Основные методы генной инженерии

Действие пестицидов на злаках обнаруживается по их влиянию на морфогенез растений, проявляющейся в изменениях типа морфозов. У озимой пшеницы, при высокой пестицидной нагрузке (2,4Д), диален, лонтрел, тилт, байлетон, метафос) наиболее распространенным и устойчивым типом морфоза является "мутовка", т.е. увеличение числа колосков на уступе колосового стержня. Внесение минеральных удобрений может также прямо или косвенно приводить к появлению морфозов колоса у озимой пшеницы (в пределах 7% -39% в зависимости от гидротермического режима и вида удобрений). Колосовые морфозы и фазовый индекс, характеризуя интенсивность воздействия на растение агрохимикатов и других повреждающих факторов, могут быть успешно использованы в качестве диагностической тест- системы.

Видимо, успешное решение проблем биоиндикации во многом будет определяться подбором, а иногда и направленным созданием сортов (линий) культурных растений, чувствительных к загрязнению. К сожалению, в настоящее время подобные сорта и линии в России отсутствуют. Поэтому усилия исследователей должны быть направлены на поиск перспективных форм и работу с ними. Так, в Англии, специально выведен сорт табака Bel W3, характеризующийся восприимчивостью к содержанию озона в воздухе. C помощью этого сорта была создана картосхема Британских островов, характеризующая их загрязнение озоном. При слабом воздействии озона на табак через несколько дней по всей поверхности листовой пластинки образуется густая сеть некротических пятен серебристого цвета. В качестве эталона сравнения одновременно высаживается относительно устойчивый к озону сорт табака Bel B.

2.3 Амарантус-тест на цитокинин (бензимидазол), 2,4-Д

Успешное применение находят дикорастущие фитотесты в частности из семейства рясковых. Рясковые - самые мелкие цветковые растения, при благоприятных условиях размножаются круглогодично (преимущественно вегетативно). Интенсивность фототаксиса хлоропластов в листецах ряски, оцениваемая по изменению количества хлоропластов в эпистрофном положении, можно рассматривать как чувствительный показатель, свидетельствующий о степени загрязнения элементов агроландшафта. Явление отрицательного фототаксиса и послужило основой метода фитотестирования. Благодаря этим преимуществам ряску можно назвать ''экологической дрозофилой''. Ряска малая (Lemna minor L.) и ряска тройчатая (Lemna trisulcs L.), чувствительны к загрязнению воды, при содержании в ней до 10 мкг/мл ионов Ba, Cu, Mg, Fe, Co. На каждый загрязнитель у видов рясок проявляется специфическая реакция. На медь (0,1- 0,.25 мг/мл) - листецы реагируют полным рассоединением из групп и изменением окраски с зеленой на голубую; реакция проявляется через 4 часа после воздействия. На цинк (0,025мг/мл) реакция заключается в изменении окраски листеца: с насыщенно зеленой до бесцветной; где зелеными остаются только точки роста; барий(0,1-0,25 мг/мл) вызывает полное рассоединение листецов, отпадание корней и изменение окраски с зеленой на молочно-белую; кобальт (0,25-0,0025 мг/мл) - полную приостановку роста и потерю окраски.

Изучая природу тестов на цитокинины (бензимидазол, 2,4 - Д), можно сказать следующее: цитокинины были открыты как вещества, необходимые для деления клеток у стеблевого каллюса табака и изолированной сердцевинной ткани стебля табака. Эти ткани не способны к синтезу цитокининов, а также ауксинов, что позволило выявить многие существенные стороны действия данных фитогормонов на ростовые процессы. Так, в работах Скуга с сотрудниками было показано, что у изолированной сердцевинной ткани стебля табака в стерильной культуре одна ИУК несколько усиливала синтез ДНК, вызывала в отдельных клетках митозы, но не индуцировала клеточных делений. Точно так же один кинетин не вызывал деления клеток. В его присутствии не происходили митозы, а синтез ДНК он стимулировал в меньшей степени, чем ИУК. Только совместное действие ауксинов и кинетина значительно активировало синтез ДНК, вызывало митозы и индуцировало деление, клеток в изолированной сердцевине стебля табака.

