Основные методы генной инженерии

2

Содержание

Введение

1. Ауксины и цитокинины

1.1 Основные виды продуцентов ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты

1.2 Получение гормонов и вторичных метаболитов из культур грибов ботритис и фузариум

1.3 Экстракция культурных сред с целью выделения цитокининов по Барту с помощью н-бутанола.

1.4 Работа с пятнами. Щелочные системы растворителей

2. Методы и тесты в биотехнологии.

2.1 Хроматография, биотесты (разновидности).

2.2 Биотест для изучения биологической активности гиббереллинов (на салате).

2.3 Амарантус-тест на цитокинин (бензимидазол), 2,4 - Д

Заключение

Список использованной литературы

Введение

Открытие ауксинов и цитокининов положило начало эре культивирования растительных клеток in vitro. Первым типом ткани, полученным из сердцевинной паренхимы табака, был каллус. В природе каллусы образуются в местах повреждения, когда растению необходимо как можно быстрее зарастить клетками шрам, заполняя его бесформенной недифференцированной массой клеток. Лишь позднее происходит дифференцировка и восстанавливаются поврежденные сосуды, покровные и механические ткани. Клетки каллуса, в отличие от клеток апикальных меристем или камбия, делятся, располагая веретено деления в случайном направлении. В результате получается рыхлая быстро растущая клеточная масса. Для того, чтобы клетки быстро размножались in vitro в среду нужно добавить и ауксины, и цитокинины. Только в этом случае растительные клетки начинают делиться. Показано, что ауксины активируют СDK-протеинкиназы клеточного цикла (cycline dependent kinases), а цитокинины - соответствующие циклины. Комплекс СDK-циклин необходим для запуска клеточного деления. Изменение соотношения ауксин/цитокинин в среде приводит к существенным изменениям в развитии клеток in vitro. При преобладании ауксинов (недостатке цитокининов) начинается процесс ризогенеза (от греч. "rhizo-" - "корень"; "genesis" - "рождение"). При преобладании цитокининов (недостатке ауксинов) образуются меристемы побегов: начинается геммагенез ("gemma" - "почка растения"). Такое поведение культур клеток хорошо согласуется с функцией ауксинов и цитокининов как "гормонов благополучия" побегов и корней соответственно. Недостаток ауксинов воспринимается клетками как недостаточное развити побегов, и служит сигналом для их образования. В дифференцированных побегах происходит синтез ауксинов и баланс гормонов восстанавливается. Аналогичный механизм срабатывает при недостатке цитокининов (формируются корни).

Итак, для нормальной жизни в растении всегда должен существовать баланс между ауксинами и цитокининами. Процесс вегетативного роста растений можно моделировать, рассматривая только полярный транспорт и взаимодействие ауксинов и цитокининов. Представим, что главный стебель отделен от корня. В верхней части осталась точка синтеза ауксинов, цитокинины в дефиците. Ауксин из апекса транспортируется к основанию черенка, где создается избыток этого гормона. Чтобы сохранить гормональный баланс, нужны цитокинины: в основании закладываются придаточные корни. У оставшейся нижней части растения есть точки синтеза цитокининов, а ауксинов не хватает. Цитокинины транспортируются наверх и накапливаются около среза. Это также вызывает нарушение гормонального баланса, что приводит к активации синтеза ауксинов. Пробуждаются спящие почки или даже возникают новые из каллусной массы. В интактном растений активные деления клеток сосредоточены на кончике корня и на кончике побега. Согласно модели, чем дальше находится орган от кончика корня, тем меньше в нем цитокинина. Апексом побега транспорт заканчивается и происходит накопление цитокинина. Ауксин сам синтезируется в апексе побега. Таким образом в меристеме побега концентрация цитокининов и ауксинов оказывается достаточной для поддержания клеточных делений. Обратная ситуация наблюдается в апексе корней: ауксин накапливается т.к. апекс корня является конечным пунктом транспорта. Вместе с синтезируемыми в кончике корня цитокининами, ауксины вызывают клеточные деления в меристеме корня. Чем больше расстояние от кончика корня до верхушки побега преодолевают гормоны, тем меньше их содержание в меристеме. Наконец, наступает момент, когда цитокинины перестают поступать в апекс побега в нужной для делений концентрации. Рост стебля вверх останавливается. Аналогично регулируется рост корня вглубь. Таким образом, полярный рост растения можно моделировать на основании баланса ауксинов и цитокининов. В зоне вторичного утолщения делящиеся клетки расположены не случайно. По флоэме вниз перемещается ауксин, а по ксилеме вверх - цитокинин. Между этими ткаными лежит камбиальное кольцо (слой делящихся клеток). Здесь клетки находятся на "перекрестке" потоков ауксинов и цитокининов (а также фотоассимилятов и минеральных веществ), необходимых для деления клеток.

Генетическая инженемрия (генная инженерия) -- совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.

Генетическая инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических наук, как молекулярная и клеточная биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология.

Итак, целью написания данной курсовой работы является изучение материала по основным методам генинженерии, а также природы биотестов (проведение экстракции веществ).

Основными задачами курсовой работы являются: изучение основных видов продуцентов ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты, получение гормонов и вторичных метаболитов из культур грибов ботритис и фузариум, а также система экстракции культурных сред с целью выделения цитокининов по Барту с помощью н-бутанола, работа с пятнами, изучение щелочных систем растворителей, изучение разновидностей биотестов, их специфики.

В ходе написания курсовой работы были использованы материалы и труды таких известных авторов в сфере генинженерии и генетики, как Мызина С.Д., Гершкович И.В., Вагнер Р., Митчелл Г., Кольцов Н. К., Ратнер В. А., Спирин А.С., и др.

1. Ауксины и цитокинины

1.1 Основные виды продуцентов ауксинов, цитокининов и абсцизовой кислоты

Ауксины - группа гормонов растений. Регулируют на разных этапах жизни растения его рост, дифференцировку органов, ростовые реакции на свет и силу тяжести. По химической природе -- производные индола. Основной представитель -- индолилуксусная кислота.

