины» № 1212045 с приор. от 24.01.84 г., А.С. «Способ подбора стабилизатора для сухой вирусной вакцины» № 1314679 с приор. от 15.08.84 г. в соавторстве),

Впервые в отечественной ветеринарной практике научно обоснована и количественно определена оптимальная иммунизирующая доза вакцины против НБ из штамма «Ла-Сота».

Разработана технология получения вакцины против НБ на основе концентрированного методом ультрафильтрации на полых волокнах вирусного материала (ВСМ) штамм «Ла-Сота» с гемагглютинирующей активностью которого не ниже 2048 ГАЕ/см³, что позволяет получать стабильный при хранении препарат с содержанием доз во флаконе от 20 и выше. В качестве стабилизатора применена защитная среда на основе белкового гидролизата определенного пептидного состава (патент РФ «Вакцина против болезни Ньюкасла птиц и способ ее применения» № 2035917 с приор. от 28.12.92 г., А.С. «Способ изготовления ферментативного гидролизата тканей куриного эмбриона для приготовления защитных сред при производстве сухих вирусных вакцин» № 1277457 с приор. от 12.09.85 г. в соавторстве).

Разработана технология изготовления живой комбинированной вакцины (против НБ и ИЛТ) на основе концентрированного ВСМ штамм «Ла-Сота», использование которого позволяет избежать разбавления второго компонента вакцины ВСМ ИЛТ, не подлежащего концентрированию, и уменьшить объем вакцинальной дозы (патент РФ «Способ получения комбинированной вакцины против ньюкаслской болезни и инфекционного ларинготрахеита птиц» № 2106152 с приор. от 16.06.93 г. в соавторстве).

Разработана схема камерной экологически безопасной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров однодневного возраста против НБ, которая исключает выброс вируса в окружающую среду. Определена доза вакцины против НБ из штамма Ла-Сота, которая не обладает реактогенностью при аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров с различным уровнем материнских антител и обеспечивает необходимую защиту при контрольном заражении (Патент РФ «Способ профилактики болезни Ньюкасла» № 2035915 приор. от 28.12.92 г. в соавторстве).

1.4 Практическая ценность работы

Результаты исследований использованы при усовершенствовании действующих и разработке новых технологий биопрепаратов против НБ и среды защитной для вирусных вакцин.

При непосредственном участии автора на ФГУП «Курская биофабрика» в 1993г. внедрена вакцина сухая против НБ из штамма «Ла-Сота». Производство осуществляется в соответствии с НД на вакцину (Инструкция, утв. ГУВ 29.08.1990 г., ТУ 10-19-212-86 и ТУ-10-19.45-88 «Среда защитная (СПЛФ-жидкая) для вирусных препаратов»). Предприятием выпущено 4,8 млрд. доз вакцины против НБ штамм «Ла-Сота» неизменно высокого качества.

В 1994 г. организовано опытное производство ВНИТИБП. Выпущено и реализовано вакцины против НБ из штаммов «Ла-Сота», «В1», «Бор-74 ВГНКИ», «Н» и «ГАМ-61» 272,36 млн. доз.

Разработан в соавторстве и внедрен ОСТ 100083-95 «Продукция агробиологической промышленности. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, построения, согласования и утверждения.». В 2009 г. основные положения ОСТа пересмотрены с учетом требований ГОСТ Р 52249-2009 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» и включены в проект ГОСТ Р «Средства лекарственные для животных. Технологические регламенты производства. Содержание, порядок разработки, согласования и утверждения».

Разработан комплект методических рекомендаций по вопросам внедрения системы менеджмента качества на предприятиях агропромышленного комплекса. Материалы документов используются с 2004 г.при проведении планового обучения специалистов предприятий РОАО «Росагробиопром» (ФГУП «Щелковский биокомбинат», «Орловская биофабрика», ОАО «Покровский завод биопрепаратов») и входят в системы документации этих предприятий.

1.5 Основные положения диссертационной работы, которые выносятся на защиту

- результаты исследования кинетики термоинактивации вируса НБ; методики определения стабильности вирусных вакцин по тесту «ускоренного старения» и количественной оценки стабильности живых вирусных вакцин и применение их на этапах жизненного цикла вакцины;

- результаты экспериментальных исследований по определению оптимальной дозы вакцины против НБ штамм «Ла-Сота»;

- результаты исследований по разработке технологического процесса концентрирования вируссодержащего материала;

- технология производства, методы биологического контроля моновакцины из концентрированного вируса, результаты комиссионных испытаний опытно-промышленных серий препарата;

- технология изготовления ассоцииированной вакцины против НБ и ИЛТ птиц;

- результаты исследований по разработке экологически безопасных технологий крупнокапельной и камерной аэрозольной вакцинации цыплят-бройлеров против НБ;

- результаты анализа технологического процесса производства вакцины против НБ (в соответствии с требованиями стандартов ИСО с.9000 и Правил GMP) в условиях опытного производства ВНИТИБП.

