Вплив гідратації на стабільність спіральних форм нуклеїнових кислот різного АТ/GC - складу

Механізм заповнення молекулами води гідратно-активних центрів природних ДНК. Модельні двоспіральні полінуклеотиди. Оцінка внесків різних типів взаємодій у загальну енергію стабілізації спіральних структур. Вплив низьких температур на гідратну оболонку.

Рубрика Физика и энергетика
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 10.01.2014
Размер файла 52,6 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна

УДК 577.32

Вплив гідратації на стабільність спіральних форм нуклеїнових кислот різного АТ/GC - складу

03.00.02 - біофізика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фізико-математичних наук

Березняк Катерина Германівна

Харків 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України молекула вода полінуклеотид спіральний

Науковий керівник:

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник Семенов Михайло Олексійович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я.Усикова НАН України, провідний науковий співробітник (м.Харків).

Офіційні опоненти:

- доктор фізико-математичних наук, професор Димант Леонід Наумович, Севастопольський державний технічний університет, професор (м.Севастополь);

- доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник

Сорокін Віктор Олександрович, Фізико-технічний інститут низьких температур ім.Б.І.Вєркіна НАН України, провідний науковий співробітник (м.Харків).

Провідна установа:

Донецький державний університет, кафедра біофізики, м.Донецьк.

Захист відбудеться "22" червня 2000 року о 1600 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному

університеті ім. В.Н.Каразіна, 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4, ауд.7-4.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В.Н.Каразіна: 61077, м.Харків, пл.Свободи, 4.

Автореферат розісланий "19" травня 2000 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Для розуміння природи структурних перетворень, динамічних характеристик макромолекул і їхньої термодинамічної стабільності необхідно з'ясувати механізми взаємодії макромолекул нуклеїнових кислот (НК) з молекулами води. У зв'язку з цим активно здійснюється експериментальне та теоретичне вивчення гідратації НК.

Місця локалізації молекул води в різних структурах НК визначено із кристалографічних досліджень. Для з'ясування ролі води у стабілізації НК багатообіцяючими виявилися результати, що одержані при комп'ютерному моделюванні азотистих основ у парах і в стопках. Однак зараз практично відсутні експериментальні дані, які можна порівняти з теоретичними результатами для того, щоб більш глибоко зрозуміти енергетичну і пов'язану з нею структурну роль води у формуванні канонічних форм НК. Тому виникла необхідність одержання коректних експериментальних даних для оцінки енергії взаємодії біомолекул з водою, енергій водневих зв'язків в уотсон-криківських парах, стекінг- та інших типів взаємодії.

Вибір НК різного нуклеотидного складу як об'єкта дослідження пов'язано з тим, що збільшення кількості GC - пар призводить до підвищення термостабільності та ентальпії теплового переходу спіраль-клубок. Проведення термодинамічного дослідження переходу НК різного нуклеотидного складу з неупорядкованого стану в спіральні А- і В-форми дало б змогу виявити внесок молекул води в їхню термостабільність.

Інтерес до вивчення структурного стану НК при малому вмісті води і впливу низьких температур на структуру ДНК пов'язаний з проблемою вибору умов тривалого зберігання генетичного матеріалу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з держбюджетними темами відділу молекулярної та прикладної біофізики Інституту радіофізики та електроніки НАН України "Структура и стабильность системы биополимер-вода-биологически активное вещество при воздействии температуры и излучений" (шифр "Кор", № 01.92U027978, постанова Бюро ВФА НАН України від 11.12.91, протокол №10), "Дослідження фізичних особливостей гідратованих біополімерів з урахуванням впливу іонізуючої радіації" (шифр "Гран", №01.96U006110, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.12.95, протокол №9), "Експериментальні та теоретичні дослідження гідратно-залежних процесів стабілізації структури природних та модельних нуклеїнових кислот" (№2.4/759, виконується за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень). Фінансова підтримка роботи частково забезпечувалася за рахунок гранта INTAS-97-31753.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було з'ясування ролі гідратного оточення у формуванні та стабілізації спіральних структур синтетичних і природних НК різного нуклеотидного складу. Для досягнення мети вирішувались такі задачі:

Одержання методами ІЧ-спектроскопії та п'єзогравіметрії експериментальних даних про механізм заповнення молекулами води гідратно-активних центрів природних ДНК різного AT/GC-складу та модельних двоспіральних полінуклеотидів, а також виявлення інтервалів сорбції води, у яких відбувається формування канонічних структур НК.

Експериментальне визначення величин енергії зв'язування молекул води з НК (енергетичний "спектр") у широкому діапазоні відносної вологості (ВВ).

Оцінка внесків різних типів взаємодій у загальну енергію стабілізації спіральних структур НК різного нуклеотидного складу за отриманими експериментальними даними.

Вивчення впливу низьких температур на гідратну оболонку та структурний стан ДНК при різних значеннях ВВ.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано ІЧ-спектри НК різного АТ/GC-складу в широкому інтервалі ВВ і визначено послідовність зв'язування молекул води з гідратно-активними центрами, проведено поділ гідратної оболонки на шари, що формують А- і В-форми НК. Розраховано значення абсолютної інтенсивності смуг поглинання азотистих основ нуклеотидів і полінуклеотидів у розчинах D2O.

Вперше отримано експериментальні величини енергій зв'язування молекул води з НК на різних стадіях формування спіральних структур, що дозволило виявити основні типи взаємодій, що стабілізують А- і В-форми НК. Встановлено, що незалежно від нуклеотидного складу внесок енергії взаємодії молекул води з гідратно-активними центрами НК складає 70%, внесок енергії водневих зв'язків в уотсон-криківських парах - 25%. Інші типи взаємодій істотно не впливають на стабілізацію.