В последующем были предприняты попытки разграничить во времени действие ИУК и кинетина в индукции клеточных делений у этой ткани. Полученные данные не имеют пока однозначной интерпретации, но позволяют предполагать, что начальные стадии процесса индуцируются одним ауксином, тогда как в последующем необходимы оба гормона.

Таким образом, было установлено, что регуляция деления клеток в изолированной сердцевинной ткани стебля табака осуществляется не одним гормоном - гипотетическим индуктором клеточных делений, а одновременным действием двух гормонов - цитокинина и ауксина. При этом для каждого фитогормона был показан свой предел концентраций, в которых он при наличии в среде другого гормона стимулирует данный процесс. Например, кинетин в присутствии в питательной среде 2 мг/л ИУК стимулировал деление клеток сердцевинной ткани стебля табака, начиная с концентрации 0,005 мг/л, но максимальное его действие достигалось в пределах концентраций от 0,02 до 0,5 мг/л. Увеличение концентрации кинетина до 2 мг/л приводило к угнетению процесса. Стимулирующее действие ИУК при одном и том же содержании в среде кинетина нарастало с увеличением ее концентрации до 1,8 мг/л. Максимальную интенсивность деления клеток вызывало сочетание оптимальных концентраций в среде обоих фитогормонов.

Вместе с тем в литературе появилось сообщение о том, что если заменить ИУК на 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) и взять последнюю в очень высокой концентрации, можно получить слабо идущее деление клеток сердцевинного каллюса табака и в отсутствие кинетина. По поводу этих данных возникают два предположения: либо только ауксины критичны для деления клеток каллюса, либо высокие концентрации 2,4-Д индуцируют синтез в каллюсе эндогенных цитокининов. Дальнейшие исследования должны показать, какое из этих предположений справедливо.

В связи с этим важно упомянуть, что у отдельных штаммов каллюса сердцевины табака обнаружена способность к синтезу цитокининов. Эти штаммы возникали спонтанно при длительной культуре каллюса. Одни из них были способны к синтезу только цитокининов, а другие - и цитокининов и ауксинов. Для интенсивного роста таких штаммов не требовалось добавления в питательную среду соответствующих фитогормонов. Они сами могли служить источником фитогормонов для обычных дефектных штаммов. Аналогичное явление наблюдалось и для каллюсов семядолей сои, которые обычно также не способны к синтезу ауксинов и цитокининов и нуждаются для роста в их предоставлении извне. В месте с тем были обнаружены штаммы этой ткани, не зависящие в своем росте от присутствия в среде цитокининов, и было показано, что это происходит потому, что они приобретают способность к синтезу собственных цитокининов.

Достаточное эндогенное содержание цитокининов, нехватка ауксинов или других необходимых веществ могут стать причиной отсутствия стимулирующего действия цитокининов на деление клеток. Кроме того, в случае высокого эндогенного содержания цитокининов их предоставление извне может привести и к угнетению клеточных делений. Возможно, именно с таких позиций следует рассматривать работы, в которых показано отсутствие стимуляции или даже торможение деления клеток цитокининами. Кроме того, нужно еще иметь в виду, что некоторые растительные объекты могут быть не компетентны для реакции на цитокинин активацией клеточных делений. Вместе с тем стимуляция с помощью цитокининов митозов и деления клеток продемонстрирована на очень большом числе разнообразных объектов, включая изолированные ткани.

Наиболее эффективно цитокинины стимулируют рост клеток в отрезках растущих листьев. Это было показано на листьях самых различных двудольных травянистых растений.

На отрезках листьев однодольных растений стимуляция роста клеток цитокинином не удается. С помощью цитокинииов удается индуцировать рост клеток в листьях, уже давно закончивших рост. Помимо листьев, стимуляция роста клеток цитокининами показана и у многих других объектов.

Индукция с помощью цитокининов органогенеза у недифференцированной ткани стеблевого каллюса табака была впервые показана Скугом с сотрудниками, которые с помощью ИУК и кинетина вызывали образование у каллюса корней и побегов и установили, что для закладки каждого из, этих органов требовались свои специфические концентрации обоих фитогормонов. Меняя содержание фитогормонов в питательной среде, можно было направлять органогенез в сторону образования корней или побегов.