Ауксины (от греч. auxano -- расту) - группа фитогормонов. Активируют метаболизм, необходимы для роста и развития растений, дифференциации органов, ориентации по отношению к свету и силе тяжести. По химической природе -- производные индола. Исследование эффектов ауксинов начато Ч. Дарвином и его сыном в 1880, продолжено П. Бойсен-Йенсеном (1913), А. Паалем (1919), Н. Г. Холодным и Ф. Вентом (1924-28) и др.

Основным ауксином является индолил-3-уксусная кислота (ИУК). Обнаружены и другие природные вещества с ауксиновой активностью, такие как индолил-3-ацетонитрил, 4-хлор-3-индолилуксусная и фенилуксусная кислоты, однако их ауксиновая активность существенно слабее. В растениях часто обнаруживают конъюгаты ИУК с аминокислотами, сахарами и спиртами, представляющие, как полагают, запасные формы ауксинов. Искусственно синтезирован ряд соединений с высокой ауксиновой активностью (2,4-дихлорфеноксиуксусная-, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная- индолил-3-масляная-, 1-нафтилуксусная кислоты и другие), часто применяемых для научных и практических целей. ИУК синтезируется из триптофана в верхушках побега и перемещается сверху вниз по паренхимным клеткам со скоростью 10-15 мм/час благодаря особому механизму полярного транспорта. Возможно также более быстрое передвижение ауксинов по транспортным каналам растения. Ауксины обладают многообразным физиологическим действием и жизненно важны для роста и развития растений. Ауксины необходимы для деления и растяжения клеток, для формирования проводящих пучков и корней, способствуют разрастанию околоплодника. Ауксины обусловливают явление апикального доминирования, т. е. тормозящее действие апикальной почки на рост пазушных почек. Ауксины играют первостепенную роль в ростовых движениях: фото- и геотропизме и настиях. Ауксины усиливают аттрагирующее действие органов и тканей (т. е. их способность притягивать питательные вещества) и во многих случаях задерживают их старение. При реализации многих физиологических программ ауксины взаимодействуют с цитокининами и другими фитогормонами. При высоких концентрациях ауксины повышают образование своего антагониста -- фитогормона этилена. Первичное действие ауксинов направлено на изменение активности (активацию или репрессию) определенного набора компетентных генов, характерного для данной ткани. ИУК также активирует АТФ фазу плазмалеммы, вызывая выкачивание протонов из клетки и закисление клеточной стенки. Это приводит к размягчению матрикса стенки, что делает возможным рост клеток растяжением. На практике ауксины и их синтетические аналоги применяют для размножения клеток и растений в стерильной культуре и для получения трансгенных растений (совместно с цитокининами). Их часто используют для предотвращения предуборочного опадения плодов древесных культур, получения бессемянных плодов томатов, огурцов, баклажанов, перца и др., а также как стимуляторы корнеобразования у черенков; в высоких дозах -- как гербициды и дефолианты (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота и др.). Ауксины синтезируются многими фитопатогенными и симбиотическими микроорганизмами, что помогает последним воздействовать на клетки растения-хозяина.

Холодный и Вент сделали вывод, что гипотетический ауксин действительно существует и вызывает растяжение клеток. Можно было предположить, что при одностороннем освещении ауксин перетекает на затененную сторону и вызывает изгиб к свету.

Не имея в руках выделенного препарата чистого ауксина, Вент и Холодный изучили основные свойства этот сигнального вещества. Так, если вырезать зону изгиба и накладывать агаровый кубик снизу (с базальной стороны), то изгиба не будет. Это означает, что ауксин движется по растению полярно (т.е. в строго заданном направлении) - от апекса побега к его основанию, а затем - к кончику корня. Была измерена скорость транспорта ауксинов. Для этого на участок заданной длины помещали сверху агар с ауксином, а снизу - агаровый блок без ауксина. Верхний агаровый блок служил донором ауксинов, а нижний - своеобразным коллектором. Нижний блок через равные промежутки времени заменяли новым. Всю полученную серию нижних блоков анализировали на проростках на предмет наличия ауксинов. Скорость транспорта ауксинов обычно составляет от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров в час.

Однако необходимо было выделить ауксин в чистом виде. Немецкий химик Кёгль в 1939 году исследовал химический состав мочи вегетарианцев. Он отметил, что в отличие от мочи других людей, она содержит новое вещество, которое удалось выделить и расшифровать его формулу. Это была индолилуксусная кислота (ИУК). Чтобы научиться определять ее в малых количествах и изучить ее физиологические свойства, Кёгль испробовал ИУК в разных живых системах. Выяснилось, что ИУК способна усиливать рост проростков с отрезанной верхушкой, как и ауксин. Если наложить агаровый блок с ИУК асимметрично, то происходит характерный изгиб субапикальной зоны. Лишь через 6 лет из верхушек побегов было выделено то же самое соединение - индолилуксусная кислота - и стало ясно, что она и является одним из акусинов. К настоящему времени вопрос о других соединениях ауксиновой природы окончательно не решен. Известен ряд веществ, обладающих ауксиновой активностью (фенилуксусная кислота, индолилпировиноградная кислота), но их активность ниже, чем у ИУК и они менее распространены. Кроме них химикам удалось синтезировать вещества, вызывающие такой же физиологический эффект, как и природные ауксины. Поскольку они не встречаются в растениях, их называют синтетическими аналогами ауксинов. Среди них упомянем лишь 2,4-Дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и a-нафтилуксусную кислоту (НУК). Синтетические аналоги эффективно связываются с рецепторами ауксина, однако слабо взаимодействуют с системой транспорта или окислительной деградации естественных ауксинов.

1.2 Получение гормонов и вторичных метаболитов из культур грибов ботритис и фузариум

Что касается истории открытия цитокининов, то здесь можно сказать следующее: первые стерильные культуры клеток животных удалось получить еще в начале ХХ века, однако вплоть до 1950-х годов получить устойчиво растущие культуры растительных клеток на искусственных питательных средах не удавалось.