Оцінка змін термодинамічних параметрів при викликаному гідратацією переході НК у спіральну конформацію показала, що при малому вмісті води (Р-форма) полінуклеотиди та ДНК знаходяться в частково упорядкованому стані. Термостабільність GC - збагачених НК забезпечується, в основному, їхньою взаємодією з водою.

На основі аналізу ІЧ-спектрів вологих плівок ДНК при кімнатних і низьких (до 80 К) температурах пояснено природу зменшення поперечних розмірів жолобків ДНК при зниженні температури. Це зв'язано зі скороченням довжин водневих зв'язків між молекулами води та ДНК і у водних містках. Виявлено повну оборотність низькотемпературних структурних змін ДНК.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні результати дозволили поглибити існуючі уявлення про роль води як стабілізатора при формуванні спіральних структур НК. Це сприяє більш глибокому розумінню фізичних процесів при функціонуванні ДНК у живих системах.

Систематичні дані відносно інтенсивності смуг поглинання азотистих основ можуть бути використані для розрахунку резонансних частот поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ.

Виявлена при низьких температурах оборотність структурних змін ДНК, а також залежність величини фракції води, що не вимерзає, від сольового складу у системі ДНК - вода - іони дозволяють вибрати такі умови зберігання ДНК, за яких значно зменшено шкідливу дію низьких температур. Частина міцно зв'язаної води регулюється вмістом солі в системі. Ці результати можуть використовуватись при розробці режимів консервації біологічних матеріалів у кріобіології та кріомедицині.

Особистий внесок здобувача. В опублікованих спільно зі співавторами наукових роботах особистий внесок здобувача полягає:

- у роботах [1, 6, 7, 9] - у розробці методики та одержанні ІЧ-спектрів при низьких температурах, обробці й аналізі отриманих результатів;

- у роботах [2, 8] - у проведенні ІЧ-спектроскопічних вимірів, обробці й інтерпретації одержаних результатів, обгрунтуванні висновків;

- у роботах [3, 10, 11] - у розрахунках енергетичних внесків, проведенні термодинамічного аналізу та узагальненні результатів;

- у роботах [4, 5] - у виконанні розрахунків для розвитку методики аналізу змін спектральних параметрів смуг поглинання.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи за темою дисертації доповідались і обговорювались на:

- II Международной конференции "Молекулярные основы биотехнологии", Пущино, 1987;

- VI конференции по спектроскопии биополимеров, Харьков, 1988;

- Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков,1989;

- Second World Congress of Theoretical Organic Chemistry, University of Toronto, Canada, 1990;

- II з'їзді Українського біофізичного товариства, Харків, 1998;

- International Conference "Physics of Biological Systems", Pouskcha-Vodytsa, Kiеv, 1998;

- II съезде биофизиков России, Москва, 1999;

- Symposium "Theoretical physics and biology", Kiev, 1999;

- семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства, Харків, 2000.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових робіт, у тому числі 5 статей у наукових журналах і 6 тез доповідей на конференціях.

Структура дисертації. Дисертація складається з вступу, п'ятьох розділів, висновків і додатку. Матеріал дисертації викладено на 148 сторінках, з них 3 стор. займає додаток, 10 стор. - 26 ілюстрацій, 6 стор. - 13 таблиць, 18 стор. - список використаних джерел (185 найменувань).

Основний зміст роботи

У вступі обгрунтовано актуальність обраної теми, сформульовано мету і задачі дослідження, показано наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів, наведено дані про апробацію роботи.

Розділ 1 містить огляд літератури, присвячений сучасному теоретичному й експериментальному дослідженню гідратації НК, а також аналізу сил, що стабілізують їхні спіральні конформації. Наведено дані про структуру, фізико-хімічні властивості іон-гідратної оболонки, необхідної для існування вторинної структури НК, про специфіку взаємодії між молекулами води та гідратно-активними центрами біополімера. Розглянуто природу АВ- переходів, що викликані зміною гідратації. На основі даних рентгено-структурного аналізу (РСА) показано, що стан гідратного оточення залежить від нуклеотидного складу та конформації подвійної спіралі, а частина молекул води є структурним елементом спіральних форм НК і бере участь у їхній стабілізації. Також розглянуто інші типи внутрішньо- та міжмолекулярних взаємодій (водневі зв'язки в уотсон-криківських парах, гідрофобні та стекінг-взаємодії, взаємодія при конформаційному підстроюванні), які стабілізують спіральні конформації НК, і наведено оцінки їхніх енергій. Показано, що недостатня кількість експериментальних даних, які можна було б порівняти з результатами теоретичних розрахунків, ускладнює розуміння енергетичної та структурної ролі води у формуванні і стабілізації канонічних форм НК різного нуклеотидного складу. У останній частині огляду обговорюється вплив низьких температур на структуру і гідратне оточення ДНК. Це питання важливе у зв'язку з проблемою кріоконсервації генетичного матеріалу. На підставі всіх наведених в огляді даних сформульовано основні задачі дослідження.

У розділі 2 наведено методи дослідження і подано характеристику вивчених зразків. Завдяки високій чутливості до міжмолекулярних взаємодій і структурних змін біополімерів для дослідження гідратації і конформаційних переходів НК використано метод ІЧ-спектроскопії. У розділі коротко розглянуто фізичну основу методу, надано характеристику спектральних параметрів смуг поглинання, наведено віднесення основних смуг поглинання НК (Tsuboi, 1974; Taillandier, 1990). Описано методики приготування плівкових зразків, одержання й обробки ІЧ-спектрів. Похибка визначення оптичної щільності складала не більше 2%, а частот - 1-2 см-1.

