Молекулярно-генетические методы защиты сельскохозяйственных растений от вредителей. Биобезопасность растений

Целью данного этапа работы явилось изучение ДНК-полиморфизма и генетического разнообразия различных географических популяций яблонной плодожорки из России и Украины по трем микросателлитным локусам Ср1.63; Ср2.39 и Ср2.157 [Franck et al, 2005].

Объектом исследований явились выборки из популяций различных географических популяций яблонной плодожорки из Украины (две выборки: гг.Киев и Мелитополь) и России (четыре выборки: гг. Краснодар (Учхоз «Кубань»), Ейск («Колледж Ейский»), Ставрополь (НПК «Незлобнинский») и Санкт-Петербург). В ПЦР использовали три пары микросателлитных праймеров Ср1.63 (мотив повтора (GA)19), Ср2.39 (мотив повтора (ТС)4АС(ТС)11) и Ср2.157 (мотив повтора (GA)10).

Всего было исследовано 120 насекомых (по 20 особей из каждой выборки). Наиболее высокое соотношение нулевых аллелей (более 50%) было отмечено для локуса Ср2.157, поэтому он был исключен из дальнейшего анализа.

Результаты ПЦР анализа ДНК яблонной плодожорки по двум микросателлитным локусам приведены на рисунке 3.

Рисунок 3 - SSR-фенотипы яблонной плодожорки. Электрофореграмма ампликонов C. pomonella в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локусам Ср1.63 и Ср2.39).М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.).

Можно заметить, что основная часть ДНК-фрагментов для локуса Ср2.39, по сравнению с Ср1.63, смещена несколько в более высокомолекулярную часть спектра. Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 100 до 370 пар нуклеотидов (п.н.) для Ср1.63 и от 100 до 480 п.н. - для Ср2.39. По всем популяциям в целом оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Среднее количество аллелей на локус по всем популяциям составило 2,3 и 3,2 для Ср1.63 и Ср2.39, соответственно. Доля гетерозигот в среднем для обоих локусов была равна 0,57 (таблица 7).

Таблица 7 - ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие в различных выборках из географических популяций C.pomonella по двум микросателлитным локусам

ПЦР анализ насекомых из Украины и России выявил значительные отличия в молекулярно-генетической структуре исследуемых популяций C.pomonella. Среди выборок из разных стран наиболее гетерогенны были выборки из Мелитополя, Киева и Краснодара. Наиболее высокий генетический полиморфизм и генетическое разнообразие наблюдали в выборке из Мелитополя (Украина). Эта популяция характеризовалась наибольшим числом аллелей на особь (Аr = 3,2 - для локуса Ср1.63 и Аr = 7,3 для - Ср2.39), наибольшей долей гетерозигот, отсутствием нулевых гомозигот и наиболее высоким генетическим разнообразием (по двум локусам h=0,18 и I=0,29). В свою очередь, наименьшим генетическим разнообразием характеризовались выборки из Ейска и Ставрополя (h=0,04 и 0,03; I=0,08 и 0,07 по двум локусам, соответственно). Эти же выборки характеризовались наименьшим количеством выявляемых аллелей в среднем на локус и на одну особь.Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяций C.pomonella из России и Украины в целом сопоставимы с полученными ранее для популяций Франции, Италии, Армении и Чили (Franck et al., 2007). В работе французских исследователей наблюдали также относительно более высокое число аллелей и «обогащенность» аллелями для локуса Ср2.39 по сравнению с Ср1.63 для всех исследуемых популяций (в 1,5-2 раза у популяций из европейских стран). Кроме того, анализ данных по всем исследуемым 27 выборкам так же, как и в нашей работе, выявил значительную (более 20%) долю нулевых аллелей по локусу Ср2.157.Снижение генетического полиморфизма и гетерогенности популяций C.pomonella из России (выборки из Ейска, Ставрополя и Санкт-Петербурга), вероятно, было связано с большей пестицидной нагрузкой на фруктовые сады. Так в частности нам известно, что популяции из Киева и Мелитополя, практически не подвергались инсектицидным обработкам. За последние годы в этих садах проводили от 1 до 5 обработок, тогда как, например, в Ейском районе (фруктовый сад хозяйства «Колледж Ейский») и в Ставрополе (НПК «Незлобнинский») количество обработок против вредителей ежегодно достигало 10-12. В то же время полученные данные можно рассматривать лишь как предварительные и требующие более детальной проверки на генетически однородном биоматериале (выборки из одной популяции, но с разными показателями резистентности к инсектицидам).