1.6 Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены:

на заседаниях ученого совета и методической комиссии ВНИТИБП (1975 - 2009 гг.) в виде ежегодных отчетов по темам госзаданий; ветеринарной секции НТС Минсельхоза СССР (17.10. 1984 г.); секции «Ветеринарная биотехнология»» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2002, 2004-2009 гг.); на 5-ти Международных конгрессах и симпозиумах: ХХI Всемирный ветеринарный конгресс (Москва, 1979 г.); І Болгаро-Советский симпозиум «Свободные радикалы и биостабилизаторы» (София, 1987 г.); Российско-американский конгресс «Экологическая инициатива» (Воронеж, 1996 г.); XI International congress оf the World Veterinary poultry association(Будапешт,1997 г.); І Международный ветеринарный конгресс по птицеводству (Москва, 2005 г.); на 37 Всесоюзных, Республиканских, Международных и Всероссийских конференциях, посвященных научным и практическим проблемам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, проводившихся: в Москве, Минске, Риге, Киеве, Харькове, Алуште, Воронеже, Ст. Петербурге, Саранске, Владимире, Новосибирске, Екатеринбурге, Ставрополе, Краснодаре, Курске, Щелково (1977 - 2009 гг.).

Разработки по материалам диссертационной работы удостоены: серебряной медали ВДНХ СССР, 2-х медалей «Лауреат ВВЦ» и нагрудного знака «Участник ВВЦ» (пост. № 678-Н от 13/ІХ-88 г.; № 2682 от 11.ХІІ.2002 г.; № 685 от 12.10.09 г.; № 157 от 24.10.06 г.).

1.7 Публикации

Основные положения диссертационной работы опубликованы в 86 научных работах, в том числе в 7 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получено 6 патентов и авторских свидетельств, разработаны и утверждены 1 отраслевой стандарт и 7 методических рекомендаций. На разработанные и внедренные препараты утверждены нормативные документы в установленном порядке.

1.8 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 398 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, обсуждение, выводы и практические предложения, содержит 35 таблиц и 15 рисунков. Список литературы включает 580 источников. В приложении представлены сводные таблицы исходных данных и копии документов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.9 Личный вклад автора

Заключается в формулировании проблемы, постановке целей и задач исследований, теоретическом и методологическом обосновании путей решения поставленных задач, непосредственном планировании эксперимента и выполнении исследований, обобщении и интерпретации результатов. Автор лично принимала участие в апробации и промышленном производстве разработанных препаратов, подготавливала публикации.

1.10 Благодарности

Автор выражает благодарность научному консультанту, директору ВНИТИБП, академику РАСХН А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники института Э.Ф. Токарик, Н.С.Шевырев, Л.А. Неминущая, А.А. Нежута, Б.Е. Блехерман, Б.И. Токарик, С.М. Панферова, В.В. Панферов, Л.А. Елисеева, Ю.Д. Фролов, В.И. Еремец, С.В. Кузнецова, Е.И. Ярыгина, а также сотрудники ВГНКИ: В.И. Смоленский Т.В., Руденко; ВНИВИП М.И. Слободенюк, Р.Г. Айрапетов; ВНИТИП В.И. Филоненко, В.Г., Шоль, И.П. Салеева, Д.В. Шешенин за что приносим им сердечную благодарность.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 1975-2009 гг. во ВНИТИБП и в его опытном производстве. Часть исследований проводилась совместно с сотрудниками ВГНКИ, ВНИВИП и ВНИТИП. Эксперименты, касающиеся практической реализации научно-исследовательских разработок, осуществляли на базе ряда предприятий отрасли, экспериментального бройлерного хозяйства ВНИТИП.

В качестве материалов для исследований использованы: вакцинные и контрольные штаммы вирусов НБ и ИЛТ; вируссодержащий материал (ВСМ), полученный в лабораторных и производственных условиях; образцы опытных и производственных серий вакцины из штамма «Ла-Сота», «В₁», «Бор-74 ВГНКИ», «Н», ГАМ-61»; опытные серии сухой комбинированной вакцины против НБ и ИЛТ, вакцины «Моновак-НБ-форте», вакцины «Оровак НБ». Для получения ВСМ использовали инкубационное яйцо от невакцинированных против НБ кур (из хозяйств, благополучных по болезням птиц), с 1997г. SPF куриное яйцо (ФРГ, «Lomann Tierzucht») и SPF- эмбрионы кур 9-10-сут возраста производства ФГУП «Щелковский биокомбинат». Вакцинные штаммы ВНБ характеризовали по показателям: среднее время гибели КЭ (МТD); индекс интрацеребральной патогенности для однодневных цыплят (ICPI); индекс интравенозной патогенности для 6-ти недельных цыплят (IVPI); стабильность вирусных гемагглютининов при +56⁰С; стабильность инфекционности вируса при рН 2,8-3,0; агглютинабельность вируса по отношению к эритроцитам петуха,лошади и крупного рогатого скота. Морфологию вируса исследовали методом электронной микроскопии. Инфекционную активность вируса НБ и образцов вакцин определяли титрованием на 9-10 суточных КЭ и рассчитывали по методу Кербера, титр гемагглютининов - в реакции гемагглютинации. Инфекционную активность вируса ИЛТ штамм «ВНИИБП» определяли в реакции нейтрализации. Применяли растворители: 10%-ный раствор глицерина в дистиллированной воде; растворитель для сухой вирусвакцины против болезни Марека (2%-ный раствор пептона в 2-х молярном глициновом буферном растворе) - ТУ 46-21-58-74; АР 1 - Авистим (ТУ 10.07-025-93) - растворитель для живых сухих вакцин против НБ.

В качестве компонентов защитной среды для высушивания вакцины против НБ применяли пептон производства Семипалатинского завода и ГКЭ - гидролизат куриных эмбрионов.