Для інтерпретації змін спектральних параметрів при гідратації і структурних переходах використовувалися емпіричні правила прояву водневого зв'язку, результати квантово-хімічного розрахунку гідрату 5'-ЦМФNa2 (Стариков, 1988) і розрахунків резонансних частот поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ (Семенов, 1990). Значення абсолютних інтенсивностей смуг поглинання азотистих основ, що необхідні для обчислення резонансних частот, отримано в роботі шляхом поділу перекритих смуг спектра методом багатогранника, що деформується (Химмельблау, 1975). Контури смуг поглинання апроксимувалися лінійною комбінацією функцій Гаусса та Лоренца.

Для оцінки впливу протиіонів на спектральні параметри смуг поглинання проведено квантово-хімічний розрахунок комплексу 5'-ГМФNa2Н2О напівемпіричним методом ППДП/2 у spd-базисі хвильових функцій за допомогою програми, наданої Ю.Ф.Педашом. Виявилося, що переміщення іона Na+ відносно нуклеотиду викликає значні зміни електронної щільності, які поряд з впливом гідратації можуть призводити до змін спектральних параметрів, що спостерігаються на початковій стадії зволоження. Однак розділити ці ефекти в теперішній час неможливо.

У розділі коротко розглянуто метод п'єзогравіметрії, що використовувався для одержання ізотерм гідратації НК. Об'єктом дослідження були синтетичні полінуклеотиди poly(rG)-poly(rC) і poly(dA)-poly(dT), а також природні ДНК різного нуклеотидного складу: ДНК з Microcoсcus lysodeikticus (АТ/GC=0,28/0,72) та ДНК з Clostridium perfringens (АТ/GC=0,69/0,31). Для аналізу залучено дані, отримані раніше М.О.Семеновим та Т.В.Больбухом при дослідженні комплексу poly(rA)-poly(rU) та ДНК з тимуса теляти (АТ/GC=0,58/0,42).

У розділі 3 наведено результати ІЧ-спектроскопічного дослідження плівок НК у широкому інтервалі ВВ. В процесі зволоження плівки відбуваються значні зміни спектральних параметрів.

Для надійно віднесених смуг поглинання побудовано залежності частот і відносних інтенсивностей R, визначених як відношення оптичних щільностей при i-й та нульовій вологостях, від числа молекул води n, що припадають на один нуклеотид.

На початковому етапі гідратації (ВВ50%) спостерігаються низькочастотні зсуви та зріст інтенсивності більшості смуг поглинання, що зв'язано з установленням водневих зв'язків між молекулами води і гідратно-активними центрами НК. Одночасно гідратуються катіон-фосфатні групи, а також гідрофільні групи сахарів і азотистих основ, що призводить до утворення моногідратного шару.

При подальшому збільшенні ВВ починається процес переходу НК у спіральну конформацію. Високочастотні зсуви та гіпохромізм смуг поглинання поза- та внутрішньокільцевих коливань азотистих основ пов'язані з виникненням резонансних взаємодій коливальних моментів переходів при утворенні "стопок" основ. Формування спіральної структури також характеризується високочастотними зсувами структурно-чутливої смуги при 1710 см-1 та смуг поглинання фуранози внаслідок зміни її конформації. На цьому етапі гідратації утворюється упорядкований шар молекул води внутрішньої гідратної оболонки типу "центр-вода-центр" зі суцільною сіткою водневих зв'язків.

Перехід ДНК у В-форму супроводжується додатковим зв'язуванням молекул води й формуванням зовнішньої гідратної оболонки, що призводить до зросту інтенсивності та низькочастотним зсувом смуг поглинання деяких груп.

Максимум смуги поглинання валентних коливань ОН-груп води, яка зв'язана з НК, в процесі гідратації зміщується у високочастотну область від =3370 см-1, але для GC-збагачених зразків не досягає значення, характерного для рідкої води.

На основі аналізу залежностей і R від n визначено інтервали вмісту води, в яких НК існують у моногідратному стані, інтервали переходів в А- і В- спіральні конформації, а по насиченню спектральних параметрів знайдено ступені гідратації НК (табл.1). Інтервал моногідратного стану природних ДНК ширше, ніж модельних полінуклеотидів, а також вище їхній ступінь гідратації. Гідратна оболонка комплексу poly(rG)-poly(rC) містить на 3-4 молекули води на нуклеотид менше, ніж poly(rA)-poly(rU). Незалежно від нуклеотидного складу перехід ДНК із А- у В - форму відбувається при зв'язуванні більше 11 молекул води на нуклеотид.

Таблиця 1 Інтервали існування різних структурних форм полінуклеотидів і ДНК

Зразок НК

Інтервал n моногідратного стану

Інтервал n А-форми

Інтервал n В-форми

Ступінь гідратації n

poly(dA)-poly(dT)

0n2

-

2n12

12-13

poly(rA)-poly(rU)

0n3

3n11

-

11-12

poly(rG)-poly(rC)

0n1,5

1,5n8

-

8

ДНК з Cl.perfringens

0n5

5n10

10n14

13-15

ДНК з тимуса теляти

0n5

5n11

11n18

18-20

ДНК з M.lysodeikticus

0n8

8n13

13n16

15-17

У розділі 4 за допомогою комплексного методичного підходу до вивчення гідратації НК у системі НК - змінний вміст води проаналізовано внески різних типів взаємодій у загальну ентальпію стабілізації спіральних структур НК і проведено термодинамічний аналіз переходу НК із неупорядкованого стану в спіральні А- і В-форми в процесі гідратації. Значення ентальпії теплової денатурації може бути подано у вигляді суми трьох доданків:

++,

(1)

де - надлишкова енергія гідратації при утворенні А- або В-форм НК;

- енергія водневих зв'язків у парах основ;

- енергія інших типів взаємодії.