На основании полученных данных по частотам встречаемости аллелей нами проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций. Генетическая идентичность и генетические расстояния между исследуемыми географическими выборками из популяций яблонной плодожорки приведены в таблице 8.

Таблица 8 - Генетическая идентичность и генетические расстояния [по Nei (1978) Genetics 89:583-590]

Можно заметить, что наиболее близки в генетическом отношении оказались выборки из Ейска и Ставрополя (генетическая идентичность по Nei = 1,0), что, вероятно, указывает на принадлежность этих выборок к одной популяции. Это также наглядно демонстрируют данные кластерного анализа (рисунок 4), где обе эти выборки входили в один кластер.

Наиболее близкой к ним с генетических позиций, несмотря на географическую удаленность, была выборка C.pomonella из Санкт-Петербурга, а наиболее удаленной от них в генетическом отношении была выборка насекомых из Мелитополя.

Рисунок 4 - Дендрограмма по Nei's (1978). Генетические расстояния: метод UPGMA

Таким образом, описана молекулярно-генетическая структура ряда популяций яблонной плодожорки из России и Украины по микросателлитным локусам. Обнаружены значительные отличия в молекулярно-генетической структуре между популяциями как по числу аллелей на локус, степени гетерозиготности, так и по внутрипопуляционному генетическому разнообразию. Данные различия, вероятно, связаны не только с географическим положением, но и с пестицидным прессом, которому подвергались популяции насекомых. Определены коэффициенты генетического сходства и генетические расстояния между исследуемыми выборками насекомых. Снижение гетерогенности отдельных популяций, по-нашему мнению, может быть связано с большим количеством пестицидных обработок в этих садах.

Глава 5. ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей к инсектицидам

Исследование насекомых-вредителей молекулярно-генетическими методами позволяет изучать механизмы изменчивости структуры популяций под влиянием стрессовых факторов внешней среды, в том числе инсектицидов, а также приблизить нас к пониманию механизмов развития резистентности к инсектицидам непосредственно на генетическом уровне. В данной главе диссертации представлены результаты оценки влияния инсектицидов и условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки и клопа вредная черепашка.

Проблема поиска ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам по сути связана с проблемой идентификации генотипов (в нашем случае резистентных насекомых) по фенотипу (RAPD-фенотипу). Попытки идентификации резистентных к инсектицидам генотипов методом RAPD-PCR были предприняты для разных видов насекомых [Cидоренко и др., 2000; Баринов и др., 2005; Guerrero et al, 1997].

Для молекулярно-генетического анализа исследуемой популяции насекомых прежде всего необходимо иметь две группы особей, близких в генетическом отношении, но различающихся по признаку «резистентность к инсектициду». При этом выбор исходного материала для поиска молекулярных (ДНК) маркеров резистентности к инсектицидам базируется на отборе резистентных генотипов в ходе лабораторной селекции в ряду нескольких поколений поливольтинных видов насекомых при постоянном воздействии селектирующего фактора (инсектицида).

В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год или в несколько лет, использование такого подхода не представляется возможным, поскольку получение резистентных генотипов в лаборатории предполагает посемейный отбор в ряду как минимум 10-20 поколений, что, в свою очередь, требует многолетней работы. При этом исходные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Кроме того, при доминантном характере наследования признака гетерозиготные самки (самцы) при скрещивании будут снова давать расщепление по данному признаку.

В этой связи нами был использован новый подход к отбору резистентных к инсектицидам генотипов. Он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких генераций, процесса селекции и постоянного посемейного отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход заключается в том, что выборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают динамику смертности насекомых, отбирая при этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, или оставшихся в живых, в зависимости от используемой концентрации инсектицида (устойчивые). При этом количество отобранных особей должно быть не более 10% от объема выборки. Кроме того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в постоянном взаимодействии с инсектицидами и иметь высокий показатель (уровень) резистентности, что априори предполагает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции моновольтинного вида - клопа вредная черепашка E. integriceps.

С использованием имеющегося у нас набора RAPD-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по восьми из них найдены отличия между двумя группами насекомых, а наиболее характерные - по двум ДНК-фрагментам (рисунок 5).

Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высокой частотой встречаемости ДНК-маркера OPA18/520, а также наличием маркеров OPA07/410 и OPA06/470 при отсутствии таковых у чувствительных особей. В свою очередь для чувствительных особей было характерно 100%-ное присутствие маркера OPA06/430 при практическом отсутствии его у устойчивых особей и более высокая частота встречаемости маркеров OPA18/400, OPA07/470, OPA07/450. Наиболее характерные различия между двумя выборками наблюдали по праймеру OPA06 (RAPD-маркеры 470 и 430 п. н.).

