Молекулярно-генетические методы защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Биобезопасность растений

1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Молекулярно-генетические методы защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Биобезопасность растений

Специальность: 06.01.07- защита растений

На правах рукописи

Киль Владимир Ильич

Краснодар, 2010

Работа выполнена в государственном научном учреждении - Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) в 2001-2010 гг.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Волчков Юрий Андреевич

доктор биологических наук, Мироненко Нина Васильевна

доктор биологических наук, Антонова Татьяна Сергеевна

Ведущая организация: ГНУ Краснодарский научно-исследовательский институт им. П.П. Лукьяненко

Защита состоится 27 октября 2010 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.038.06 при ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г.Краснодар, ул. Калинина, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет», с авторефератом - на сайте ВАК.

Автореферат разослан и размещен на сайте « » июля 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

профессор Горьковенко В.С.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Для успешного осуществления программ защиты сельскохозяйственных растений от вредных членистоногих необходимо изучение биологии и генетики популяций как вредных, так и полезных насекомых. Это включает в себя знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей.

Значительный прогресс в этом отношении был достигнут в 50-60-е годы прошлого столетия, благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетических) таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизило ученых к пониманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки [Behura, 2006].

Использование молекулярно-генетических подходов, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов и позже ДНК-маркеров, во многом способствовало более глубокому пониманию исследуемых закономерностей в популяциях насекомых. Большинство ДНК-маркеров, используемых сегодня - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК-маркеры позволяют анализировать и объяснять популяционные процессы там, где этого не могут сделать никакие другие методы исследований. Использование ДНК-маркеров необходимо для анализа структуры популяций как полезных насекомых - паразитов и хищников, так и вредителей. Кроме того, они могут использоваться для целей таксономии и филогении [Roehrdanz, Flanders, 1993; Mitchell et al., 2006]. С их помощью можно разделить таксоны насекомых, т.е. биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом [Mitchell et al., 2005, Mitchell, Samways, 2005; Silva-Brandao et al., 2008].

Несмотря на столь широкие возможности ДНК-маркеров, в нашей стране в генетических исследованиях популяций вредителей преобладает использование морфологических и фенетических маркеров. На их основе исследователи продолжают изучать динамику, поведенческие реакции и строят прогнозы о развитии резистентности насекомых к инсектицидам, главным образом для сельскохозяйственно значимых вредителей [Фасулати, Вилкова, 2000; Сухорученко, 2001, 2005; Король, Новосельская, 2001; Беньковская и др, 2004; Ростовцева, 2005].

Несмотря на то, что фенетические маркеры просты для использования и часто проявляются на протяжении всего жизненного цикла организма, они имеют ряд существенных недостатков. Основными ограничениями их использования является то, что хорошо различимые фены относительно редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых. Проблема идентификации вида по морфологическим признакам в отдельных случаях значительно затрудняется из-за существования видов-двойников. Кроме того, модификационная изменчивость фенетических маркеров, как правило, весьма значительна, что затрудняет оценку и прогноз динамики популяционных процессов. Более того, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании их генетического контроля и того, как гены, контролирующие этот признак, наследуются в потомстве.

Использование для этих целей современных методов молекулярно-генетического анализа, в частности ПЦР-метода и полученных на его основе ДНК-маркеров, может во многом способствовать решению этих проблем. Важно отметить, что использование ДНК-маркеров не умаляет применения фенетических и других морфологических критериев в практике защиты растений от вредителей, но лишь дополняет их и расширяет возможности для популяционных исследований видов насекомых, не имеющих четких фенетических признаков, позволяет повысить точность мониторинга и прогноза. Кроме того, с использованием ДНК-маркеров появляется возможность проследить динамику отдельных генетических элементов, отдельных хромосомных локусов, генов и аллелей генов в популяциях, оценить гетерозиготность, гетерогенность и сходство популяций непосредственно на генетическом уровне и другие параметры, которые невозможно оценить с помощью морфологических критериев.

Таким образом, сегодня исследователям недостает точных методов анализа и прогноза в популяциях вредных и полезных насекомых для целей мониторинга и защиты. Существует также недостаток знаний о молекулярно-генетической структуре популяций насекомых и закономерностях ее изменчивости под влиянием стрессовых факторов внешней среды. В этой связи данные исследования, несомненно, актуальны и представляют интерес для практики защиты растений от вредных насекомых.

В то же время многие эксперты по сельскому хозяйству считают, что проблема нехватки продовольствия не может быть решена без применения ДНК-технологий и в частности генной инженерии. Генетическая инженерия по сути продолжает направление традиционной селекции по улучшению генотипов полезных растений, но достигает той же цели более эффективным и быстрым путем. На сегодняшний день генетическая инженерия уже располагает большим арсеналом знаний и методов для эффективного переноса полезных генов из одних организмов в другие [Романов, 2000]. На этой основе уже созданы многие сорта трансгенных или генетически-модифицированных растений (ГМР) и некоторые виды ГМ-насекомых, которые нашли применение в мировой практике защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Однако их использование в нашей стране и в частности ГМ-растений сдерживается недостаточным изучением вопросов их экологической безопасности.