З енергетичної точки зору i-ту молекулу води можна вважати "зв'язаною", якщо її енергія взаємодії Еi з відповідним гідратно-активним центром перевищує середню енергію взаємодії вода - вода в рідкій фазі, Е0 = 40,5 кДж/моль:

Еi = Еi - Е0

(2)

Значення Егідр оцінювалися із частотних зсувів максимуму смуги поглинання валентних коливань ОН-груп молекул води, які припадають на НК (рис.3), за допомогою співвідношення Беджера-Бауера:

/0Е1,210-2 (3)

На підставі обчислених значень Егідр, а також даних, отриманих Т.В.Больбухом при аналізі ізотерм гідратації НК і А.І.Гасаном при калориметричному вимірі ентальпії випарювання води з вологих плівок НК, побудовано усереднені залежності надлишкової енергії гідратації від числа молекул води, які припадають на один нуклеотид, для усіх вивчених полінуклеотидів і ДНК.

Можна виділити три особливості на цих залежностях:

- усі функції Егідр(n) є монотонно спадаючими, тобто по мірі сорбції молекул води їхні енергії зв'язування з гідратно-активними центрами НК і молекулами води внутрішньої гідратної оболонки зменшуються;

- чим більше вміст GC - пар в складі НК, тим вище проходять залежності Егідр(n), тобто з гідратно-активними центрами комплексу poly(rG)-poly(rC) і ДНК з M.lysodeikticus молекули води утворюють більш міцні водневі зв'язки;

- надлишкова енергія гідратації на заключній стадії формування гідратних оболонок для комплексу poly(rG)-poly(rC) і ДНК з M.lysodeikticus має значний розмір, тобто молекули води в зовнішньому шарі взаємодіють між собою з більшою енергією, ніж в об'ємній фазі.

Із використанням величин Егідр для кожної молекули води (рис.4) і даних табл.1 отримано значення енергії зв'язування молекул води з НК на різних ступенях формування спіральних структур (табл.2). Повна надлишкова енергія гідратації природних ДНК більше, ніж полінуклеотидів, і її значення зростають при збільшенні вмісту GC - пар.

Для переходу ДНК із А- в В-форму незалежно від нуклеотидного складу потрібні незначні витрати енергії. У останньому рядку таблиці наведено теоретичні значення Егідр для В-форми ДНК (Tumanyan, 1990), що задовільно узгоджуються з експериментальними величинами для ДНК із випадковою нуклеотидною послідовністю.

Таблиця 2 Розподіл енергій молекул води по шарам у полінуклеотидах та ДНК різного нуклеотидного складу

Енергія Егідр на пару нуклеотидів, кДж/моль Н2О

Тип гідратного шару

poly(rA) poly(rU)

poly(dA) poly(dT)

poly(rG) poly(rC)

ДНК з Cl.perfr

ДНК з тим. теляти

ДНК з M.lysod

Моногідратний шар

34,82

19,21,2

21,91

663

703

95,44,8

Вода А-форми

24,44

-

41,14

20,83

223,6

20,43

Вода В-форми

-

20,83

-

62,4

6,62

9,22,2

Повна енергія гідратації

Експериментальна

Теоретична

59,26

-

40,04,2

86

63,05

-

92,88,4

101

98,68,6

106

12510

121

Для оцінки енергії водневих зв'язків у комплементарних парах азотистих основ було використано значення середніх енергій водневих зв'язків в одиночних парах: 4,2 кДж/моль у AU(AT)-парі та 4,6 кДж/моль у GC-парі (Семенов, 1990). У випадку синтетичних полінуклеотидів враховувалася кількість водневих зв'язків у парі основ, а у природних ДНК - нуклеотидний склад:

ЕН зв = + (1 - ) ,

(4)

де і - надлишкові енергії водневих зв'язків, відповідно, у AT- і GC-парах;

- частка АТ-пар азотистих основ у складі ДНК.

Значення ентальпії теплової денатурації Нперех частково було взято з літератури, а для ДНК з M.lysodeikticus і ДНК з Cl.perfringens проведено калориметричне визначення Нперех у 0,1% водному розчині. У таблиці 3 наведено внески різних типів взаємодій у Нперех, визначенні з точністю 5-10%.

Звертає на себе увагу мале значення енергії інших типів взаємодії (у тому числі стекінг-взаємодії). Можливо, вони не впливають суттєво на стабільність структури ДНК, а стабілізація "стопок" азотистих основ здійснюється за рахунок водневих зв'язків.

Не дивлячись на те, що значення енергії водневих зв'язків у парах зростає зі збільшенням вмісту GC-пар у зразку, її внесок у Нперех складає 25-30% незалежно від нуклеотидного складу НК.

Основним фактором, що стабілізує структуру синтетичних комплексів і природних ДНК (70-75%), є молекули води гідратної оболонки.

Таблиця 3 Типи енергій взаємодій у НК

Тип енергії

Енергія на пару нуклеотидів, кДж

poly(rA) poly(rU)

poly(dA) poly(dT)

poly(rG) poly(rC)

ДНК з Cl.perfr

ДНК з тимуса теляти

ДНК з M.lysod

Нперех

34,3

30,9

53,1

36,4

40,1

46,4

Егідр А-форми

24,4

-

41,1

-

-

-

Егідр В-форми

-

20,8

-

26,8

28,6

29,6

ЕН-зв у парах

8,4

8,4

13,8

10,1

10,7

12,3

Еінш

1,5

1,7

-1,8

-0,5

0,8

4,5

При структурних переходах, індукованих зміною гідратації, зовнішнім параметром, який викликає зміну вільної енергії G, є хімічний потенціал води . Ці переходи носять кооперативний характер і характеризуються різкою зміною спектральних параметрів у межах вузького інтервалу сорбції молекул води.