Рисунок 5 - RAPD-фенотипы клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58 (праймер ОРА06). Дорожки: 1-8 - чувствительные особи; 9-17-устойчивые особи. М - Маркеры молекулярных масс Pst1)

Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в данном случае присутствием двух главных RAPD-локусов, по которым отличались конкретные генотипы. Присутствие одного из маркеров, как правило, сопровождается отсутствием другого, что, вероятно, указывает на существование определенной взаимосвязи между маркируемыми локусами. Более того, вполне вероятно, что исследуемый признак контролируется большим числом генов и маркируется соответственно большим числом ДНК-фрагментов. В целом влияние инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было весьма существенным. Оценка по наиболее значимым RAPD-маркерам между двумя исследуемыми выборками насекомых (чувствительные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства между ними был незначителен и составил 0,61 (по Nei, 1978). Важно отметить также, что наблюдаемое генетическое разнообразие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это вполне объяснимо, так как действие инсектицида ведет к элиминации чувствительных особей, а, следовательно, и к снижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой в частности по отдельным ДНК-локусам.

Таким образом, влияние инсектицида Би-58 Новый на клопов вредной черепашки сопровождается изменениями в молекулярно-генетической структуре и снижением генетического разнообразия популяции. Поиск ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, постоянно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода. RAPD-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная черепашка и выявить резистентные к инсектицидам генотипы.

Таблица 9 - Генетическое разнообразие и частота встречаемости отдельных RAPD-локусов в выборках клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58

В то же время из-за низкой воспроизводимости RAPD-маркеров к их использованию для целей мониторинга резистентности необходимо подходить с осторожностью. Чтобы избежать ошибки опыта эксперименты необходимо ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором реактивов, на одном амплификаторе, в одной ПЦР. Кроме того, для большей репрезентативности необходимо последующее преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи полученные данные носят лишь предварительный характер, в то же время это не снижает значимости самого подхода. В конечном итоге результаты подобных экспериментов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и помогут лучше понять механизмы формирования этого процесса.

Глава 6. Изучение экологической безопасности трансгенных растений с использованием фенетических и ДНК-маркеров

Создание трансгенных или генетически модифицированных растений (ГМР) в конце прошлого века и активное их использование в мировом сельскохозяйственном производстве ставит вопрос об их экологической безопасности. Это равным образом относится и к Bt-защищенным растениям, с признаком устойчивости к вредным насекомым и в частности к Bt-картофелю, устойчивому к колорадскому жуку.

6.1 Мониторинг резистентности колорадского жука к Bt-картофелю

Во многих работах подтверждена взаимосвязь адаптивности популяций колорадского жука к инсектицидам с рисунком центральной части переднеспинки имаго [Кохманюк, 1982; Фасулати, 1986; Король, Новосельская, 2001]. Вот почему нам казалось естественным исследовать возможность оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю (растение-инсектицид) по фенетическим маркерам, что может являться основой для более простого метода мониторинга популяций этого вредителя.

В задачу данного этапа исследований входило изучение изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под действием Bt-картофеля и на этой основе поиск фенетических маркеров резистентности. Для изучения взаимосвязи чувствительности популяций колорадского жука к Bt-картофелю и их фенетической структуры мы оценивали частоту встречаемости феноформ под влиянием трансгенного картофеля и чувствительность к Bt-токсину у ряда популяций Краснодарского края.

По полученным данным нами проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить продолжительность жизни личинок колорадского жука (IV возраста) от частоты встречаемости феноформы «V»:

где Y - продолжительность жизни личинок колорадского жука IV возраста (сут); Х - частота встречаемости феноформы «V» (%).

Предложенная математическая модель достаточно адекватно описывает исследуемые закономерности в данной группе популяций. Возможно для других популяций колорадского жука предложенная модель может быть модифицирована. В то же время это не снижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения аналогичных мероприятий для тех популяций и в тех зонах возделывания, где планируется возделывать Bt-сорта.

Таким образом, мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt-чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности по разработанной формуле расчета.

В то же время мы понимаем, что морфологический анализ и построенная на нем система мониторинга не может являться абсолютно достоверной, тем более в виду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Вот почему мониторинг по ДНК-маркерам, как нам кажется, будет более достоверным, хотя, несомненно, и более дорогостоящей процедурой. В то же время, данный подход также может иметь право на жизнь. Вероятно, совместное использование всех доступных методов позволит проводить эффективный мониторинг резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по морфо-генетическим критериям.