В этой связи данные исследования также актуальны и могут найти свое отражение в практике защиты растений на этапе предрегистрационных испытаний и пострегистрационного мониторинга ГМР и продукции на их основе.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось теоретическое обоснование применения молекулярно-генетических методов в практике защиты сельскохозяйственных растений от вредных насекомых и оценке трансгенных Bt-защищенных растений на экологическую безопасность и на этой основе разработка новых методов мониторинга популяций вредителей и трансгенов.

Для достижения цели исследований были поставлены следующие задачи:

Разработать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Изучить ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяций колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки по RAPD-, ISSR- и SSR-маркерам.

Изучить влияние инсектицидов, географического положения и условий года на фенетическую, молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяций насекомых-вредителей.

Выявить фенетические и ДНК-маркеры резистентности вредителей к инсектицидам и Bt-картофелю и на этой основе разработать новые методы мониторинга резистентности вредных насекомых.

Усовершенствовать методы детекции и количественной оценки трансгенов в биоматериале.

Оценить риск вертикального переноса генов для ГМ-картофеля и кукурузы.

Оценить пролонгированное влияние трансгенного (Bt) картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, на нецелевые виды насекомых, а именно на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции картофельной минирующей моли, а также на жизнеспособность насекомых.

Научная новизна.

Разработаны новые системы описания рисунка и окраски имаго колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Выявлены закономерности изменчивости фенетической структуры популяций насекомых под влиянием инсектицидов и других стрессовых факторов внешней среды. Показано, что чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций, как считалось ранее, но в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка, что ограничивает возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности этого вредителя к инсектицидам.

По данным молекулярно-генетических исследований показано генетическое сходство клопа вредная черепашка с другими представителями семейства Pentatomidae, что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.

Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 Новый.

Разработана математическая модель, позволяющая проводить прогноз развития резистентности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Разработан метод полуколичественной оценки содержания генетически модифицированных источников в зерне сои и соевой муке.

Разработан новый подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и метод оценки влияния Bt-картофеля на картофельную моль в ряду нескольких генераций насекомых.

Практическая значимость результатов исследований.

Разработаны системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых, которые рекомендуется использовать для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Разработана методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR), которую предлагается использовать для молекулярно-генетического анализа популяций членистоногих.

Предложен подход к поиску резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на отборе резистентных генотипов в природной популяции вредителя, постоянно взаимодействующей с инсектицидом.

Разработаны новые методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале, которые предлагается использовать в целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов.

Разработан новый метод мониторинга резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго.

Предложен подход к оценке пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых и разработана методика оценки влияния Bt-картофеля на картофельную минирующую моль, которую рекомендуется использовать на этапе предрегистрационных испытаний Bt-картофеля.

Основные положения, выносимые на защиту:

Новые системы описания феноформ рисунка и окраски колорадского жука и клопа вредная черепашка, которые позволяют более эффективно проводить анализ популяционных процессов этих видов насекомых, нежели традиционные. Фенетическая структура популяций насекомых определяется не столько пестицидным фактором, сколько соотношением генотипов с неспецифической устойчивостью к стрессам.

Методика оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по феноформам рисунка переднеспинки, с использованием предлагаемой нами формулы расчета. Использование для этих целей фенетических маркеров необходимо рассматривать только в качестве предварительной, грубой оценки.

Новый подход для поиска и идентификации резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых, основанный на обработке инсектицидом выборки насекомых из природной резистентной популяции. ДНК-маркеры резистентности к инсектициду Би-58 Новый в популяции клопа вредная черепашка для целей создания новых методов мониторинга и прогноза развития резистентности.

Новый подход для оценки пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых биоценоза и методика оценки влияния трансгенного (Bt) картофеля на картофельную минирующую моль, на основе использования сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

Метод полуколичественной оценки на основе ПЦР по целевому гену устойчивости к гербициду раундап (СP4 EPSPS) для целей мониторинга генетически модифицированных источников в зерне и зернопродуктах сои.

Апробация работы. Исследования проводились в 2001-2010 гг. в Всероссийском научно-исследовательском институте биологической защиты растений Россельхозакадемии (ВНИИБЗР) по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований РАСХН по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2006-2010 гг. «Разработать агротехнологии интегрированной защиты растений, использования биобезопасных, экологичных и экономически эффективных химических и биологических средств защиты растений нового поколения, сортов сельскохозяйственных культур, устойчивых к вредным организмам, и на их основе региональных систем управления процессами фитосанитарного оздоровления агроценозов» по этапу «Разработать системы технологий фитосанитарного оздоровления и стабилизации агроценозов на основе оптимизации их по экономической эффективности, биологической и экологической безопасности».

Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах ВНИИБЗР, а также научно-практических конференциях: Международной конференции "Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений" (ВНИИБЗР, Краснодар, 2002); третьей региональной научно-практической конференции молодых учёных "Научное обеспечение агропромышленного комплекса" (КубГАУ, Краснодар, 2001); Международной конференции «Генетически модифицированные источники пищи: оценка безопасности, законодательно-нормативная база, маркетинг», (Москва. 2003); Всероссийской научно-технической конференции "Биотехнология 2003" (Сочи, 2003); VII Всероссийском конгрессе «Здоровое питание населения России» (Москва, 2003); 2-м Московском международном конгрессе: "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва,2003); 5-ой региональной научно-практич. конф. молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, КубГАУ, 2003); Международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, ВНИИБЗР, 2004); III съезде ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2004); IV Семинаре-совещании «Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур» (Анапа, 2005); Отчетной научной конференции грантодержателей РФФИ (Сочи, 2005); международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь, 2005); Втором Всероссийском Съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 2005); 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес» «Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность» (2006,Пущино); Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар.2006); отчетной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (пос. Агой туапсинского р-на-2006, 2007, 2008); Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 2007); 2-й Всероссийской научно-практической конференции Ставропольского отделения Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии Северо-Кавказского региона» (Ставрополь, 2007); 13 съезде Русского энтомологического общества (Краснодар.2007); международной конференции «Информационные системы диагностики, мониторинга и прогноза важнейших сорных растений, вредителей и болезней сельскохозяйственных культур» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2008); международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2008); II Международной научно-практической интернет-конференции «Актуальные вопросы энтомологии» (Ставрополь, 2009); Х сессии Генеральной Ассамблеи ВПРС МОББ и Международной научно-практической конференции «Биологические основы регулирования вредных организмов в агроценозах» (Киев, 2009).

Работа поддержана субвенциями Миннауки: "Оценка биологической эффективности генно-инженерно-модифицированных растений (ГИМР) и разработка методов оценки их биоценотической безопасности", а также РФФИ и администрацией Краснодарского края: гранты №№ 03-04-96772, 06-04-96737, 06-04-96644, 09-04-96514, 09-04-96556 и грантом МНТЦ №3768.

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 70 научных трудах, в том числе монографии и 9 статьях - в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, выводов, рекомендаций, списка литературы и четырех приложений; содержит 48 таблиц и 60 рисунков. Список литературы содержит 404 источника, из них 66 на русском языке.

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность всем соавторам проведенных исследований: сотрудникам сектора биотехнологии, к.б.н. А.П. Савве и сотрудникам лаборатории гербологии; Ж.А.Ширинян, к.б.н. М.В.Пушне и другим сотрудникам лаборатории массового разведения и применения энтомоакарифагов; к.б.н. И.С. Агасьевой и сотрудникам лаборатории поддержания гос. коллекции энтомоакарифагов; д.б.н. О.Д. Ниязову, д.б.н. В.Г.Коваленкову, а также зам. директора ВНИИБЗР к.б.н. В.Я.Исмаилову и директору ВНИИБЗР академику РАСХН, профессору В.Д.Надыкте за помощь и поддержку в проведении данных исследований.

Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты растений от вредных насекомых

В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Приводится описание техники трансформации членистоногих для создания трансгенных и паратрансгенных насекомых и их использование в программах биологической защиты растений.

Описывается современное состояние исследований по выращиванию генетически модифицированных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и преимущества их возделывания, а также вопросы экологической безопасности генетически модифицированных растений, устойчивых к вредным насекомым.

Глава 2. Материалы и методы

Объект исследования. Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: полужесткокрылые Hemiptera (клопы Nezara viridula, Graphosoma lineatum, Dolicorys baccarum, Eysarcoris incospicnus, Piesodorus lituratus, Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus, Eurygaster integriceps, Perillus bioculatus, Podisus maculiventris); жесткокрылые Coleoptera (колорадский жук Leptinotarsa decemlineata); двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana); чешуекрылые Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella; картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella; хлопковая совка Helicoverpa armigera), а также растения картофеля (Bt-защищённые сорта картофеля Супериор Ньюлиф («Монсанто», США), Луговской-плюс (Центр «Биоинженерия» РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR («Монсанто», США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR («Монсанто», США).

Молекулярно-генетический анализ.

Основным методом молекулярно-генетических исследований являлась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, ISSR-PCR) и электрофорез в агарозном геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) и термоциклере «iCycler» (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и ISSR-анализ проводили одновременно в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов (Диалат ЛТД, Москва). Сравнение выборок проводили по воспроизводимым и четко детектируемым ДНК-фрагментам.

SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл реакционной смеси на термоциклере «Терцик» по одной из следующих программ:

- режимы амплификации для 35S-промотора, NOS-терминатора, гена актина сои: 3 минуты 30 секунд при 94С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94С, 40 секунд отжиг праймеров при - 54С, 60 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72С.

- режимы амплификации для генов CP4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минуты при 94С - предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60С, 25 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 10 минут при 72С.