Тому оцінка відносної стабільності двох конформаційних станів НК поза межами області переходу дає значення G при структурному переході (Птицин, 1969):

(5)

Зміну вільної енергії Гіббса обчислювали за формулою:

,

(6)

де n - кількість молекул води, необхідних для здійснення переходу;

ср і 2 - хімічні потенціали, відповідно, у середній точці і після переходу (, де -відносна вологість). Результати розрахунків наведено в табл.4.

Величина зміни вільної енергії при структурному переході залежить від нуклеотидного складу. Із збільшенням вмісту GC-пар стабільність зростає. Термостабільність корелює з цим ефектом. Оскільки вода, завдяки ентальпійному члену, вносить основний внесок у G, вона і визначає стабільність, а також термостабільність спіральних структур нуклеїнових кислот.

Не дивлячись на те, що ступінь гідратації poly(rG)-poly(rC) нижче, ніж poly(rA)-poly(rU) (табл.1), його підвищена термостабільність визначається високим значенням Егідр (табл.3), оскільки молекули води зв'язуються з GC-комплексом більш міцними водневими зв'язками (рис.4). Можливо, гідратне оточення poly(rG)-poly(rC) більш жорстке, ніж poly(rA)-poly(rU). Це підтверджується даними РСА про довжини водневих зв'язків у водяних містках оліго- і полінуклеотидів AU- і GC-типу (Rich, 1976).

Сильне зв'язування молекул води з GC-комплексом мабуть призводить до утворення вторинної гідратної оболонки, яка сприяє зберіганню первинної оболонки, і тим самим опосередковано стабілізує структуру poly(rG)-poly(rC). Про це свідчить істотне значення надлишкової енергії гідратації при 92-96% ВВ.

Таблиця 4 Термодинамічні параметри конформаційних переходів НК, індукованих зміною гідратації

Зразок НК

AT/GC -склад

Tпл 0C

-G кДж/моль

-H кДж/моль

-S Дж/мольград

Тип переходу

poly(rA)-poly(rU)

1/0

62

17

29,2

42

PA

poly(dA)-poly(dT)

1/0

67

19

32,8

47

PB

ДНК з Cl.perfr

0,69/0,31

77

20

36,9

58

PB

ДНК з тим. тел.

0,58/0,42

87

21

39,3

69

PB

ДНК з M.lysod

0,28/0,72

93

23

41,9

75

PB

poly(rG)-poly(rC)

0/1

136

24

54,9

105

PA

Величина зміни ентропії S при РА або РВ-переході НК (табл.4) за абсолютним значенням помітно менше, ніж при тепловому переході спіраль-клубок. Це свідчить про те, що НК при малому вмісті води (Р-форма) частково упорядковані.

У розділі 5 подано результати ІЧ-спектроскопічного дослідження плівок ДНК з тимуса теляти при різних значеннях ВВ в інтервалі температур від +20 до -1900С. Охолодження сухої плівки викликає зріст інтенсивності смуг поглинання ДНК, пов'язаний зі зміною заселеності коливальних рівнів. Для ДНК, зволоженої вище 50% ВВ (рис.5), зниження температури призводить до структурних змін, основною причиною яких є молекули води:

- низькочастотні зсуви та зростання інтенсивності смуг поглинання фосфатних груп свідчать про підсилення водневого зв'язку вода-фосфат, яке призводить до локалізації молекул води на РО-групах і збільшенню жорсткості спіралі ДНК;

- високочастотні зсуви смуг поглинання дезоксирибози пов'язано з обмеженням псевдообертання фуранозного кільця внаслідок скорочення водневих зв'язків вода - сахар.

Слабка чутливість смуг поглинання азотних основ до зниження температури пов'язана, мабуть, з їх більш жорсткою локалізацією в структурі ДНК. Порівняння спектрів ДНК до охолодження і після відігріву свідчить про повну оборотність низькотемпературних структурних змін.

Для дослідження стану гідратної оболонки ДНК при низьких температурах отримано ІЧ-спектри частково дейтерованих плівок ДНК в області ОD-коливань води, яка зв'язана з ДНК. При ВВ80% низькотемпературні спектральні зміни пов'язані з підсиленням водневого зв'язку вода-ДНК і вода-вода (рис.6,а). При 90%ВВ зниження температури призводить до появи піка, що відповідає льодоподібній фазі води (рис.6,б). Поділ смуг, що перекриваються, дозволив провести аналіз їхніх інтегральних інтенсивностей, який показав, що величини фракцій води, яка не вимерзає та тієї, що вимерзає, складають, відповідно, 12 і 3 молекули води на нуклеотид. Збільшення вмісту домішкової солі до 8% зменшує фракцію, що не вимерзає, до 9 молекул води на нуклеотид.

Шляхом екстраполяції низькотемпературного частотного зсува валентних коливань зв'язаної води до 10К оцінено, що зменшення довжин водневих зв'язків у ланцюжку з 3-5 молекул води призводить до скорочення поперечного розміру головного жолобка на 0,3-0,5А0, що раніше спостерігалося методом РСА (Дикерсон, 1982).