6.2 Влияние Bt-картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых

Одним из экологических рисков является возможное негативное влияние ГМР на нецелевую биоту, что может негативно отразиться на биоразнообразии видов и в том числе нецелевых насекомых биоценоза. В настоящее время исследователей и общественность волнует главным образом вопрос не острой токсичности ГМР, но пролонгированного действия Bt-растений на нецелевые виды биоты [Соколов и др., 2005]. Действительно, долговременное влияние Bt-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых) может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генетическом разнообразии популяций организмов, населяющих биоценоз Bt-картофеля и питающихся листьями, клубнями или пыльцой трансгенного растения. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и в конечном итоге на виде в целом.

Кроме того, влияние Bt-токсинов может привести не к элиминации, а наоборот, к увеличению жизнеспособности насекомых, относящихся к нецелевой группе. Применительно к вредителям данное явление крайне нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и соответственно на урожае картофеля. Эти аспекты биобезопасности ГМР до настоящего времени оставались вне поля зрения ученых и требовали своего рассмотрения.

Целью данного этапа исследований являлось изучить влияние Bt-токсинов на некоторые нецелевые виды насекомых, населяющих биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду первых нескольких генераций. В этой связи ставилась задача провести сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в частности популяции картофельной минирующей моли при питании исходным и трансгенным (Bt) картофелем. Кроме молекулярно-генетических исследований ставилась задача провести оценку исследуемых двух групп насекомых по некоторым показателям их роста и развития, при этом в анализ планировали включать каждые пять-семь поколений насекомых. Важно отметить, что картофельная минирующая моль Phthorimaea operculell, как нецелевой вид для Bt-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, является удобным объектом для такого рода исследований, так как способна размножаться на искусственных питательных средах и в лабораторных условиях может дать до 13 генераций насекомых в год.

Проведенный анализ исходной популяции картофельной моли и первых двадцати пяти ее генераций на среде с Bt-токсином показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции в условиях питания Bt-картофелем остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было [Киль и др. 2008, 2009,2010]. В этом разделе автореферата представлены результаты анализа двадцатой и двадцать пятой генерации насекомых, содержащихся на среде с токсином Сry3A.

Опыт проводили в лабораторных условиях. Выборки из популяции насекомых, содержащихся на искусственной питательной среде с листьями исходного и Bt-картофеля, анализировали по RAPD- и ISSR-маркерам и некоторым показателям роста и развития. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона (Н) [Chalmers et al, 1992]. После проведения предварительного скрининга 20 RAPD- и 10 ISSR-праймеров для целей исследования были отобраны наиболее информативные четыре: RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, ОРВ01 и ISSR-праймер UBC810.

Оценка внутрипопуляционного генетического разнообразия по Шеннону не выявила существенных различий между исследуемыми выборками насекомых, питающихся традиционным и трансгенным (Bt) картофелем. Cравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп насекомых также показал отсутствие статистически значимых различий в исследуемых выборках (таблица 10).

Таблица 10 - Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в популяции P. operculella при питании исходным и трансгенным картофелем (двадцатая генерация насекомых)

Результаты анализа насекомых картофельной минирующей моли, содержащихся при разных условиях питания по некоторым показателям роста и развития насекомых приведены в таблице 11.

Можно заметить, что различия между двумя исследуемыми выборками были несущественны: фактические значения критерия Стьюдента по всем показателям были меньше табличного.

Таким образом, сравнительный анализ частот встречаемости ДНК-маркеров показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции картофельной моли в условиях питания Bt-картофелем (сорт Луговской плюс) остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было. Для оценки пролонгированного действия трансгенного Bt-картофеля на нецелевых насекомых можно использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль по предлагаемой нами методике. Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых на этапе предрегистрационных испытаний рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого лежит содержание поливольтинных видов насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины (опыт) и исходный сорт (контроль), и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых.

Таблица 11 - Средние значения показателей роста и развития картофельной минирующей моли в условиях питания Bt-картофелем (двадцать пятая генерация)

6.3 Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам

Одним из аспектов экологической безопасности ГМ-культур является оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Под вертикальным переносом генов понимают передачу генетического материала в поколениях половым путем. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению. В результате это приведет к появлению так называемых «суперсорняков» и увеличению засоренности полей, что может создать экологическую проблему.