Использовали цыплят и кур различных возрастов мясных и яичных пород и кроссов: цыплята- бройлеры «Гибро - 6»; кросс «Конкурент»; «Бройлер-6»; «Беларусь-9»; породы белый леггорн и кросс «Хайсекс белый. Вакцинацию проводили интраназально, окулярно, перорально (выпаиванием), крупнокапельным распылением и аэрозольно в камере специальной конструкции. Безвредность и реактогенность вакцин определяли общепринятыми методами. Материнские и специфические сывороточные антитела определяли в РЗГА по общепринятой методике. Эффективность вакцинации оценивали по напряженности иммунитета и по уровню защиты птицы при контрольном заражении. Рассчитывали ЭД₅₀ и ЭД₉₅ (50% и 95% защитные дозы).

Для исследования термостабильности использовали термостаты и ультратермостаты (± 0,5⁰).Исследовали воздействие градиента температур, начиная с +40⁰С (интервал 5⁰), и постоянной температуры (от +4⁰ до +70⁰С) на биологическую активность вируса НБ в течение времени, выбранного так, чтобы снижение активности вируса было достоверным. Образцы сухой вакцины после прогревания хранили при температуре ? - 40⁰С не более 10 дней.

Методом гельфильтрации исследовали процесс разделения ВСМ на полых волокнах и пептидный состав гидролизатов белка - основы защитных сред (гель «Toуpearl» HW - 50 F₁ Япония) на колонке 2,6Ч40 см; элюирование проводили фосфатным буферным раствором (0,15 М, рН 7,2). Белок определяли методом Къельдаля, содержание растворимого белка - по методу Лоури, аминный и общий азот - известными методами.

Статистические методы. Опыты проводили с числом повторов ?3, достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Стьюдента-Фишера при уровне значимости р = 0,05. Результаты исследований по термоинактивации обрабатывали методом регрессионного анализа и с применением коэффициента корреляции. Для построения линий прогноза использовали Аррениусовскую температурную зависимость ln K_T от 1/T, прогнозирование сроков годности вакцин осуществляли методом экстраполяции. Для оценки точности и стабильности технологического процесса производства вакцины применяли метод гистограмм. Ретроспективную оценку стабильности технологического процесса проводили с помощью контрольной карты Шухарта для средних значений и размаха (, R).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Совершенствование технологии производства вакцины против НБ

1.1 Разработка количественного метода оценки стабильности вакцины

Кинетика термоинактивации биологической активности вируса НБ в жидкой и сухой вакцине. Успешная профилактика заболеваний птиц с помощью живых вирусных вакцин зависит от ряда факторов, одним из которых является стабильность свойств биологического агента в процессе производства, хранения, транспортировки и применения. Повышение стабильности биологических препаратов является одним из приоритетных направлений в обеспечении их качества. Изучение стабильности рекомендовано проводить до маркетинга и в пострегистрационный период. В комплект документов, представляемых для регистрации в РФ ветеринарных лекарственных средств, должен быть включен отчет по изучению стабильности, на основании которого устанавливают срок годности, условия хранения и транспортирования данного препарата.

С 1976 года ученые ВНИТИБП при непосредственном участии автора решали проблемы стабилизации биообъектов на модели вакцины против НБ, успех которых зависел от разработки методов количественной оценки достигнутого эффекта стабилизации. Были проведены исследования кинетики термоинактивации биологической активности вируса. Применяли метод оценки стабильности биообъектов в сложных системах, основанный на двух теоретических положениях.

Первое состоит в том, что процесс тепловой инактивации биообъекта может быть описан кинетически уравнением первого порядка:

lg Y = lg Y₀ - КЧt, где Y₀ - исходная активность биообъекта; Y - величина активности через время t; К - константа скорости инактивации (1/ ед. времени).

В координатах lg У от t данное уравнение - прямая линия с тангенсом угла наклона к оси Х, равным константе скорости инактивации.

Второе положение - для описания зависимости константы скорости инактивации от температуры применяется уравнение Аррениуса:

K = A^-Ea/RT или lnk = E_a/RT + lnA , где К - константа скорости инактивации (1/ ед. времени); T - абсолютная температура (⁰ К); R= 1,987 кал/градЧмоль (газовая постоянная Больцмана); E_a - эмпирическая энергия активации (кал/моль); А - предэкспоненциальный множитель.

На основании предварительных исследований подобраны такие температуры, при воздействии которых на объект снижение биологической активности было статистически значимым. Для изучения кинетики инактивации вирусных гемагглютининов (ГА) выбрана температура +52⁰С. Установлен линейный характер снижения ГА-активности вируса в эмбриональной жидкости при этой температуре, средний коэффициент корреляции (n= 3) составил - 0,86.

Статистическая обработка результатов показала, что при температуре +37⁰С снижение ИА вируса в эмбриональной жидкости от исходной активности до уровня 3,0 - 4,0 lg ЭИД₅₀/см³ также носит линейный характер и описывается кинетическим уравнением первого порядка, коэффициент корреляции - 0,87. Это позволяет нам применять константы скорости инактивации (К_Т) биологической активности вируса для количественной оценки его стабильности в эмбриональной жидкости - исходном сырье для приготовления вакцины.