У додатку наведено значення спектральних параметрів смуг поглинання азотистих основ, отримані шляхом поділу смуг, що перекриваються в експериментальних спектрах.

Висновки

Методами ІЧ-спектроскопії і п'єзогравіметрії вивчено гідратно-залежний процес формування канонічних спіральних структур синтетичних полінуклеотидів і природних ДНК різного нуклеотидного складу та визначено центри їхньої гідратації. Виявлено, що інтервали структурних переходів залежать від вмісту GC-пар у зразку, однак АВ перехід для всіх вивчених ДНК відбувається при зв'язуванні більше 11 молекул води на нуклеотид.

Проведений квантово-хімічний розрахунок електронної щільності 5'-ГМФ2Na+ показав, що переміщення іона Na+ відносно нуклеотида поряд із впливом гідратації може служити якісним поясненням спектральних змін, що спостерігаються на початковій стадії гідратації.

Отримано "енергетичні спектри" води, зв'язаної з НК. Ці залежності для всіх зразків, незалежно від нуклеотидного складу, мають монотонно-спадаючий характер. При збільшенні вмісту GC - пар взаємодія між молекулами води і НК підсилюється.

Вперше отримано експериментальні значення надлишкової енергії гідратації при формуванні А- і В-форм НК. Встановлено, що енергія гідратації моногідратного шару і повна енергія гідратації збільшуються з ростом вмісту GC-пар в ДНК. Незалежно від нуклеотидного складу для АВ переходу необхідні незначні витрати енергії.

Проведено оцінку внесків різних типів взаємодій в енергію стабілізації спіральних форм НК. Виявлено, що основним фактором, який стабілізує НК будь-якого АТ/GC-складу, є взаємодія молекул води з азотистими основами і сахарофосфатним ланцюгом (70%). Внесок енергій водневих зв'язків в уотсон-криківських парах складає 25%, інші типи взаємодій - не більше 5%.

При термодинамічному дослідженні переходів НК з неупорядкованого стану в А- і В-форми виявлено кореляцію між термостабільністю НК і зміною вільної енергії переходу. Оскільки вода за рахунок ентальпійного члена вносить основний внесок у вільну енергію, вона і визначає стабільність, а також термостабільність двоспіральних структур НК. Зміни ентропії свідчать про те, що при малому вмісті води НК знаходяться у частково упорядкованому стані.

Вивчення впливу низьких температур (до 80К) на зволожені плівки ДНК показало, що зниження температури призводить до оборотнього скорочення довжин водневих зв'язків між молекулами води і гідратно-активними центрами ДНК, а також у водяних містках, що є причиною зменшення поперечних розмірів жолобків. Підвищений вміст домішкової солі викликає зменшення кількості води, що не кристалізується при охолодженні.

Список опублікованих праць за темою дисертації

Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. ИК-спектроскопическое изучение влияния низких температур на структуру и гидратацию ДНК // Проблемы криобиологии. - 1991. - №4. - С.5-10.

Семенов М.А., Малеев В.Я., Березняк Е.Г., Гасан А.И., Больбух Т.В. Гидратация и стабильность комплекса поли (rG)-поли (rC) // Мол.биология. - 1991. - Т.25. - №6. - С.1626-1634.

Березняк Е.Г., Семенов М.А., Больбух Т.В. Гидратация и стабильность нуклеиновых кислот с различным АТ и ГЦ - составом в конденсированном состоянии // Вісн.Харк.ун-ту. - 1998. - №410.Біофізичний вісн. Вип.1. - С.5-20.

Березняк Е.Г., Семенов М.А., Стариков Е.Б., Педаш Ю.Ф., Больбух Т.В., Матвеев Д.А., Малеев В.Я. ИК-спектроскопическое и квантово-химическое изучение гидратации динатриевой соли рибогуанозин-5'-монофосфата // Вісн.Харк.ун-ту. - 1998. - №422.Біофізичний вісн. Вип.2. - С.29-34.

Березняк Е.Г., Семенов М.А. Спектральные параметры нуклеотидов и полинуклеотидов в D2О. - Харьков: 1989. - 16с. (Препринт №379. / ИРЭ АН Украины).

Веревкин А.Г., Березняк Е.Г. ИК-спектроскопическое проявление гидратации и конформационного состояния ДНК при низких температурах // Тезисы докл. II межд. конф. "Молекулярные основы биотехнологии". - Пущино. - 1987. - С.7.

Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. Сравнительный анализ состояния нативной и денатурированной ДНК во влажных пленках при низких температурах // Тезисы докл. VI конф. по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С.69-70.

Семенов М.А., Березняк Е.Г. ИК-спектроскопические особенности гидратации одно- и двуспиральных полинуклеотидов поли рГ и поли рЦ // Тезисы докл. VI конф. по спектроскопии биополимеров. - Харьков. - 1988. - С.264-265.

Веревкин А.Г., Березняк Е.Г., Семенов М.А., Малеев В.Я. Влияние низких температур на ион-гидратную оболочку и конформацию ДНК // Тезисы докл. межд. конф. "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины". - Харьков. - 1989. - С.12.

Семенов М.А. Березняк Е.Г. Гидратация, структурные переходы и стабильность нуклеиновых кислот в пленках // Abstr. of Conf. on physics of biological systems. - Pouskcha-Vodytsa, Kiev (Ukraine). - 1998. - P.37.

Семенов М.А., Больбух Т.В., БерезнякЕ.Г. Термодинамические аспекты взаимодействия нуклеиновых кислот с водой // Тезисы II съезда биофизиков России. - Москва (Россия) - 1999. - Т.1. - С.155.