Вопросы риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля и ГМ-кукурузы к их диким сородичам и другим возделываемым сортам также исследованы нами с применением метода ПЦР. При этом анализ генетической вставки проводили с использованием SCAR-праймеров, направленных на регуляторные области генома, 35S-промотор (детектируемый фрагмент размером 195 п.н.), Nos-терминатор (180 п.н.) и целевые гены, в частности ген Cry3A Bt-картофеля (117 п.н.).

Результаты экспериментов по вертикальному переносу генов от Bt-картофеля выявили отсутствие переноса генетической конструкции к диким видам и культурным сортам картофеля. Необходимо отметить, что, несмотря на то, что картофель является самоопылителем, перекрестное опыление может составлять у него от 0 до 20 % [Plaisted, 1980]. Если учесть, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семена, можно заключить, что риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля минимален. К тому же дикие родственники картофеля на территории Российской Федерации не произрастают, а если бы и произрастали, гибридные семена не образовывались бы, что подтверждалось результатами наших опытов.

На закрытых сертифицированных участках опытных полей ВНИИБЗР был проведен также многолетний опыт по изучению возможности вертикальной передачи генов от раундап-устойчивой кукурузы к традиционно возделываемым сортам. В задачу исследований входило изучение возможности переноса пыльцы, дистанция рассеивания пыльцы, определение зоны безопасности и пространственной изоляции при выращивании трансгенной кукурузы.

ПЦР анализ выявил наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по различным направлениям переносимой ветром пыльцы (рисунок 6). Перенос генов от ГМ-кукурузы к традиционно возделываемым сортам наблюдали главным образом на дистанции 5-10 м, однако в отдельных случаях - до 200 м (юго-западное направление).

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Степень перекрестного опыления между трансгенной кукурузой и культурными сортами, находящимися поблизости, будет зависеть от ряда факторов, таких как расстояние между ними, локальных барьеров на пути движения пыльцы, местного климата и топографии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому, риск интрогрессии трансгенов от ГМ-кукурузы к ее диким видам в Российской Федерации отсутствует [Крутенко, 2006].

Вопросы ПЦР-детекции и идентификации трансгенов при мониторинге вертикального переноса генов от ГМ-культур тесно связаны с методами контроля за ГМ-семенами, зерном, растениями и продукцией на их основе. При этом встает вопрос не только детекции и идентификации трансгенов, но и их количественной оценки в образцах.

6.4 Полуколичественная оценка ГМИ в семенах сои

Существующие сегодня методы количественной оценки генетически модифицированных источников (ГМИ) в пище, зерне и кормах основаны главным образом на применении техники «Real Time RCR». Такая техника исследований требует использования флуоресцентной метки и дорогостоящего оборудования. Вот почему нами была предпринята попытка количественной оценки ГМИ с использованием стандартного метода ПЦР, на основе подбора оптимальных условий для высокоспецифичной амплификации ДНК [Киль, Крутенко, 2003].

Объектом исследования являлась раундап-устойчивая соя, сорт Stine 2254 RR (Монсанто, США).

На рисунке 7 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 10,0 %; 5,0 %; 3,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,01 %.

Можно заметить хорошо различимое изменение интенсивности полос при соответствующем изменении концентрации ГМИ в зерне, что позволяет проводить полуколичественную оценку ГМИ в образцах на основе простой визуальной оценки. Эти данные, в свою очередь, позволяют построить калибровочный график зависимости от концентрации ГМИ в образце и интенсивности ДНК-фрагмента, используя соответствующие статистические методы и программы, и на этой основе количественно оценить содержание ГМИ в исследуемом образце.

Таким образом, подобрана оптимальная система полуколичественной оценки ГМИ в семенах сои (в диапазоне концентраций 0,1-10 %), что позволяет проводить быстрый и эффективный мониторинг ГМ-сои как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на ее основе.

Выводы

В результате проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы:

Созданы новые более информативные системы описания фенетической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка.

Чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к различным стрессам, что указывает также на универсальный характер выявленных закономерностей.

Выявлена сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов вредной черепашки с полом. Изучение популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий.

Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка, что ставит под вопрос использование фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам.

Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности к инсектицидам Би-58 Новый: RAPD-маркеры ОРА06/470 и 430 п. н.

Показано генетическое сходство клопов-черепашек с другими представителям семейства щитников (Pentatomidae), что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae.

Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt-чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности - по разработанной формуле расчета.