Для изучения кинетики инактивации ИА вируса в сухой вакцине выбран спектр температур: +70⁰, +55⁰, +37⁰, +20⁰ и +4⁰С. Снижение ИА вируса имело общий характер, наиболее быстро активность снижалась при +70⁰ и медленнее всего при +4⁰С. Кинетические кривые инактивации вируса, высушенного без защитной среды, состояли из двух компонент (рис.1-А). Первая компонента «быстрая» отражала начальный ускоренный период термоинактивации ИА вируса, вторая «медленная» период относительной стабилизации оставшейся активности. Смена механизмов инактивации вирусной активности происходила на уровне 2,3 - 4,4 lg ЭИД₅₀/см³.

А

Б

Рис.1. Кинетика инактивации инфекционной активности вируса НБ при 37⁰С: А) в эмбриональной жидкости; Б) в сухой вакцине ( 1- среда на основе пептона, 2- ОМ)

При инактивации вируса, высушенного с защитными средами, получены однокомпонентные кривые. Среды на основе пептона, по сравнению с производственной средой обезжиренное молоко (ОМ), были более эффективными (рис. 1-Б). Зависимость изменения активности вируса в сухой вакцине от времени при каждой из температур - линейная, поэтому величины К_Т вируса являются количественным выражением стабильности вакцины и при соответствующей постановке экспериментов могут быть использованы для оценки вклада различных факторов в ее стабильность. Так эффективность защитных сред, используемых при изготовлении вакцины, оценивали отношением констант скоростей инактивации вируса.

Для разработки экспресс-теста контроля стабильности вакцины определяли наличие и характер связи между величинами снижения титра ИА вируса в условиях «ускоренного старения» (7 суток - 37⁰С) и при низких температурах (20⁰ и 4⁰С). Анализ экспериментальных данных методами биологической статистики подтвердил наличие линейной связи между величинами Д₃₇ и Д₂₀, Д₃₇ и Д₄, что позволило предложить в качестве экспресс-теста стабильности вакцины против НБ величину снижения титра ее инфекционной активности за 7 суток при 37⁰С - (Д₃₇).

Прогнозирование сроков хранения сухой вирусвакцины против НБ. Для составления прогнозов сроков годности исследуемых серий вакцины использованы К_Т и уравнение Аррениуса. В аррениусовских координатах InК_Т и данное уравнение изображается прямой линией, тангенс угла наклона которой определяет энергию активации. Полученные экспериментальные данные по кинетике термоинактивации обрабатывали методом наименьших квадратов, при этом была подтверждена линейная зависимость между Y = ln K_T и X = Ч 10³. Она представлена прямой линией в координатах (ln K_Т от 1/Т) и является уравнением прогноза срока годности и изменения активности вакцины, с помощью которого методом экстраполяции можно определять величины K_Т при интересующих нас температурах. Рассчитана энергия активации (ДЕ_а) процесса потери активности вируса в сухой вакцине при повышенных температурах (ДЕ_а= 28,3 ккал/моль). Комиссионная апробация экспресс-метода определения сроков годности сухой вакцины против НБ подтвердила его пригодность в условиях производства.

1.2. Определение прививной дозы вакцины против НБ штамм «Ла-Сота»

Вопросы эффективности и безопасности применяемых вакцин тесно взаимосвязаны, зависят от многих факторов, в том числе от количества (дозы) вводимого антигена.

На начало проведения исследований в наставлениях по применению вакцин против НБ доза вируса выражалась в инфекционных единицах (ЭИД₅₀) только для аэрозольной иммунизации, для интраназальной и пероральной вакцинации - в объемных. При таких методах вакцинации наблюдалось изменение дозы в 100 раз, что приводило к существенному занижению или завышению ее при крайних значениях (8,0-10,0 lg ЭИД₅₀/см³) ИА вируса и, как следствие, к неудовлетворительным результатам. В связи с этим необходимо было обосновать выбор эффективной дозы вакцины из штамма «Ла-Сота» и перевести ее из объемных единиц в количественные (ЭИД₅₀).

Проведена статистическая обработка данных лабораторных опытов 1980-1989 гг. Исследована иммуногенность 64 опытных и промышленных серий вакцины (3500 цыплят породы белый леггорн). Установлено, что для цыплят 15-20 суточного возраста надежная назальная доза (80-100% защита от 1000 ЛД₅₀ вирулентного вируса НБ) находилась в диапазоне от 3,0 до 6,3 lg ЭИД₅₀/см³ (титры сывороточных антител 3,0 - 9,0 lоg₂). Наиболее часто встречаемая доза 4,3 lg ЭИД₅₀/см³ (рис.2). Для цыплят 5 суточного возраста (с материнскими антителами) эффективная доза равна 6,3 lg ЭИД₅₀/см³, с учетом стандартной средней ошибки* титрования (при десятикратном разведении) вируса (± 0,4 lg ЭИД₅₀/см³⁾, она равна 6,7 lg ЭИД₅₀/см³ или 5 000 000 ЭИД_50.

* получена в результате многократного (в течение 2-х лет, п = 100) определения инфекционности вируса эталонной серии вакцины против НБ штамм «Ла-Сота».