Так, например, содержание в питательной среде 2 мг/л ИУК и 0,02 мг/л кинетина вызывало у каллюса сердцевинной ткани стебля табака интенсивное деление клеток и дифференциацию корней. Повышение концентрации кинетина до 0,5 - 1 мг/л угнетало корнеобразование, но индуцировало формирование стеблевых почек. Дальнейшее увеличение концентрации кинетина до 2 мг/л оказывало общее ингибирующее действие на рост каллюса и процессы органообразования.

При этом в ряде случаев цитокинины, стимулируя образование побегов, вместе с тем задерживали закладку корней. Однако Хайде на листьях бегонии показал, что закладка и корней, и стеблевых почек нуждается у этого объекта в цитокининах и ауксинах, и для каждого из этих процессов существуют оптимальные концентрации обоих фитогормонов, при которых они усиливают действие друг друга. Так как концентрации цитокининов, стимулирующие закладку корней, крайне низки, в большинстве объектов хватает, по-видимому, собственных цитокининов для осуществления этого процесса. Возможно, именно этим объясняется тот факт, что данные извне цитокинины ингибируют корнеобразование. Вместе с тем у каллюса Рорulus tremuloides L. корнеобразование происходило только при полном удалении из питательной среды кинетина и при наличии в среде 2,4-Д. Кроме того, образование побегов требовало у этого объекта удаления из среды ауксинов и происходило под действием одного цитокинина. Эти данные противоречат результатам Скуга о необходимости обоих фитогормонов для дифференциации, как корней, так и побегов. Однако это противоречие могло бы быть разрешено с позиции большего эндогенного содержания обоих фитогормонов в каллюсе Рорulus tremuloides L., по сравнению с их содержанием в каллюсе сердцевины стебля табака.

Выше были приведены примеры, когда с помощью цитокининов можно было вызвать рост боковых побегов на растении и их зацветание в неблагоприятных для цветения условиях. Что же касается общей стимуляции роста растений цитокининами, то ее получить весьма сложно и пока еще не найдены пути эффективного воздействия на рост и урожай растений. В этом отношении было сделано несколько неудачных попыток. Так, например, опрыскивание растений карликовой пшеницы раствором кинетина не влияло на их рост, а полив растений томатов, росших в песке, раствором кинетина (10 - 100 мг/л) резко угнетал их рост. Кинетин, добавленный в питательную среду (0,002 - 2 мг/л), тормозил также рост томатов, огурцов и гороха и задерживал их зацветание. Неудачей закончились и наши попытки повлиять с помощью кинетина на формирование зерна и содержание в нем азотистых веществ у пшеницы. По-видимому, во всех этих случаях в растениях хватало эндогенных цитокининов или, по крайней мере, не они являлись лимитирующим фактором.

Однако в литературе известны примеры и стимулирующего действия цитокининов на рост растений. Например, кинетин, добавленный в крайне низких концентрациях к раствору Кнопа, стимулировал рост проростков подсолнечника, фасоли и люпина, растений ряски в темноте, проростков люпина в темноте и на свету, а также проростков редиса на свету. Погружение растений табака на 1 час корнями в раствор цитокинина (5*10-4 М) вызывало значительное усиление роста листьев на растении и повышало в них содержание калия. Есть указания о возможности повлиять с помощью цитокининов нарост плодов яблони и на формирование урожая у растений кукурузы. Особенно интересные сведения, которые показали, что однократное опрыскивание растений подсолнечника раствором кинетина на фоне высокой дозы азотного питания вызывает значительную прибавку общего веса растений и увеличение веса корзинок. Подобное же опрыскивание ускоряет и зацветание растений подсолнечника.

Приведенные примеры позволяют заключить, что, хотя случаи, когда эндогенные цитокинины бывают в растениях в минимуме и поэтому проявляется стимулирующее действие экзогенных цитокининов, бывают, по-видимому, редко, все же могут быть найдены условия, при которых можно ожидать, что цитокинины окажутся эффективным средством воздействия на рост и урожай растений.