Анотація

Березняк К.Г. Вплив гідратації на стабільність спіральних форм нуклеїнових кислот різного AT/GC-складу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет ім. В.Н.Каразіна, Харків, 2000.

Методами ІЧ-спектроскопії та п'єзогравіметрії вивчено гідратно-залежний процес формування канонічних форм синтетичних полінуклеотидів і природних ДНК різного АТ/GC - складу, визначено центри їхньої гідратації та інтервали структурних переходів. Послідовний облік надлишкової енергії гідратації виявив основні типи взаємодій у системі нуклеїнова кислота - вода. Незалежно від нуклеотидного складу взаємодія молекул води з азотистими основами і сахарофосфатним ланцюгом складає 70-75% від загальної ентальпії стабілізації спіральних структур, водневі зв'язки в парах основ - 25-30%, інші типи взаємодій - близько 5%. Термодинамічний аналіз структурних переходів, індукованих зміною гідратації, показав, що підвищена термостабільність GC- збагачених зразків визначається їхньою взаємодією з молекулами води. Зміни ентропії свідчать про те, що при малому вмісті води (Р-форма) нуклеїнові кислоти частково упорядковані. Низькотемпературне дослідження вологих плівок ДНК показало, що основна причина зворотних структурних змін ДНК при охолодженні пов'язана з молекулами води гідратної оболонки. Оцінка зменшення довжин водневих зв'язків ДНК - вода і вода - вода пояснили причини скорочення поперечних розмірів жолобків ДНК внаслідок зниження температури. Виявлено залежність розміру внутрішньої гідратної оболонки від кількості домішкової солі.

Ключові слова: нуклеїнові кислоти, ІЧ-спектроскопія, гідратація, енергетика, стабільність, низькі температури.

Аннотация

Березняк Е.Г. Влияние гидратации на стабильность спиральных форм нуклеиновых кислот различного AT/GC-состава. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет им. В.Н.Каразина, Харьков, 2000.

Методами ИК-спектроскопии и пьезогравиметрии изучен гидратно-зависимый процесс формирования канонических форм синтетических полинуклеотидов и природных ДНК различного АТ/GC - состава, определены центры их гидратации и интервалы структурных переходов. Последовательный учет избыточной энергии гидратации выявил основные типы взаимодействий в системе нуклеиновая кислота - вода. Независимо от нуклеотидного состава взаимодействие молекул воды с азотистыми основаниями и сахарофосфатной цепью составляет 70-75% от общей энтальпии стабилизации спиральных структур, водородные связи в парах оснований - 25-30%, остальные типы взаимодействий - около 5%. Термодинамический анализ структурных переходов, индуцированных изменением гидратации, показал, что повышенная термостабильность GC- обогащенных образцов определяется их взаимодействием с молекулами воды. Изменения энтропии свидетельствуют о том, что при малом содержании воды (Р-форма) нуклеиновые кислоты частично упорядочены. Низкотемпературное исследование влажных пленок ДНК показало, что основной причиной обратимых структурных изменений ДНК при охлаждении являются молекулы воды гидратной оболочки. Оценка сокращения длин водородных связей ДНК-вода и вода-вода объяснила природу уменьшения поперечных размеров желобков при понижении температуры. Обнаружена зависимость размера внутренней гидратной оболочки от содержания примесной соли.

Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, ИК-спектроскопия, гидратация, энергетика, стабильность, низкие температуры.

Summary

Bereznyak E.G. Influence of hydration on stability of helical forms of nucleic acids with different AT/GC - composition.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - Biophysics. - Karazin National Kharkov University, Kharkov, 2000.

It is known that the structural state and stability of nucleic acids (NA) are determined by numerous factors such as interactions with water molecules and ions, hydrogen bonds in Watson - Crick pairs, interplanar interactions (so-called stacking interaction), hydrophobic and other types of interactions. Increasing recognition has recently been given to the concept according to which the stabilization of the helical structure of NA is provided with their interaction with a hydrate-ionic environment. This concept is based on the results of many experimental and theoretical studies of hydration behavior of NA in various conditions including the condensed state. Studies of a wide set of crystallohydrates of NA duplexes by X-ray diffraction have shown convincingly that the coupled water molecules are structural elements of their helical conformations. Encouraging results for the understanding of a role of water in stabilization of NA were obtained by Monte Carlo computer simulations. However, there are no systematic experimental data about energy of different type of interactions. In this paper the results of an experimental study of the influence of water on structure, structural transitions and stability of synthetic and natural NA are discussed. It has allowed to estimate the contributions of various types of interactions to total energy of the stabilization of helical structures of NA.

Infrared spectroscopy of synthetic polynucleotides and natural DNA of various nucleotide composition in the NA - water system with variable water content has been used to investigate the process of formation of NA structure and its hydration environment. From the analysis of the features of the frequencies and intensities of the absorption bands assigned to vibrations of the nitrogenous bases and sugar phosphate chain in the dependencies on relative humidity, three intervals of moisture have been found in which three structural states (the P-, A- and B-form) of NA are realized. The "energy spectrums" of bound water for NA with different AT/GC - composition have been found from the IR spectroscopic study of water sorbed on NA and also from the results obtained by piezogravimetry and calorimetry,. It is discovered that the binding energies decrease with the process of sorption of water molecules with the hydration-active centers of NA and connected water molecules. The water molecules form stronger H-bonds with the hydration-active centers of GC-enriched NA. An excess hydration energy for complex poly rG-poly rC and DNA from M.lysodeikticus has a significant value at the final stage of formation of hydration environments.