Американец Ф. Скуг работал над проблемой получения стерильных культур клеток растений. Он работал в университете штата Висконсин поэтому его излюбленным объектом был один из сортов табака, который выращивали в этом штате - "Wisconsin-38". Из стеблей добывали сердцевинную паренхиму, помещали на искусственные среды, содержащие минеральные вещества, сахар, витамины, аминокислоты. Однако клетки не делились. После открытия ауксина Скуг добавил ИУК в среды: вдруг растительным клеткам не хватает ауксина? Клетки паренхимы приступали к делениям, но рост быстро останавливался. В лаборатории Скуга перепробовали самые различные добавки: экстракт дрожжей, томатный сок, сок листьев самого табака, и все безрезультатно. Небольшого успеха удалось добиться, добавив в среду кокосовое молоко.В 1950-х годах ученые обнаружили, что наследственная информация передается от родителей к потомкам с помощью ДНК. (Как устроено это вещество и какие свойства позволяют передать информацию тогда еще не было известно). И Скуг предположил, что растительным клеткам не хватает ДНК. В лаборатории появилась банка с ДНК, добытой из молок сельди (самый дешевый источник ДНК) и ее добавляли в среду наряду с ауксинами и питательными веществами. Клетки не делились. Открытие цитокининов состоялось благодаря ошибке, допущенной в ходе эксперимента. Чтобы среда была стерильной, флаконы со средой помещали в автоклав, где раствор нагревается выше 100 С⁰. Случайно режим автоклавирования был нарушен и среда вместе с ДНК перегрелась. Именно на этой среде сердцевинная паренхима табака сорта "Wisconsin-38" начала интенсивно расти. При более детальной проверке выяснилось, что в перегретом препарате ДНК из молок сельди появлялось некоторое вещество, которое на фоне ауксина вызывает активные деления клеток. В 1953 году вышла первая статья, посвященная этому явлению, а затем удалось идентифицировать вещество, вызывающее рост клеток - фурфуриладенин. По физиологическому эффекту это вещество получило тривиальное название кинетин (от греч. "Кинезис" - "деление").

Вскоре из эндосперма кукурузы удалось выделить природное вещество, которое заставляет делиться клетки в организме растения - зеатин (Zea- кукуруза). Так было положено начало открытию новой группы растительных гормонов - цитокининов. Выяснилось также, что природные цитокинины легко разрушаются при нагревании, что объясняет первые неудачи Скуга. В растительных экстрактах содержались природные цитокинины, но поскольку среды обязательно автоклавировали, эти гормоны разрушались и не оказывали действия на клетки.

Итак, цитокинины - группа фитогормонов, производные азотистого основания пурина, необходимые для деления клеток, роста и дифференцировки растений. Природные цитокинины -- зеатин (6-(4-окси-3-метил-2-бутенил) аминопурин), изопентениладенин, дигидрозеатин, о-оксибензиладенин -- часто выявляются в виде рибозидов и риботидов. Рибозиды считаются основной транспортной формой цитокининов.

Цитокинины образуются главным образом в кончиках корней и перемещаются в верхние части растения по ксилеме; заметные количества цитокининов обнаруживаются и во флоэме. Цитокинины типа изопентениладенина и зеатина найдены в составе некоторых тРНК, причем не только у растений. Цитокинины синтезируются многими фитопатогенными и симбиотическими микроорганизмами, что помогает последним воздействовать на клетки растения-хозяина.

Цитокинины обладают многообразным физиологическим действием и жизненно важны для роста и развития растений. Совместно с ауксинами они активируют деление клеток, стимулируют развитие боковых побегов (снятие апикального доминирования), в культуре клеток способствуют клеточной дифференцировке и формированию побегов. Цитокинины усиливают способность клеток притягивать питательные вещества (аттрагирующий эффект) и задерживают старение листьев многих растений. Цитокинины активируют формирование хлоропластов и усиливают газообмен растений за счет открывания устьиц. Для многих растений, цитокинины способствуют прорастанию семян и повышают их всхожесть. Цитокинины увеличивают размеры клеток листа и тем самым усиливают рост молодых листьев. Цитокинины обладают и определенным защитным действием на растения против неблагоприятных внешних условий.

Действие цитокининов связано с изменением активности (активацией или репрессией) определенного набора компетентных генов, характерного для данной ткани. В ряде случаев цитокинины активируют аппарат синтеза белка независимо от воздействия на геном клетки. На практике используют цитокинины как аденинового ряда (6-бензинаденин, кинетин), так и производные фенилмочевины с высокой цитокининовой активностью (дропп, 4-PU). Цитокинины и их синтетические аналоги применяют для размножения клеток и растений в культуре ткани и для получения трансгенных растений (совместно с ауксинами). Цитокинины используют с целью усиления кущения растений, изменения формы и увеличения размеров ряда плодов, повышения доли женских цветков (у огурца), всхожести семян, устойчивости растений к абиотическим стрессам и болезням. Дропп применяют для предуборочной дефолиации хлопчатника.

Абсцизовая кислота (от англ. abscission -- отделение, опадение) - гормон растений. Тормозит ростовые и метаболические процессы, подавляет транспирацию в условиях засухи, способствует формированию и покою семян, клубней и корнеплодов, а также облегчает опадение цветков и плодов многих растений. По химической природе -- изопреноид (сесквитерпеноид). Первые препараты абсцизовой кислоты независимо выделены в 1963 Ф. Эддикоттом и сотрудниками (США) и Ф. Уорингом и сотрудниками (Великобритания). В растениях обнаружен также близкий к абсцизовой кислоте по структуре и физиологической активности ксантоксин. У водорослей и печеночных мхов функции ингибитора роста выполняет лунуларовая кислота.

Биосинтез абсцизовой кислоты происходит путем специфического расщепления каротиноидов типа виолаксантина. В природе абсцизовая кислота может образовывать конъюгаты, в первую очередь с углеводами, что ведет к инактивации этого фитогормона. Абсцизовая кислота обнаруживается во всех органах и тканях растения и может синтезироваться по крайней мере во многих из них: листьях, корнях, семенах и плодах. В клетках листа абсцизовая кислота накапливается в хлоропластах. Транспорт абсцизовой кислоты на дальние расстояния происходит по ксилеме и флоэме, на ближние -- по апопласту (клеточным оболочкам и межклетникам) и симпласту (протопластам клеток, сообщающимся между собой при помощи плазмодесм).