Таким образом, цитокинины повышают устойчивость клеток к самым различным неблагоприятным воздействиям, таким как, действие повышенной и пониженной температуры, обезвоживание, гребная и вирусная инфекция, механическое воздействие и влияние различных химических агентов.

Одним из проявлений действия фитогормонов является усиление роста стебля в высоту. Поэтому, прежде всего, проведем исследования по влиянию кинетина на рост растений пшеницы.

Данные по этому вопросу представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.

Влияние кинетина на длину побеговой системы 10-ти проростков пшеницы (см).

Таблица 2.

Влияние кинетина на длину корневой системы 10-ти проростков пшеницы (см)

Как видно из таблиц 1 и 2 кинетин практически не повлиял на длину корневой и побеговой системы.

Учитывая то, что калий не повлиял на длину побеговой системы, но вызвал увеличение ее массы, мы провели исследования по влиянию кинетина на накопление массы корневой и побеговой систем в зависимости от уровня минерального питания. Данные расположены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3.

Влияние кинетина на массу побеговой системы 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мг).

Таблица 4

Влияние кинетина на массу корневой системы 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мг)

Анализируя таблицы 2 и 3 можно сделать вывод, что кинетин практически не повлиял на массу побеговой и корневой системы. Хотя можно отметить незначительный рост массы побеговой системы у 11-ти дневных проростков.

Как и в опытах с калием, влияние кинетина изучалось и на интенсивность дыхания и фотосинтеза. Данные, полученные в результате опыта приведены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5.

Влияние кинетина на интенсивность дыхания 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мкл O₂ / гч)

Таблица 6

Влияние кинетина на интенсивность фотосинтеза 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мкл O₂ / гч).

Из таблиц 5 и 6 видно, что кинетин усиливает процессы дыхания и фотосинтеза. Интенсивность дыхания в отсутствии калия увеличилось на 11%, а на полной питательной смеси - на10%. Интенсивность фотосинтеза в отсутствии калия увеличивается на 11%, а на ППС на 30%. Усиление процесса фотосинтеза связано с увеличением содержания хлорофилла под влиянием кинетина.

И в таблицах 7 и 8 приведены результаты опытов по влиянию кинетина на содержание в проростках сахаров и хлорофилла.

Таблица 7.

Влияние кинетина на содержание хлорофилла 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мг/ч).

Таблица 8

Влияние кинетина на содержание сахаров 10-ти проростков пшеницы в зависимости от уровня калийного питания (мг/г сырого веса)

Аналогичная картина наблюдается и по уровню содержания сахаров и хлорофилла, которое под влиянием кинетина тоже увеличивается.

Содержание сахаров в отсутствии калия увеличивается на 16%, а на ППС на 17%. Хотя у проростков в возрасте 4-х дней содержание сахаров уменьшается, т.к. при переходе от гетеротрофного питания к автотрофному усиливается дыхание проростков. Это хорошо видно в таблице 5. В возрасте 6, 8,10 дней содержание сахаров под влиянием кинетина начинает увеличиваться, т.к. увеличивается интенсивность фотосинтеза.

Содержание хлорофилла в отсутствии калия увеличилось на 41%, а на ППС на 30%.

Диаграмма влияния цитокинина и калия на длину побеговой системы

Диаграмма влияния цитокинина и калия на массу побеговой системы

Диаграмма влияния цитокинина и калия на длину корневой системы

Диаграмма влияния цитокинина и калия на массу корневой системы

Диаграмма влияния цитокинина и калия на интенсивность дыхания

Диаграмма влияния цитокинина и калия на интенсивность фотосинтеза

Диаграмма влияния цитокинина и калия на содержание хлорофилла

Диаграмма влияния цитокинина и калия на содержание сахаров

Выводы

1. Под влиянием кинетина увеличение накопления массы проростков практически не наблюдается. В то же время присутствие кинетина значительно влияет на увеличение интенсивности дыхания и фотосинтеза, содержания сахаров и хлорофилла.

2. Влияние кинетина оказывается наиболее эффективным при недостатке калия, что вероятно связано с тем, что кинетин компенсирует недостаток калия в питательной среде. Отсюда можно сделать предположение, что кинетин и калий возможно влияют на одни стороны изучаемых процессов.