- режимы амплификации для гена Cry3A: 10 минут при 94С - предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60С, 30 секунд синтез при 72С; последний цикл синтеза 7 минут при 72С.

Электрофорез продуктов амплификации (SCAR-PCR) осуществляли в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электрического поля 5В/см.

Визуализацию ампликонов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat).

Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 50 µM каждого dNTP, 0,4µM каждого из праймеров, 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере iCycler (BioRad) с предварительной денатурацией (940С 2 мин) в режиме: денатурация - 940С 30с, отжиг праймера - 580С 40с (для Сp2.39; Сp2.157; HaSSR1; HaSSR3) и 610С 40с (для Сp1.63), элонгация - 720С 40с (35 циклов), конечный синтез - 720С 3 мин.

Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, толщиной 1 мм при напряжении 300-400 вольт в течение 4-5 часов.

Статистический анализ данных.

Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона. Генетическое разнообразие оценивали по Шеннону с использованием формулы: H= - ? (pi ? ln pi), где pi - частота i-го аллеля в выборке [Chalmers, 1992], а также другим методом - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров.

Сравнение средних по выборке проводили по критерию Стьюдента, канонический дискриминантный анализ - с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили методом UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetical Averages), определение генетических расстояний между генотипами - по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ Treecon [Van de Peer, De Wachter, 1994].

Глава 3. Фенетические маркеры в изучении генетической структуры популяций вредных и полезных насекомых

Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи пришли к выводу о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследованиях. Несомненно, использование фенетических маркеров, по сравнению с молекулярными, в популяционных исследованиях обладает рядом преимуществ и, прежде всего, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых мы будем говорить ниже.

3.1 Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под действием инсектицидов

Целью данного этапа исследований явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка на этой основе метода прогноза развития резистентности к Bt-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задача разработать новую систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука.

В настоящее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata проводят, главным образом, по рисунку переднеспинки взрослых особей в соответствии с методикой, разработанной Фасулати (1986). Однако, по нашим данным, данный подход не учитывает всего многообразия феноформ в популяции и в частности слияние феноформ «A» внизу между собой и с фенокомплексами «P» и «M». Поэтому мы предложили использовать дополнительно к девяти феноформам (по Фасулати) еще фенокомплексы группы «А», описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами впервые: VР; HР; VHР; HY (рисунок 1).

Такой комплексный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов, оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где наиболее часто встречался именно описанный нами фенокомплекс НР (в среднем примерно 30%) (таблица 1).

Рисунок 1 - Основные типы (феноформы) рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 - по Фасулати, 1986; V, H, VH, Y - по Кохманюк, 1982; VР; HР; VHР; HY - по Киль и др., 2004)

Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского края, % (2001-2003 гг.)

Феноформа	Популяция
	краснодарская	темрюкская	староминская
1	4,7	4,3	5,0
2	3,7	1,2	1,7
3	14,0	10,1	10,3
4	1,0	2,0	1,8
5	2,6	2,0	2,2
6	13,6	13,7	13,2
7	1,2	3,0	2,4
8	0,8	2,4	2,1
9	10,7	13,9	12,0
V	2,2	3,4	1,5
Y	4,0	5,0	3,7
VP	1,7	0,2	3,2
HP	27,6*	27,5*	32,1?
HY	5,5	2,7	3,5
H	4,6	6,5	2,7
VHP	1,4	2,0	2,6
VH	0,1	0,1	0,2
*-достоверно отличается от других феноформ ( tфакт. ? t 0,5 )

Оценка выживаемости под действием стрессового фактора наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан). Выживаемость особей колорадского жука в условиях пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые насекомые краснодарской популяции фенокомплекса VP являлись наиболее толерантными к инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а часто встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались невысокой выживаемостью в условиях стресса (в среднем =12,9; 16,4% соответственно). Это указывало на то, что фенетическая структура популяций колорадского жука определяется не только пестицидным, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды. По всей видимости, чувствительность различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука.

В то же время обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) жуков часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по своему механизму действия стрессовые факторы. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать следующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа показывали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались наименьшей дисперсией (??), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При этом данная закономерность прослеживалась для всех трех исследованных популяций и в течение двух лет испытаний. Вероятно, данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды (засуха, холод, зной и др.), что в конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях (специфическая устойчивость к инсектицидам этих феноформ в большинстве случаев ниже среднего).

Становится понятным роль редких феноформ в структуре популяций колорадского жука. Скорее всего, именно эти фенетические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, например, к воздействию пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В дальнейшем эти, первоначально редкие феноформы насекомых, ставшие впоследствии доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре.

Несомненно, интересным представлялась возможность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых.

Фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка

В нашей стране популяционные исследования клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps традиционно проводятся на основе феноформ рисунка щитка взрослых особей и в частности в Институте Защиты Растений (Санкт-Петербург) [Фасулати, 2005]. Некоторые исследователи отмечают адаптивный характер феноформ клопов под действием инсектицидов [Фасулати, 2005; Махоткин, Махоткина, 2006]. В то же время существующая система описания фенетической структуры популяций базируется только на пяти фенокомплексах, что с нашей точки зрения явно недостаточно и требовало усовершенствования. При этом важно было определить, носят ли выявленные выше закономерности формирования фенетической структуры популяций универсальный характер, то есть какую роль в адаптивности популяции играют редкие и часто встречаемые феноформы у других видов насекомых, а именно клопа вредная черепашка.