The consecutive account of an excess hydration energy on formation of the NA structures has revealed the basic types of interactions stabilizing the canonical A- and B-forms of NA. Foremost, it is the interaction of water molecules with the nitrogenous bases and sugar-phosphate chains of NA. It was found that the energy of this interaction (the contribution to total energy of stabilization of helical structure amounts to about 70%) does not depend either on the quantity of water molecules, forming of any structures, or on the AT- or GC-composition of the NA. The latter statement has been confirmed in X-ray research on hydrated duplexes, since the analysis of these data has shown that the lengths of H-bonds in water bridges depend on nucleotide composition. The contribution of energies of H-bonds in Watson - Crick pairs to total energy of stabilization of the A- and B-forms of NA, irrespectively of nucleotide composition, is estimated to be about 30%. According to our estimations, however, the stacking interaction and other types of interactions do not make considerable contributions to the total energy of stabilization of NA.

Thermodynamic studies of the transition from the monohydration state into the helical A- and B-forms was carried out with the purpose of revealing the contribution of water molecules to the thermostability of the NA and determining their structural state under conditions of low water content. Interest in the study of the structural state of the monohydration form is connected to the problem of the choice of conditions for long-term preservation of NA. It was found that the values of the free energy change at a structural transition depends on the nucleotide composition: with increase of GC-composition the stability grows. Thermostability correlates with this effect. Due to the presence of the enthalpy term, water brings the largest contribution to the free energy and hence it should determine the stability and thermostability of double-helical structures of NA. Estimation of the entropy changes of the PA or PB transition testifies the fact that, irrespective of nucleotide composition, NA in the monohydration state are partially ordered.

Thus, our results demonstrate that the hydration environment plays a determining role in the formation and stabilization of helical structures of NA with various nucleotide compositions and in their dynamic behavior.

The effect of low temperatures (to 80K) on the absorption spectra of nitrogen bases, sugar-phosphate chain and bound water in humid films of thymus DNA was studied. It has been found that the decrease of temperature leads to a reversible shortening of the hydrogen bonds between water molecules and phosphate groups, thus narrowing the DNA grooves. A detailed analysis of water spectra at low temperatures allowed to determine the amounts of frozen and unfrozen water of the DNA hydrate environment versus the composition of the DNA-water-ions system. This appears to be important for choice of optimum conditions for preservation of NA.

Key words: nucleic acids, IR-spectroscopy, hydration, energetics, stability, low temperatures.

Размещено на Allbest.ru


Подобные документы

  • Розрахунок і коригування вихідного складу води. Коагуляція з вапнуванням і магнезіальних знекремнювання вихідної води. Розрахунок складу домішок по етапах обробки. Вибір підігрівачів тепломережі та побудова графіку якісного регулювання режиму роботи.

    дипломная работа [2,0 M], добавлен 24.08.2014

  • Природа водної енергії. Енергія і потужність водяного потоку. Схеми концентрації напору. Гідроакумулюючі та припливні електростанції, установки, які використовують енергію води і вітру. Сучасні способи перетворення різних видів енергії в електричну.

    реферат [142,2 K], добавлен 19.12.2010

  • Загальні відомості, вольт-амперна характеристика, p-i-n структури, фізичний механізм та заряд перемикання напівпровідникового діода. Особливості та експерименти по визначенню заряду перемикання сплавних, точкових, дифузійних та епітаксіальних діодів.

    дипломная работа [863,1 K], добавлен 16.12.2009

  • Кристалічна структура води, її структурований стан та можливість відображати нашу свідомість. Види і характеристики води в її різних фізичних станах. Досвід цілющого впливу омагніченої води. Графіки її початкового й кінцевого потенціалів за зміною в часі.

    курсовая работа [1,6 M], добавлен 26.03.2014

  • Сутність і особливості поширення води на планеті Земля. Ізотопного складу, конструкція молекули води, фізичні властивості води, їх аномальність. Переохолоджена вода. Аномалія стіслівості. Поверхневий натяг. Аномалія теплоемності. Структура та форми льоду.

    реферат [31,3 K], добавлен 18.12.2008

  • Єдина теорія полів і взаємодій у цей час. Об'єднання слабкої й електромагнітної взаємодій елементарних часток. Мрія Ейнштейна у пошуках єдиної теорії будови Всесвіту. Основної ідеї та теоретичні досягнення у теорії суперструн на сьогоднішній день.

    курсовая работа [474,6 K], добавлен 25.01.2011

  • Визначення розрахункових витрат води. Обґрунтування прийнятої схеми очистки. Розрахунок насосної станції. Водопостачання теплоелектростанції потужністю 2400 мВт. Насосне підживлення технічного водопостачання з річки. Споруди з обороту промивної води.

    дипломная работа [471,3 K], добавлен 05.03.2011

  • Розробка водогрійної котельні для забезпечення потреб опалення, вентиляції та гарячого водопостачання. Розрахунок витрат та температур мережної води на опалення, а також теплової схеми котельні. Робота насосів рециркуляції і насосів технологічної води.

    дипломная работа [761,1 K], добавлен 16.06.2011

  • Термоелектричні явища, відомі у фізиці твердого тіла. Ефект Зеєбека в основі дії термоелектричних перетворювачів, їх технічні можливості. Основні правила поводження з термоелектричними колами. Виготовлення термопар для вимірювання низьких температур.

    курсовая работа [534,7 K], добавлен 12.02.2011

  • Рух молекул у рідинах. Густина і питома вага рідини. Поняття про ідеальну рідину. Поверхневий натяг, змочуваність і капілярні явища. Перехід з рідкого у газоподібний стан і навпаки. Зміна об'єму та густини рідини. Випаровування, конденсація, кавітація.

    реферат [69,5 K], добавлен 22.12.2013

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.