Молекулярно-генетический анализ и оценка показателей роста и развития картофельной минирующей моли свидетельствует об отсутствии позитивного / негативного влияния Bt-картофеля (сорт Луговской плюс) на генетическое разнообразие, структуру популяции, жизнеспособность и репродуктивные функции этого нецелевого вида насекомых как минимум в первых двадцати пяти поколениях.

Риск вертикального переноса генов от Bt-картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, при этом необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы.

Разработан метод полуколичественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка целевого гена CP4 EPSPS с использованием пары праймеров: RR01 и RR04, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зернопродуктах сои, но и определять их количественное содержание.

Практические рекомендации

Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых.

Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную нами методику: «Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR)».

Поиск резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, основанного на обработке инсектицидом выборки из природной резистентной популяции.

В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов использовать предлагаемые нами методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале.

Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется.

Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю проводить с использованием предлагаемого нами метода: «Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго».

На этапе предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых проводить с использованием предлагаемого нами подхода и в частности оценку Bt-картофеля - по предлагаемой нами методике: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», основанной на использовании сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Киль, В.И. ДНК технологии в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых [Текст] / В.И. Киль, Россельхозакадемия, ВНИИ биологической защиты растений.- Краснодар: ООО «Просвещение-Юг», 2009.- 160 с.: ил.; - Библиогр.: с.128-159.-300 экз. - ISBN- 978-5-9900297-4-3.

2. Киль, В.И. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку [Текст] / Киль В.И., Надыкта В.Д. // Агро ХХI.- 2002. - № 1.- С.12-15.

3. Киль, В.И. Оценка риска вертикального переноса генов у Bt-картофеля и других трансгенных культур [Текст] / Киль В.И. // Агрохимия.-2003.-№ 4.- С.81-89.

4. Киль, В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука к Bt-защищенному картофелю [Текст] / Киль В.И. // Агро XX1.- 2003/2004.- №7-12.- С.22-24.

5. Киль, В.И.. Выгоды и преимущества возделывания трансгенных растений [Текст] / Киль В.И., Исмаилов В.Я., Надыкта В.Д // Достижения науки и техники АПК.-2003.-№.10.-С.26-30.

6. Киль, В.И. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим Bt-защищенным культурам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В.// Агрохимия.-2004.-№7.-С.77-91.

7. Киль, В.И. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Агрохимия.-2006.-№2.-С.58-64.

8. Киль, В.И. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) [Текст] / В.И. Киль, В.В. Гронин, Д.В. Крутенко, В.Я. Исмаилов // Сельскохозяйственная биология.- 2008.-№1.-С.70-76.

9. Киль, В.И. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клопа вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам [Текст] / В.И. Киль, В.Я. Исмаилов // Агрохимия.- 2009.-№1.-С.38-49.

10. Киль, В.И. Изучение пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых [Текст] / В.И. Киль, Е.Н.Беседина, М.В.Пушня, В.Я.Исмаилов // Труды Кубанского государственного аграрного университета.-2010.-Выпуск 1(22).-С.96-100.

11. Киль, В.И. Морфологические маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Наука Кубани.-2004.-№ 3, ч.1.-С.116-119.

12. Киль, В.И. Генетичесие маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В. // Наука Кубани.-2005.-№4-С.126-130.

13. Киль В.И. Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Наука Кубани-2007-№4.-С.25-29.

14. Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для выявления резистентных к инсектициду Би-58 генотипов клопов вредной черепашки [Текст] / В.И. Киль, М.В. Пушня, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.-Приложение.-2008.-С.87-92.

15. Киль, В.И. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae) [Текст] / В.И. Киль, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.- Приложение.- 2008.-С.176-179.

16. Киль, В.И. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяции и жизнеспособность картофельной минирующей моли в ряду генераций [Текст] / Киль В.И., Беседина Е.Н., Пушня М.В., Исмаилов В.Я // Наука Кубани.-2009.-№3.- С.69-73.

17. Киль В.И. ДНК полиморфизм клопов вредной черепашки Eurygaster integriceps Put (Hemiptera: Scutelleridae) по межмикросателлитным локусам [Текст] / Киль В.И // Наука Кубани.-2009.-№4.-С.42-45.

18. Киль, В.И. Методические подходы к определению наличия трансгенов в пищевых продуктах и кормах [Текст] / Киль В.И. // Материалы международной научно-практической конференции: «Трансгенные растения - новое направление в биологической защите растений» (ВНИИБЗР, Краснодар, 19-22 июня 2002 г).- Краснодар.-2003.-С.193-208.