Заключение

Итак, подведем итоги написания курсовой работы

Ауксины - гормоны, вырабатываемые в апикальных меристемах побегов. Для растения вцелом ауксиновый сигнал означает, что побег интенсивно растет и необходимо обеспечивать его потребности, и каждая клетка растения в зависимости от своего положения выполняет эту задачу.

Образно ауксин можно назвать "гормоном благополучия апекса побега". Самый первый эффект ауксинов - аттрагирующий (от латинского "attractio" - "привлечение"). Клетки меристемы "привлекают" к себе питательные вещества. Аттрагирующий механизм ауксинов не установлен, но наиболее вероятным представляется следующий сценарий событий. Способность клетки к поглощению многих веществ зависит от электрохимического потенциала на мембране. Так, сахароза проникает в клетку через мембрану вместе с Н+-ионом, и чем выше концентрация протонов снаружи от клетки (и чем ниже она внутри), тем больше сахарозы клетка может захватить. Активизация работы Н+-помпы идет на усиление трансмембранного тртанспорта веществ. Таким образом, клетки, нуждающиеся в питательных веществах, создают более сильный перепад концентраций протонов на мембране, увеличивающий их поглотительную способность. Кроме сахарозы, клетки апикальной меристемы аттрагируют аминокислоты, нуклеотиды, неорганические ионы, воду и другие вещества. Аттрагирующий эффект проявляется в зоне активных делений клеток.

Совместно с цитокининами ауксины вызывают деления клеток, которые также происходят в определенных клетках апекса побега. В лежащей ниже зоне ауксин вызывает растяжение клеток. Механизм растяжения также активизируется через Н+-помпу.

Таким образом, генная инженерия, будучи одним из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствует ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

Генетическая инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путем использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток или новых пород экспериментальных мышей для научных исследований.

Основой микробиологической, биосинтетической промышленности является бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых -- способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение -- аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту. Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов.

Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку -- от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения. Цель этих приёмов одна -- добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат -- получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии и широко применяется в современной биотехнологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля. Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 110  C, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений и животных. Это очень важный и перспективный путь, который также реализуется в биотехнологии. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий. Это было важное достижение -- полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно.

Список использованной литературы

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия // Учебная литература для студентов медицинского института, 2002.

2. Бреслер С. Е., Основные методы генинженерии. М. -- 2002.

3. Вагнер Р., Митчелл Г., Генетика и обмен веществ. М. - 2001.

4. Ващенко И.М. Основы сельского хозяйства, М. - 2002.

5. Гамбург К.З. Фитогормоны и клетки. // М., Наука, 2001.

6. Гершкович И.В. Генетика. Изд. - во «ЮНИТИ», М. - 2003.

7. Кольцов Н.К., Хроматография, биотесты. Изд. - в «ЮНИТИ», М. - 2002.

8. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д Биологическая химия: Учебник/.-3-е, испр. изд.-М.: Высш.шк., 2006.

9. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функции. М., Наука, 2001.

10. Молекулярная генетика: учебник для вузов. Изд. - во «ЮНИТИ», М. - 2001.

11. Морозов А.С. Физиологические основы питания сельскохозяйственных растений. // Сборник статей - М., 2000.

12. Мызина С.Д. Ауксины и цитокинины. Изд. - во «ЮНИТИ», М. - 2001.

13. Ратнер В.А., Принципы организации и механизмы молекулярно-генетических процессов, Новосибирск, 2000.

14. Ростунов А.А. Влияние фитогормонов на поступление ионов в зависимости от уровня минерального питания. // Межвузовский сборник научных трудов, МОПИ, 1998.

15. Спирин А.С. Вестник Российской академии наук, том 62, М. - 2003.

16. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот: Учеб. пособие для биол. спец. Вузов / Высш.шк., 2002.

17. Якушкина Н.И., Пушкина Г.П. Изменение интенсивности фосфорилирования в проростках кукурузы под действием гибберелина и кинетина, Физиология растений, т.22, вып. 7, 1999.