В рамках указанной проблемы на данном этапе исследований ставилась задача разработать новую систему описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, изучить влияние условий года, географического положения и химических инсектицидов на фенетическую структуру популяций.

3.2 Новая система описания фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка

Нами была разработана новая система описания фенооблика популяций клопа вредная черепашка, которая так же, как и система Фасулати (2005), базировалась на сочетании признаков рисунка и окраски частей тела насекомого. Предложенная нами система описания включала в себя 15 фенокомплексов щитка и 10 морфотипов брюшка (таблицы 2 и 3).

Для апробации новой системы описания феноформ мы проанализировали фенетическую структуру двух выборок краснодарской популяции клопа вредная черепашка. Данные по частотам встречаемости различных феноформ в популяции клопа вредная черепашка приведены в таблице 4.

Можно заметить, что практически все фенотипические классы предлагаемой системы описания были представлены в обеих выборках, кроме фенокомплексов щитка №1 и №3. Однако это не исключало их присутствие при описании других популяций, что в действительности нами и было обнаружено в дальнейшем при фенетическом анализе ставропольской популяции [Киль и др., 2007].

В целом фенооблик обеих выборок, ВНИИБЗР и Елизаветинской (по щитку и брюшку) был одинаков, о чем свидетельствовал и статистический анализ данных распределений (2 факт. = 0, 9 и 1,9, что меньше 2 05). Это позволяло заключить, что данные выборки принадлежали, вероятно, к одной популяции, а предлагаемая нами система описания феноформ вполне пригодна для оценки изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка и изучения популяционных процессов этого вида насекомых.

Таблица 2- Классификация феноформ щитка клопа вредная черепашка

№ фенокомплекса	Признак
	Окраска щитка	Контрастность рисунка
1	Желтый	Контрастный
2	Желтый	Слабый
3	Желтый	без рисунка
4	Коричневый	Контрастный
5	Коричневый	Слабый
6	Коричневый	без рисунка
7	Бурый	Контрастный
8	Бурый	Слабый
9	Бурый	без рисунка
10	темный, серо-коричневый	Контрастный
11	темный, серо-коричневый	Слабый
12	темный, серо-коричневый	без рисунка
13	темно-бурый	Слабый
14	темно-бурый	без рисунка
15	Черный	без рисунка

Таблица 3 - Классификация феноформ брюшка клопа вредная черепашка

№ фенокомплекса	Признак
	Окраска брюшка	Наличие рисунка
1	Оранжевое	Рисунок присутствует
2	Оранжевое	Без рисунка
3	Бурое	Рисунок присутствует
4	Бурое	Без рисунка
5	Желтое	Рисунок присутствует
6	Желтое	Без рисунка
7	темно-серое	Рисунок присутствует
8	темно-серое	Без рисунка
9	Коричневое	Рисунок присутствует
10	Коричневое	Без рисунка

Таблица 4 - Частота встречаемости феноформ в краснодарской популяции клопа вредная черепашка, % * (2006 г.)

Фенокомплекс	Выборка из популяции
	ВНИБЗР	Елизаветинская	ВНИБЗР самки	ВНИБЗР самцы	Елизаветинская самки	Елизаветинская самцы
Щиток
1	0	0	0	0	0	0
2	1,0	0,5	0	2,0	0,5	0,5
3	0	0	0	0	0	0
4	23,0	20,1	16,1	30,1	14,2	28,4
5	9,7	9,2	6,5	13,1	6,4	12,2
6	7,5	9,2	7,7	7,2	8,7	9,6
7	2,6	2,3	0	5,2	0,5	4,6
8	7,8	8,7	5,2	10,5	5,5	12,2
9	5,5	5,8	4,5	6,5	6,0	5,6
10	13,0	14,0	11,0	15,0	15,1	12,7
11	13,6	13,5	24,5	2,6	20,6	5,6
12	10,7	10,4	18,1	3,3	15,6	4,6
13	1,3	1,9	1,9	0,7	1,8	2,0
14	2,0	1,4	1,3	2,6	1,4	1,5
15	2,3	2,2	3,2	1,3	3,7	0,5
2	0,9	46,2**	29,7**
Брюшко
1	2,9	3,1	1,9	3,9	2,8	3,6
2	2,6	1,7	0,6	4,6	0	3,6
3	20,8	17,1	12,3	29,4	9,2	25,9
4	24,7	22,9	14,8	34,6	15,6	31,0
5	17,5	17,1	33,5	1,3	28,9	4,1
6	1,9	2,7	1,9	2,0	3,7	1,5
7	1,0	0,7	1,9	0	1,4	0
8	3,6	2,7	0	7,2	0	5,6
9	19,2	25,5	29,7	8,5	35,3	14,7
10	5,8	6,5	3,2	8,5	3,2	10,2
2	1,9	71,8**	55,4**
* - % от общего количества всех особей в выборке, для самцов и самок - от общего количества самцов и самок соответственно; ** - различия достоверны (2 факт. 2 05 )