Абсцизовая кислота обладает многообразным физиологическим действием, хотя получены «увядающие» мутанты растений, не образующие абсцизовой кислоты или не чувствительные к ней. Абсцизовая кислота особенно важна для поддержания водного баланса в условиях засухи. Недостаток влаги ведет к резкой активации синтеза абсцизовой кислоты и ее выходу из мест депонирования во внутри- и внеклеточное пространство. В устьичных клетках абсцизовая кислота вызывает быстрый выход калия, что ведет к падению тургора этих клеток и закрытию устьичной щели. Одновременно абсцизовая кислота активирует всасывание воды корнями. Во многих физиологических процессах абсцизовая кислота является антагонистом ауксина, гиббереллина или цитокинина. Абсцизовая кислота препятствует преждевременному прорастанию семян при их созревании и усиливает состояние покоя зрелых семян, спящих почек, клубней и корнеплодов. Она тормозит стимулируемый ауксинами рост колеоптилей. Совместно с этиленом абсцизовая кислота усиливает процессы старения и опадения, особенно увядших цветков и плодов. На биохимическом уровне различают быстрые и медленные эффекты абсцизовой кислоты. Быстрые эффекты происходят за считанные минуты на уровне плазматической мембраны (устьичных клеток) и связаны асимметричным транспортом ионов калия, кальция и анионов через мембрану, в результате чего замедляется поступление воды в устьичные клетки и их тургор падает. Медленные эффекты абсцизовой кислоты связаны с изменением активности (активацией или репрессией) определенного набора компетентных генов, характерного для данной ткани. Открытие абсцизовой кислоты стимулировало работы по созданию новых форм устойчивых к засухе растений, а также синтезу эффективных химических регуляторов транспирации растений.

Fusarium(Фузариум)- большой род филаментарних аскомикотових грибов (Ascomycota), широко распространенных в почве и в ассоциации с растениями. Большинство видов являются безопасными сапрофитамы и относительно распространены среди микрофлры грунта. Некоторые виды производят микотоксинов (например фумонизины и трихотесены), в частности в зерновых культурах, и могут вредно влиять на здоровье человека и других животных. Включает 9 секций, 26 видов и 29 разновидностей. Размножаются бесполым путём - конидиями, которые разнообразны по форме, размеру, строению и способу образования. Микроконидии одно - или двуклеточные, овальные или яйцевидные, образуются как на конидиеносцах, так и непосредственно на коротких веточках мицелия. Макроконидии (4--7-клеточные и более) серповидной или веретеновидно-серповидной формы. Образуются на разветвленных конидиеносцах, часто собранных в своеобразные подушечки - спородохии, окрашенные в яркие цвета (оранжевый, фиолетовый, розовый и др.). Способны также образовывать хламидоспоры в период интенсивного роста мицелия. Для некоторых видов Фузариума известно сумчатое спороношение в виде перитециев. Большинство Фузариумов - сапрофиты, живущие в почве на растительных остатках. Многие виды - паразиты, вызывающие опасные заболевания растений - фузариозы. Некоторые виды Фузариума выделяют токсические вещества, губительно действующие на растения. Употребление в пищу ржи, пшеницы, ячменя, овса и некоторых других растений, пораженных токсинами Фузариум, приводит к развитию у человека алейкии алиментарно-токсической (септической ангины), у животных - фузариотоксикоза. Мицелий Fusarium aguaeductum, обитающего в воде, разрастаясь, может вызвать закупорку водопроводных труб.

Ботритис клинера, (Botrytis clinerea), грибок, конидиальная форма плодоношения аскомицетного гриба Peziza Fuckeliana de Bary; весьма часто нападает в виде сероватой пушистой плесени, на проростки оранжерейных растений, вызывая их гибель; на ягодах винограда вызывает благородное гниение. Botrytis Bassiana,-- мускардинный грибок, причина болезни шелковичного червя мускардины.

1.3 Экстракция культурных сред с целью выделения цитокининов по Барту с помощью н-бутанола

Следующее изобретение относится к области микробиологии и сельского хозяйства и может быть использовано для получения рост стимулирующих препаратов для растениеводства путем микробиологического синтеза.

Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток. По химическому строению они представляют собой производные аденина или аденозина, у которых аминогруппа в положении N6 связана с диметилаллилом, что приводит к образованию соответственно изопентениладенина и изопентениладенозина. Боковая цепь может содержать гидроксильную группу, что соответствует фитогормонам зеатину и зеатинрибозиду. Если боковая цепь содержит насыщенную связь, то это соответственно дигидрозеатин и дигидрозеатинрибозид. Названные шесть соединений составляют основную группу природных цитокининов, синтезируемых растениями.

Несмотря на тот факт, что цитокинины являются наиболее активными среди открытых рост регулирующих веществ, они еще не нашли широкого применения ни в сельском хозяйстве, ни в садоводстве [1], [2]. Это связано с тем, что природные фитогормоны, отличающиеся морфогенетическим эффектом, труднодоступны, дороги [3], а эффективность их синтетических аналогов невысока, и применение последних не окупает затрат на их производство [4]. Тем не менее, в связи со способностью цитокининов влиять на активность процессов, повышающих устойчивость и урожайность растений, их применение в практике растениеводства представляется перспективным.

Способность синтезировать цитокинины, помимо растений, присуща и некоторым микроорганизмам. Это в первую очередь клубеньковые бактерии, микоризообразующие грибы и некоторые фитопатогенные микроорганизмы. Отдельные микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, также способны синтезировать цитокинины. К ним относятся представители родов Azotobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Frankia species.

На основе штамма Pseudomonas stutzeri 136 был создан препарат "Микроцит", действующим началом которого являются цитокинины и смесь биологически активных соединений. Названный препарат может быть использован в биотехнологии при культивировании культур клеток и тканей растений; при вегетативном размножении растений; реверсии пола и прорастании семян. Использование фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве может быть перспективно при наличии штамма продуцента, обеспечивающего достаточно высокий уровень секреции внеклеточных цитокининов.