19. Киль, В.И. Мониторинг генно-инженерно-модифицированных растений: ПЦР-детекция RR - сои [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тез. докл. на Всероссийскую научно-техническую конференцию "Биотехнология 2003".-Сочи.-2003.-С.87-89.

20. Киль, В.И. Сравнительный анализ методов ПЦР-детекции семян RR-сои и полуколичественная оценка их содержания в зерне и кормах [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы VII Всероссийского конгресса «Здоровое питание населения России».-Москва 12-14 ноября 2003.-С.235-236.

21. Киль, В.И. Идентификация и полуколичественная оценка содержания семян RR-сои в зерне [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-Москва,10-14 ноября 2003.-С.199-200.

22. Киль, В.И. Молекулярно-генетический анализ популяции колорадского жука по признакам пола и окраски яиц [Текст] / Киль В.И., Игнатов А.Н., Калисниченко С.М., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В., Дорохов Д.Б. // Тезисы 2-го Московского международного Конгресса: "Биотехнология: состояние и перспективы развития".-Москва,10-14 ноября 2003.-С.200-201.

23. Головатенко, Н.А. Оценка базовой чувствительности различных географических популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Головатенко Н.А., Киль В.И. // Тез. Докл. 5-й региональной научно-практич. конф. Молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса», Краснодар, КГАУ, 2003.- С.82-83.

24. Киль, В.И. Новый подход к описанию рисунка переднеспинки имаго колорадского жука на примере некоторых его популяций в краснодарском крае [Текст] / Киль В.И.,. Головатенко Н.А, Есипенко Л.П. // Материалы докладов конф., посв. 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар-2004.-С.126-133.

25. Головатенко, Н.А. Изменчивость фенетической структуры популяций колорадского жука под влиянием Bt-картофеля и инсектицидов на основе комплексного описания рисунка переднеспинки имаго жуков [Текст] / Головатенко Н.А., Киль В.И., Есипенко Л. П. // Материалы докладов конф., посв. 100-летию со дня рожд. Е.М.Степанова. (Краснодар, 8-9 окт, 2002).- Краснодар.-2004.-С.133-147.

26. Надыкта, В.Д. Биологическая эффективность и биоценотическая безопасность генно-инженерно-модифицированных сортов картофеля отечественной и зарубежной селекции, устойчивых к колорадскому жуку [Текст] / Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М.В., Крутенко Д.В., Киль В.И. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004.- С. 477.

27. Исмаилов, В.Я. Методы мониторинга резистентности колорадского жука к Bt-картофелю [Текст] / Исмаилов В.Я., Ширинян Ж.А., Пушня М.В., Головатенко Н.А., Киль В.И. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004.- С.500.

28. Зотов, И.С. Оценка генетических различий между популяциями колорадского жука мультивариантным ПЦР анализом [Текст] / Зотов В.С., Игнатов А.Н., Маллабаева Д.Ш., Киль В.И., Дорохов Д.Б. // Тез. Докл. на III съезд ВОГиС, «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004, С.48.

29. Киль, В.И. К вопросу о механизмах формирования структуры популяций колорадского жука в связи с резистентностью к инсектицидам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.201-209.

30. Киль, В.И. RAPD-анализ ДНК имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata (Say) различных географических популяций [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.209-222.

31. Киль, В.И. Возможность оценки продолжительности жизни личинок колорадского жука, питающихся Bt-картофелем, по фенам рисунка переднеспинки имаго [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А.// Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем», (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.222-229.

32. Крутенко, Д.В. Методы ПЦР-детекции трансгенных растений [Текст] / Крутенко Д. В., Киль В. И. // Материалы докладов международной конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 29 сент.-1 окт.2004).- Краснодар.-2004.-Вып.2.- С.303-313.

33. Надыкта, В.Д. Генетически улучшенные культуры - новое средство биологической защиты растений [Текст] / Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я., Киль В.И. // Тез. докл. участников IV Семинара-Совещания «Средства защиты растений, регуляторы роста, агрохимикаты и их применение при возделывании сельскохозяйственных культур».-5-9 сентября 2005.-Анапа.-2005.-С.118-121.

34. Киль, В.И. Изучение закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под влиянием инсектицидов и генетически модифицированного картофеля [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Сборник материалов международной конференции «Актуальные вопросы экологии и природопользования» (Ставрополь.-16-19 ноября, 2005).-Ставрополь. «Агрус».-2005.-Т.1.-С.140-151.