Вакцина в дозах от 1 до 5 млн. ЭИД₅₀ у 5 и 20 суточных цыплят обеспечивала защиту от 2 млн. ЛД₅₀ вирулентного вируса НБ. При введении вакцины в дозе 5 000 000 ЭИД₅₀ антитела в сыворотке крови цыплят появлялись на 3- 4 сутки после вакцинации, титр составлял 3,0 - 4,0 lоg₂. На 4 сутки птица была на 70% защищена от 1000 ЛД₅₀ вирулентного штамма вируса НБ, на 6-й день на 90% (титры антител 5,0 lоg₂), на 7-8-е сутки птица полностью защищена (титры антител 5,0-6,0 lоg₂), к 14 дню титр антител составлял 6,0 -9,0 lоg₂. Максимальное накопление сывороточных антител наблюдалось через 30 дней после вакцинации, к 120 дню титр сывороточных антител снижался до 3,0 - 2,0 lоg₂. Через три месяца после вакцинации было защищено 92-100 % птицы, а через 5 месяцев 70 - 85% (по результатам контрольного заражения).

Рис. 2. Ретроспективный анализ экспериментальных данных об эффективности прививных доз вакцины против НБ штамм «Ла-Сота».

Результаты опытов по определению иммуногенности промышленных и экспериментальных серий вакцины из штамма «Ла-Сота» для цыплят кроссов Хайсекс белый и Бройлер-6, иммунизированных интраназально и выпаиванием в возрасте 15 и 40 суток с последующим серологическим контролем до 120 дней, также подтвердили эффективность предлагаемой дозы.

Согласно НД 1 см³ вируссодержащего материала (ВСМ) с титром инфекционности 8,0 - 10,0 lg ЭИД₅₀/см³ содержит 250 доз. Тогда как, только при титре инфекционности вируса 9,5± 0,4 lg ЭИД₅₀/см³ в 1 мл вакцины количество доз составляет 250. Отсутствие стандартной дозировки вакцины требовало внесения изменений в НД по изготовлению, контролю и по применению вакцины с целью стандартизации ее по активности и повышения гарантий эффективности при применении в ветеринарной практике.

Испытания эффективности назальной дозы вакцины «штамм Ла-Сота» 5 000 000 ЭИД₅₀ проведены в условиях промышленного птицеводства. Птицу яичного направления породы белый леггорн кросса «Беларусь-9» (9000 гол.) вакцинировали в возрасте 12-15 дней и ревакцинировали в 45 дней (одной назальной дозой) производственной серии вакцины, выпущенной в новой дозировке. Уровень материнских антител составлял 3,2 lоg₂. Контрольную группу птицы (36000 гол.) вакцинировали и ревакцинировали интраназально (согласно действующему наставлению) вакциной с активностью 9,0 lg ЭИД₅₀/см³ того же производства. Растворитель - дистиллированная вода. Динамику титра антител в сыворотках крови птицы обеих групп определяли в РТГА. После вакцинации уровень сывороточных антител в опытной и контрольной группах составил 5,9 и 5,5 lоg₂, соответственно; после ревакцинации - 5,0 и 5,2 lоg₂; перед контрольным заражением - 3,5 и 3,4 lоg₂. Контрольное заражение (10000 ЛД₅₀), проведенное через три месяца после ревакцинации, показало 100% защиту птицы в опытной и контрольной группах при 100% гибели невакцинированной птицы (15 гол.).

Таким образом, в условиях промышленного птицеводства подтверждена эффективность назальной дозы вакцины 5 000 000 ЭИД_50.

1.3 Разработка технологического процесса получения концентрированной эмбриональной жидкости куриных эмбрионов, содержащей вирус НБ

Для исследований использовали вируссодержащий материал (ВСМ) развивающихся куриных эмбрионов (РЭК), содержащий вирус НБ штамм «Ла-Сота». Продолжительность инкубирования РЭК до сбора эмбриональной жидкости (14-15 суток) определена опытным путем. Для этого учитывались: максимальная ИА вируса, минимальное количество белка в ВСМ, максимальный объем жидкости, собранной с эмбриона.

Для очистки и концентрирования ВСМ проводили сравнительные испытания ядерных мембран (ЯМ; диаметр пор 0,05-0,08 мкм), фторопластовых мембран (МФФ; 0,05-0,08 мкм) и полых волокон (ПВ; 0,02 мкм). Предварительную очистку ВСМ от механических крупнодисперсных примесей проводили на установке УСФ-293-7 с использованием картона фильтровального для биологических жидкостей (КФБЖ). ВСМ концентрировали на ультрафильтрационных (УФ) мембранах в ячейках ФМ-02-200 или ФМ-02-1000, УФ на полых волокнах (ВПУ-15ПА) проводили на установке УПВ-6,0. Эффективность мембран оценивали: по кратности концентрирования ВСМ по объему, биологической активности вируса и ее сохранности в концентрате ВСМ, очистке материала по белку, скорости фильтрации и селективности. Количество белка определяли спектрофотометрически (длина волны 280 нм) и по методу Лоури.

Во всех опытах отмечено повышение ИА и ГА-активности в ВСМ. На МФФ потери вируса были наибольшими - титр ИА фильтрата составлял 3,5lg ЭИД₅₀/см³. Максимальное увеличение ГА-активности (1: 8192) получено при использовании ПВ. Применение КФБЖ способствовало повышению пропускной способности мембран в 2-3 раза. Все испытанные мембраны частично пропускали белок в фильтрат. При концентрировании ВСМ в 8-10 раз по объему кратность концентрирования по белку составляла 1,4-3,5 раза, то есть происходила частичная очистка вируса от сопутствующих белков. При этом степень очистки вируса по белку была выше на ЯМ, чем на ПВ: 86,8 % и 65,2 %, соответственно.