Известен штамм Pseudomonas stutzeri 136, продуцент цитокининов, способность которого продуцировать цитокинины оценивалась путем определения биологической активности очищенного экстракта из культуральной жидкости в биотестах: по стимуляции накопления амарантина в три раза и увеличению массы семядолей огурца на 182%. Однако уровень продукции цитокининов (содержание в культуральной среде) не известен и их конкретные формы не установлены. По этой причине заявленный штамм не может быть использован для получения индивидуальных цитокининов и целенаправленного применения в растениеводстве. Наиболее близки к заявляемому штамму по продуцирующей способности штаммы Esherihia coli АТСС 53437, 53438, 53439, содержащие рекомбинантные плазмиды, полученные введением генов tmr tzs из плазмид Agrobacterium tumefaciens или фрагментов ДНК плазмид Pseudomonas syringae pv. savastanoj. К недостаткам упомянутых рекомбинантных штаммов следует отнести относительно невысокий уровень накопления цитокининов, в частности зеатина (не превышает 110 нг/мл среды), а также законодательные ограничения на применение генетически модифицированных микроорганизмов в природных условиях, существующие в большинстве развитых стран.

Цель настоящего изобретения - получение природного, генетически неизмененного штамма почвенных бактерий, превосходящего по уровню накопления цитокининов известные штаммы. На мясопептонном агаре (МПА) образуют мелкие колонии овальной формы диаметром до 4 мм. Поверхность колоний складчатая, профиль выпуклый с возвышенным центром, цвет желтовато-бежевый с приглушенным блеском. Структура колоний однородная, консистенция пастообразная, края колоний зубчатые. Физиологические признаки. В анаэробных условиях не растет, реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. При сбраживании глюкозы газ не образует. Разлагает казеин, гидролизует крахмал, усваивает цитрат, индол не образует. Фенилаланин не дезаминирует, тирозин не разлагает. Растет в присутствии 7% NaCl и при pH 9,0. По совокупности физиолого-биохимических признаков штамм принадлежит к семейству Bacillaceae и относится к роду Bacillus, виду subtilis.

Состав среды для культивирования, мас. %: крахмал 1; пептон 0,5; дрожжевой экстракт 0,3; кукурузный экстракт 0,3; K2HPO4 0,2; (NH4)2SO4 0,2; вода водопроводная до 100.

Пример 1. Почвенные бактерии, принадлежащие к виду Bacillus subtilis, выращивают на среде вышеупомянутого состава путем культивирования на установке УВМТ 12-250 при 160 мин-1 и температуре 37oC. На поздней логарифмической фазе роста или в начале стационарной фазы (обычно на третий день) биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин и супернатант анализируют на содержание цитокининов методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа.

Культуральная жидкость штаммов B. subtilis ИБ-15, B. subtilis ИБ-22 достоверно и в значительной степени ингибирует реакцию антиген-антитело, что свидетельствует о наличии в культуральной среде цитокининов, эквивалентно 199,0 и 647 нг-экв. зеатина / мл культуральной среды соответственно.

Пример 2. Дополнительное подтверждение наличия цитокининовой активности в культуральной жидкости получают с помощью биотеста на проростках щирицы Amaranthus caudatus L. по накоплению амарантина. Для этого семена Amaranthus caudatus L. раскладывают на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри, проращивают в течение 72 часов в темноте при температуре 24^oC. Затем на рассеянном свету у каждого из проростков отделяют корешок и раскладывают их по 10 штук на фильтровальную бумагу в чашки Петри. Предварительно в чашки Петри вносят по 1 мл 0,01М фосфатного буфера (pH 6,3), содержащего 2 мг тирозина. Далее, в четыре из них приливают по 1 мл дистиллированной воды (контроль), в три по 1 мл стандартного раствора зеатинрибозида концентрацией 500 нг/мл, в следующие три по 1 мл стандартного раствора ЗР концентрацией 50 нг/мл и в последние три по 1 мл образца исследуемой культуральной жидкости. Растворы стандарта готовят на 0,01М фосфатном буфере.

Чашки инкубируют в темноте при 24^oC в течение 18 часов. Для извлечения образовавшегося амарантина все проростки щирицы из одной чашки Петри помещают в 2 мл 0,1 н. HCl и трижды замораживают и оттаивают. Концентрацию амарантина определяют с помощью фотоколориметра. КФК-2 при длине волны 540 нм. Количество веществ с цитокининовой активностью в исследуемом образце определяют по концентрационной кривой, построенной на основе определения количества амарантина в проростках из чашек Петри со стандартными растворами зеатинрибозида.

Полученные данные (чертеж) свидетельствуют, что культуральная жидкость B. subtilis ИБ-22 проявляет цитокининовую активность, соответствующую примерно 600 нг зеатинрибозида на 1 мл, B. subtilis ИБ-15 - порядка 250 нг/мл.

Пример 3. Бактерии B. subtilis ИБ-22 выращивают, как в примере 1. Количественный и качественный состав цитокининов в культуральной жидкости определяют с помощью иммуноанализа в сочетании с афинной и тонкослойной хроматографией. Пробу наносят на аффинную колонку, заполненную широкопористым мелкодисперсным стеклом, конъюгированным через аминопропильные группы с антителами к рибозиду зеатина. Наличие цитокининов анализируют в тест-системах для определения зеатина. Цитокининсодержащую фракцию прогревают 15 мин при 80^oC и подвергают тонкослойной хроматографии на пластинах (60 F-254) производства фирмы "Merck" в системе н-бутанол: аммиак: вода (6: 1: 2). Материал разделенных зон элюируют 0,1М фосфатным буфером (pH 7,4) в течение 16 ч и вносят в лунки микропланшета в нескольких разведениях для иммуноанализа. Количество цитокининов во фракциях определяют с помощью ИФА. Иммунологически определяется около 640 нг-экв. /мл зеатина (в пересчете на культуральную жидкость).

1.4 Работа с пятнами. Щелочные системы растворителей

Растворители -- индивидуальные химические соединения или их смеси, способные растворять различные вещества, то есть образовывать с ними однородные системы переменного состава двух или большего числа компонентов

Что касается щелочной системы растворителей, то здесь можно отметить следующее: основными щелочными металлами являются калий, натрий, литий.