35. Киль, В.И. Генетический полиморфизм популяций колорадского жука, различающихся чувствительностью к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В. // Материалы Второго Всероссийского съезда по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем», Симпозиум «Резистентность вредных организмов к пестицидам».- Санкт-Петербург.- 5-10 декабря, 2005.-С.33-34.

36. Киль, В.И. Изучение генетического полиморфизма популяций колорадского жука с целью управления их резистентностью к инсектицидам и трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Головатенко Н. А., Крутенко Д. В. // Тез. докл. на Заключительную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «р2003юг» (п. Агой, Туапсинского р-на, 28 ноября - 1 декабря 2005).- Краснодар. - 2005.-С.101-103.

37. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК различных видов клопов по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. // Международное сотрудничество в биотехнологии: ожидания и реальность.-Материалы 3-ей международной конференции из серии «Наука и бизнес».-19-21 июня 2006.-Пущино.-2006.-С.114-117.

38. Киль, В.И. ПЦР анализ ДНК некоторых видов клопов из энтомологической коллекции [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.435-436.

39. Киль, В.И. Изучение молекулярно-генетического полиморфизма различных видов клопов методом RAPD-PCR [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В., Исмаилов В.Я. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.437-441.

40. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.-С.442-446.

41. Киль, В.И.. Полиморфизм ДНК популяции клопов-вредной черепашки Eurygaster integriceps Put. по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Головатенко Н.А. // Материалы международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 20-22 сентября, 2006).- Краснодар.-2006.- Вып.4.- С.447-451.

42. Киль, В.И.. Изучение влияния трансгенного картофеля на генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых. [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Пушня М.В., Ширинян Ж.А. // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» -2006.- С. 175-177.

43. Киль, В.И. Изучение особенностей формирования морфо-генетической структуры популяций клопа - вредная черепашка под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» -2006.-С. 138-139.

44. Гронин, В.В. Новая система описания фенов в популяциях клопов-вредной черепашки [Текст] / Гронин В.В. Крутенко Д.В., Киль В.И. // Материалы VIII Региональной научно-практической конференции молодых ученых (Краснодар, 7-8 декабря, 2006).- Краснодар. -2006.- С.108-110.

45. Киль, В.И. Методика популяционных исследований насекомых вредителей сельскохозяйственных культур с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [Текст] / Киль В.И. // Высокопроизводительные и высокоточные технологии и методы диагностики и фитосанитарного мониторинга.- Россельхозакадемия, М.- 2007.- С. 8-15.

46. Киль, В.И.. Мониторинг резистентности популяции клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Материалы 4 Международной научно-практической конференции «Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов» (Краснодар, 13-17 июня, 2007).- Краснодар.-2007.-С.396-398.

47. Киль, В.И. Новая система описания фенов рисунка и окраски имаго клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.28-34.

48. Киль, В.И. Фенетическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки. [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.34-40.

49. Киль, В.И. Молекулярно-генетическая структура Краснодарской и Ставропольской популяций клопов вредной черепашки [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В. // Труды Ставропольского отделения Русского энтомологического общества. Вып. 3: материалы 2-й Всероссийской научно-практической конференции.- Ставрополь: АГРУС, 2007.-С.40-46.

50. Киль, В.И. Влияние инсектицида Би58-новый на фенетическую и молекулярно-генетическую структуру популяции клопа вредная черепашка. [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В., Крутенко Д.В. // Тезисы докладов ХIII съезда Русского энтомологического общества «Достижения энтомологии на службе агропромыщленного комплекса, лесного хозяйства и медицины», Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007.-С.92-93.

51. Киль, В.И. Полиморфизм ДНК популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae) по RAPD-маркерам [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В., Ширинян Ж.А. // Тезисы докладов ХIII съезда Русского энтомологического общества «Проблемы и перспективы общей энтомологии», Краснодар, 9-15 сентября 2007 г.- Краснодар.-2007.-С.144-145.

52. Киль, В.И. Изменчивость морфо-генетической структуры популяций клопов вредной черепашки под воздействием пестицидов и других стрессовых факторов внешней среды [Текст] / В.И. Киль, Д.В. Крутенко, В.В. Гронин, М.В. Пушня // Тезисы докладов на отчетную конференцию грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края «ЮГ-РОССИИ», «Вклад фундаментальных исследований в развитие современной инновационной экономики Краснодарского края» (п. Агой, Туапсинского района, 24-28 октября, 2007).-2007.-С.144-146.