Исследования показали, что более технологичным является метод концентрирования ультрафильтрацией на ПВ, характеризующийся низкими энергоемкостью и эксплуатационными затратами. УФ на ПВ позволяет работать с большими объемами вирусного материала, сохранить структуру биологически активного вещества, обеспечить герметичность и асептические условия процесса. Очистка и концентрирование ВСМ проводились практически в одну стадию. Установлены следующие параметры концентрирования вируса: рабочее давление 0,08-0,12 МПа, линейная скорость потока жидкости 0,1-0,8 м/с.

В процессе концентрирования на ПВ выявлена зависимость селективности ПВ мембраны от срока хранения ВСМ до концентрирования. При использовании ВСМ с малым сроком хранения получали мутные концентраты, содержащие коагулированные белки. Статистическая обработка данных подтвердила значимое влияние срока хранения ВСМ на селективность мембран (до 4 суток - 11-22 %; до 25-26 суток - 63-67 %) и на стандартность характеристик полученного жидкого концентрата. Срок хранения ВСМ перед концентрированием должен составлять не менее 10 суток.

Апробация в опытно-промышленных условиях подтвердила воспроизводимость и надежность разработанного метода ультрафильтрации. Полученный биологический материал был стерилен и содержал морфологически полноценный вирус (по результатам электронной микроскопии). Скопления вирионов характеризовались четко выраженными пепломерами, повреждающего действия процесса очистки и концентрирования на вирус НБ не наблюдалось.

Процесс разделения ВСМ на ПВ контролировали гельфильтрацией в пробах (исходная, концентрат и фильтрат). Гельхроматограммы подтверждают прохождение процесса концентрирования. Содержание белковых примесей в концентрированном ВСМ существенно ниже, чем в исходным материале, низкомолекулярные фракции полностью отсутствуют (рис.3).

Рис.3. Гельхроматограмма вируссодержащего материала.

В процессе ультрафильтрации объем ВСМ уменьшался в 8-12 раз (по сравнению с начальным объемом), содержание общего белка снижалось на 65%, в среднем. Величина ИА вируса в концентрате составляла 9,9-11,0 lg ЭИД₅₀/см³, гемагглютинирующая активность варьировала от 11,0 до13,0 lоg₂. Можно предположить, что значительное увеличение ГА-активности вируса связано с удалением в процессе ультрафильтрации ингибиторов гемагглютининов.

Титры инфекционности и ГА-активности вируса в концентрате не снижались через 4 часа хранения при комнатной температуре и через 45 дней хранения при 4-6⁰С (срок наблюдения).

Глава 2. Разработка новых препаратов на основе концентрированного вируса НБ

2.1 Разработка технологии изготовления и контроля вакцины на основе концентрированного вируса НБ

Разработка новой вакцины была вызвана необходимостью иммунизировать против НБ птицу подсобных и фермерских хозяйств в районах расположения птицефабрик, для создания буферных иммунных зон. Ориентировочно в 2009 г. поголовье такой птицы было около 37,9 млн. голов. Дозировка коммерческих вакцин против НБ составляет, как правило, не менее 1000 доз во флаконе, что не удовлетворяет численности поголовья этих хозяйств. Для частных потребителей необходимо выпускать вакцину, расфасованную в малых дозах.

Скрининговые исследования показали, что простым разведением ВСМ не удается получить стабильный препарат в малой дозировке, поскольку вирус в разведении 100 доз во флаконе и ниже имеет большие потери активности при замораживании-высушивании и обладает очень низкой ГА-активностью. Литературные данные свидетельствовали в пользу предположения, что цель может быть достигнута использованием для изготовления вакцины концентрированного вируса, так как основой гуморального иммунитета против вируса НБ является наличие в крови специфических антител, уровень которых зависит от гемагглютинирующей активности вакцинного штамма.

Экспериментальные серии вакцины (с содержанием доз во флаконе 50, 100 и 250) готовили исходя из того, что в 1 см³ ВСМ с титром инфекционности 9,5 lg ЭИД₅₀/см³ содержится 250 назальных доз. Вирусный концентрат разводили с учетом величины назальной дозы. Конечная концентрация основных ингредиентов защитной среды (пептон и лактоза) составляла 5% (табл. 1).

Концентрированный вирус обладает высокой иммуногенностью: прививная назальная доза для 15-суточных цыплят составляет в среднем 800000 ЭИД₅₀ против 5000000 ЭИД₅₀ в коммерческой вакцине, приготовленной по ТУ 10-19-212-86. Более высокая иммуногенность вакцины из ПВ - концентрата вируса НБ, возможно, объясняется очисткой от ГА-ингибитора. Варьирование содержания концентрированного вируса в двух мл вакцины позволяет получать препарат с различным содержанием доз во флаконе (от 20 и выше).

Таблица 1.Биологическая активность и стабильность ВНБ экспериментальных серий вакцины

Кол-во доз	ВСМ ЗС	ЗС	Инфекционная активность lg ЭИД50/ мл
			Концентрат ВСМ (nv ~10 раз)	Исходный ВСМ
			после сушки	7 суток - 370С	Д37	после сушки	7 суток - 370С	Д37
50	1:9	5%	9,1	8,2	0,9	8,9	7,4	1,5
100	1:4	7,5%	9,5	8,7	0,8	8.8	7,5	1,3
250	1:1	10%	9,7	8,6	0,9	8,4	8,0	0.4

В качестве стабилизатора применяли защитную среду (ЗС) на основе гидролизата белков (пептона), содержащего пептиды, мас. %: высокомолекулярные (30000-80000g) - 10-15; среднемолекулярные (5000-20000g) - 68-70; низкомолекулярные (5000g) - остальное.