Щелочные металлы непосредственно взаимодействуют с водородом, образуя гидриды MH. Наиболее характерна эта реакция для лития: 2Li + H2 = 2LiH

В отличие от соединений с p-элементами, в которых водород находится в положительной степени окисления, в гидридах щелочных металлов он присутствует в степени окисления -1, образуя гидридный анион H. В отсутствие воды гидрид лития не реагирует с кислородом и галогенами, но вода немедленно его разлагает:

LiH + H2O = LiOH + H2

В этой реакции протон выступает в роли окислителя, а гидридный анион - восстановителя: H+ + H- = H2

Гидриды остальных щелочных металлов менее устойчивы и более реакционноспособны. Их свойства определяются свойствами гидридного аниона, т.е. они являются сильными восстановителями.

Несмотря на то, что щелочные металлы во всех своих соединениях находятся в единственной степени окисления +1, каждый из них образует несколько бинарных соединений с кислородом. Кроме нормальных оксидов существуют пероксиды, супероксиды и озониды щелочных металлов.

Образование таких соединений обусловлено в большей мере свойствами кислорода, чем свойствам щелочных металлов.

Особенности элементов первой группы в образовании соединений с кислородом заключаются в том, что относительно большие однозарядные ионы обладают малым поляризующим действием и не дестабилизируют молекулярные ионы кислорода. При горении в кислороде получаются оксид лития, пероксид натрия и супероксиды остальных металлов:

2Li + 1/2O2 = Li2O 2Na + O2 = Na2O2 K + O2 = KO2

Пероксид лития может быть получен косвенным путем.

Оксиды получают из продуктов сгорания, нагревая их с соответствующим металлом:

Na2O2 + 2Na = 2Na2O2 KO2 + 3K = 2K2O

При взаимодействии калия, рубидия и цезия с озоном образуются озониды:

K + O2 = KO3

Большинство соединений с кислородом окрашено. Оксиды лития и натрия бесцветны, но уже Na2O2 имеет светло-желтую окраску, KO2 - оранжевого, RbO2 - темно-коричневого цвета.

Естественно, что нормальные оксиды щелочных металлов практически не проявляют ни окислительных, ни восстановительных свойств, тогда как остальные соединения являются сильными окислителями. Большая часть органических веществ (эфир, уксусная кислота, древесные опилки, хлопок) реагируют с Na2O2 или KO2 со вспышкой или со взрывом.

Пероксид натрия получают в промышленности в больших количествах путем сжигания металлического натрия в токе воздуха. При взаимодействии его с водой идет реакция гидролиза:

O₂^2- + H₂O = OH^- + HO^2-

Водные растворы пероксида натрия - достаточно сильные окислители и широко используются для отбеливания органических средств - древесной массы, тканей, меха.

Смесь пероксида натрия с супероксида калия применяется в изолирующих дыхательных аппаратах, так как в этом случае число молей выделившегося кислорода может быть равно числу молей поглощенного CO2:

Na2O2 + CO2 = Na2CO3 + 1/2O2

2KO2 + CO2 = K2CO3 + 3/2O2

Все бинарные соединения элементов I группы с кислородом реагируют с водой, образуя гидроксиды. Например:

Li2O + H2O = 2LiOH, Na2O2 + 2H2O = 2NaOH + H2O,

2KO2 + 2H2O = 2KOH + H2O2 + O2

Гидроксиды щелочных металлов, называемые щелочами, в воде хорошо растворимы и практически полностью диссоциированы:

NaOH (кр) = Na+ (p-p) + OH- (p-p)

В чистом виде это твердые бесцветные вещества, плавящиеся без разложения при 300 - 500C. Только гидроксид лития при нагревании выше Тпл = 445C теряет воду:

2LiOH = Li2O + H2O

Твердые гидроксиды и их концентрированные растворы сильно гигроскопичны, они жадно поглощают влагу и используются для осушения газов, не обладающих кислотными свойствами, в частности аммиака. Уже при обычных условиях твердые щелочи легко реагируют с «кислотами» газами - CO2, SO2, NO2, галогенами, галогено- и халькогеноводородами. Поэтому щелочи широко используются для поглощения таких газов и очистки от них кислорода, водорода, азота.

В силу этих причин как твердые щелочи, так и их растворы следует хранить в плотно закрытой посуде.

Наибольшее применение находит NaOH - едкий натр, который в громадных количествах получают в промышленности электролизом раствора хлорида натрия. Он широко применяется при производстве целлюлозы, искусственного шелка, при рафинировании жидких растительных масел и нефти, в мыловаренной промышленности, при синтезе красителей и в других химических производствах.

Растворы щелочных металлов

При обсуждении свойств типичных металлов - галогенов, серы, фосфора - неоднократно упоминалась их способность растворяться в некоторых растворителях, из которых затем они могут быть выведены в неизменном виде. Такими растворителями для неметаллов являются малополярные вещества вроде CS₂, CC_l4 или бензола. По мере перехода от молекулярных кристаллов к атомным и металлическим способность растворяться без химических реакций постепенно уменьшается, и простые вещества элементов IV и III группы переходят в раствор только в результате химического превращения.

В случае щелочных металлов связи в металлических кристаллах, осуществляемые единственным валентным электроном, настолько слабы, что появляется возможность их разрушения в результате молекулярных, а не химических, в полном смысле этого слова, взаимодействий.

Так, в отсутствие следов железа все щелочные металлы достаточно хорошо растворимы в жидком аммиаке. При этом образуются голубые или синие растворы, из которых металлы могут быть выведены в неизменном виде после испарения аммиака. Подобным же образом натрий и другие металлы могут быть растворены в некоторых органических растворителях - аминах и эфирах. Все эти растворы обладают хорошей электропроводимостью, что говорит о ионной природе растворенных частиц. Различными методами доказано, что во всех случаях имеет место равновесие:

M (кр) M (p-p) M+ (p-p) + e- (p-p)

Как катион металла, так и электрон сильно сольватируются молекулами растворителя; например, в аммиаке образуются ионы Na(NH3)4+, и это приводит к общему выигрышу энергии при растворении.