Изменчивость фенетической структуры популяций клопа вредная черепашка под влиянием различных факторов внешней среды:

А. Географическое положение

С использованием разработанной нами системы описания феноформ окраски и рисунка имаго клопа вредная черепашка был проведен сравнительный анализ фенооблика краснодарской и ставропольской популяций насекомых. При описании феноформ щитка выявились статистически значимые отличия в фенетической структуре популяций. Между самцами и самками наблюдали статистически значимые отличия. При этом наиболее значимые отличия между полами наблюдали по феноформам брюшка у обеих популяций (2 факт. 2 05). Одновременно с этим желтое брюшко с узором (фенокомплекс № 5) встречалось почти исключительно у самок. Кроме того, самки с феноформами брюшка № 5 и 9 встречались наиболее часто (свыше 60 % от всех самок).

Полученные данные указывали на сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов с полом. Вполне вероятно, что желтый цвет брюшка у самок клопа вредная черепашка играет важную роль при спаривании, привлекая особей противоположного пола. Так ранее установлено, что желтый цвет является привлекающим фактором для многих видов насекомых, в том числе и клопов. Данный факт известен энтомологам давно и в настоящее время используется при изготовлении цветоловушек для защиты садовых насаждений [Васильева, 2006].

Таким образом, фенетическая структура популяций клопа вредная черепашка подвержена изменчивости в зависимости от географического положения популяции. Отмечены статистически значимые отличия в фенооблике краснодарской и ставропольской популяций, а также сцепление генов рисунка и окраски клопов с полом. Это указывало на то, что исследуемые группы особей относятся к разным популяциям насекомых (этот вывод подтверждался также данными молекулярно-генетических исследований, глава 4 диссертации), а изучение популяционных процессов по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

Б. Инсектициды

Далее проводили оценку изменчивости фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка под действием инсектицидов разного спектра действия, Би-58 Новый и суми-альфа. Влияние инсектицидов приводило к значительным изменениям в фенетической структуре популяции. При этом характер изменчивости фенетической структуры зависел от природы инсектицида.

Оценка выживаемости под действием инсектицидов наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила также тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию стрессового фактора. Выживаемость клопов вредной черепашки в условиях пестицидного пресса не коррелировала с частотой их встречаемости в популяции. Таким образом, чувствительность насекомых различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяции клопа вредная черепашка, как указывали некоторые авторы [Фасулати, 2005; Беньковская и др., 2004; Рославцева, 2005], так как насекомые редких феноформ, как правило, имеют более высокую толерантность к инсектицидам. Это согласуется с нашими исследованиями на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006].

Кроме того, обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) клопов часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, часто встречаемые фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по механизму действия стрессовые факторы, что наглядно демонстрировали результаты статистического анализа: наиболее часто встречаемые в популяции феноформы характеризовались наименьшей дисперсией (??), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ.

Таким образом, полученные данные подтверждают сделанный нами ранее (на колорадском жуке) вывод о механизмах становления структуры популяций насекомых и универсальность данных механизмов адаптивности популяций насекомых к стрессовым факторам внешней среды: фенетическая структура популяции определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам.

В то же время для достоверности оценки резистентности популяции по феноформам необходимо, помимо наличия сцепления генов резистентности с генами рисунка и окраски, соблюдение следующего важного условия: паратипическая составляющая признака должна быть, по сравнению с генотипической компонентой, относительно невысокой. Этой части исследований посвящен следующий раздел.

В. Условия года

Несомненный интерес представляло изучение влияния условий года на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. Основной целью данного этапа исследований было определить величину паратипической компоненты признака «рисунка и окраски» клопов. Результаты оценки фенооблика популяции клопа вредная черепашка в зависимости от условий года приведены в таблице 5.

Необходимо отметить, что погодные условия были типичными для г. Краснодара только в 2006 году, что подтверждалось данными 2005-2006 гг. - фенетическая структура популяции в эти годы в целом не менялась. Наоборот, погодные условия 2007 года (жаркие и засушливые весна и лето), когда температура уже в мае достигала 400С и выше и держалась на протяжении четырех-пяти месяцев при практическом отсутствии осадков, привели к существенным изменениям в фенетической структуре популяции клопа вредная черепашка 2007-2008 гг. Экстремальные погодные условия 2007 года привели краснодарскую популяцию клопа вредная черепашка к значительной элиминации, так что это вызвало депрессию численности клопов в 2008 году, и нам с трудом удалось собрать материал для фенетического анализа. Это драматично отразилось и на фенетической структуре популяции 2008 года, что подтверждали данные статистической обработки (таблица 5).