Полученная вакцина безвредна и не реактогенна, стабильна при хранении. Комиссионные испытания во ВНИТИБП и в одном из предприятий биологической промышленности подтвердили эти результаты. Вакцина, приготовленная из очищенного и концентрированного ВСМ, обладает высокой биологической активностью: титры ГА (8,0 lоg₂, в контроле - 6,0 lоg2)и иммуногенность (lg ЭД₅₀/см³равен 6,5, в контроле lg ЭД₅₀/см³- 4,9) (Р >0,05).

Для устранения побочного эффекта процесса ультрафильтрации (агрегация вирусных частиц в концентрате, приводящая к получению заниженных данных о титрах вируса, особенно после длительного хранения) предложено использовать специальный растворитель, обладающий дезагрегирующей активностью («Авистим Р1»), в состав которого входят пептон, фосфатно-буферная система, трилон Б и твин-80. Новую вакцину против НБ из очищенного и концентрированного вируса штамма «Ла-Сота» назвали «Моновак-НБ-форте».

Испытания вакцины «Моновак-НБ-форте» опытно-промышленной серии проводили в условиях прмышленного птицеводства на птице (9 тыс. голов) породы леггорн кросса «Беларусь-9». Птицу вакцинировали в возрасте 17-19 суток и ревакцинировали спустя 30 дней интраназально с использованием растворителя «Авистим - Р1». Прививная доза равнялась 5 000 000 ЭИД₅₀мл. Через три месяца после ревакцинации проводили контрольное заражение (10 000 ЛД₅₀ вирулентного вируса НБ). Титр сывороточных антител перед заражением составил 3,86 log₂. Вакцинированная птица в течение срока наблюдения (10 дней) не проявила клиники НБ и выжила (100%-ная защита от контрольного заражения). Вся невакцинированная птица погибла.

В НД на вакцину введены следующие дополнительные контроли готовой продукции: отсутствие контаминации микоплазмами; определение идентичности вакцинного вируса; гемагглютинирующая активность вируса, термостабильность вакцины, расчет количества доз во флаконе.

Вакцина предназначена для иммунизации птицы в условиях промышленного птицеводства и в хозяйствах с малым поголовьем (фермерские хозяйства и декоративное птицеводство). Вакцина может применяться интраназально, перорально (выпаиванием) и аэрозольно, в том числе для камерной вакцинации цыплят в однодневном возрасте. Интраназально и аэрозольно вакцина применяется с растворителем «Авистим - Р1».

2.2. Разработка технологии изготовления ассоциированной вакцины против НБ и ИЛТ

Исследования проводились в рамках Договора о творческом сотрудничестве между ВНИВИП и ВНИТИБП, заключенного по «Плану комплексных исследований по изучению и созданию ассоциированных вакцин (живых и инактивированных) против болезней птиц при научно-техническом сотрудничестве ВНИВИП и фирмы Рон-Мерьё (Франция)».

Для изучения возможности одновременного использования в составе вакцины вирусов ИЛТ штамм «ВНИИБП» и НБ штамм «Ла-Сота» проведено два модельных опыта. При одновременной инокуляции цыплятам вакцинных штаммов вирусов НБ и ИЛТ не выявлено повышение реактогенности. Совместное культивирование вирусов в КЭ в следующих дозах: вирус ИЛТ - 3000 ЭИД₅₀/0,1см³ и вирус НБ - 10, 100, 1000 и 3000 ЭИД₅₀/0,1 см³; вирус НБ - 3000 ЭИД₅₀/0,1см³ и вирус ИЛТ - 10, 100, 1000 и 3000 ЭИД₅₀/0,1 см³ не вызывает интерференции между ними. Показатели гуморального иммунитета и устойчивости цыплят к контрольному заражению статистически достоверно не отличаются от этих показателей при использовании моновакцин.

Для конструирования ассоциированной живой вакцины против НБ и ИЛТ накопление вирусов проводили раздельно с использованием технологий получения моновакцин с последующим концентрированием ВСМ НБ (см.1.3.). Использование концентрата вируса НБ позволяет избежать разбавления ВСМ ИЛТ (гомогенизированные хориоаллантоисные оболочки вместе с экстраэмбриональной жидкостью РЭК), не подлежащего концентрированию.

Соотношение вирусов НБ и ИЛТ в вакцине определено с учетом их активности до и после сублимационного высушивания и оптимальных величин доз этих вирусов в зависимости от предполагаемого способа применения вакцины. Количество доз вакцины рассчитывали по биологической активности вируса ИЛТ. ВСМ объединяли из расчета 1 ЭИД₅₀ вакцинного вируса ИЛТ плюс 4000 ЭИД₅₀ вакцинного вируса НБ.