Очевидно, что сольватированные электроны в заметных количествах не могут существовать в растворах, содержащих протоны, так как непременно должна идти реакция

H+ (p-p) + e- (p-p) = 1/2H2

или, иначе, обмен электроном между атомом металла и протоном:

M (кр) + H+ (p-p) = M+ (p-p) + 1/2H2

В водных растворах этот процесс количественно характеризуется стандартным восстановительным потенциалом. Для щелочных металлов E k практически одинаковы и равны -2,9В. Такие большие отрицательные значения E говорят о том, что ни при каких условиях щелочные металлы не могут существовать с водой и любыми водными растворами, а значит, не могут быть восстановлены из водного раствора. Действительно, все щелочные металлы энергично, во многих случаях со взрывом, реагируют с водой и растворами кислот. Со щелочными растворами, в которых концентрация протонов мала, реакции идут более спокойно. Натрий, брошенный на поверхность воды, немедленно плавится за счет теплоты реакции, а иногда поджигает выделяющийся водород: Na (кр) + H2O (ж) = NaOH (p-p) + 1/2H2. Калий всегда реагирует с водой со вспышкой или со взрывом.

2. Методы и тесты в биотехнологии

2.1 Хроматография, биотесты (разновидности)

Биотесты, биологические пробы, применяемые с целью обнаружения в растениях физиологически активных соединений (фитогормонов, витаминов, фитонцидов, полифенолов и др.), а также для диагностики вирусных, микоплазменных и бактериальных заболеваний винограда и др. Чаще всего используют биотесты, основанные на ростовой реакции семян, проростков, целых растений. Например, биотесты, основанные на растяжении клеток, служат для определения активности ауксинов и ингибиторов роста. Для изучения соединений типа цитокининов используют биотесты, основанные на делении клеток (стерильная культура клеток, рост каллуса, укоренение черенков винограда и др.). В фитопатологии обычно используют группы биотестов для исследования заболеваний, природа которых неизвестна или мало изучена.

В зависимости от скорости проявления биоиндикаторных реакций выделяют несколько различных типов чувствительности тест-организмов:

I тип - биоиндикатор проявляет внезапную и сильную реакцию, продолжающуюся некоторое время, после чего перестает реагировать на загрязнитель.

II тип - биоиндикатор в течении длительного времени линейно реагирует на воздействие возрастающей концентрации загрязнителя.

III тип - после немедленной, сильной реакции у биоиндикатора наблюдается ее затухание, сначала резкое, затем постепенное.

IV тип - под влиянием загрязнителя реакция биоиндикатора постепенно становится все более интенсивной, однако достигнув максимума постепенно затухает.

V тип - реакция и типы неоднократно повторяются, возникает осцилляция биоиндикаторных параметров (Биоиндикация наземных экосистем, 1988).

Для экотоксикологического картирования агроландшафта можно использовать биоиндикаторы, аккумулирующие загрязнители по безбарьерному типу, т.е. прямо-пропорционально их концентрации во внешней среде. Например, покровные ткани растений (кора) и животных (шерсть) представляются малоактивными индикаторами для этого метода. Листья, цветки и другие органы растений накапливают поллютанты по фонобарьерному типу

При проведении биоиндикации существенную роль играет выбор стандартов для сравнения. Последние делятся на две группы: абсолютные и относительные.

Для объективной оценки загрязнения агроценоза ксенобиотиками необходимы адекватные тест-системы и фитотесты, реагирующие на комплекс загрязнителей и пригодные для выявления мутагенного потенциала встречающихся в агросфере поллютантов. При этом индикаторы должны удовлетворять ряду требований: накопление загрязняющих веществ не должно приводить к гибели тест-организмов; численность тест-организмов должна быть достаточной для отбора, т.е. без влияния на их воспроизводство; в случае долгосрочных наблюдений предпочтительны многолетние виды флоры; фитотесты должны быть генетически однородными; должна быть обеспечена легкость взятия проб; должна реализоваться относительная быстрота проведения тестирования; биотесты должны обеспечивать получение достаточно точных и воспроизводимых результатов; биоиндикаторы должны быть одновозрастными и характеризоваться, по возможности, близкими свойствами; диапазон погрешностей измерений (по сравнению с классическими или эталонными методами тестирования) не должен превышать 20-30%; при выборе тест-организмов предпочтение следует отдавать регистрации функциональных, этологических, цитогенетических изменений отдельных индикаторных процессов биоты, а не только изменению ее структуры, численности или биомассы, т.к. эти последние являются более консервативными.

Возможно, методы оценки состояния разных типов экосистем потребуют специфичных биоиндикаторов. Так, например, для оценки состояния биоты вследствие загрязнения атмосферного воздуха, широко применяются методы лихенометрии (использование лишайников). Для санитарного контроля и нормирования загрязнителей в педоценозах успешно применяются методы микробиологического тестирования. Они включают вирусологические, бактерологические исследования и метод определения "токсикоза" почв.

Наиболее важными сферами применения биоиндикации могут быть следующие: выявление естественного буферного потенциала агроценоза и допустимых нагрузок экзогенных веществ при различных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур; контроль за состоянием фитопопуляции с целью ранней диагностики и предотвращения отрицательных последствий поллютантов, которые могут повлиять на структуру и функции биоты, продуктивность агроценоза, а также на здоровье человека; комплексная система экологического мониторинга агросферы, включая обнаружение негативных изменений, их диагностику на самой ранней стадии антропогенного воздействия; сохранение биоразнообразия агроландшафта, позволяющее обеспечить существование как можно большего числа организмов, в особенности редких видов биоты, высокочувствительных к загрязнению.

Специальные биотесты для определения загрязнения фитопопуляции солями тяжелых металлов, остатками пестицидов, микотоксинами и другими агентами сводятся к оценке степени изменения морфометрических, физиологических и биохимических показателей биоты. Подобные нарушения проявляются в изменении энергии прорастания, всхожести семян, размеров корней, в повреждении растений под воздействием загрязнителей. Рассмотрим некоторые из них на примере различных организмов.