Таблица 5 - Частота встречаемости феноформ краснодарской популяции клопа вредная черепашка в разные годы исследований (молодые особи)*, %

Фенокомплекс	Самки	Самцы
	2006	2007	2008	2006	2007	2008
Щиток
1	0	1,1	0	0	0	5,0
2	0,2	4,1	2,4	1,3	1,8	1,4
3	0	4,0	0	0	2,4	0
4	15,2	24,7	25,0	29,3	21,1	36,6
5	6,5	17,7	33,9	12,7	15,1	21,7
6	8,2	10,8	10,5	8,4	13,6	5,0
7	0,3	4,5	12,1	4,9	7,3	14,9
8	5,4	3,9	6,5	11,3	6,7	4,0
9	5,3	2,2	0,8	6,1	2,8	0,5
10	13,1	10,0	4,8	13,8	13,1	2,0
11	22,5	8,4	3,2	4,1	10,8	3,0
12	16,8	1,8	0	3,9	0,5	0
13	1,8	3,9	0,8	1,3	3,2	4,0
14	1,4	2,4	0	2,1	0,9	1,4
15	3,5	0,5	0	0,9	0,7	0,5
2		43,9**	78,2**		15,1	36,8**
Брюшко
1	2,4	0,5	0	3,7	0,9	0
2	0,3	0	0	4,1	0,8	0
3	10,8	5,2	0	27,7	14,4	2,3
4	15,2	10,5	0	32,8	20,0	2,3
5	31,2	19,7	81,5	2,7	9,9	19,8
6	2,8	4,2	4,0	1,8	5,3	12,9
7	1,7	0,2	0	0	0,2	0,5
8	0	0,5	0	6,4	1,0	0
9	32,5	44,8	9,7	11,6	29,2	24,3
10	3,2	14,4	4,8	9,3	18,3	37,6
2		18,0**	65,7**		31,7**	106,0**
*- общее число особей в 2006 г. - 723; 2007 г. - 871; 2008 г. - 326; ** - есть статистически значимые различия между двумя распределениями, по отношению к 2006 г. (2 факт 2 таб.)

Сравнительный анализ влияния различных факторов внешней среды на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка приведен в таблице 6.

Таблица 6 - Влияние различных факторов на фенетическую структуру популяции клопа вредная черепашка (значения 2 )

Фактор	Самки	Самцы
	Щиток	Брюшко	Щиток	Брюшко
Географическое положение	50,4*	15,1*	31,5*	24,6*
Условия года	43,9*	18,0*	15,1	31,7*
Инсектицид Би58 Новый	36,3*	36,3*	31,9*	13,7
Инсектицид суми-альфа	30,5*	30,5*	16,2	51,0*
* - 2 факт 2 05

Можно заметить, что влияние условий года в некоторых случаях было даже более значительным, чем влияние инсектицидов. Понятно, что сила влияния фактора будет меняться в зависимости от меняющихся условий внешней среды, природы инсектицида и кратности обработок.

Таким образом, можно заключить, что паратипическая компонента признака «рисунок и окраска» щитка и брюшка клопа вредная черепашка весьма значительна, что ставит под вопрос возможность использования фенетических маркеров при мониторинге резистентности популяций этого вредителя к инсектицидам. По-видимому, морфологический анализ популяций клопа вредная черепашка и построенная на нем система мониторинга резистентности к инсектицидам не может являться абсолютно достоверной ввиду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Поэтому прогноз резистентности по феноформам рисунка имаго или другим морфологическим критериям можно рассматривать только лишь в качестве предварительной, грубой оценки, как мы уже отмечали ранее на колорадском жуке [Киль, Головатенко, 2006], и при необходимости можно дополнить проведением молекулярно-генетического анализа с использованием в частности RAPD-маркеров.

3.3 Генетический контроль феноформ окраски щитка и переднеспинки клопа периллюса

Северо-Американский хищный клоп периллюс Perillus bioculatus - специализированный энтомофаг колорадского жука, являлся объектом пристального внимания ученых на протяжении многих десятилетий ХХ века. Попытки его акклиматизации во многих странах не дали положительных результатов. В мае 2008 года при обследовании зарослей амброзии полыннолистной (на территории ВНИИБЗР), оставленной на поле люцерны в качестве резервата амброзиевого листоеда Zygograma suturalis, были обнаружены многочисленные личинки периллюса (от 10 до 20 экз/м2 ), активно питающиеся гербифагом. Это предопределило большой интерес к хищнику, так как вид, очевидно, самостоятельно акклиматизировался и распространился в агроэкосистемах юга России.

В краснодарской популяции клопа P. bioculatus нами были выделены три четко различающихся по окраске щитка и переднеспинки между собой феноформы: красно-черная, желто-черная и бело-черная. В 2009 г. популяция периллюса была представлена самой многочисленной красно-черной феноформой - до 70% популяции, бело-черной и оранжево-черной - до 15% каждая. Данный фенетический полиморфизм может явиться хорошим инструментом в дальнейших популяционных исследованиях этого вида насекомых. Однако использование феноформ для этих целей должно базироваться на знании генетики этого признака, его наследуемости и изменчивости.