При выборе защитной среды для высушивания вакцины сравнивали две: СПЛФ (ВНИТИБП) и среду ВНИВИП. Определение биологической активности вирусов НБ и ИЛТ после высушивания показало отсутствие статистически достоверных различий. Выбор был сделан в пользу СПЛФ, которая к тому времени была внедрена и использовалась в биологическом производстве, в том числе в процессе промышленного изготовления сухой вакцины против ИЛТ птиц из штамма «ВНИВИП». Совместно с сотрудниками лаборатории сублимационного высушивания ВНИТИБП разработан режим замораживания-высушивания вакцины, определен допустимый уровень остаточной влажности после высушивания ? 4%. Стабильность биологической активности вирусов в образцах сухой вакцины определяли экспресс-тестом (+37⁰ С-7 суток) и долгосрочным хранением при температуре + 4+6⁰С. По результатам определения стабильности установлено, что при изготовлении вакцины титр ИА вируса НБ должен быть ? 9,75-10,0 lg ЭИД₅₀/ см³; вируса ИЛТ ?5,5 -5,7 lg ЭИД₅₀/ см³.

Опытным путем подтверждены безвредность и отсутствие реактогенности 10-кратной дозы вакцины для цыплят 15-17- дневного возраста. Изучение иммуногенных свойств вакцины проводили на цыплятах того же возраста породы белый леггорн. При окулярном способе вакцинации цыплятам наносили на конъюнктиву по 1 дозе вакцины, содержащей 1000 ЭИД₅₀ вируса ИЛТ и 4 000 000 ЭИД₅₀ вируса НБ. Вакцина индуцировала у 100% цыплят напряженный иммунитет к вирусу НБ (титр антител по группам 5,0 - 6,5 log₂) и обеспечивала 100% защиту от 1000 ЛД₅₀ вирулентного вируса. При окулярной иммунизации ассоциированной вакциной по сравнению с соответствующей моновакциной титр гемагглютининов и устойчивость цыплят к контрольному заражению 1000 ЛД₅₀ вируса НБ значимо не отличались друг от друга (таблица 2).

Таблица 2. Иммуногенность вакцины при окулярном^а) и энтеральном^б) методах вакцинации

№ п/п	Вак- цина	Кол-во птиц	Титр анти-ГА ( log2) к вирусу НБ	Устойчивость к 1000 ЛД50 вирулентного вируса НБ	Титр вируснейтрализующих антител к вирусу ИЛТ	Устойчивость к 1000 ИД50 вирулентного вируса ИЛТ
			До вак-ци- на- ции	Через 15 дней	Забо- лело	r*	Р	До вак- ци- на -ции	Через 15 дней	Забо-лело	r*	Р
1а)	НБ и ИЛТ	91	2,0	6,5	0/31	- 1,0	<0,05	0,3	2,16	5/60	-0,85	<0,05
2а)	НБ	20	2,0	6,3	0/20	- 1,0	<0,05	0,3	0,3	-	-	-
3а)	ИЛТ	47	2,0	2,0	-	-	-	0,3	2,34	3/47	-0,90	<0.05
4а)	Конт- роль	40	2,0	2,0	0/20	-	-	0,3	0,3	20/20	-	-
1б)	НБ и ИЛТ	56	2,0	5.2	2/21	- 0,9	<0,05	0,5	2,20	3/35	-0.89	<0.05
2б)	НБ	53	2,0	5,5	0/20	-1,0	<0,05	0,5	0,5	-	-	-
3б)	ИЛТ	20	2,0	2,0	-	-	-	0,5	2,20	4/53	-0,89	<0,05
4б)	Конт- роль	60	2,0	2,0	20/20	-	-	0,5	0,5	39/40	-	-

r^* -коэффициент корреляции, Р - достоверность

К вирусу ИЛТ вакцина индуцировала выработку вируснейтрализующих антител со среднегеометрически титром, равным 2,16, а при применении моновакцины 2,34. Коэффициенты корреляции устойчивости к вирулентным вирусам составили: к вирулентному штамму вируса НБ - 1,0 (для ассоциированной и моновакцины); к вирулентному вирусу ИЛТ (1000 ИД₅₀) штамма «24а» - 0,85 и - 0,9 (для ассоциированной и моновакцины, соответственно).

Иммуногенность вакцины при энтеральном методе введения определяли путем выпаивания птицам по 4 дозы (4000 ЭИД₅₀) вируса ИЛТ и 16 000 000 ЭИД₅₀ вируса НБ (таблица 2). Титр сывороточных антител к вирусу НБ при применении ассоциированной вакцины 5,2 log₂, а при применении моновакцины -5,5 log_2. При контрольном заражении цыплят, вакцинированных ассоциированной вакциной, коэффициент корреляции устойчивости к контрольному заражению вирулентным вирусом НБ (1000 ЛД₅₀) равнялся -0,90, а при применении моновакцины -1,0. Аналогичные результаты получены в отношении вируса ИЛТ (1000 ИД₅₀).

При нанесении ассоциированной вакцины на конъюнктиву глаза птицы и при пероральном (с питьевой водой) применении формировался напряженный иммунитет со 100% защитой цыплят при заражении вирулентными вирусами.

Глава 3. Разработка высокоэффективных и экологически безопасных способов (технологий) вакцинации цыплят-бройлеров против ньюкаслской болезни

3.1 Разработка спрей - метода вакцинации цыплят-бройлеров против НБ

Спрей состоит из относительно крупных капель (250 µ и выше) по сравнению с диаметром капель в аэрозоле (около 50 µ). Этим основным различием обусловливается разница между распылением и аэрозольным введением в потерях суспензии вакцины, в эффективности и безопасности процедуры вакцинации. Крупнокапельное распыление особенно эффективно для введения вакцин против респираторных вирусов. Для успешной вакцинации необходимо знание принципов ее проведения, а также точное и надежное оборудование.