Для тестирования остатков пестицидов, ТМ в почве и воде используется стандартный микробиотест. Он позволяет определить эффект суммарного присутствия всех токсикантов и токсическое действие широкого круга загрязнителей. Метод основан на получении водной почвенной вытяжки и количественной оценки в ней токсикантов по степени ингибирования одной из ключевых ферментных систем - люцеферазой, что количественно регистрируется биолюминаметром типа БЛМ 8101. В питательную среду на основе водной вытяжки (почва/вода - 1/10) высевают культуру Photobacrterium phosphoreum. Этим способом анализируются остатки пестицидов (ФОС, ХОП), нитриты и ТМ. В санитарно-эпидемиологических исследованиях наряду с прямым определением содержания патогенных микроорганизмов, также применяются методы индикаторных штаммов (или "почвенной закладки") и определения "токсикоза" почв. При этом в качестве тест-объектов используют Clostridium tetani,Cl.perfringens, Bacillus anthracis, Escherichia coli и др. Сущность метода "почвенной закладки" заключается в оценке соотношения вегетативных и споровых форм биоиндикаторов в стерильной и нативной почве. Степень токсичности ("токсикоза") почв определяют по проценту пророста индикаторных бактериальных штаммов, т.е. по отношеннию образовавшихся колоний к количеству посевов. Показатель токсичности рассчитывается как величина обратная проросту. Токсичность почвы ранжируется по восьми классам опасности.

Классическим тест-объектом на загрязнители является одноклеточная зеленая водоросль хлорелла (Chlorella vulgaris Beijer.). Ее преимущества для экспресс-анализа загрязнения агроценоза заключаются в коротком жизненном цикле и возможности проводить оценку по таким показателям, как пигментное секторирование, нарушение споруляции клеток и летальность.

Метод, основанный на оценке численности живых особей и динамики ее фитомассы, дает, в конечном счете, представление о влиянии токсикантов на продолжительность жизни и плодовитость тест-системы. Существует альгологическая оценка фитотоксичности гербицидов (метод "бумажных дисков"). Оценивается интенсивность роста биоиндикатора Ch.vulgaris в зависимости от концентраций токсиканта. За альгицидные принимают концентрации вещества полностью подавляющие рост водорослей на дисках. Другой метод оценки химических веществ, основанный на эффекте замедленной флюоресценции (ЗФ). Этот эффект проявляется у растений при наличии сформированного фотосинтетического аппарата. Гербициды (ингибиторы фотосинтеза) способны изменять интенсивность ЗФ. Под действием очень низких концентраций гербицида резко ингибируется ЗФ, что регистрируется на специальной установке. Этим способом можно выявить наличие гербицидов ингибиторов реакций Хилла, однако в случае других пестицидов метод малоэффективен.

Многие методы биологического тестирования основаны на визуальных оценках. Весьма пригодны для этой цели зеленые и диатомовые водоросли. Под действием токсикантов первоначально зеленая масса водоросли меняет цвет - становится густо-коричневой или наоборот, обесцвечивается. Некоторые токсиканты не вызывают заметных изменений окраски, однако водоросли теряют тургор и легко повреждаются.

Существуют достаточно надежные способы количественной регистрации воздействия загрязнителей, например, плазмолиз. Для определения количества погибших клеток пользуются методом витального окрашивания. Живые клетки сильно ограничивают проникновение в протоплазму органических веществ, и будучи помещенными в раствор ряда красителей, практически не окрашиваются. В мертвые клетки краска проникает свободно, благодаря чему наличие погибших клеток легко поддается учету.

Система тестов, фиксирующих изменения каких-либо функций организма, основана на скорости движения протоплазмы, которая у многих клеток способна совершать круговые движения (циклозис). Реакция замедления или остановки протоплазмы лучше всего заметна на растениях с удлиненными клетками, такими как харовые водоросли (Charophyta), дюнамилла (Dunamilla) и элодея (Elodea). Присутствие свинца в среде, например, влияет на скорость движения протоплазмы, начиная с концентрации 0,5мг/мл.

Для тестирования почвы, загрязненной ТМ используют тест учета биологического разнообразия водорослей на единицу площади. При малейшем загрязнении почвы, первыми из водорослевых сообществ "выбиваются" зеленые водоросли. Желто-зеленые водоросли, особенно одноклеточные, являются показателями чистоты и здоровья почвы. Их исчезновение становится сигналом на загрязнение. Однако, почвенные водоросли, как индикаторы, имеют ограничения: зачастую обеднение структуры альгопедоценоза указывает на степень общего загрязнения, без дифференцировки отдельных контаминантов.

2.2 Биотест для изучения биологической активности гиббереллинов (на салате)

Для биотестирования отработано немало методов на различных культурах: белой горчице(Sinapis alba L.), озимой и яровой пшенице(Triticum aestivum L.), овсе(Avena L.), гречихе (Fagopyrum L.), огурце(Cucumis L.), кресс-салате(Lepidium sativum L.), сое (Glycine L.), льне (Linum L.), ежи сборной (Dactylis glomerata L.).

На горчице учитывают степень ингибирования первичного корешка проростка после обработки семян противодвудольным гербицидом. Определяют также увядание растений, торможение прироста листьев надземной массы проростков.

Овес и рис используют как индикаторы почвенных противозлаковых гербицидов, так как это наиболее чувствительные виды среди злаковых культур. При этом основным тестом является ингибирование роста зародышевого корня и листа.

Редис является традиционным биотестом при исследовании остатков пестицидов в почве и конечной продукции растениеводства, т.к. обладает по сравнению с другими объектами как наиболее высокой чувствительностью к фитотоксичным препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры.

На огурце и гречихе тестируют гербициды - производные мочевины и фенилкарбаматы. При этом у огурца учитывают рост первичного корня, у гречихи - утолщение стебля, деформацию зародышевых листьев, а также торможение роста. Кресс-салат используется как тест - объект для оценки загрязнения воздуха и почвы. Тест длится 10 дней. При наличии вредных веществ снижается процент всхожести и ингибируется рост зародышевых корешков. К недостаткам данного теста можно отнести неспецифичные изменения, затрудняющие выявление конкретного загрязнителя. Очевидно, это объясняется наличием генетической неоднородности культуры.