Целью данного этапа исследований являлось изучение молекулярно-генетического полиморфизма популяции клопа периллюса по признаку «окраска щитка» насекомого. В этой связи ставилась задача провести ПЦР анализ трех исследуемых внутрипопуляционных групп особей.

В общей сложности было испытано 25 RAPD- и 15 ISSR-праймеров. Наиболее четкие отличия между исследуемыми группами насекомых наблюдали только по RAPD-праймеру ОРЕ07, что подтверждалось данными кластерного анализа. Наблюдали практически полное разделение RAPD-фенотипов на три кластера, соответственно признаку окраски щитка. Это указывало на наличие сцепления отдельных ДНК-маркеров с генами, контролирующими окраску щитка насекомого. В частности RAPD-локус размером 750 пар нуклеотидов (п.н.) наблюдался исключительно у белых особей, тогда как локусы 370 и 390 п.н. - только у клопов с красным щитком.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывали на наличие генетического контроля данного признака, что, в свою очередь, делает возможным использование феноформ окраски в дальнейших популяционных исследованиях P. bioculatus.

Глава 4. Молекулярно-генетический анализ популяций вредных насекомых по ДНК-маркерам

Тестирование генетического разнообразия в популяциях по ДНК-маркерам позволяет проводить мониторинг их состояния вне зависимости от средовых эффектов и видовых особенностей насекомых. Современные методы молекулярно-генетического анализа позволяют оценить уровень ДНК-полиморфизма популяций, внутрипопуляционное генетическое разнообразие, установить степень генетического сходства между видами, популяциями и отдельными индивидуумами непосредственно на генетическом уровне, в отдельных случаях оценить гетерозиготность популяции, изучить генетическую изменчивость по отдельным локусам и аллелям генов.

В данной главе диссертации приводятся результаты анализа ДНК-полиморфизма и молекулярно-генетической структуры различных популяций некоторых наиболее сельскохозяйственно значимых вредных видов насекомых: колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки. При этом проводили ПЦР анализ как природных, так и лабораторных популяций, а также насекомых из энтомологических коллекций, с использованием различных типов ДНК-маркеров (RAPD-, ISSR- и SSR-PCR). Так с использованием метода RAPD-PCR нами был исследован ДНК-полиморфизм различных популяций клопа вредная черепашка и других представителей отряда полужесткокрылых (Hemiptera).

ДНК-полиморфизм различных видов клопов (Hemiptera)

Всего было проанализировано 127 особей из различных таксонов. В целом по всем изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА06 было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 - от 12 до 27. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА06 и GT09 колебалось в зависимости от вида в пределах 5,6 11,7; и 4,2 13,5 соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРА06) и 86,2 % (GT09). Размеры продуктов амплификации варьировали от 100 до 2300 (ОРА06) и от 170 до 2700 пар нуклеотидов (GT09).

По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК фрагментам для обоих праймеров вместе (по 58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ (КДА). Все особи четко распределились в отдельные кластеры в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в самостоятельный кластер выделились особи клопов Pyrrhocoris apterus и Coreus marginatus, принадлежащих к семействам, отличным от клопов-щитников (Pentatomidae). КДА подтвердил результаты кластерного анализа и позволил выявить генетическое сходство клопов вредной черепашки с клопами щитниками более отчетливо (рисунок 2).

Рисунок 2 - Дискриминация девяти видов клопов в пространстве первой и второй дискриминантных функций

Генетические расстояния шести исследуемых видов клопов-щитников до центроида составляли 9,4 12,7 (у клопа вредная черепашка - 12,0), тогда как представители других семейств отстояли от центроида щитников на расстоянии 13,9 (Coreus marginatus, Coreidae) и 17,6 (Pyrrhocoris apterus, Pyrrhocoridae).

Таким образом, на основании проведенных исследований нам представляется необходимость в более детальном изучении таксономической принадлежности клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. и других представителей семейства Scutelleridae. Этот вид, по всей вероятности, скорее можно отнести к семейству Pentatomidae, о чем ранее высказывались и другие исследователи [Бей-Биенко и др., 1955].

ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных видов чешуекрылых (Lepidoptera)

В данном разделе диссертации приводятся данные по молекулярно-генетической структуре различных видов чешуекрылых: картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки.

SSR-анализ различных географических популяций яблонной плодожорки

Проведение молекулярно-генетического анализа популяций яблонной плодожорки C. pomonella с использованием кодоминантных маркеров, таких как микросателлиты (SSR, simple sequence repeat), стало возможным благодаря исследованиям последних лет [Zhou et al, 2005; Franck et al, 2005]. Так сконструированные французскими учеными для яблонной плодожорки SSR-праймеры [Franck et al, 2005] позволили проанализировать молекулярно-генетическую структуру популяций C. pomonella по микросателлитным локусам во Франции [Franck et al, 2007] и Чили [Fuentes-Contreras et al, 2008].